Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương BÀI : CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT I Khái niệm : Phân lập vi sinh vật trình tách riêng loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu đưa dạng khiết Đây khâu có ý nghĩa quan trọng việc nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật Vi sinh vật dạng khiết giống vi sinh vật đươc tạo từ tế bào ban đầu - Trong thiên nhiên vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác Muốn nghiên cứu hình thái, sinh lý, lý hoá sử dụng vào thực tiễn loài cần phải đưa chúng dạng khiết - Nguyên tắc: Tách rời tế bào vi sinh vật; Nuôi cấy tế bào môi trường dinh dưỡng đặc trưng khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt II Phương pháp phân lập vi sinh vật khiết: Quá trình phân lập vi sinh vật dạng khiết: Với hầu hết loại mẫu nghiên cứu, trình phân lập vi sinh vật dạng khiết gồm bước sau: - Tạo khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu - Phân lập vi sinh vật khiết - Kiểm tra độ tinh khiết khuẩn lạc 2.1 Tạo khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật môi trường phân lập a Yêu cầu: - Nếu mẫu ban đầu dạng rắn phải đưa dạng lỏng cách: + Nghiền mẫu + Hoà tan mẫu nước cất vô trùng Sau thực mẫu dạng lỏng + Tiếp tục pha loãng nồng độ cần thiết + Cấy mẫu môi trường đặc trưng - Để có chủng thuần, cần tiến hành lặp lại nhiều lần kỹ thuật pha loãng nêu tất khuẩn lạc xuất môi trường đồng Mức độ khiết chủng kiểm tra sau: 37 Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương - Việc tạo hộp ria từ khuẩn lạc đơn chủng tạo loại khuẩn lạc bề mặt môi trường có hình thái giống với khuẩn lạc chủng ban đầu - Mỗi khuẩn lạc đơn chứa loại tế bào có hình thái giống quan sát kính hiển vi Trong thao tác tạo khuẩn lạc đơn cần lưu ý hạn chế thấp nguy bị nhiễm cách thực nghiêm túc yêu cầu thao tác vô trùng b Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn: - Có nhiều kỹ thuật ria khác để thực hộp ria tạo khuẩn lạc đơn Một số kỹ thuật ria thường dùng: kỹ thuật ria chữ T , kỹ thuật ria bốn góc , kỹ thuật ria tia ,kỹ thuật ria liên tục - Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn thực sau: Kỹ thuật hộp ria: - Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu giống - Ria đường đĩa pêtri chứa môi trường thích hợp (ria chữ T ria bốn góc) Sau đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy làm nguội trước thực đường ria - Bao gói đĩa pêtri, ủ nhiệt độ thời gian thích hợp tủ ấm Kỹ thuật hộp trải: - Dùng pipetman đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường đĩa pêtri - Nhúng đầu gạt (que trải) thuỷ tinh vào cồn 700, hơ qua lửa để khử trùng Để đầu gạt nguội không gian vô trùng lửa - Mở đĩa pêtri, đặt nhẹ nhàng gạt lên bề mặt thạch đĩa petri Dùng đầu gạt xoay, trải dịch giống lên bề mặt thạch Trong trải, thực xoay đĩa vài lần, lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho gạt trải dịch giống khắp bề mặt môi trường - Rút gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, gói ủ nhiệt độ thời gian thích hợp tủ ấm Kỹ thuật hộp đổ: - Dùng pipetman đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển m dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường đĩa pêtri 38 Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương - Đổ khoảng 15 - 20 ml môi trường đun chảy để nguộ đến 45 - 550C vào đĩa petri cấy mẫu - Xoay nhẹ đia petri chiều ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống trộn môi trường cấy - Đậy nắp đĩa pêtri, để đông tự nhiên 2.2 Phân lập vi sinh vật môi trường đặc đĩa pêtri a Phân lập vi sinh vật hiếu khí: + Hút 0,1 ml dịch mẫu pha loãng cho vào đĩa pêtri có môi trường thích hợp + Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải khắp mặt thạch + Tiếp tục sử dụng que gạt gạt mẫu cho khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ đĩa thứ + Đặt đĩa pêtri 1, 2, vào tủ ấm nhiệt độ thích hợp sau thời gian định tuỳ giống vi sinh vật ta nhận khuẩn lạc riêng rẽ từ đĩa thứ b Phân lập vi sinh vật kị khí: + Dùng môi trường đặc ống nghiệm đem chưng cách thuỷ để loại bỏ không khí môi trường + Để nguội môi trường 45 - 50 0C + Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống môi trường, đậy nút lại, lắc tròn quanh trục ống nghiệm + Rót nhanh môi trường ống nghiệm vào nắp đĩa pêtri đậy thật nhanh nắp lại, cho mặt nắp môi trường không không khí + Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc nắp đĩa petri ủ nhiệt độ thích hợp + Sau vi sinh vật phát triển, chọn khuẩn lạc riêng rẽ khối môi trường, dùng que cấy cắt khối môi trường cấy vào môi trường lỏng thích hợp 2.3 Kiểm tra độ tinh khiết giống phân lập Có nhiều cách kiểm tra: Kiểm tra vết cấy: Quan sát sinh trưởng vi sinh vật qua vết cấy môi trường đặc + Nếu vết cấy có bề mặt màu sắc đồng đều, chứng tỏ giống phân lập tinh khiết giữ lại 39 Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương + Nếu vết cấy không loại bỏ Kiểm tra lại độ chủng loại khuẩn lạc: + Chọn khuẩn lạc riêng rẽ môi trường thạch nghiêng + Tách khuẩn lạc hoà tan, pha loãng nồng độ cần thiết nước cất vô trùng + Nhỏ giọt dịch vào đĩa pêtri có môi trường + Dùng que gạt phân phối giọt dịch khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ nhất, đĩa thứ 2, thứ + Đặt đĩa pêtri vào tủ ấm với nhiệt độ thời gian thích hợp tuỳ loại vi sinh vật + Sau lấy quan sát khuẩn lạc riêng rẽ Sự khiết khuẩn lạc biểu khiết giống III 3.1 Thực hành phân lập vi sinh vật từ loại canh trường khác Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis: - Cỏ khô cắt nhỏ, cho vào bình tam giác - Bổ sung thêm: + Một chút phân + Nước đổ ngập cỏ - Đun sôi 15 phút để diệt tế bào sinh dưỡng tế bào không sinh bào tử - Đậy nút bông, để tủ ấm nhiệt độ 25 - 26 0C 48 - 72 h - Kết quả: + Xuất lớp váng xám có nhiều vi khuẩn Bacillus sublitis cỏ khô có bào tử vi khuẩn + Soi kính hiển vi : Tế bào Bac sublitis có hình que, dài, bào tử hình ôvan nằm xa tâm hay gắn tâm khuẩn lạc Tế bào có kích thước (3 - x 0,6) µm 3.2 Phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus niger Mucor: - Có thể phân lập loài nấm mốc cơm nguội, xôi làm mốc tương, bánh mì để khô ngày - Thông qua màu sắc mốc để nhận diện + Mốc có màu trắng: Có thể Mucor hay Rhizopus + Mốc có màu đen Aspergillus niger + Mốc có màu xanh lục Penicillium italicum Loại mốc thường có vỏ cam, chanh để lâu ngày 40 Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương - Dùng que cấy đầu hình thước thợ lấy sợi nấm cấy vào môi trường thạch nghiêng thích hợp (Czapek) 3.3 Phân lập nấm men: - Có thể phân lập nấm men dễ dàng từ môi trường như: + Bề mặt trái dịch ép số trái táo, lê, nho, dâu, mơ, dứa, + Trong rượu nếp, bánh men rượu, bia, nước mía, hạt kêphia - Nấm men quan sát kính hiển vi thường có dạng hình cầu hay hình trứng Tế bào có kích thước lớn, có khả nảy chồi Khuẩn lạc cho màu trắng sữa - Chọn khuẩn lạc nấm men riêng rẽ cấy vào môi trường thích hợp ng khoai tây - đường cám hay môi trường Sabouraud) 41