Đang tải... (xem toàn văn)
Hiện nay, có nhiều phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp dựa trên các chủng vi sinh vật biến đổi gen, chủ yếu là vi khuẩn (E.coli, Bacillus brevis…) hoặc nấm men (Saccharomyces cerevisiae , Pichia pastoris…)Có 2 nhóm phương pháp sản xuất Insulin tái tổ hợp trong các chủng VSV biến đổi gen là : nhóm phương pháp 2 chuỗi và nhóm phương pháp mini proinsulin.Kỹ thuật AND tái tổ hợp là tập hợp nhiều kỹ thuật để tạo ra một gen hoặc cả hệ gen ; cải biến cấu trúc của gen, nhằm tạo ra các gen mới rồi chuyển chúng vào trong tế bào, cơ thể nhằm mục đích sản xuất các sản phẩm ( protein, enzym,…), các tế bào, cơ thể có tính trạng mới theo mong muốnNhững hiểu biết sâu sắc về các đại phân tử sinh học là cơ sở khoa học của kỹ thuật gen( kỹ thuật di truyền) mà khởi đầu là kỹ thuật AND tái tổ hợp.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA SẢN XUẤT INSULIN BẰNG CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP GVPT: TS TRẦN THỊ NGỌC YÊN NHÓM NỘI DUNG LỜI MỞ ĐẦU VÀI NÉT VỀ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG SƠ LƯỢT VỀ INSULIN CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN TỪ VI SINH VẬT LỜI MỞ ĐẦU • Bệnh tiểu đường bệnh đe dọa nghiêm trọng tới sức khoẻ người.Trên giới số người mắc bệnh tiểu đường ngày tăng, gia tăng số người mắc bệnh tiểu đường kéo theo gia tăng biến chứng bệnh thần kinh, xơ vữa động mạch… Số người tử vong giới bệnh tiểu đường liên tục gia tăng năm gần Điều đòi hỏi phải tìm hướng tiếp cận cho việc ngăn ngừa điều trị bệnh Best Banting- người chiết suất insulin năm 1921 Collip MacLeod- người dùng insulin chiết suất để điều trị bệnh tiểu đường type cho Leonard Thomson Vậy bạn biết bệnh tiểu đường ? VÀI NÉT VỀ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG KHÁI NIỆM • Bệnh đái tháo đường, gọi Bệnh tiểu đường, bệnh rối loạn chuyển hóa cacbohydrat hoóc môn insulin tụy bị thiếu hay giảm tác động thể, biểu mức đường máu cao • Bệnh tiểu đường nguyên nhân nhiều bệnh hiểm nghèo, điển hình bệnh tim mạch vành, tai biến mạch máu não, mù mắt, suy thận, liệt dương, hoại thư, v.v PHÂN LOẠI BỆNH TIỂU ĐƯỜNG TIỂU ĐƯỜNG LOẠI TIỂU ĐƯỜNG LOẠI Tiểu đường không phụ thuộc insulin hay tiểu Tiểu đường phụ thuộc insulin hay tiểu đường người trưởng thành, chiếm khoảng 90-95% đường người trẻ, chiếm khoảng 5-10% tổng số bệnh nhân bệnh tiểu đường, thường tổng số bệnh nhân gặp lứa tuổi 40, gần xuất ngày nhiều lứa tuổi 30, chí lứa tuổi thiếu niên SƠ LƯỢT VỀ INSULIN o o Insulin người polypeptide Bao gồm: • • • Chuỗi A 21 acid amin Chuỗi B 30 acid amin Có cầu nối disulfur chuỗi A cầu nối disufur nối hai chuỗi A B o Công thức hóa học: C257H383N65O77S6 o CẤU TRÚC PHÂN TỬ INSULIN Trọng lượng phân tử: 5808 TỔNG HỢP INSULIN TRONG CƠ THỂ • Preproinsulin: chuỗi peptid dài 110 acid amine, tổng hợp tế bào β đảo Langerhans tuyến tụy • Proinsulin: Khi Preproinsulin tiến tới lưới nội chất, protease chuyên biệt cắt bỏ đoạn peptide tín hiệu tạo proinsulin Proinsulin hình thành cầu nối disulfur lưới nội chất, hình thành cấu trúc bậc ba • Insulin: Hình thành qua trình phân cắt nhờ enzyme PC1/3 liên kết chuỗi B C enzyme PC2 vị trí liên kết chuỗi A C VAI TRÒ SINH HỌC CỦA INSULIN Gia tăng tuần hoàn insulin Tế bào hấp thu glucose Năng lượng trao đổi chất Tổng hợp chất béo Tổng hợp Glycogen Kích thích tuyến tụy tiết insulin Tăng lượng Glucose máu Lượng Glucose lại Glucose máu Giảm lượng Glucose máu Hấp thu Glucose vào máu Kích thích tuyến tụy tiết Glucagon Glycogen chuyển thành Glucose gan Gia tăng tuần hoàn Glucagon Sơ đồ biểu điều hòa hàm lượng glucose máu NHỮNG TÁC ĐỘNG KHÁC CỦA INSULIN - Insulin làm tăng tính hấp thụ axitamin - Insulin làm tăng tính thấm ion kali, magie photphat vô tạo điều kiện cho trình photphoryl hoá sử dụng glucoz Insulin làm tăng tính thấm ion kali, magie photphat vô MỘT SỐ LOẠI INSULIN TRÊN THỊ TRƯỜNG Loại insulin Màu sắc Tác dụng nhanh - Insulin Actrapid HM Nguồn gốc Người - Insulinum maxirapid Lợn Tác dụng bán chậm Người - Insulatard HM đục - Insulin Lente Loại pha trộn - Mixtard HM 30/70 Tác dụng chậm - Utra - Lente Thời gian bắt đầu có tác dụng 30 phút (tiêm da) Lợn Thời gian hết tác dụng 20 18 đục Người 30 phút 20 đục Bò 30 QUY TRÌNH SẢN XUẤT INSULIN TỪ VI SINH VẬT • Hiện nay, có nhiều phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp dựa chủng vi sinh vật biến đổi gen, chủ yếu vi khuẩn (E.coli, Bacillus brevis…) nấm men (Saccharomyces cerevisiae , Pichia pastoris…) • Có nhóm phương pháp sản xuất Insulin tái tổ hợp chủng VSV biến đổi gen : nhóm phương pháp chuỗi nhóm phương pháp miniproinsulin KHÁI QUÁT VỀ CÔNG NGHỆ AND TÁI TỔ HỢP • Kỹ thuật AND tái tổ hợp tập hợp nhiều kỹ thuật để tạo gen hệ gen ; cải biến cấu trúc gen, nhằm tạo gen rồi chuyển chúng vào tế bào, thể chủ nhằm mục đích sản xuất sản phẩm ( protein, enzym,…), tế bào, thể có tính trạng theo mong muốn • Những hiểu biết sâu sắc đại phân tử sinh học sở khoa học kỹ thuật gen( kỹ thuật di truyền) mà khởi đầu kỹ thuật AND tái tổ hợp PHƯƠNG PHÁP 1: Sinh tổng hợp Insulin tái tổ hợp theo phương pháp miniproinsulin (MPI) • Tách mARN gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ người Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để khuếch đại gen, loại bỏ protein Do hầu hết mARN người có đuôi polyA nên sử dụng chuỗi polyT để bắt cặp BƯỚC1: Tách gen mã hoá proinsulin người nhiễm sắc thể số 11 với đuôi polyA • Sử dụng sắc kí lực với polyT giữ lại mARN cần thiết cho trình dịch mã; lại loại bỏ ADN ARN khác • Cắt bỏ cầu nối A - T thu mARN Tách mARN gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ người BƯỚC 3: Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp trộn với dung dịch ion Ca tạo lỗ xung điện Tách biến nạp Plasmic tái tổ hợp vào E.Coli BƯỚC 4: Lên men phương pháp nuôi cấy liên tục thu sinh khối Các vi khuẩn chuyển gen sau đưa vào nồi lên men Nuôi chúng nồi lên men với điều kiện tối ưu Sử dụng phương pháp nuôi cấy liên tục, theo chất dinh dưỡng liên tục bổ sung để đảm bảo tăng trưởng vi khuẩn theo hàm mũ Cứ 20 phút lại có hàng triệu vi khuẩ nhân lên qua nguyên phân Như vậy, sau thời gian ngắn, sinh khối tăng BƯỚC 5: Tiền tinh BƯƠC 6: Hoạt hóa Hoạt hoá proinsulin invitro cách xử lý dung dịch đệm, giúp đạt cấu trúc bậc 4, sau dùng enzym đặc hiệu trypsin để phân cắt proinsulin Khi sản phẩm thu có hoạt tính cần thiết Hoạt hoá proinsulin thành insulin hoàn chỉnh BƯỚC 7: Hổn hợp tinh có insulin • Bằng phương pháp sắc ký, tách phương pháp miễn dịch gắn enzym • Độ tinh insulin đánh giá qua mỗi giai đoạn trung gian trình sản xuất nhờ phòng thí nghiệm chuyên hoá Cuối insulin tinh thể hoá PHƯƠNG PHÁP 2: Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A B Phương pháp tránh việc sản xuất enzim đặc hiệu cần thiết để biến proinsulin thành insulin Nhà sản xuất cần hai gen nhỏ đẻ sản xuất hai chuỗi A B Xác định trình tự ADN để qua tổng hợp tách hai dòng gen Mỗi ADN chèn vào plasmit Sau sản xuất tương tự sản xuất proinsulin Cuối hai chuỗi A B trộn với hình thành cầu nối đisulfua qua phản ứng tái oxi hoá khử nhờ chất oxi hoá định Sản xuất insulin tái tổ hợp với chuỗi A chuỗi B riêng biệt Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A B CẢM ƠN CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE