Nghiên cứu tăng khả năng sinh tổng hợp kháng sinh DIHYDROCHAL COMYCIN của chủng xạ khuẩn STREPTOMYCES SP KCTC 0041BP

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “ NGHIÊN CỨU TĂNG KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH DIHYDROCHALCOMYCIN CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES SP.KCTC 0041BP” Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực Lớp Khóa : ThS Nguyễn Thị Ngọc Anh : Nguyễn Thị Hoa : KSCNSH – 1102 : 18 Hà Nội – 2015 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP-2015 NGUYỄN THỊ HOA- LỚP1102 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Nguyễn Thị Ngọc Anh tận tình hướng dẫn, truyền thụ cho em kiến thức chuyên môn vô quý báu lòng nhiệt tình suốt trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn TS Tạ Thị Thu Thủy – Chủ nhiệm khoa Công Nghệ Sinh Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội, toàn thể thầy cô giáo, anh chị kĩ thuật viên bạn sinh viên Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử bên cạnh động viên, khích lệ, ủng hộ em suốt thời gian học tập nghiên cứu Em xin cảm ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội tận tình dạy dỗ cho em kiến thức đồng thời giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình , bạn bè, người bên cạnh động viên, khích lệ, giúp đỡ em suốt thời gian học tập nghiên cứu Do thời gian khả thân hạn chế, khóa luận em không tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận bảo thầy cô đóng góp ý kiến bạn để khóa luận em đầy đủ hoàn chỉnh Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Hoa KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP-2015 NGUYỄN THỊ HOA- LỚP1102 MỤC LỤC MỞ ĐẦU………………………………………………………………… ….1 PHẦN 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH 1.1.1 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH 1.1.2 ĐỊNH NGHĨA VỀ KHÁNG SINH 1.1.3 PHÂN LOẠI KHÁNG SINH 1.1.4 CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA KHÁNG SINH 1.1.5 CÁC NGHIÊN CỨU GẦN ĐÂY VỀ KHÁNG SINH 1.1.6 KHÁNG SINH DYHYDROCHALCOMYCIN 1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN 15 1.2.1 CÁC ĐẶC ĐIỂM CHUNG VÀ VAI TR̉ CỦA XẠ KHUẨN TRONG TỰ NHIÊN 15 1.2.2 CẤU TẠO CỦA XẠ KHUẨN 17 1.2.3 SỰ H̀ NH THÀNH CHẤT KHÁNG SINH Ở XẠ KHUẨN 20 1.2.4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN 21 1.2.5 CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES SP.KCTC4001 BP 22 1.3 ĐỘT BIẾN TĂNG KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH Ở VI SINH VẬT 24 1.3.1 MỤC ĐÍCH 24 1.3.2 ĐỘT BIẾN NHÂN TẠO BẰNG TÁC NHÂN VẬT LÍ 24 1.3.3 ĐỘT BIẾN NHÂN TẠO BẰNG TÁC NHÂN HÓA HỌC 25 1.3.4 MỘT SỐ THÀNH TỰU ỨNG DỤNG ĐỘT BIẾN GEN TĂNG KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH Ở VI SINH VẬT 25 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 27 2.1.1 CÁC CHỦNG GIỐNG VI SINH VẬT 27 2.1.2 HÓA CHẤT, DỤN CỤ VÀ THIẾT BỊ 27 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.2.1 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY CÁC CHỦNG VI SINH VẬT 29 2.2.2 PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN GIỐNG 31 2.2.3 PHƯƠNG PHÁP GÂY ĐỘT BIẾN XẠ KHUẨN BẰNG TIA UV 32 2.2.4 PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN XẠ KHUẨN BẰNG HÓA CHẤT MNNG 34 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP-2015 NGUYỄN THỊ HOA- LỚP1102 2.2.5 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG SINH 37 2.2.6 TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG SINH 39 PHẦN KẾT QUẢ 41 3.1 NGHIÊN CỨU TẠO VÀ LỰA CHỌN CHỦNG ĐỘT BIẾN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CAO BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN ( XỬ LÝ UV/ HÓA CHẤT 41 3.1.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN BẰNG UV 41 3.1.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN TĂNG KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH BẰNG XỬ LÝ VỚI MNNG 42 3.2 SO SÁNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES SP.KCTC0041 BP TỰ NHIÊN VỚI ĐỘT BIẾN 43 3.2.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC 43 3.2.2 KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH 45 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 48 4.1 KẾT LUẬN 48 4.2 ĐỀ XUẤT 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP-2015 NGUYỄN THỊ HOA- LỚP1102 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Axit Deoxyribonucleic ARN Axit Ribonucleic CKS Chất kháng sinh D Đường kính trung bình vòng vô khuẩn tính theo milimet Gram (-) Gram dương Gram (+) Gram âm H Giờ HSCC Hệ sợi chất HSKS Hế sợi khí sinh ISP2 The International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces quốc tế) LB Luria Bertani MNNG N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin NST Nhiễm sắc thể Nu Nucleotit S Độ lệch thực nghiệm hiệu chỉnh (độ lệch chuẩn) v/p Vòng/phút VSV Vi sinh vật XK Xạ khuẩn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP-2015 NGUYỄN THỊ HOA- LỚP1102 DANH MỤC CÁC BẢNG STT Bảng 1.1 Nội dung Dự đoán chức gen ORFs nhóm gen sinh tổng hợp dihydrochalcomycin Bảng 2.1 Dụng cụ, thiết bị dùng đề tài Trang 11 28 Ảnh hưởng thời gian chiếu UV đến khả sinh trưởng Bảng 3.1 sinh kháng sinh chủng Steptomyces spKCTC 0041 BP 41 tự nhiên Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ MNNG đến khả sinh trưởng sinh kháng sinh chủng Steptomyces sp KCTC 0041 BP 43 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP-2015 NGUYỄN THỊ HOA- LỚP1102 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Nội dung Trang Hình 1.1 Cơ chế tác dụng kháng sinh Hình 1.2 Công thức cấu tạo hóa học Dihydrochalcomycin Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Hình 1.6 Hình 1.7 Dự đoán đường sinh tổng hợp gốc đường khử bước cuối hoàn thành cấu trúc kháng sinh Dihydrochalcomycin Khuẩn lạc, khuẩn ty bào tử xạ khuẩn Khuẩn lạc chủng Streptomyces sp KCTC 0041 BP môi trường ISP2 Hình ảnh bào tử chủng Streptomyces sp KCTC 0041 BP Hình dạng KTKS KTCC chủng Streptomyces sp KCTC 0041 BP 13 18 23 23 24 Hình 2.1 Tác dụng gây đột biến tia UV 33 Hình 2.2 Công thức cấu tạo MNNG 35 Hình 2.3 Tác dụng gây đột biến MNNG 35 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Đĩa xạ khuẩn sau đột biến đĩa sàng lọc xạ khuẩn sau đột biến Khuẩn lạc chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041 BP đột biến Màu sắc dịch nuôi chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041 BP đột biến Kết thử hoạt tính kháng sinh phương pháp đục lỗ thạch chủng U-M1(1) chủng U-M8(2) 42 44 45 46 Kết thử hoạt tính kháng sinh khoanh giấy lọc Hình 3.5 chủng Streptomyces sp KCTC 0041 BP tự nhiên(1), chủng U-M1(2), chủng U-M8(3), methanol(4) 46 MỞ ĐẦU Thuốc kháng sinh đột phá lớn y học đại đầu kỉ 20 Nhờ loại thần dược mà nhiều bệnh vi sinh vật gây kiểm soát cách hữu hiệu Tuy nhiên, ngày y học lo ngại trước gia tăng không ngừng tượng kháng thuốc nhiều loài vi sinh vật Những loại kháng sinh thời gian trước xem vị cứu tinh ngày tỏ không hiệu chữa trị Kho tàng thuốc kháng sinh ngày trở nên hạn hẹp khan Tốc độ phát triển loại kháng sinh kháng loại vi sinh vật gây bệnh bắt kịp sức tăng trưởng biến đổi mầm bệnh kháng thuốc Hiện tượng kháng kháng sinh trở thành vấn đề mang tính toàn cầu đặc biệt trội nước phát triển Với gánh nặng bệnh nhiễm khuẩn chi phí có liên quan việc chữa trị trở thành gánh nặng lớn bệnh nhân Chính vậy, song sng với việc sử dụng thuốc kháng sinh cách hợp lý người bệnh việc nghiên cứu, phát triển ứng dụng sản xuất loại kháng sinh nghĩa vụ trách nghiệm nhà khoa học giới Từ phương pháp tạo kháng sinh tổng hợp bán tổng hợp công nghệ vi sinh sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò Trong 10.000 chất kháng sinh tìm có khoảng 2.000 chất thực vật tạo ra, khoảng 8.000 chất kháng sinh vi sinh vật tổng hợp, xạ khuẩn tổng hợp 80%.Kháng sinh Dihydrochalcomycin kháng sinh mới, xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP sản xuất nhà khoa học quan tâm Kháng sinh Dihydrochalcomycin kháng sinh thuộc nhóm Macrolide, có 16 cacbon, kháng sinh ngoại bào tử từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP Kháng sinh có hoạt tính chống lại vi khuẩn Gram (+) mạnh, có vai trò ứng dụng quan trọng nghiên cứu lâm sàng, có ưu điểm vượt trội vs kháng sinh Macrolide 12 14 cacbon chưa có tượng kháng thuốc vi khuẩn phản ứng phụ đối tượng điều trị Tuy nhiên, khả sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn tự nhiên chưa cao, cần có biện pháp cải thiện suất nhằm thu hàm lượng sinh kháng sinh cao Vì nhóm nghiên cứu thực đề tài: “Nghiên cứu tăng khả sinh tổng hợp kháng sinh Dihydrochalcomycin chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP ” * Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu tạo chủng chủng Streptomyces sp KCTC0041 BP đột biến gen phương pháp chiếu tia UV sử dụng hóa chất MNNG từ chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao, có nhiều ứng dụng thực tế * Nội dung nghiên cứu: - Tạo chủng đột biến phương pháp chiếu trực tiếp tia UV lên tế bào xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041 BP tự nhiên - Sử dụng chủng đột biến UV tiếp tục làm tăng khả sinh kháng sinh hóa chất MNNG - Sàng lọc lựa chọn chủng đột biến có khả sinh kháng sinh cao chủng tự nhiên - So sánh đặc điểm sinh học khả sinh kháng sinh chủng tự nhiên chủng đột biến PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan kháng sinh 1.1.1 Lịch sử kháng sinh Năm 1928, nhà sinh vật học người Anh, Alexander Fleming nghiên cứu tụ cầu ống thấy xung quanh khuẩn lạc mốc xanh nhiễm vào hộp petri nuôi tụ cầu tạo thành vòng vô khuẩn Hiện tượng kì lạ Fleming nghiên cứu, phân lập khiết xác định mốc xanh Penicillium Notatum – chủng tạo Penicillin Năm 1938, Fleming nhận thư hai nhà khoa học từ trường Đại học Oxford Ernst Boris Chain Howard Walter Florey, với lời đề nghị hợp tác với ông để tiếp tục thực công trình nghiên cứu penicillin họ thử nghiệm thành công penicillin chuột vào 1940 Năm 1941, nhóm chọn loại nấm Penicillium ưu việt chủng Penicillum chrysogenium, chế loại penicillin có hoạt tính cao triệu lần penicillin Fleming tìm thấy lần đầu năm 1928 Năm 1945, Fleming giải thưởng Nobel y học với Ernst Boris Chain Howard Walter Florey Một số kháng sinh khác: sulfornamid Gerhard Domard (Đức) tìm vào năm 1932 streptomycin Selman Waksman Albert Schat tìm vào năm 1934 Sau đặc biệt hai thập kỷ cuối kỷ XX, công nghệ sinh học hóa dược phát triển mạnh, người ta tìm nhiều loại kháng sinh Ngày người biết khoảng 8000 chất kháng sinh khác có nguồn gốc từ nấm mốc, xạ khuẩn vi khuẩn, 100 loại dùng Y khoa Thú y 1.1.2 Định nghĩa kháng sinh Thời kì vàng son kháng sinh sản xuất penicillin để dùng lâm sàng (1941) Khi người ta định nghĩa:" Kháng sinh sản phẩm trao đổi chất tự nhiên vi sinh vật tiết (vi khuẩn, vi nấm), có tác dụng ức chế phát triển tiêu diệt chọn lọc vi sinh vật khác", theo Waksman1942 đặcbằng 3% Dùng micropipet lấy dịch nuôi VSV cho vào môi trường LB đặc, lắc đổ đĩa petri với thể tích 20 ml/đĩa + Tiến hành kiểm tra hoạt tính kháng sinh: Tùy theo mục đích mà ta tiến hành sử dụngmột phương pháp sau đây: - Phương pháp đục giếng thạch (Phương pháp khuếch tán dịch nuôi) Đục giếng nhỏ đĩa thạch rắn có chứa VSV kiểm định Dùng micropipet lấy khoảng 500 µl dịch nuôi xạ khuẩn từ môi trường NDYE ly tâm vào giếng nuôi từ 18 ÷ 24 điều kiện thích hợp với VSV kiểm định - Phương pháp kiểm tra hoạt tính khoanh giấy lọc Đối với phương pháp này, ta sử dụng mẫu thử kháng sinh thô Cắt khoanh giấy lọc có đường kính 6mm, nhỏ 10 µl mẫu thử lên, sấy khô tiếp tục tra mẫu làm lần liên tiếp Sau đặt khoanh giấy lên bề mặt môi trường chứa VSV kiểm định Nuôi cấy hộp petri có chứa mẫu thử điều kiện thích hợp khoảng 18 ÷ 24 Đánh giá hoạt lực kháng sinh dựa vào đường kính vòng vô khuẩn + Đánh giá hoạt lực kháng sinh Ta sử dụng tổng hợp phương pháp sau đây: - Phương pháp đo vòng vô khuẩn: Để đo vòng vô khuẩn sử dụng thước kẹp milimet thước đo milimet thông thường - Phương pháp xử lý thống kê: Đánh giá kết dựa vào đường kính vòng vô khuẩn tính theo công thức: D : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn n ∑D i D= Di : Đường kính vòng vô khuẩn lần đo thứ i (i= 1÷ n) i =1 n S= ∑ (D − D ) i n S: Độ lệch chuẩn n: Số lần thí nghiệm lặp lại 38 2.2.6 Phương pháp tách chiết kháng sinh thô Phần lớn chủng sinh kháng sinh tiết môi trường xung quanh, có số chủng tiết phần vào môi trường chủ yếu nằm sinh khối Tuy nhiên có chủng, chất kháng sinh tích tụ sinh khối Để lựa chọn phương pháp tách chiết chất kháng sinh phù hợp phải dựa vào chất hóa học chất kháng sinh Các chất kháng sinh tan nước dung môi hữu Đối với chất tan dung môi hữu dễ tinh so với tan nước Thông thường, kháng sinh nằm dịch nuôi cấy lựa chọn phương pháp: chiết rút dung môi không hỗn hợp với nước, kết tủa thành dạng hợp chất không hòa tan hấp phụ nhựa trao đổi ion, chất kháng sinh nằm sinh khối tế bào chiết rút dung môi hữu Trước tiến hành chiết rút kháng sinh khỏi môi trường nuôi cấy, phải loại sinh khối tế bào khỏi dịch nuôi phương pháp lọc hay ly tâm Khi sử dụng phương pháp lọc để loại sinh khối, pH dịch nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến việc chất kháng sinh môi trường nhiều hay tích tụ sinh khối nhiều Đối với dịch lên men có độ nhớt cao thường gây khó khăn cho trình lọc, để khắc phục, người ta thường bổ sung số chất trợ lọc giúp cho trình lọc diễn tốt Phương pháp ly tâm loại sinh khối mà loại bỏ chất lợi khỏi dịch nuôi cấy Do Dihydrochalcomycin kháng sinh ngoại bào nên nhóm nghiên cứu tìm hiểu kĩ phương pháp tách chiết kháng sinh từ dịch lọc Để tách thu nhận kháng sinh thô với quy mô phòng thí nghiệm nhóm nghiên cứu sử dụng dung môi Ethylacetat Bước 1: Thu dịch nuôi môi trường R2YE Bước 2: Ly tâm nhiệt độ phòng 10 phút với tốc độ 6000 v/p, 4oC để loại bỏ sinh khối tế bào Bước 3: Thu dịch nuôi bổ sung dung môi Ethylacetat: dịch nuôi theo tỉ lệ50:50 Bước 4: Lắc hỗn hợp 1-2 28oC 39 Bước 5: Ly tâm hỗn hợp nhiệt độ 4oC,10 phút với tốc độ 6000 v/p để tạo phân lớp phần dịch có chứa kháng sinh dung môi Bước 6: Loại lớp dịch đục bên trên, thu lớp dịch phía bao gồm dung môi kháng sinh Dyhydrochalcomycin hòa tan Bước 7: Quay khô chân không để thu kháng sinh thô Bước 8: Hòa tan kháng sinh 1,5ml Metanol bảo quản 40C 40 PHẦN KẾT QUẢ 3.1 Nghiên cứu tạo lựa chọn chủng đột biến có khả sinh tổng hợp kháng sinh cao phương pháp đột biến (xử lý UV/ hóa chất) 3.1.1 Kết nghiên cứu tạo chủng đột biến phương pháp chiếu tia UV Tiến hành thử nghiệm lấy 100ml dịch nuôi xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041 BP pha loãng đến nồng độ 10-3 chang đĩa R2YE Sau chiếu UV lên tế bào với mức thời gian chiếu UV khác từ 45s đến 135s Sau chiếu UV nuôi tủ ấm 280C 4÷ ngày lựa chọn tế bào sinh kháng sinh Qua trình sàng lọc lựa chọn chủng tiềm sau chiếu tia UV dựa vào quan sát đặc điểm thay đổi màu sắc khuẩn lạc Hầu hết khuẩn lạc sống sót có màu nhạt, khuẩn lạc bị giảm mạnh không khả sinh kháng sinh Một số khuẩn lạc có màu nâu đậm nâu đen, sậm màu so với khuẩn lạc chủng tự nhiên dự đoán khuẩn lạc tiềm cho khả sinh kháng sinh cao Lựa chọn tế bào có màu nâu đen, sậm màu tiến hành sàng lọc để chọn chủng đột biến có khả sinh kháng sinh cao để tiếp tục làm đột biến hóa chất MNNG, kết thu bảng 3.1 Bảng 3.1.Ảnh hưởng thời gian chiếu UV đến khả sinh trưởng sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces spKCTC0041 BP tự nhiên Đường kính vòng vô khuẩn Thời gian Tỷ lệ sống sót (%) (giây) D (mm) 45 51.28% 18.1 60 36.2% 20.3 75 16.7% 21.1 90 10.9% 24.3 105 8.8% 27.2 120 3.5% 25.1 135 0 41 Kết từ bảng 3.1 cho thấy khả sống sót chủng Streptomyces sp KCTC 0041 BP giảm dần tăng thời gian chiếu UV từ 51.28% (ở thời gian chiếu xạ 45s) xuống 0% (ở thời gian chiếu xạ 135s) Đường kính vòng vô khuẩn đạt giá trị lớn thời gian chiếu 105s ( D=27.2 mm) Như ta chọn chủng đột biến UV105 để tiếp tục thực đột biến chủng hóa chất MNNG 3.1.2 Kết nghiên cứu tạo chủng đột biến tăng khả sinh kháng sinh xửa lý với MNNG Tiến hành thử nghiệm xử lý tế bào chủng đột biến UV105 lựa chọn thí nghiệm với nồng độ MNNG khác từ 0,5mg/ml đến nồng độ 3mg/ml Sau nuôi MNNG tế bào tách khỏi MNNG nuôi cấy đĩa thạch R2YE để lựa chọn tế bào sinh kháng sinh Kết thu xác định phương pháp đo đường kính vòng vô khuẩn với VSV kiểm định B.subtilis Cụ thể ta tiến hành sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh hình 3.1 Các khuẩn lạc có màu nâu đen, đậm màu sau đột biến ( Hình 3.1-A) lựa chọn cấy ria đĩa thạch, nuôi 280C 72 ( đủ thời gian để chúng phát triển sinh kháng sinh), sau kiểm tra hoạt tính kháng sinh đo đường kính vòng vô khuẩn với VSV kiểm định B subtilis ( Hình 3.1-B), khuẩn lạc cho đường kính vòng vô khuẩn lớn chọn lọc cấy ria đĩa thạch R2YE khác ( hình 3.1-C), phục vụ cho nghiên cứu Hình 3.1.Đĩa xạ khuấn sau đột biến đĩa sàng lọc xạ khuẩn sau đột biến Đối với mốc thời gian nghiên cứu, ta tiến hành sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh mô tả trên, thu kết bảng 3.2 42 Bảng 3.2: Ảnh hưởng nồng độ MNNG đến khả sinh kháng sinh sinh trưởng chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC BP sau đột biến UV Nồng độ chất gây đột biến (mg/ml) Tỷ lệ sống sót (%) Đường kính vòng vô khuẩn D (mm) 0,5 70.4% 7.4 1,0 55.3% 15.6 1,5 37.8% 27.3 2,0 18.8% 30.7 2,5 10.5% 28.7 3,0 4.6% 21.3 Kết cho thấy nồng độ MNNG có ảnh hưởng lớn đến khả sống sót sinh kháng sinh Streptomyces sp KCTC 0041 BP Khi nồng độ MNNG tăng tỉ lệ sống sót tế bào giảm dần từ 70.4%đến 4.6% , đường kính vòng vô khuẩn trung bình tăng dần đạt giá trị lớn nồng độ MNNG mg/ml ( D = 30.7 mm) Tại nồng độ MNNG mg/ml, lựa chọn khuẩn lạc có khả sinh kháng sinh có hoạt tính cao U-M1 U-M8 để tiếp tục nuôi cấy thực thí nghiệm 3.2 So sánh số đặc điểm chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.KCTC 0041BP tự nhiên với chủng Streptomyces sp.KCTC 0041BP đột biến Các chủng lựa chọn Strptomyces sp U-M U-M8 đem nuôi cấy môi trường R2YE khảo sát số đặc điểm như: đặc điểm sinh học khả tạo kháng sinh chủng so với chủng tự nhiên ban đầu 3.2.1 Đặc điểm sinh học Về hình thái khuẩn lạc chủng tự nhiên chủng đột biến khác Khuẩn lạc mọc bám sâu vào bề mặt thạch khô, hình dạng khuẩn lạc hình tròn hình bầu dục, có bề mặt xù xì, độ dày khuẩn lạc Về màu sắc khuẩn ty: Quan sát sau ngày nuôi cấy, thời gian chủng trưởng thành, màu sắc khuẩn lạc chủng bắt đầu xuất màu nâu đen Điều chứng tỏ trình trao đổi chất để tạo thành kháng sinh sản phẩm 43 trung gian bậc bắt đầu Thấy chủng đột biến cho màu nâu đen đậm hẳn so với chủng tự nhiên Chứng tỏ hình thành sản phẩm bậc kháng sinh chủng đột biến mạnh so với chủng tự nhiên Về khả sống: Khi nuôi môi trường dịch lỏng môi trường đĩa thạch R2YE, tế bào xạ khuẩn đột biến phát triển chậm so với chủng tự nhiên khoảng 10-12h Về khả hình thành bào tử: Các khuẩn lạc chủng đột biến khó khả hình thành bảo tử Đặc biệt môi trường nghèo dinh dưỡng ISP2 chúng khả hình thành bào tử sau khoảng tuần khuẩn lạc khô lại mà không thấy xuất bào tử Hình 3.2: Khuẩn lạc chủng Strepcomyces sp KCTC 0041 BP đột biến đĩa môi trường R2YE 44 Hình 3.3: Màu sắc dịch nuôi chủng xạ khuẩnstreptomyces sp KCTC 0041BP đột biến môi trường R2YE sau ngày nuôi cấy Chủng xạ khuẩn đột biến nuôi cấy môi trường R2YE dạng lỏng với điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ nuôi cấy 28oC, nuôi lắc với tốc độ 150 v/p khảo sát điều kiện tương tự Streptomyces sp KCTC 0041 BP tự nhiên Ta thấy rằng, sau ngày nuôi cấy dịch nuôi môi trường R2YE có màu nâu nhạt Sau ngày nuôi cấy sản phẩm trao đổi chất nội bào tiết môi trường tạo nên màu đen đặc trưng dịch nuôi Kết thu hoàn toàn tương đồng với chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041 BP tự nhiên 3.2.2 Khả sinh kháng sinh Các khuẩn lạc đột biến lựa chọn nuôi môi trường tạo sản phẩm R2YE, với dịch lỏng nuôi lắc điều kiện 28oC, 250 vòng/ phút, 4-5 ngày Sau tiến hành tách kháng sinh từ dịch nuôi để tiến hành thử hoạt tính kháng sinh chủng đột biến phương pháp khoanh giấy lọc phương pháp đục lỗ thạch 45 Hình 3.4 Kết thử hoạt tính kháng sinh đục lỗ thạch chủng U-M1(1), U-M8(2) Hình 3.5: Kết thử hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces sp KCTC 0041 BP tự nhiên (1) chủng đột biến U-M1 (2) , U-M8(3), Methanol (4) 46 Kết kiểm tra hoạt tính cho thấy, đường kính vòng vô khuẩn chủng sau đột biến có chênh lệch nhiều so với chủng trước đột biến Do kết luận khả sinh kháng sinh chủng đột biến ( D = 30.7 mm) vượt trội nhiều lần so với chủng tự nhiên ban đầu ( D = 25.5 mm) Điều sơ kết luận chủng đột biến U-M1 U-M8 tạo thành từ xử lý hóa chất MNNG kết hợp UV có khả sinh tổng hợp kháng sinh dyhirochacomycin cao so với chủng tự nhiên lựa chọn để làm chủng cho nghiên cứu để phát triển thành chủng sản xuất 47 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 KẾT LUẬN Các kết luận rút từ kết nghiên cứu đề tài trình bày sau: Chọn chủng Streptomyces sp KCTC 0041 BP đột biến sau gây đột biến chủng Streptomyces sp KCTC 0041 BP tự nhiên UV thời gian chiếu 105s UV105 cho đường kính vòng vô khuẩn D = 27.2 mm Chọn chủng đột biến U-M1 U-M8 sau đột biến MNNG nồng độ 2mg/ml, cho đường kính vòng vô khuẩn trung bình là: D = 30.7 mm cao chủng tự nhiên So sánh đặc điểm sinh học (hình thái khuẩn lạc, màu sắc khuẩn ty, thời gian hình thành bào tử…), hoạt tính kháng khuẩn chủng đột biến với chủng Streptomyces sp KCTC 0041 BP tự nhiên Đặc biệt khả sinh kháng sinh chủng đột biến ( D = 30.7 mm)cao so với chủng tự nhiên ban đầu ( D = 25.5 mm) 1.2 Đề xuất Do thời gian thực đề tài hạn chế nên chưa sâu nghiên cứu hết vấn đề liên quan đến chủng đột biến nên em đề xuất số kiến nghị nhằm mục đích mở rộng đề tài nghiên cứu sau: - Tiếp tục nghiên cứu để cải tạo, nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces sp KCTC 0041 BP - Nghiên cứu phương pháp tinh chế sản phẩm Dihydrochalcomycin để phục vụ cho nghiên cứu - Tiếp tục phân tích sản phẩm sau đột biến 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO A TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Biền Văn Minh (2000), Nghiên cứu khả sinh chất kháng sinh số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội Bùi Thị Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh CKS chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 2006 Cao Văn Thu, Bài giảng kháng sinh Vitamin, Bộ môn Công nghiệp Dược, Đại học Dược Hà Nội, 2000 Hưng, TV, Malla, S., Park, BC, Liou, K., Lee, HC, Sohng, JK (2007) J Microbiol Công nghệ sinh., 17, 1538-1545 Lê Gia Hy, Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh CKS chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 1994 Nguyễn Hoàng Chiến , Nghiên cứu chủng xạ khuẩn Streptomyces V6 sinh CKS chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh cà chua, Luận văn thạc sĩ sinh học, Hà Nội, 2000 Nguyễn Khang, Kháng sinh học ứng dụng, Nhà xuất y học Hà Nội,Trang 7-20, 2005 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứuvi sinh vật học, Tập I, NXBKHKT Hà Nội, 328 – 345 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo Dục, Hà Nội, tr 39 – 41 10 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Nữ Kim Thảo, Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, Vietsciences, 15/02/2006 11 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học - Tập III, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội 49 12 Nguyễn Thành Đạt, K.A Vinogradva V.A.Poltorac (1974), Tính biến dị bề mặt bào tử Xạ khuẩn sinh choromomycin, Act.A buraviensis,microbiologia, TXL III, N5, NXB Academia cccp 13 Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men chất kháng sinh, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội 14 Vi Thị Đoan Chính (2000), Nghiên cứu khả nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces rimosus R77 Streptomyces hygroscopicus 5820 kỹ thuật dung hợp tế bào trần, Luận án TSsinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội B TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 15 Arcamone F, Cassinelli G, Fantini G, et al.(1969) "Adriamycin, 14hydroxydaunomycin, a new antitumor antibiotic from S peucetiusvar caesius" Biotechnol Bioeng11 (6): 1101–10 16 Demain A.L.A - Fang (1995) "Emerging concept of secondary metabolism in actinomycetes", J Actinomycetologica, 9, 98 – 117 17 Demain A.L.A (1974), "How antibiotic - producing microorganism avoid suicide" Annuals of the New York academy of science, 235, 601-602 18 Di Marco A, Gaetani M, Scarpinato B (February 1969) "Adriamycin (NSC123,127): a new antibiotic with antitumor activity" Cancer Chemother Rep53 (1): 33–7 19 Dickens ML, Strohl WR (1996) "Isolation and characterization of a gene from Streptomyces sp strain C5 that confers the ability to convert daunomycin to doxorubicin on Streptomyces lividans TK24" J Bacteriol.178 (11): 3389–95 20 FoARNri FA, Randolph JK, Yalowich JC, Ritke MK, Gewirtz DA (April 1994) "Interference by doxorubicin with DNA unwinding in MCF-7 breast tumor cells" Mol Pharmacol45 (4): 649–56 21 Frederick C.A , Williams L D , Ughetto G , van der Marel G A., van Boom J H., Rich A.,Wang , A.H., (1990) Structure, Comparison of Anticancer Drug-DNA Complexes: Adriamycin Biochemistry, 29, 2538-2549 22 Goldat S iu., 1958, Antibiotiki, N4, p.14-18 50 and Daunomycin 23 Jongsik Chun, Seung B.K, youn Kyung Oh, Goodfellow M (1999), "Amycolatopsis thermoflava sp.nov, anovel soil actinomycete from Hainan Island, China", Int J, Syst Bacteriol - 49, 1369 – 1373 24 Lomovskaya N, Otten SL, Doi-Katayama Y, et al.(1999) "Doxorubicin overproduction in Streptomyces peucetius: cloning and characterization of the dnrU ketoreductase and dnrV genes and the doxA cytochrome P-450 hydroxylase geneJ Bacteriol.181 (1): 305–18 25 Mason M.G., Ball A.S., Reeder B.J., Silkstone G., Nicholls P., Wilson M.T (2001), “Extracellular heme peroxidases in actinomycetes: a case of mistaken identity”, Appl Environ Microbiol, 67, pp 4512-4519 26 Miyadoh S (2001), Identification manual of Actinomycetes, Business Center for Academic Scieties Japan 27 Momparler RL, Karon M, Siegel SE, Avila F (August 1976) "Effect of adriamycin on DNA, RNA, and protein synthesis in cell-free systems and intact cells" Cancer Res36 (8): 2891–5 28 Pasti M B., Pometto A P., Nuti M P., Crawford D.L (1990),“Ligninsolubilizing ability of actinomycetes isolated from termite (Termitidae) gutt”, Appl Environ Microbiol,pp 2213-2218 29 Robert D Nolan, Thomas C (1988), "Isolation and Screeming of Actinomycetes" In Actinomycetes in Biotechnology, Academic Press, London 30 Tan C, Tasaka H, Yu KP, Murphy ML, Karnofsky DA (March 1967) "Daunomycin, an antitumor antibiotic, in the treatment of neoplastic disease Clinical evaluation with special reference to childhood leukemia" Cancer20 (3): 333–53 31 Waksman, S A (1961) The Actinomycetes Classification, identification DNA descriptions of genra ADN species, vol 2, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA 32 Weinberrg E.D (1973), Secondary metabolism Control by temperature and inorganic photphate, Ind Microbiol 15, – 14 51 C TÀI LIỆU WEBSITE 33 http://en.wikipedia.org/wiki/Actinobacteria 34 http://en.wikipedia.org/wiki/Doxorubicin 35 http://en.wikipedia.org/wiki/Methylnitronitrosoguanidine 36 http://neurolex.org/wiki/Category:Doxorubicin 37 http://science.howstuffworks.com/question479.htm 38 http://vi.wikipedia.org/wiki/Sắc_kí_lớp_mỏng 39 http://vi.wikipedia.org/wiki/Tử_ngoại 40 http://www.case.vn/vi-VN/87/88/117/details.case 41 http://www.khoahoc.com.vn/doisong/ung-dung/5463_Nam-kho-bao-vebong-khoi-nam-gay-benh.aspx 42 http://www.sciencefoto.de/detail.php?id=214660&rubrik=Bio&lang=en&q= &qrubrik= 43 http://www.voer.edu.vn/module/khoa-hoc-va-cong-nghe/xac-dinh-su-sinhtruong-cua-vi-sinh-vat.html 52 [...]... Omethyltransferase của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP bằng phương pháp tiếp hợp Trong kết quả nghiên cứu này đã chứng minh được chức năng của gen gerMI trong con đường sinh tổng hợp kháng sinh dihydrochalcomycin của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP Chức năng của gen gerMI là mã hóa sinh tổng hợp enzyme O-methyltransferase, xúc tác phản ứng methyl hóa nhóm -OH tại vị trí 14 C3 của đường... Xạ khuẩn Streptomycessp KCTC 0041BP sinh kháng sinh có khả năng ức chế vi khuẩn Gr+ và vi khuẩn Gr- Tuy nhiên, kháng sinh này có khả năng ức chế cao hơn đối với vi khuẩn Gr+ Điều này được giải thích bởi vi khuẩn Gr- có lớp thành tế bào dày và nhiều lớp hơn so với vi khuẩn Gr+, vì vậy chúng ít chịu ảnh hưởng bởi kháng sinh hơn Trong các vi khuẩn Gr+ được nghiên cứu, khả năng ức chế vi sinh vật của xạ. .. công Bước đầu chứng minh được chức năng của gen ger MIII trong con đường sinh tổng hợp kháng sinh dihydrochalcomycin của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP 1.2 Đại cương về xạ khuẩn 1.2.1 Các đặc điểm chung và vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên Xạ khuẩn là một nhóm VSV rất đa dạng trong đó đa số sinh trưởng hiếu khí và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm Xạ khuẩn có danh pháp khoa học là:... sinh vật của xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP lên vi khuẩn Bacillus 22 cereus là lớn nhất (D = 21,33 mm), tiếp theo là vi khuẩn Bacillussubtilis (D = 19,50 mm)[6] Hình 1.5: Khuẩn lạc của chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP trên môi trường ISP2 Hình 1.6.Hình dạng bào tử của chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP (× 5.000-50.000) 23 Hình 1.7.Hình dạng KTKS và KTCC của chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP (× 3.000... PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, thiết bị và hóa chất 2.1.1 Các chủng vi sinh vật - Xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP Chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP được phân lập tại Hàn Quốc do khoa Hóa học trường Đại học Sun Moon – Hàn Quốc cung cấp Đây là chủng hoang dại sản sinh ra kháng sinh dihydrochalcomycin, được dùng làm tế bào thể nhận trong tiếp hợp gen - Vi khuẩn Bacillus subtilis Chủng Bacillus... các kháng sinh không bị ảnh hưởng bởi cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn và từ đó nghiên cứu và phát triển nhóm kháng sinh polyketide synthase (PKS) thế hệ mới 1.1.6.1 Cấu trúc của Dihydrochalcomycin Dihydrochalcomycin thuộc nhóm kháng sinh macrolide 16C, là sản phẩm trao đổi bậc 2 của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP, được tách chiết lần đầu tiên và xác định cấu trúc năm 1996 - Về cấu tạo, Dihydrochalcomycin... là chất dẫn của kháng sinh chalcomycin đã được xác định trước đó bởi nhóm nghiên cứu khác [14], [19] Mặc dù toàn bộ cơ chế tác dụng của dihydrochalcomycin chưa được nghiên cứu hoàn toàn đầy đủ nhưng một số nghiên cứu đã khẳng định hoạt tính sinh học của dihydrochalcomycin hoàn toàn tương tự như hoạt tính của kháng sinh chalcomycin và mycinamycin[17] Nghiên cứu về cấu trúc tinh thể phóng xạ để xác định... 1.2: Cấu trúc của Dihydrochalcomycin 1.1.6.2 Vai trò và hoạt tính sinh học Qua nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng, kháng sinh dihydrochalcomycin đã biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh có thể ức chế và tiêu diệt cả vi khuẩn Gr9 và Gr+ Chủng xạ khuẩn tạo ra dihydrochalcomycin đã được phân lập, đồng thời cấu trúc hóa học của chúng cũng được xác định bởi nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc, kháng sinh này được... tra sản phẩm kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP Nhóm đã bước đầu tách chiết thành công AND tổng số của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP sau đột biến Đã sàng lọc được các chủng M3-110, M3-8-21, M3-3-13 có xảy ra quá trình trao đổi chéo kép làm mất gen gerMIII bằng phản ứng nhân gen PCR thành công với các cặp mồi đặc hiệu Giải trình tự gen chứng minh chủng xạ khuẩn đã đột... tương tự khi gây đột biến ở chủng xạ khuẩn Streptomyces globisboris (chủng tổng hợp ra Streptomycin), từ chủng tự nhiênban đầu chỉ có năng xuất 30mg/l, qua chọn lọc đột biến đã nâng năng xuất của chủng lên hơn 100 lần so với chủng ban đầu Những kết quả này là tiền đề để cho những nghiên cứu tiếp theo và mở ra một hướng mới trong việc nâng cao khả năng sinh tổng hợp CKS của xạ khuẩn bằng phương pháp đột