Công nghệ sản xuất Insulin bằng DNA tái tổ hợp

Hiện nay, có nhiều phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp dựa trên các chủng vi sinh vật biến đổi gen, chủ yếu là vi khuẩn (E.coli, Bacillus brevis…) hoặc nấm men (Saccharomyces cerevisiae , Pichia pastoris…)Có 2 nhóm phương pháp sản xuất Insulin tái tổ hợp trong các chủng VSV biến đổi gen là : nhóm phương pháp 2 chuỗi và nhóm phương pháp mini proinsulin.Kỹ thuật AND tái tổ hợp là tập hợp nhiều kỹ thuật để tạo ra một gen hoặc cả hệ gen ; cải biến cấu trúc của gen, nhằm tạo ra các gen mới rồi chuyển chúng vào trong tế bào, cơ thể nhằm mục đích sản xuất các sản phẩm ( protein, enzym,…), các tế bào, cơ thể có tính trạng mới theo mong muốnNhững hiểu biết sâu sắc về các đại phân tử sinh học là cơ sở khoa học của kỹ thuật gen( kỹ thuật di truyền) mà khởi đầu là kỹ thuật AND tái tổ hợp.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

SẢN XUẤT INSULIN BẰNG CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ

HỢP

GVPT: TS TRẦN THỊ NGỌC YÊN

NHÓM 4

LỜI MỞ ĐẦU

VÀI NÉT VỀ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG

SƠ LƯỢT VỀ INSULIN

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN TỪ VI SINH VẬT

NỘI DUNG

LỜI MỞ ĐẦU

• Bệnh tiểu đường là một trong những căn bệnh đe dọa nghiêm trọng tới sức khoẻ con người.Trên thế giới số người mắc bệnh tiểu đường ngày càng tăng, sự gia tăng số người mắc bệnh tiểu đường

sẽ kéo theo sự gia tăng các biến chứng của căn bệnh này như thần kinh, xơ vữa động mạch… Số người tử vong trên thế giới do bệnh tiểu đường liên tục gia tăng trong những năm gần đây Điều đó đòi hỏi phải tìm ra những hướng tiếp cận mới cho việc ngăn ngừa

và điều trị căn bệnh này.

Best và Banting- những người đầu tiên đã chiết suất được insulin

năm 1921

Collip và MacLeod- những người đầu tiên dùng insulin chiết suất đó để

điều trị bệnh tiểu đường type 1 cho Leonard Thomson

Vậy bạn biết gì về bệnh tiểu đường ?

• Bệnh đái tháo đường, còn gọi là Bệnh tiểu đường, là một bệnh do rối loạn chuyển hóa cacbohydrat khi hoóc môn insulin của tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể, biểu hiện bằng mức đường trong máu luôn cao

• Bệnh tiểu đường là một trong những nguyên nhân chính của nhiều bệnh hiểm nghèo, điển hình là bệnh tim mạch vành, tai biến mạch máu não, mù mắt, suy thận, liệt dương, hoại thư, v.v

KHÁI NIỆM

VÀI NÉT VỀ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG

TIỂU ĐƯỜNG LOẠI 1

Tiểu đường phụ thuộc insulin hay tiểu

đường ở người trẻ, chiếm khoảng 5-10%

tổng số bệnh nhân

TIỂU ĐƯỜNG LOẠI 2

Tiểu đường không phụ thuộc insulin hay tiểu đường ở người trưởng thành, chiếm khoảng 90-95% trong tổng số bệnh nhân bệnh tiểu đường, thường gặp ở lứa tuổi trên 40, nhưng gần đây xuất hiện ngày càng nhiều ở lứa tuổi 30, thậm chí cả lứa tuổi thanh thiếu niên

PHÂN LOẠI BỆNH TIỂU ĐƯỜNG

SƠ LƯỢT VỀ INSULIN

o Insulin người là một polypeptide

o Bao gồm:

• Chuỗi A 21 acid amin

• Chuỗi B 30 acid amin

• Có một cầu nối disulfur trong chuỗi A và 2 cầu nối

disufur nối giữa hai chuỗi A và B.

• Preproinsulin: là chuỗi peptid dài 110 acid amine, tổng hợp trong các

tế bào β của đảo Langerhans của tuyến tụy

• Proinsulin: Khi Preproinsulin tiến tới lưới nội chất, một protease

chuyên biệt sẽ cắt bỏ đoạn peptide tín hiệu tạo proinsulin Proinsulin

hình thành cầu nối disulfur trong lưới nội chất, hình thành cấu trúc bậc

ba

• Insulin: Hình thành qua quá trình phân cắt nhờ enzyme PC1/3 tại liên

kết giữa chuỗi B và C và enzyme PC2 ngay vị trí liên kết giữa chuỗi A

TỔNG HỢP INSULIN TRONG CƠ THỂ

VAI TRÒ SINH HỌC CỦA INSULIN

Sơ đồ biểu hiện sự điều hòa hàm lượng glucose máu

Gia tăng tuần hoàn insulin Tế bào hấp thu glucose Năng lượng trao đổi chất

Tổng hợp chất béo Tổng hợp Glycogen Lượng Glucose còn lại

Kích thích tuyến tụy tiết ra insulin

Kích thích tuyến tụy tiết ra Glucagon Hấp thu Glucose vào máu

Glycogen chuyển thành Glucose ở gan Gia tăng tuần hoàn Glucagon

Giảm lượng Glucose trong máu Glucose trong máu

Tăng lượng Glucose

trong máu

NHỮNG TÁC ĐỘNG KHÁC CỦA INSULIN

- Insulin làm tăng tính hấp thụ của các

axitamin.

- Insulin làm tăng tính thấm các ion kali,

magie và photphat vô cơ tạo điều kiện cho

quá trình photphoryl hoá và sử dụng

glucoz.

Insulin làm tăng tính thấm các ion kali, magie và photphat vô cơ

MỘT SỐ LOẠI INSULIN TRÊN THỊ TRƯỜNG

Loại insulin Màu sắc Nguồn gốc Thời gian bắt đầu có tác

30 phút (tiêm dưới da) 8 giờ

QUY TRÌNH SẢN XUẤT INSULIN TỪ VI

SINH VẬT

• Hiện nay, có nhiều phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp dựa trên các chủng vi sinh vật biến đổi gen, chủ yếu là vi khuẩn (E.coli, Bacillus brevis…) hoặc nấm men (Saccharomyces cerevisiae , Pichia pastoris…)

• Có 2 nhóm phương pháp sản xuất Insulin tái tổ hợp trong các chủng VSV biến đổi gen là : nhóm phương pháp 2 chuỗi và nhóm phương pháp miniproinsulin.

KHÁI QUÁT VỀ CÔNG NGHỆ AND TÁI TỔ HỢP

• Kỹ thuật AND tái tổ hợp là tập hợp nhiều kỹ thuật để tạo ra một gen hoặc cả hệ gen ; cải biến cấu trúc của gen, nhằm tạo ra các gen mới rồi chuyển chúng vào trong tế bào, cơ thể chủ nhằm mục đích sản xuất các sản phẩm ( protein, enzym,…), các tế bào, cơ thể có tính trạng mới theo mong muốn

• Những hiểu biết sâu sắc về các đại phân tử sinh học là cơ sở khoa học của kỹ thuật gen( kỹ thuật di truyền) mà khởi đầu là kỹ thuật AND tái tổ hợp

PHƯƠNG PHÁP 1: Sinh tổng hợp Insulin tái tổ hợp theo phương pháp

miniproinsulin (MPI)

• Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ của người Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để khuếch đại gen, loại bỏ protein Do hầu hết các mARN của người đều có đuôi polyA nên sử dụng chuỗi polyT để bắt cặp với đuôi polyA đó.

• Sử dụng sắc kí ái lực với polyT giữ lại mARN cần thiết cho quá trình dịch mã; còn lại loại bỏ ADN và các ARN khác.

• Cắt bỏ cầu nối A - T thu được mARN

Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ của người

BƯỚC 3: Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp

trộn với dung dịch ion Ca hoặc tạo lỗ xung điện.

Tách và biến nạp Plasmic tái tổ hợp vào E.Coli

Các vi khuẩn chuyển gen sau đó được đưa vào nồi lên

men Nuôi chúng trong các nồi lên men với các điều kiện

tối ưu Sử dụng các phương pháp nuôi cấy liên tục, theo

đó các chất dinh dưỡng liên tục được bổ sung để đảm bảo

sự tăng trưởng của vi khuẩn theo hàm mũ Cứ 20 phút lại

có hàng triệu vi khuẩ được nhân lên qua nguyên phân

Như vậy, chỉ sau một thời gian ngắn, sinh khối sẽ tăng

BƯỚC 4: Lên men bằng phương pháp nuôi cấy liên tục thu sinh khối

BƯỚC 5: Tiền tinh sạch

BƯƠC 6: Hoạt hóa

Hoạt hoá proinsulin invitro bằng

cách xử lý dung dịch đệm, giúp nó

đạt cấu trúc bậc 4, sau đó dùng

enzym đặc hiệu trypsin để phân

cắt proinsulin Khi đó sản phẩm

thu được mới có hoạt tính cần thiết

Hoạt hoá proinsulin thành insulin hoàn chỉnh

BƯỚC 7: Hổn hợp tinh sạch chỉ còn có insulin

• Bằng phương pháp sắc ký, tách và

phương pháp miễn dịch gắn enzym

• Độ tinh sạch của insulin được đánh giá

qua mỗi giai đoạn trung gian của quá

trình sản xuất nhờ phòng thí nghiệm

chuyên hoá Cuối cùng insulin được tinh

thể hoá

PHƯƠNG PHÁP 2: Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B

Phương pháp này sẽ tránh được việc sản xuất enzim đặc

hiệu cần thiết để biến proinsulin thành insulin

Nhà sản xuất cần hai gen nhỏ đẻ sản xuất hai chuỗi A và

B Xác định trình tự ADN để qua đó tổng hợp và tách hai

dòng gen này

Mỗi ADN được chèn vào plasmit Sau đó sản xuất tương

tự như sản xuất proinsulin

Cuối cùng hai chuỗi A và B được trộn với nhau và hình

thành cầu nối đisulfua qua phản ứng tái oxi hoá khử nhờ một

chất oxi hoá nhất định

Sản xuất insulin tái tổ hợp với chuỗi A và chuỗi B riêng

biệt

Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B

CẢM ƠN CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG

NGHE