Ứng dụng enzyme trong hóa sinh

Ứng dụng enzyme trong hóa sinh

Mục lục ỨNG DỤNG ENZYME TRONG HÓA SINH Tổng quan enzyme 1.1 Định nghĩa enzyme Trong thể sống (các tế bào) luôn xảy trình trao đổi chất Sự trao đổi chất ngừng sống không tồn Quá trình trao đổi chất tập hợp quy luật nhiều phản ứng hóa học khác Các phản ứng hóa học phức tạp có liên quan chặt chẽ với điều chỉnh lẫn Enzyme hợp chất protein xúc tác cho phản ứng hóa học Chúng có khả xúc tác đặc hiệu phản ứng hóa học định đảm bảo cho phản ứng xảy theo chiều hướng định với tốc độ nhịp nhàng thể sống Chúng có hầu hết loại tế bào thể sống Chính tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme gọi chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm để phân biệt với chất xúc tác hóa học Enzyme học khoa học nghiên cứu chất xúc tác sinh học có chất protein Hay nói cách khác, enzyme học khoa học nghiên cứu tính chất chung, điều kiện, chế tác dụng tính đặc hiệu enzyme 1.1 Lược sử nghiên cứu enzyme Do enzyme học coi cột sống hóa sinh học nên phần lớn nghiên cứu hóa sinh từ trước đến liên quan nhiều đến enzyme Về phát triển học thuyết enzyme, chia thành giai đoạn: - Giai đoạn 1: trước kỷ thứ XVII Giai đoạn 2: từ kỷ XVII đến nửa đầu kỷ XIX Giai đoạn 3: từ kỷ XIX đến 30 năm đầu kỷ XX Giai đoạn 4: từ năm 30 kỷ XX đến 1.1.1 Giai đoạn Trước kỷ XVII người ta biết sử dụng trình enzyme đời sống song có tính chất kinh nghiệm thực tế thông qua hoạt động vi sinh vật Đó trình lên men rượu, muối dưa, làm tương nước chấm Ở thời kỳ người ta chưa hiểu chất enzyme trình lên men 1.1.2 Giai đoạn Ở giai đoạn nhà bác học tiến hành tìm hiểu chất trình lên men Thời kỳ khái quát tượng lên men tượng phổ biến sống enzyme yếu tố gây nên chuyển hóa chất trình lên men Vào năm 1600 kỷ XVII, Van Helmont người cố gắng sâu tìm hiểu chất trình lên men Van Helmont nhận thấy thực chất tiêu hóa chuyển hóa hóa học thức ăn giải thích chế với so sánh với trình lên men rượu Danh từ ferment (từ chữ Latinh fermentatio - lên men) Van Helmont dùng để tác nhân gây chuyển biến chất trình lên men rượu Vào nửa cuối kỷ thứ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp Réaumur nghiên cứu chất tiêu hóa Nhà tự nhiên học cho chim quạ đen nuốt miếng thịt đặt sẵn ống kim loại có thành đục sẵn buộc vào dây thép Sau vài không thấy ống Hiện tượng thúc đẩy nghiên cứu thành phần dịch tiêu hóa để tìm hiểu khả tiêu hóa dịch dày Sau thí nghiệm thời gian, vào năm 1783, nhà bác học người Ý Spalanzani lặp lại thí nghiệm cách lấy dịch dày trộn với thịt thấy có tượng hòa tan xảy Vào đầu kỷ XIX, nhà nghiên cứu tách chất gây trình lên men Năm 1814 Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg phát nước chiết mầm đại mạch có khả chuyển hóa tinh bột thành đường nhiệt độ thường Đây công trình thu chế phẩm amylase dạng dung dịch lịch sử enzyme học thực xem Mười chín năm sau (năm 1833), hai nhà khoa học người Pháp Payen Pessoz chứng minh chất có hoạt động phân giải tinh bột thành đường tách dạng bột Thí nghiệm tiến hành cách cho etanol vào dịch chiết lúa đại mạch nảy mầm thấy xuất kết tủa Kết tủa hình thành có khả chuyển hóa tinh bột đun kết tủa tác dụng chuyển hóa Danh từ diastase (từ chữ Latinh diastasis - phân cắt) Payen Persoz dùng để gọi enzyme amylase lúc Tiếp người ta tìm tách nhiều enzyme khác enzyme phân giải protein dịch tiêu hóa dày Pepsin (Emberle Shwan) - nhà khoa học người Đức, năm 1836) Sau đó, lý thuyết xúc tác đời Năm 1835, nhà khoa học Berzelius có quan điểm cho tăng tốc độ phản ứng tượng xúc tác Đây quan điểm Song thật đáng tiếc nhà khoa học coi chất xúc tác hoạt động "lực sống" không theo điều khiển người Đây quan điểm tâm, siêu hình làm trì trệ phát triển khoa học ảnh hưởng sâu sắc đến phát triển ngành enzyme học 1.1.3 Giai đoạn Giai đoạn từ kỷ XIX đến 30 năm đầu kỷ XX Ở giai đoạn số lượng lớn enzyme dạng hòa tan tách chiết Trong thời kỳ này, có hai trường phái đấu tranh với nhau: trường phái Pasteur - nhà bác học vĩ đại người Pháp trường phái Liebig - nhà bác học tiếng người Đức • Trường phái Pasteur: Năm 1856 Pasteur đề cập đến chất trình lên men Ông cho tách enzyme khỏi tế bào Tác dụng tính chất enzyme gắn liền với sống tế bào trình lên men rượu kết hoạt động sống tế bào nấm men kết tác dụng enzyme Ông tiến hành thí nghiệm nhận thấy dung dịch hữu cơ, ví dụ dung dịch glucose để bình khử trùng không xảy trình lên men rượu Chính suy nghĩ ấy, Pasteur chia enzyme thành loại: "enzyme có tổ chức" "enzyme tổ chức" Theo ông, "enzyme có tổ chức" enzyme tách khỏi tế bào, tách chúng bị tác dụng xúc tác enzyme tế bào nấm men thực trình lên men rượu; "enzyme tổ chức" enzyme thực tính xúc tác thể enzyme có dịch tiêu hóa (ví dụ Pepsin dày, amylase tuyến nước bọt, mầm thóc ) Quan điểm sai lầm Pasteur thống trị ngành enzyme học thời gian dài Năm 1878 Kuhne đề nghị dùng danh từ "ferment" (từ tiếng Latinh: fermentatio = lên men) để gọi "enzyme có tổ chức" gọi chất chiết có tác dụng xúc tác cho phản ứng hóa học enzyme (từ chữ Hy Lạp: en = bên trong, zyme = men rượu, tức "ở nấm men" để gọi enzyme "không có tổ chức" Danh từ enzyme xuất phát từ • Trường phái Liebig: Chống lại quan điểm Pasteur, Liebig (trước có Berzelius) cho hoạt động tế bào vi sinh vật có trình lên men Điều có nghĩa ông coi enzyme chất hóa học gây nên hiệu tương tự chất xúc tác, tác dụng tế bào, không phụ thuộc vào hoạt động sống cúa vi sinh vật Nhưng năm 1871 Liebig thất bại thực nghiệm không chứng minh quan điểm Các thí nghiệm tiến hành cách lấy dịch chiết từ tế bào nấm men nghiền nát tác dụng gây lên men rượu Cũng vào năm 1871 Manatxein bác sĩ người Nga dùng cát thạch anh nghiền tế bào nấm men thu dịch chiết không chứa tế bào có khả biến đổi đường thành rượu Nhưng quan sát không ý tới Chính vậy, quan điểm siêu hình Pasteur hạn chế nhiều phát triển ngành enzyme học Đến năm 1897, H Büchner - nhà khoa học người Đức nhận dịch chiết nấm men cách phân huỷ tế bào hoàn thiện Trong thí nghiệm này, tế bào nấm men nghiền nát hoàn toàn với bột thủy tinh, sau ép áp suất cao Dịch chiết thu không chứa tế bào có khả gây trình lên men (chuyển hóa glucose thành rượu) Điều chứng tỏ trình lên men rượu kết hoạt động sống tế bào nấm men mà kết tác dụng enzyme vốn có tế bào Do đó, quan điểm sai lầm enzỵme "có tổ chức" enzyme "không có tổ chức" mà thực chất chất enzyme đến lúc hoàn toàn bị đánh đổ, mở thời kỳ phát triển ngành enzyme học Cũng từ phân biệt nội dung thuật ngữ "ferment" "enzyme" Có thể nói rằng, công trình Büchner đánh dấu bước ngoặt quan trọng lịch sử phát triển enzyme học Sau đó, nhiều loại enzyme thể sống tìm Vì việc phân loại gọi tên enzyme cách thống cần thiết Năm 1883, Duyclo, nhà bác học Pháp đề nguyên tắc phân loại enzyme theo chất (substrate) chúng biến đổi thêm đuôi tận "ase" vào Ví dụ enzyme phân giải tinh bột (amilun) amylase Tuy vậy, thực tế tồn nhiều ngoại lệ thuật ngữ, ví dụ tên gọi enzyme pepsin, trypsin, catalase trước dùng Ở thời kỳ này, dựa vào thành tựu hóa học, đặc biệt hóa lý hóa keo, nhà khoa học hướng vào việc nghiên cứu tính chất hóa lý học enzyme hoàn thiện phương pháp làm khiết enzyme Giai đoạn quan trọng thời kỳ công trình nhà bác học vĩ đại người Đức E Fisher Ông đặt móng cho khái niệm đại tính đặc hiệu enzyme, tương tác không gian enzyme chất Giả thuyết tiếng ông enzyme chất kết hợp với "ổ khóa với chìa khóa" Rồi nghiên cứu Bach Palladin enzyme ôxy hóa khử tạo nên sở cho việc xây dựng học thuyết ôxy hóa khử sinh học Trong thời gian người ta phát tính tác dụng thuận nghịch enzyme (Đanilepski, 1894), coenzyme phát (Harden Young, 1906) Họ người khám phá rằng, dịch chiết tế bào nấm men chứa hai loại chất cần thiết cho trình lên men "zymase" "cozymase" Họ nhận thấy dịch chiết tế bào nấm men hoạt tính xúc tác bị thẩm tích bị đun lên đến 50 Nhưng dịch chiết bị thẩm tích không hoạt động hoạt động trộn với dịch bị đun nóng không hoạt động Như hoạt độ phụ thuộc vào có mặt hai loại chất: thành phần không bền với nhiệt (heat - labile); không thẩm tích (được gọi zymase) phân đoạn bền với nhiệt (heat - stable), thẩm tích (được gọi cozymase) Ngày biết "zymase" bao gồm tất enzyme, "cozymase" bao gồm ion kim loại, ATP, ADP coenzyme NAD+ Thời gian người ta hiểu biết tác dụng kìm hãm hoạt hóa số enzyme (Sorensen 1909) Vào đầu kỷ XX, phát sinh sở động học tác động enzyme dựa vào nghiên cứu nhà bác học Anh Brown nhà bác học Pháp Henri Đến năm 1913, Michaelis Menten phát triển công trình nêu lên thuyết động học xúc tác enzyme Sau đại chiến giới lần thứ nhà bác học tiếng người Đức Willstatter có nhiều cống hiến việc tìm hiểu chất hóa học enzyme Đó công trình khoa học năm ông cộng (1922) nhằm làm khiết enzyme phương pháp hấp thụ chọn lọc Qua từ nhận xét thấy giai đoạn cuối trình làm khiết enzyme, thường bị chất chưa biết do, enzyme bị tính xúc tác, cho phép Willstatter nêu lên lần giả thuyết enzyme hai cấu tử (enzyme hai thành phần) Nhóm hoạt động (coenzyme, coferment, agon) có khả xúc tác kết hợp với phần protein đặc hiệu (apoferment, apoenzyme, feron = protein) xác định đặc tính enzyme đóng vai trò chủ đạo việc thể tác dụng xúc tác enzyme Willstatter coi feron (protein) chất trơ chả có tác dụng Agon chất hấp phụ chất Và vào năm 1926, dịp thuyết trình, ông cho enzyme không thuộc hợp chất biết, tức enzyme protein, glucid, mà chúng "chất đặc biệt" Đó quan niệm sai lầm Willstatter Ông người tìm nhiều phương pháp làm enzyme làm sáng tỏ nhiều tính chất đặc hiệu enzyme Nhưng mục đích làm sáng tỏ chất hóa học enzyme ông lại không đạt Ngày người ta quan niệm enzyme hai thành phần phần coenzyme quy định kiểu phản ứng chịu trách nhiệm làm bền Còn apoenzyme quy định tính đặc hiệu enzyme tăng hiệu suất xúc tác Coenzyme + apoenzyme = (holo) enzyme = (enzyme hoàn chỉnh) Coferment + apoferment = (holo) ferment Coenzyme dùng để phần protein enzyme trường hợp dễ tách khỏi phần apoenzyme cho thẩm tích qua màng bán thấm tồn độc lập Phần protein enzyme gọi nhóm ngoại hay nhóm "prostetic" liên kết chặt chẽ với phần protein enzyme 1.1.4 Giai đoạn Bản chất hóa học enzyme xác định đắn từ sau kết tinh enzyme Năm 1926 nhà hóa sinh Mỹ trẻ tuổi Sumner (39 tuổi) thành công việc chứng minh protein kết tinh từ hạt đậu tương chất giống enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân urê Đây enzyme kết tinh Bốn năm sau (1930) Mỹ Northrop tách pepsin dạng tinh thể, vào năm 1931 Northrop Kunitz tách trypsin dạng tinh thể Trong thời kỳ J.B.S Hardane viết "Enzymes" Mặc dù lúc chất phân tử Enzyme bí mật, tác giả đưa dự đoán tuyệt vời vai trò tương tác liên kết yếu enzyme chất chế hoạt động enzyme Điều giữ nguyên tính thời thời đại Các công trình Sumner Northrop mở chương lịch sử phát triển enzyme học đại Những kết đạt cho phép xác định cách dứt khoát chất hóa học enzyme protein Phải nói chất hóa học phần lớn enzyme protein định nghĩa có tính chất kinh điển Enzyme phải xem lại từ sau phát T R Cech năm 1981 Cech phát RNA có hoạt tính xúc tác enzyme gọi ribozyme (xuất phát từ tên ribose enzyme) Ribozyme xúc tác cho trình chuyển hóa tiền chất RNA thông tin (pre - m RNA) thành m-RNA Do enzyme không thiết phải protein! Đây phát minh có ý nghĩa lớn Tác giả phát minh giải Nobel năm 1989 Cho đến khoảng 100 ribozyme biết Có thể nói rằng, công trình nói mở cho giai đoạn thứ tư lịch sử phát triển enzyme học kéo dài Từ kỷ thứ XX, thời gian gần enzyme học phát triển mạnh Nhờ ứng dụng phương pháp mới, đại như: điện di, sắc ký, quang phổ, đồng vị phóng xạ cho phép nghiên cứu cấu trúc chế tác dụng nhiều enzyme, chế trình sinh tổng hợp enzyme điều hòa hoạt động enzyme tế bào Người ta xác định cấu tạo coenzyme Đã xác định mối liên hệ enzyme vitamin (nhiều vitamin thành phần cấu tạo coenzyme phần lớn vitamin tan nước thành phần cấu tạo coenzyme) Người ta xác định enzyme xúc tác cho trình trao đổi chất như: hệ thống enzyme đường phân, Embden - Meyerhof - Parnas năm 1933, hệ thống enzyme chu trình Kreps - Szent Gyorgy năm 1937 (chu trình citric acid), chu trình ornithrin trao đổi chất protein năm 1932 (Krebs - Henseleit) Nhờ phương pháp việc tách làm enzyme, người ta xác định vai trò quan trọng kim loại xúc tác enzyme tác dụng hoạt hóa chúng Đã xác định phân bố enzyme tế bào Đã nghiên cứu chế tác dụng cấu tạo protein enzyme Bằng phương pháp Rhengen, người ta nghiên cứu cấu trúc của phân tử enzyme, cấu trúc ribonuclease (1960, Stein) Enzyme ứng dụng Enzyme xem kỹ thuật quan trọng công nghệ sinh học có chức sau: - Enzyme chất xúc tác cho biến đổi vật chất công nghệ sinh học - Enzyme nhiều hoạt chất sinh học khác sản phẩm công nghệ sinh học Chúng dùng làm công cụ công nghệ sinh học, hay sử dụng lĩnh vực khác - Enzyme xem thuốc thử có tính chuyên hóa cao mà enzyme trình công nghệ sinh học tối ưu hóa Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme loại phát triễn mạnh mẽ qui mô công nghiệp Thực tế có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán thị trường giới, chế phẩm khai thác tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp ứng dụng Các chế phẩm enzyme phổ biến amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucoseoxydase… Chế phẩm enzyme không ứng dụng y học mà ứng dụng nhiều lĩnh vực công nghiệp khác nhau, nông nghiệp, hóa học…"ý nghĩa việc sử dụng enzyme lĩnh vực thực tế không so với ý nghĩa việc sử dụng lượng nguyên tử" 2.1 Ứng dụng hóa sinh 2.1.1 Tổng quan Ribozyme Một số ARN có kích thước nhỏ có hoạt tính xúc tác giống enzyme gọi ribozyme Về vai trò tham gia trình phiên mã dịch mã thông tin di truyền, RNA chia làm ba loại chính: ARN thông tin (kí hiệu: mARN, viết tắt từ messengerARN): gồm sợi Polynucleotit dạng thẳng, có chức chép thông tin di truyền từ gen cấu trúc đem đến Riboxom nơi tổng hợp protein ARN vận chuyển (kí hiệu: tARN, viết tắt từ transportARN): mạch polynucleotit có từ 80 đến 100 ribonucleotit tự xoắn hình chạc ba nên số đoạn có nguyên tắc bổ sung A-U; G-X Có đoạn nguyên tắc bổ sung, đoạn tạo thành thùy tròn Một thùy tròn mang ba đối mã Một sợi mút sợi ARN 3' gắn với acid amin đầu mút tự 5' Mỗi tARN vận chuyển loại acid amin ứng với ba đối mã mà mang Các acid amin vận chuyển đến riboxom để tổng hợp protein ARN riboxom (kí hiệu: rARN): gồm mạch dạng xoắn tương tự tARN Ngoài ra, số ARN có vai trò điều khiển hoạt động gien có chức tham gia trình phát triển, biệt hoá tế bào RNAi (interfering RNA) hay microARN Không có ý nghĩa nghiên cứu phát minh cung cấp công cụ kĩ thuật di truyền với tiềm hứa hẹn ngăn cản lây nhiễm virus Trong công trình nghiên cứu hai nhà khoa học Sidney Altman Thomas Cech phát RNA xúc tác cho phản ứng tự nhân đôi tổng hợp nên phân tử RNA khác (ribozyme), mở đầu cho luồng ý kiến cho RNA nguyên liệu di truyền trái đất Một "thế giới" RNA tin tồn trước DNA đón nhận vai trò nguyên liệu di truyền then chốt, RNA chuyển đến giữ vai trò liên lạc DNA protein Sự khám phá chất xúc tác RNA liên hệ mật thiết với tiến hóa mà đề xuất RNA giữ vai trò hoạt động nhiều biểu gene nhận từ sớm RNA ribosome xúc tác hình thành liên kết peptide dịch mã Trước công trình nghiên cứu Altman and Cech, tất enzyme coi protein Các tính chất chức cụ thể protein xác định nhân tố di truyền hay gọi gene Thông tin di truyền ADN quy định cấu trúc chức protein, nhiên trước thông tin sử dụng trực tiếp để tổng hợp nên protein, mã di truyền cần phải mã thành dạng phân tử acid nuleic khác RNA (ribonucleic acid) Altman Cech tiến hành nghiên cứu độc lập phát RNA không phân tử có chức di truyền mà có vai trò chất xúc tác sinh học Không có ý nghĩa nghiên cứu phát minh cung cấp công cụ kĩ thuật di truyền với tiềm hứa hẹn ngăn cản lây nhiễm virus Những khám phá Altman and Cech ARN chức di truyền mà có chức xúc tác sinh học enzyme gây bất ngờ lớn từ lâu nhà sinh học tin axit nucleic phân tử sinh học giữ vai trò di truyền protein phân tử chức cấu trúc chức xúc tác Các enzyme chất xúc tác sinh học mà có vai trò định gần tất phản ứng xảy thể sống, enzyme có khả tăng tốc độ phản ứng phản ứng lên nhiều lần Các phản ứng thể sống thực khó xảy vắng mặt enzyme, hay nói cách đơn giản, enzyme sống Trong ribosome thành phần có vai trò xúc tác hình thành liên kết peptit (enzyme peptidyl transferase) ARN Điểm khác biệt peptidyl transferase với loại ribozyme khác (như ARN antisen, P RNAase …) ribozyme khác gây tác động xúc tác lên trung tâm phản ứng photpho peptidyl transferase gây hiệu ứng xúc tác lên trung tâm phản ứng Cacbon qua hình thành liên kết peptit Có thể ribozyme ribosome “dấu vết’’ sót lại dạng sống nguyên thuỷ vốn có enzyme ARN Chức xúc tác RNA cung cấp công cụ hoàn toàn công nghệ gen Đặc biêt công nghệ có sử dụng ribozyme sử dụng việc phân cắt ARN để phá huỷ phân tử ARN có đặc điểm gây hại không mong muốn thể sinh vật định Nói cách cụ thể hơn, nhà khoa học hy vọng khả cắt xén gene phương thức cắt phá huỷ ARN virus chế bảo vệ thể chống lại lây nhiễm virus, công nghệ liên quan đến ribozyme giúp tạo thực vật kháng virus góp phần điều trị có hiệu bệnh nhiễm virus bệnh cảm lạnh, HIV, bệnh truyền nhiễm virus khác…, cần có nghiên cứu sau Altman Cech chức xúc tác ARN 2.1.2 Cơ chế Sử dụng ribozyme để ngăn chặn chép virus mã gen virus Ribozyme phân tử RNA có bán phần xúc tác có khả phân cắt phân RNA đích xung quanh cánh tay RNA có khả gắn với trình tự đích cặp base bổ cứu tương tự antisense oligonucleptide Về lý thuyết ribozyme phân nhiều phân tử RNA đích Khi thâm phiên tử cắt nhiễm vectơ có chứa trình tự ribozyme tạo nhiều phiên phân tử ribozyme trị liệu tế bào đích Một chiến lược kháng virus khác lại sử dụng polypeptide mã không trội thiết kế để tương tác với phiên mã tự nhiên, mà ngăn chặn lắp ráp virus làm chức enzyme chúng 10 2.1.3 Tách chiết Ribozyme Ribozyme phân tử acid ribonucleic (RNA) có khả tác động enzyme vắng mặt hoàn toàn protein Chúng có hoạt tính xúc tác bẻ gẫy hình thành liên kết cộng hóa trị với tính đặc hiệu gia tăng tốc độ phản ứng cách phi thường Qua nguồn nguyên liệu động, thực vật từ chiết xuất chế phẩm enzyme, thấy hai nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất chế phẩm enzyme với quy mô lớn nhược điểm sau đây: - Chu kỳ sinh trưởng chúng dài - Nguồn nguyên liệu không cải tạo - Nhiều nguyên liệu dùng làm thực phẩm (dùng để ăn) dùng làm nguyên liệu để sản xuất với quy mô lớn chế phẩm enzyme nhằm thoả mãn nhu cầu kinh tế quốc dân Dùng vi sinh vật làm nguồn nguyên liệu để sản xuất chế phẩm enzyme có nhiều ưu điểm bật có tính chất độc đáo vượt xa so với nguồn nguyên liệu từ động vật, thực vật, khắc phục khó khăn hạn chế Trước hết vi sinh vật nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với số lượng lớn Đây nguồn nguyên liệu mà người chủ động tạo Chu kỳ sinh trưởng vi sinh vật ngắn (từ 16 - 100 giờ) nuôi cấy hàng trăm lần năm Enzyme vi sinh vật có hoạt tính mạnh, vượt xa sinh vật khác Vì cần lượng nhỏ enzyme chuyển hóa lượng lớn chất Số liệu tính toán cho biết, vòng 24 giờ, vi sinh vật có khả chuyển hóa lượng thức ăn gấp 30 - 40 lần so với trọng lượng thể chúng Trong đó, hệ enzyme lợn 50 kg chuyển hóa vài kg thức ăn ngày Hệ enzyme vi sinh vật vô phong phú Vi sinh vật có khả tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau, có enzyme động, thực vật không tổng hợp Ví dụ cellulase, raxemase Phần lớn thức ăn để nuôi vi sinh vật lại dễ kiếm giá rẻ Nhiều vi sinh vật cho enzyme thường có khả phát triển môi trường đơn giản, giá rẻ, dễ kiếm phế liệu ngành sản xuất Hơn nữa, dùng nguyên liệu thực phẩm, dung dịch muối vô để nuôi vi sinh vật Vì dùng vi sinh vật làm nguồn thu enzyme mang lại giá thành rẻ, thời gian nhanh hiệu kinh tế cao Vi sinh vật sinh sản phát triển với tốc độ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước bé, tỷ lệ enzyme tế bào tương đối lớn nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao Lượng enzyme sản xuất thời gian ngắn Đối với số trường hợp dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm nguồn enzyme Vi sinh vật nhạy cảm tác động môi trường, thành phần dinh dưỡng nuôi chúng số tác nhân lý hóa, học khác Do thay đổi điều kiện nuôi cấy để chọn giống tạo chủng đột biến cho ta hàm lượng enzyme đáng kể với hoạt tính xúc tác cao Có thể 11 nói rằng, nhờ nguồn enzyme vi sinh vật, người ta điều khiển tổng hợp enzyme dễ dàng nguồn nguyên liệu khác để tăng lượng enzyme tổng hợp tổng hợp định hướng enzyme Tuy trình chọn nguồn nguyên liệu từ vi sinh vật, cần lưu ý số vi sinh vật có khả sinh độc tố để có biện pháp xử lý thích hợp Nói chung vi sinh vật muốn sử dụng làm nguồn nguyên liệu tách enzyme cần phải thoả mãn điều kiện sau: - Khả tổng hợp enzyme mạnh thời gian ngắn - Dễ tách enzyme không sinh độc tố 2.1.4 Ứng dụng ribozyme Các ribozyme ứng dụng tác nhân kháng virus, dùng để điều trị ung thư rối loạn di truyền công cụ để làm sáng tỏ đường phê chuẩn đích Khởi đầu sử dụng ribozyme nhằm vào kháng virus, chủ yếu điều trị virus gây thiếu hụt miễn dịch người (HIV) Các virus mà tác động thông qua sản phẩm trung gian RNA hệ gen chu kỳ tái chúng HIV, virus gây viêm gan B, C đích hấp dẫn mẫu đơn ribozyme nhắm tới RNA hệ gen virus mRNA Ribozyme sử dụng rộng rãi gen tế bào đích bao hàm gen biểu cách lầm lạc ung thư Đích ribozyme tổng hợp bcr-abl kiến tạo từ nhiễm sắc thể Philadelphia liên quan tới bệnh bạch cầu dòng tuỷ mạn tính Đặc trưng nhiễm sắc thể chuyển vị (translation) biểu protein tổng hợp bcr-abl tải nạp Trong trường hợp này, ribozyme thiết kế để nhắm vào mRNA tổng hợp cách đặc hiệu nhắm vào bcr hay abl bình thường để ngăn chặn chức gen gây ung thư bcr-abl Khi đột biến codon 12 c-H-ras từ GGU thành GUU tạo nên vị trí cho phân cắt qua trung gian ribozyme đầu búa Một ribozyme biểu nội sinh nhắm vào đích có hiệu ứng ngăn ngừa hình thành tiêu điểm (focus formation) với khoảng 50% tế bào NIH3T3 thâm nhiễm với gen ras hoạt hóa Trái lại, tế bào biểu ribozyme tương tự lại thâm nhiễm với ras hoạt hóa có thay đổi codon vị trí 61 thay vị trí 12 không ngăn ngừa hình thành tiêu điểm Các ribozyme nhắm vào HER-2/neu biểu mức ung thư vú làm giảm đáng kể tạo u tế bào chuột Hơn nữa, để nhắm trực tiếp vào gen gây ung thư, ribozyme áp dụng cách gián tiếp với tư cách trị liệu kháng ung thư Chẳng hạn riobozyme nhắm vào gen kháng đa thuốc (multiple drug resistance gene 1) fos mRNA dòng tế bào ung thư tạo tế bào nhạy cảm với tác nhân hóa trị liệu Mặt khác, ribozyme nhắm vào bcl-2 làm bùng phát apoptosis tế bào ung thư vùng miệng Các yếu tố đòi hỏi cho di đích hấp dẫn cho ribozyme Các ribozyme nhắm mục tiêu chống lại CAPL/mts, metalloprotein gian bào (matrix), pleiotrophin VLA-6 integrin làm giảm tiềm di tế bào khối u cần lưu tâm Sự tạo mạch đích quan trọng cho gen 12 trị liệu ung thư trình ngăn chặn chuột ribozyme đích vào protein gắn yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi pleiotrophin Các trị liệu với sở ribozyme test động vật nhằm ức chế rối loạn tăng sinh khác tái hẹp động mạch vành Antitelomerase RNA ribozyme test để áp dụng gen trị liệu ung thư Dĩ nhiên việc sử dụng ribozyme tác nhân trị liệu cần có thay đổi phù hợp với loại ung thư 2.2 Ứng dụng y dược Enzyme có vị trí quan trọng y học Đặc biệt phương pháp định lượng định tính enzyme hóa học lâm sàng phòng thí nghiệm chẩn đoán Do đó, y học xuất lĩnh vực gọi chẩn đoán enzyme, có nhiệm vụ: - Phân tích xác định nồng độ chất glucose, ure, cholesterol… với hổ trợ enzyme - Xác định hoạt tính xúc tác enzyme mẫu sinh vật - Xác định nồng độ chất với hổ trợ thuốc thử enzyme đánh dấu Dùng enzyme để định lượng chất, phục vụ công việc xét nghiệm chẩn đoán bệnh, ví dụ dùng để kiểm tra glucose nước tiểu nhạy Urease để định lượng ure… Dùng enzyme làm thuốc ví dụ protease làm thuốc tắc nghẽn tim mạch, tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm, làm thuốc tăng tiêu hóa protein, thành phần loại thuốc dùng da liễu mỹ phẩm… Trong y học protease dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi sinh vật sản xuất kháng sinh, chất kháng độc… Ngoài người ta dùng enzyme protease để cô đặc tinh chế huyết kháng độc để chửa bệnh Amylase sử dụng phối hợp với coenzyme A, cytocrom C, ATP, carboxylase để chế thuốc điều trị bệnh tim mạch, bệnh thần kinh, phối hợp với enzyme thủy phân để chữa bệnh thiếu enzyme tiêu hóa 2.3 Ứng dụng hóa học Cho đến nay, việc ứng dụng enzyme hóa học enzyme có cảm ứng cao nhiệt độ, pH thay đổi khác môi trường Một ứng dụng chế phẩm enzyme đáng ý thời gian gần dùng chất mang để gắn phức enzyme xúc tác cho phản ứng nhiều bước Ví dụ tổng hợp glutathion, acid béo, alcaloid, sản xuất hormone…Cũng cách tạo phức, người ta gắn vi sinh vật để sử dụng công nghệ xử lý nước thải, sản xuất alcohol, amino acid… Trong nghiên cứu cấu trúc hóa học, người ta sử dụng enzyme, ví dụ dùng protease để nghiên cứu cấu trúc protein, dùng endonuclease để nghiên cứu cấu trúc nucleic acid… 13 Dùng làm thuốc thử hóa phân tích 2.4 Ứng dụng công nghiệp Việc sử dụng enzyme công nghiệp đa dạng, phong phú đạt nhiều kết to lớn Thử nhìn thống kê sơ sau lĩnh vực dùng protease ta thấy đa dạng: công nghiệp thịt, công nghiệp chế biến cá,công nghiệp chế biến sữa, công nghiệp bánh mì, bánh kẹo, công nghiệp bia, công nghiệp sản xuất sữa khô bột trứng, công nghiệp hương phẩm mỹ phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp da, công nghiệp phim ảnh, công nghiệp y học…Với amylase, dùng sản xuất bánh mì, công nghiệp bánh kẹo, công nghiệp rượu, sản xuất bia, sản xuất mật,glucose, sản xuất sản phẩm rau, chế biến thức ăn cho trẻ con, sản xuất mặt hàng từ quả, sản xuất nước ngọt, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy…Trong phạm vi giáo trình đề cập đến việc ứng dụng chế phẩm enzyme số lĩnh vực 2.5 Ứng dụng công nghiệp thực phẩm Protease với công nghiệp thực phẩm: Việc sử dụng chế biến làm mềm thịt ứng dụng có tính truyền thống Nhân dân ta từ lâu dùng thơm để nấu canh thịt bò; dùng rau sống chuối chát, vả kết hợp thức ăn nhiều thịt; đu đủ chống táo bón…mà thực chất sử dụng papain, bromelain, fixin Người Nga dùng protease từ hạt đậu tương mầm để làm mềm thịt Ngoài khả phân giải để làm mềm thịt, tạo thức ăn dễ tiêu hóa, công nghệ sản xuất loại dịch thủy phân giàu protein áp dụng cách có hiệu tính protease Enzyme công cụ để chế biến phế liệu công nghiệp thực phẩm thành thức ăn cho người vật nuôi Người ta khai thác tính đông tụ renin, pepsin vào công nghiệp thực phẩm sản xuất phomat Pectinase với công nghiệp thực phẩm: Pectinase dùng số ngành công nghiệp thực phẩm sau: - Sản xuất rượu vang Sản xuất nước nước uống rượu Sản xuất mặt hàng từ quả: cô đặc, mứt Sản xuất nước giải khát Sản xuất cà phê Chế phẩm pectinase sử dụng sản xuất nước từ nguyên liệu nghiền hay để làm nước ép Bởi có pectin khối nghiền có trạng thái keo, ép dịch không thóat Nhờ pectinase mà nước suốt, dễ lọc, hiệu suất tăng Pectinase góp phần chiết rút chất màu, tanin chất hòa tan khác, làm tăng chất lượng thành phẩm Những nghiên cứu ép nho có xử lý pectinase làm tăng hiệu suất mà làm tăng màu sắc Trong sản xuất mứt nhừ, mứt đông… nhờ pectinase mà dịch có nồng độ đậm đặc 14 Cellulase với công nghiệp thực phẩm: Cellulose thành phần tế bào thực vật, có mặt loại rau nguyên liệu, phế liệu ngành trồng trọt lâm nghiệp Nhưng người động vật khả phân giải cellulose Nó có giá trị làm tăng tiêu hóa, với lượng lớn trở nên vô ích hay cản trở tiêu hóa Chế phẩm cellulase thường dùng để: - Tăng chất lượng thực phẩm thức ăn gia súc - Tăng hiệu suất trích ly chất từ nguyên liệu thực vật Ứng dụng trước tiên cellulase chế biến thực phẩm dùng để tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất vị làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật Đặc biệt thức ăn cho trẻ nói chung chất lượng thực phẩm tăng lên Một số nước dùng cellulase để xử lý loại rau bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo lương thực gạo Người ta xử lý chè, loại tảo biển… Trong sản xuất bia, tác dụng cellulase hay phức hệ citase có cellulase, thành tế bào hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động protease đường hóa Trong sản xuất agar-agar, tác dụng chế phẩm cellulase làm tăng chất lượng agar-agar so với phương pháp dùng acid để phá thành tế bào Đặc biệt việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu phế liệu thực vật đem thủy phân, dùng làm thức ăn gia súc công nghệ lên men Những ứng dụng cellulase công nghiệp thực phẩm có kết tốt Tuy nhiên hạn chế lớn khó thu chế phẩm có cellulase hoạt độ cao Amylase với công nghiệp thực phẩm: Chế phẩm amylase dùng phổ biến số lĩnh vực công nghiệp thực phẩm sản xuất bánh mì, glucose, rượu, bia Trong sản xuất bánh mì, chế phẩm amylase làm thay đổi hoàn tòan chất lượng bánh mì hương vị, màu sắc, độ xốp Chế phẩm amylase cho chất lượng bánh mì tốt dạng phức hợp với protease Trong sản xuất bánh kẹo người ta thường dùng maltose sản phẩm thủy phân tinh bột amylase glucose glucoamylase Chính glucoamylase, yếu tố làm tăng hiệu suất sản xuất rượu Trong sản xuất bia, viêc sử dụng amylase có hạt nẩy mầm thay lúa mạch (malt) góp phần đáng kể việc giảm giá thành 2.6 Ứng dụng công nghiệp dệt Trong công nghiệp dệt, chế phẩm amylase dùng để rũ hồ vải trước tẩy trắng nhuộm Amylase có tác dụng làm vải mềm, có khả nhúng ướt, tẩy trắng bắt màu tốt Rũ hồ enzyme nhanh, không hại vải, độ mao dẫn tốt mà đảm bảo vệ sinh, tăng suất lao động 15 Trong sản xuất tơ tằm, người ta dùng protease để làm sợi tơ Với công đoạn xử lý enzyme sau xử lý dung dịch xà phòng giúp lụa có tính đàn hồi tốt, bắt màu đồng dễ trang trí lụa 2.7 Ứng dụng công nghiệp thuộc da Trong công nghiệp da, enzyme protease dùng để làm mềm da, làm da, rút ngắn thời gian, tránh ô nhiễm môi trường Việc xử lý tiến hành cách ngâm da dung dịch enzyme, hay phết dịch enzyme lên bề mặt da Enzyme tách chất nhờn làm đứt số liên kết phân tử collagen làm cho da mềm Thực tế cho thấy xử lý da chế phẩm protease từ vi sinh vật rút ngắn thời gian làm mềm tách lông xuống nhiều lần Điều quan trọng chất lượng lông tốt cắt So với phương pháp hóa học việc xử lý enzyme có số lượng lông tăng 20-30% Lông không cần xử lý thêm sau ngâm dịch enzyme 2.8 Ứng dụng nông nghiệp Có thể sử dụng loại chế phẩm enzyme khác để chuyển hóa phế liệu, đặc biệt phế liệu nông nghiệp cải tạo đất phục vụ nông nghiệp Ở Nhật năm sản xuất hàng vạn chế phẩm cellulase loại để dùng nông nghiệp Có chế phẩm chứa cellulase, hemicellulase, protease amylase Công nghệ phổ biến nhiều quốc gia Ở nước ta việc dùng enzyme vi sinh vật góp phần sản xuất phân hữu khai thác để thay cho phân hóa học Tóm lại, nói rằng, việc nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme ngày trọng lĩnh vực khác Trong 20 năm cuối kỷ XX năm đầu kỷ XXI enzyme khác ứng dụng Ở Việt Nam bước đầu có nhiều nghiên cứu ứng dụng enzyme chế biến nông sản, thực phẩm, lĩnh vực sản xuất bia, rượu, chế biến tinh bột (Viện công nghiệp thực phẩm, Viện công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà Nội…) Việc nghiên cứu enzyme phục vụ nông nghiệp, công nghiệp quan tâm có kết đáng khích lệ Ví dụ, chế phẩm enzyme đời phục vụ nông nghiệp E2001 có tác dụng tăng độ phì nhiêu đất, tăng suất trồng Đã có nghiên cứu ứng dụng protease sản xuất rượu bia, rút ngắn thời kỳ lên men sản xuất nước mắm ngắn ngày công nghệ enzyme protease Enzyme amylase nghiên cứu ứng dụng rộng rãi sản xuất đường bột, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose – fructose quy mô công nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Hữu Chấn, 1983 Enzyme xúc tác Sinh học Nxb Y học, Hà Nội Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng, 2000 Hóa sinh học Nxb Giáo dục, Hà Nội Đỗ Ngọc Liên, Phạm Thị Trân Châu, 1972 Enzyme I, II Đại học Tổng hợp, Hà Nội 16 Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên, 1998 Giáo trình sinh hóa đại Nxb Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Xuân Thắng, Đào Kim Chi, Phạm Quang Tùng, Nguyễn Văn Đồng, 2004 Hóa sinh học Nxb Y học, Hà Nội Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng, 1982 Enzyme vi sinh vật Nxb KH&KT, Hà Nội Lê Ngọc Tú (chủ biên), Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẫn, Lê Doãn Diên, 2000 Hóa sinh Công nghiệp, Nxb KH&KT, Hà Nội Phan Tường Lộc, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Thị Thanh, 2012 Biểu gen HIV-1 p24 thuốc chuyển gen lục lạp Viện sinh học nhiệt đới – Viện khoa học công nghệ Việt Nam Tài liệu tiếng Anh Eur J Biochem 271, 1015–1024 (2004) © FEBS 2004 Hydrolytic cleavage by a group I intron ribozyme is dependent on RNA structures not important for splicing 17 [...]... Amylase được sử dụng phối hợp với coenzyme A, cytocrom C, ATP, carboxylase để chế thuốc điều trị bệnh tim mạch, bệnh thần kinh, phối hợp với enzyme thủy phân để chữa bệnh thiếu enzyme tiêu hóa 2.3 Ứng dụng trong hóa học Cho đến nay, việc ứng dụng enzyme trong hóa học là do enzyme có cảm ứng cao đối với nhiệt độ, pH và những thay đổi khác của môi trường Một trong những ứng dụng chế phẩm enzyme đáng được... nguồn nguyên liệu từ vi sinh vật, cần lưu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố để có biện pháp xử lý thích hợp Nói chung các vi sinh vật muốn được sử dụng làm nguồn nguyên liệu tách enzyme cần phải thoả mãn các điều kiện sau: - Khả năng tổng hợp enzyme mạnh trong một thời gian ngắn - Dễ tách enzyme và không sinh độc tố 2.1.4 Ứng dụng của ribozyme Các ribozyme được ứng dụng như các tác nhân kháng... chất Số liệu tính toán cho biết, trong vòng 24 giờ, vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một lượng thức ăn gấp 30 - 40 lần so với trọng lượng cơ thể chúng Trong khi đó, hệ enzyme của con lợn trên 50 kg chỉ có thể chuyển hóa được vài kg thức ăn trong ngày Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú Vi sinh vật có khả năng tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau, trong đó có những enzyme ở động, thực vật không tổng... chế các rối loạn tăng sinh khác như tái hẹp động mạch vành Antitelomerase RNA ribozyme cũng được test để áp dụng trong gen trị liệu ung thư Dĩ nhiên việc sử dụng ribozyme như các tác nhân trị liệu cần có sự thay đổi phù hợp với từng loại ung thư 2.2 Ứng dụng trong y dược Enzyme có một vị trí quan trọng trong y học Đặc biệt là các phương pháp định lượng và định tính enzyme trong hóa học lâm sàng và phòng... chế phẩm protease từ vi sinh vật có thể rút ngắn thời gian làm mềm và tách lông xuống nhiều lần Điều quan trọng là chất lượng lông tốt hơn khi cắt So với phương pháp hóa học thì việc xử lý bằng enzyme có số lượng lông tăng 20-30% Lông không cần xử lý thêm sau khi ngâm trong dịch enzyme 2.8 Ứng dụng trong nông nghiệp Có thể sử dụng các loại chế phẩm enzyme khác nhau để chuyển hóa các phế liệu, đặc biệt... ở trên Trước hết vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với số lượng lớn Đây cũng là nguồn nguyên liệu mà con người chủ động tạo ra được Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (từ 16 - 100 giờ) vì vậy có thể nuôi cấy hàng trăm lần trong năm Enzyme vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác Vì vậy chỉ cần một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ... phẩm enzyme đáng được chú ý nhất trong thời gian gần đây là dùng chất mang để gắn phức enzyme xúc tác cho phản ứng nhiều bước Ví dụ tổng hợp glutathion, acid béo, alcaloid, sản xuất hormone…Cũng bằng cách tạo phức, người ta gắn vi sinh vật để sử dụng trong công nghệ xử lý nước thải, sản xuất alcohol, amino acid… Trong nghiên cứu cấu trúc hóa học, người ta cũng sử dụng enzyme, ví dụ dùng protease để nghiên... hợp với protease Trong sản xuất bánh kẹo người ta thường dùng maltose là sản phẩm thủy phân tinh bột bằng amylase và glucose bằng glucoamylase Chính glucoamylase, là yếu tố làm tăng hiệu suất trong sản xuất rượu Trong sản xuất bia, viêc sử dụng amylase có trong các hạt nẩy mầm thay thế lúa mạch (malt) đã góp phần đáng kể trong việc giảm giá thành 2.6 Ứng dụng trong công nghiệp dệt Trong công nghiệp... màu đồng đều và dễ trang trí trên lụa 2.7 Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da Trong công nghiệp da, enzyme protease được dùng để làm mềm da, làm sạch da, rút ngắn thời gian, tránh ô nhiễm môi trường Việc xử lý đã được tiến hành bằng cách ngâm da trong dung dịch enzyme, hay phết dịch enzyme lên bề mặt da Enzyme sẽ tách các chất nhờn và làm đứt một số liên kết trong phân tử collagen làm cho da mềm hơn... kinh tế cao Vi sinh vật sinh sản phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao Lượng enzyme có thể được sản xuất ra trong một thời gian ngắn Đối với một số trường hợp có thể dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm nguồn enzyme Vi sinh vật rất nhạy cảm đối