Tinh chế protein dung hợp SUMO INTERLEUKIN 11 người tái tổ hợp được biểu hiện trong chủng ESCHERICHIA COLI

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TINH CHẾ PROTEIN DUNG HỢP SUMO INTERLEUKIN-11 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP ĐƯỢC BIỂU HIỆN TRONG CHỦNG ESCHERICHIA COLI Cán hướng dẫn : TS Lê Thị Thu Hồng Sinh viên thực : Phùng Thị Trang Lớp : 11-04 Hà Nội - 2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến người hướng dẫn, giúp đỡ tận tình em hoàn thành luận văn này: TS Lê Thị Thu Hồng, phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học hướng dẫn hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt trình thực đề tài tốt nghiệp Nội dung khóa luận phần nội dung đề tài khoa học công nghệ cấp nhà nước “Nghiên cứu sản xuất Interleukin-3 Interleukin-11 tái tổ hợp chất lượng cao dùng y học (điều trị)” GS.TS Trương Nam Hai làm chủ nhiệm Với tình cảm chân thành, em xin cảm ơn hướng dẫn giúp đỡ toàn thể cán phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, đặc biệt ThS Dương Thu Hương, NCS Nguyễn Thị Quý KS Đặng Thị Ngọc Hà, người hướng dẫn, hỗ trợ bảo nhiệt tình chuyên môn kĩ suốt trình em hoàn thành khóa luận Em xin bày tỏ biết ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội truyền đạt cho em kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt bốn năm học tập trường Lời cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn cha mẹ, người thân gia đình, bạn bè thân thiết, người giúp đỡ, ủng hộ em suốt thời gian học tập làm việc vừa qua Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Phùng Thị Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v MỞ ĐẦU PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Interleukin 11 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Đặc tính phân tử cấu trúc Interleukin 11 1.1.3 Vai trò ứng dụng IL-11 1.1.4 Tình hình nghiên cứu nước 1.2 Hệ biểu E coli 1.2.1 Chủng biểu E coli 1.2.2 Vector biểu E coli 1.2.3 Kỹ thuật cải thiện biểu protein tái tổ hợp 10 1.3 Các kỹ thuật tinh chế protein 12 1.3.1 Kỹ thuật tinh chế protein tủa muối 12 1.3.2 Kỹ thuật tinh chế protein sắc ký lực 13 1.3.3 Kỹ thuật tinh chế protein sắc ký trao đổi ion 15 1.3.4 Kỹ thuật tinh chế protein sắc lý lọc gel 15 PHẦN VẬT LIỆU, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 17 2.1.1 Các chủng vi sinh vật plasmid 17 2.1.2 Hóa chất enzyme 17 2.1.3 Các môi trường dung dịch 17 i 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Biến nạp ADN plasmid vào tế bào E coli tái tổ hợp sốc nhiệt 19 2.2.2 Cảm ứng biểu protein tái tổ hợp 20 2.2.3 Phương pháp siêu âm phá tế bào E coli tái tổ hợp 21 2.2.4 Phương pháp tinh chế sắc kí lực 22 2.2.5 Phương pháp tinh chế tủa phân đoạn (NH4)2SO4 22 2.2.6 Điện di protein gel Polyacrylamide 23 2.2.7 Phương pháp lai Western blot 24 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Biểu SUMO_IL-11 chủng E coli Rosetta2 26 3.1.1 Tạo chủng E coli Rosetta2 mang vector biểu pESUMO_il-11 26 3.1.2 Biểu SUMO_IL-11 tái tổ hợp chủng E coli R2 27 3.2 Tách chiết SUMO_IL-11 tái tổ hợp từ tế bào E coli 30 3.3 Tinh protein tái tổ hợp SUMO_IL-11 33 3.3.1 Tinh protein tái tổ hợp SUMO_IL-11 sắc ký lực 33 3.3.2 Tiếp tục tinh SUMO_IL-11 tủa phân đoạn muối (NH4)2SO4 40 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 4.1 Kết luận 42 4.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Axit deoxyribo nucleic APS Amonium persulphate Amp Ampicillin Bp Base pair EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid E coli Escherichia coli TEMED N, N, N’, N’ – tetramethyl ethylendiamine dNTP 2’ – deoxyribonucleoside – 5’triphosphate IL-11 Interleukin-11 IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kDa Kilo Dalton SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate-PolyAcrylamid Gel Electrophoresis OD Optical density PBS Phosphate buffer saline LB Môi trường Luria-Bertani LBA Môi trường LB có bổ sung Amp iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Một số chủng E coli thường sử dụng để biểu protein ngoại lai đặc điểm chúng [12] Bảng Thành phần gel điện di biến tính SDS-PAGE 18 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Mô cấu trúc không gian IL-11 Hình 2: Đĩa biến nạp vector pESUMO_il-11vào tế bào E coli R2 26 Hình SDS-PAGE kiểm tra kết biểu SUMO_IL-11 tế bào E coli R2 28 Hình Western blot kết biểu SUMO_IL-11 tế bào E coli R2 29 Hình SDS-PAGE kiểm tra kết mẫu phá tế bào E coli tái tổ hợp biểu SUMO_IL-11 30 Hình SDS-PAGE kiểm tra mẫu phá tế bào siêu âm với số xung khác 31 Hình SDS-PAGE kiểm tra mẫu tế bào phá siêu âm lặp lại 32 Hình SDS_PAGE kiểm tra kết khảo sát tinh SUMO_IL-11 sắc ký lực 34 Hình SDS-PAGE kiểm tra kết tinh SUMO_IL-11 sắc ký lực sử dụng đệm đưa mẫu lên cột chứa 20 mM PBS, 300 mM NaCl 35 Hình 10 SDS-PAGE kiểm tra kết tinh SUMO_IL-11 sắc ký lực sử dụng đệm đưa mẫu lên cột chứa 50 mM PBS, 500 mM NaCl 36 Hình 11 SDS-PAGE kiểm tra kết tinh SUMO_IL-11 sắc ký lực với thể tích đệm rửa 10 CV 37 Hình 12 SDS-PAGE kiểm tra kết tinh SUMO_IL-11 sắc ký lực với thể tích đệm rửa CV 38 Hình 13 Sắc ký đồ kết tinh SUMO_IL-11 cột sắc ký lực His-tag 50 ml 39 Hình 14 SDS – PAGE kiểm tra kết tinh SUMO_IL-11 cột sắc ký lực 50 ml40 Hình 15 SDS-PAGE kiểm tra khả loại protein tạp khỏi SUMO_IL-11 phương pháp tủa phân đoạn ammonium sulphate 41 v MỞ ĐẦU Các yếu tố tăng trưởng tạo máu có vai trò điều khiển điều hòa trình tạo tế bào máu Chúng tham gia vào trình tăng sinh biệt hóa, từ tế bào tiền thân tủy xương đến hình thành tế bào máu trưởng thành Với vai trò vậy, yếu tố tăng trưởng hữu ích để ứng dụng hỗ trợ điều trị bệnh máu Trong năm gần đây, bệnh máu nói chung đặc biệt bệnh hệ thống tạo máu có xu hướng gia tăng mạnh mẽ Do đó, việc nghiên cứu vai trò khả ứng dụng yếu tố hỗ trợ điều trị bệnh ngày quan tâm Interleukin-11 người có chất protein biết tới cytokine tạo máu Nó yếu tố sinh trưởng tế bào nguồn u tương bào, tế bào tạo máu tiềm năng, nguyên mẫu tiểu cầu, đại thực bào Sau đó, biết có vai trò ức chế chứng phát phì với tiền tế bào mỡ Chính vậy, IL-11 có tên gọi khác yếu tố ức chế chứng phát phì (AGIF) Ngoài ra, nghiên cứu tế bào học mô học IL-11 có hoạt tính bảo vệ hồi phục màng nhày hệ tiêu hóa Như vậy, có tác động tác nhân điều biến miễn dịch hay tham gia vào hoạt động trao đổi chất xương Công nghệ sinh học ngày phát triển, công nghệ DNA tái tổ hợp giúp tạo sản phẩm ứng dụng điều trị IL-11 người tái tổ hợp (rhIL-11) số sản phẩm IL quan Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Mỹ cấp phép cho sử dụng để điều trị người Tên thương mại cấp phép cho loại rhIL-11 NEUMEGA công ty Wyeth định cho mục đích cảm ứng sinh tiểu cầu để bảo vệ bệnh nhân trước sau hóa trị liệu Sinh phẩm cung cấp số hãng dược phẩm Pfizer, Biocompare, Millipore… Hiện nay, nước ta chưa sản xuất IL-11 Các sản phẩm IL-11 phải nhập với chi phí đắt đỏ, khó khăn việc chi trả kinh phí nhiều đối tượng bệnh nhân Vì vậy, để chủ động nguồn nguyên liệu nước giảm giá thành sản phẩm IL-11, Viện Công nghệ sinh học nhà nước đầu tư cho chủ trì đề tài “Nghiên cứu sản xuất Interleukin-3 Interleukin-11 tái tổ hợp chất lượng cao dùng y học (điều trị)” Trong đó, nghiên cứu tinh chế protein dung hợp SUMO Interleukin-11 người tái tổ hợp biểu Escherichia coli nội dung quan trọng nghiên cứu sản xuất IL-11 tái tổ hợp hỗ trợ điều trị bệnh máu Tôi hướng dẫn thực nội dung cho khóa luận tốt nghiệp với tên đề tài khóa luận “Tinh chế protein dung hợp SUMO Interleukin-11 người tái tổ hợp biểu chủng Escherichia coli” Các thí nghiệm tiến hành Phòng Kỹ thuật di truyền – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Thời gian thực đề tài tốt nghiệp từ tháng năm 2014 đến tháng năm 2015 Mục tiêu đề tài tinh chế thành công protein dung hợp SUMO_IL-11 người tái tổ hợp tế bào vi khuẩn E coli, tạo sở cho việc nghiên cứu sản xuất IL-11 tái tổ hợp hỗ trợ điều trị bệnh máu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Interleukin 11 1.1.1 Giới thiệu chung Nhóm Interleukin – IL với chức điều hòa phản ứng miễn dịch phức tạp bao gồm tăng sinh, trưởng thành, di chuyển bám dính tế bào Chúng đóng vai trò quan trọng trình biệt hoạt hoạt hóa tế bào miễn dịch, tế bào phản ứng viêm Khi tạo ra, IL di chuyển đến tế bào đích bám vào thụ thể đặc hiệu bề mặt tế bào Sự tương tác tạo nên chuỗi tín hiệu bên tế bào đích giúp thay đổi trạng thái tế bào IL xác định vào năm 1970, phát 37 loại IL khác [1] Nhóm bao gồm IL-1 có chức hoạt hóa tế bào T; IL2 kích thích tăng sinh tế bào T hoạt hóa kháng nguyên tế bào B; IFNγ hoạt hóa đại thực bào; IL-3, IL-11 có vai trò việc hoạt hóa trình tạo máu IL-11 dạng cytokine, tách triết vào năm 1990 từ tủy xương tế bào mô đệm Nó nhân tố quan trọng trình tạo máu, đặc biệt kích thích trưởng thành megakaryocyte [2] Ngoài biết tới yếu tố hòa tan với tham gia chất cảm ứng IL-1α dòng tế bào đệm tủy xương, PU-34 IL-11 giúp trình nuôi cấy tế bào [3] giúp kích thích tăng trưởng tế bào tủy xương trưởng thành tiểu cầu (một loại tế bào giúp cho máu đông lại sau chấn thương xảy ra)[4] 1.1.2 Đặc tính phân tử cấu trúc Interleukin 11 Trong thể người, gen hoàn chỉnh mã hóa cho IL-11 có kích thước khoảng kb, định vị cánh dài nhiễm sắc thể số 19, vị trí 19q13.3-q13.4 Gen chứa vùng exon vùng intron [3] Một điểm đặc biệt IL-11 nằm họ IL-6 trình tự DNA gen il-11 lại tương đồng cấp độ nucleotide [4] IL-11 gắn vào thụ thể IL-11R thông qua việc hình thành phức hợp hexameric gồm hai phân tử il-11 130gp [6] Cảm ứng IL-11 biểu mRNA có Từ kết này, lựa chọn siêu âm 40 xung cho lượng thể tích mẫu dịch tế bào E coli nghiên cứu để thu hồi protein SUMO_IL-11 từ tế bào E coli R2 tái tổ hợp từ dịch sau lên men Sau đó, tiếp tục khảo sát số lần lặp lại phương pháp siêu âm Toàn dịch tế bào phá siêu âm với 20 xung Mẫu thu lại cách ly tâm Phần cặn tế bào hòa lại với đệm tiếp tục siêu âm lần hai thêm 20 xung Các mẫu pha tan cặn sau lần siêu âm điện di biến tính gel để đánh giá hiệu phá tế bào Hình SDS-PAGE kiểm tra mẫu tế bào phá siêu âm lặp lại M: thang protein chuẩn; TS: protein tổng số; T: pha tan; C: pha cặn Hình cho thấy sau 20 xung siêu âm đầu tiên, phần lớn protein SUMO_IL11 nằm pha tan, thể băng protein đậm kích thước 36 kDa đường chạy T Tuy nhiên phần nằm pha cặn (đường chạy C, 20 xung lần 1) chứng tỏ lượng tế bào mẫu chưa phá vỡ hoàn toàn Tuy nhiên sau thu riêng lượng protein tan tiếp tục siêu âm lần hai với lượng tế bào lại chưa bị phá vỡ (pha cặn từ lần siêu âm thứ nhất), protein tiếp tục giải phóng khỏi tế bào bị phá vỡ tiếp tục thu thêm protein đích nằm pha tan, pha cặn lượng nhỏ thể băng 32 protein mờ mảnh Như trình siêu âm lặp lại hai lần giúp việc phá tế bào triệt để hơn, đồng nghĩa với việc thu protein đích nhiều Tóm lại, lựa chọn điều kiện siêu âm phá tế bào thích hợp siêu âm lặp lại hai lần với tổng 40 xung cho 500 µl mẫu dịch tế bào có mật độ OD = 10, xung nghỉ 30 giây Với việc siêu âm chia làm lần, thu riêng protein giải phóng pha tan sau lần làm giảm bớt thời gian tồn mẫu siêu âm, đồng nghĩa với việc giảm khả bị biến tính kết tụ protein nhiệt sinh trình siêu âm Sau siêu âm phá tế bào, tách chiết protein SUMO_IL-11 pha tan, tiếp tục sử dụng kỹ thuật tinh để thu hồi protein đích SUMO_IL-11 từ hỗn hợp protein tan tổng số E coli 3.3 Tinh protein tái tổ hợp SUMO_IL-11 3.3.1 Tinh protein tái tổ hợp SUMO_IL-11 sắc ký lực a, Khảo sát sơ điều kiện tinh SUMO_IL-11 Sau phá tế bào siêu âm, protein tan tổng số bao gồm protein đích SUMO_IL-11 protein khác E coli Để loại bỏ protein không mong muốn thu lấy protein quan tâm SUMO_IL-11, toàn protein tổng số pha tan đưa lên cột sắc ký lực để tinh dựa vào lực liên kết đặc hiệu đuôi Histag bao gồm Histidine protein dung hợp SUMO_IL-11 với ion kim loại Niken cột sắc ký Hỗn hợp chứa protein tổng số cân đệm gắn mẫu chứa 20 mM PBS, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol đưa lên cột sắc ký lực với Histag Chỉ có protein chứa đuôi Histag bám giữ lên chất giá cột nhờ tương tác với Ni2+, protein khác bị rửa trôi khỏi cột Các đệm rửa có nồng độ imidazol tăng dần từ 10 mM, 100 mM 150 mM sử dụng để loại bỏ protein gắn kết không đặc hiệu Rửa giải thu hồi protein quan tâm SUMO_IL-11 từ cột thực với nồng độ 400 mM imidazol Phân đoạn tất bước đưa mẫu lên cột, bước rửa, bước thu hồi thu lại điện di 33 biến tính SDS-PAGE để kiểm tra có mặt protein Kết điện di thể Hình Hình SDS_PAGE kiểm tra kết khảo sát tinh SUMO_IL-11 sắc ký lực (1) Protein tổng số pha tan trước đưa lên cột; (2-3) phân đoạn đưa mẫu lên cột; (4) Mẫu rửa nồng độ imidazol 10 mM; (5): Mẫu rửa nồng độ imidazol 100 mM; (6-8): Mẫu rửa nồng độ imidazol 150 mM; (9-14): Mẫu thu nồng độ imidazol 400 mM; (M): Protein marker Kết kiểm tra mẫu sau khảo sát điều kiện tinh Hình cho thấy đưa mẫu lên cột, protein E coli không bám với chất giá cột nên bị rửa trôi theo dòng chảy Tuy nhiên, phần phân tử protein SUMO_IL-11 không bám lên cột khỏi cột Trong giai đoạn rửa đệm có nồng độ imidazol tăng dần: nồng độ 10 mM nồng độ 100 mM có protein bị rửa trôi, nồng độ 150 mM imidazol loại bỏ thêm nhiều protein bám không đặc hiệu, với SUMO_IL-11 bị nhiều Do đó, thu protein đích SUMO_IL11 phân đoạn thu mẫu Thêm vào đó, kết điện di cho thấy phân đoạn thu nhiều băng protein không đặc hiệu khác Như vậy, sử dụng cột sắc ký lực Histag giúp phân tách SUMO_IL-11 khỏi protein không quan tâm E coli nhờ vào thiết kế đuôi Histag protein dung hợp SUMO_IL-11 Tuy nhiên, qua khảo sát sơ điều kiện tinh chế ban đầu cho thấy mẫu bị nhiều bước đưa mẫu lên cột bước rửa nên protein SUMO_IL-11 thu lại có độ tinh chưa cao Vì vậy, chúng 34 tiếp tục khảo sát thành phần đệm, nồng độ muối sử dụng đưa mẫu lên cột thể tích đệm sử dụng bước rửa protein bám không đặc hiệu Đây yếu tố có khả ảnh hưởng lớn đến khả gắn protein vào chất giá cột sắc ký độ tinh protein đích b, Khảo sát điều kiện đệm đưa mẫu lên cột Như trình bày phần trên, sử dụng đệm chứa 20 mM PBS, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol đưa mẫu lên cột, nhiên khả bám lên cột protein SUMO_IL-11 không tốt Vì vậy, tiến hành khảo sát điều kiện đệm nồng độ NaCl đệm với mục đích làm tăng khả bám protein quan tâm Đầu tiên, khảo sát nồng độ NaCl bổ sung vào đệm gắn tăng từ 150 mM lên 300 mM, thành phần khác đệm giữ nguyên Kết điện di mẫu sau tinh chế (Hình 9) cho thấy protein SUMO_IL-11 bị khỏi cột bước đưa mẫu lên cột bước rửa Các phân đoạn thu mẫu chứa nhiều protein đích hơn, loại nhiều protein không đặc hiệu có kích thước thấp, tạp nhiễm nhiều protein có kích thước cao Hiệu thu hồi protein SUMO_IL-11 chưa cao Hình SDS-PAGE kiểm tra kết tinh SUMO_IL-11 sắc ký lực sử dụng đệm đưa mẫu lên cột chứa 20 mM PBS, 300 mM NaCl (1) Protein tổng số pha tan trước đưa lên cột; (2-3) Flow through đưa mẫu lên cột; (4, 5) Mẫu rửa nồng độ imidazol 10 mM phân đoạn đầu phân đoạn cuối; (6, 7) Mẫu rửa nồng độ imidazol 100 mM phân đoạn đầu phân 35 đoạn cuối; (8, 9) Mẫu rửa nồng độ imidazol 150 mM phân đoạn đầu phân đoạn cuối; (10) Mẫu rửa nồng độ imidazol 200 mM; (11-14) Mẫu thu nồng độ imidazol 400 mM; (M): Protein marker Chúng tiếp tục tăng nồng độ NaCl đệm lên 500 mM, đồng thời tăng nồng độ PBS từ 20 mM lên 50 mM Kết điện di mẫu sau tinh chế (Hình 10) cho thấy mẫu SUMO_IL-11 bám lên cột nhiều nên thu nhiều SUMO_IL11 phân đoạn thu với 400 mM imidazol Bên cạnh đó, nhận thấy rửa cột đệm chứa 100 mM imidazol loại nhiều protein bám không đặc hiệu Tuy nhiên tăng nồng độ imidazol đệm rửa lên 150 mM, 200 mM SUMO_IL-11 bị rửa trôi Hình 10 SDS-PAGE kiểm tra kết tinh SUMO_IL-11 sắc ký lực sử dụng đệm đưa mẫu lên cột chứa 50 mM PBS, 500 mM NaCl (1) protein tổng số pha tan trước đưa lên cột; (2-3) Flow through đưa mẫu lên cột; (4, 5) Mẫu rửa nồng độ imidazol 10 mM phân đoạn đầu phân đoạn cuối; (6, 7) Mẫu rửa nồng độ imidazol 100 mM phân đoạn đầu phân đoạn cuối; (8, 9) Mẫu rửa nồng độ imidazol 150 mM phân đoạn đầu phân đoạn cuối; (10) Mẫu rửa nồng độ imidazol 200 mM; (11-14) Mẫu thu nồng độ imidazol 400 mM; (M): Protein marker Vì định sử dụng đệm rửa đến nồng độ 100 mM để loại protein không mong muốn bám không đặc hiệu lên cột, sau sử dụng nồng độ 400 mM imidazol để thu hồi mẫu Nồng độ đệm sử dụng để đưa mẫu lên cột 36 cho hiệu bám tối đa protein SUMO_IL-11 lên cột sắc ký lực lựa chọn 50 mM PBS 500 mM NaCl c, Khảo sát điều kiện đệm rửa mẫu Chúng tiếp tục khảo sát thể tích đệm rửa để tăng khả rửa protein bám không đặc hiệu lên cột Đầu tiên, đệm rửa 10 lần thể tích cột (10CV) Kết kiểm tra mẫu protein sau tinh (Hình 11) cho thấy phân đoạn cuối rửa đệm chứa 10 mM imidazol protein bị rửa Đáng ý, phân đoạn cuối rửa đệm chứa 100 mM imidazol, không rửa thêm protein không đặc hiệu mà protein SUMO_IL-11 bắt đầu bị khỏi cột Do đó, để giảm thời gian tinh chế với mục đích thu hồi tối đa SUMO_IL-11, giảm thể tích đệm rửa Hình 11 SDS-PAGE kiểm tra kết tinh SUMO_IL-11 sắc ký lực với thể tích đệm rửa 10 CV (1) protein tổng số pha tan trước đưa lên cột; (2-3) Flow through đưa mẫu lên cột; (4, 5) Mẫu rửa nồng độ imidazol 10 mM phân đoạn đầu phân đoạn cuối; (6, 7) Mẫu rửa nồng độ imidazol 100 mM phân đoạn đầu phân đoạn cuối; (8 -14) Mẫu thu nồng độ imidazol 400 mM; (M): Protein marker Khi giảm thể tích đệm rửa từ 10 CV xuống CV, SUMO_IL-11 không bị phân đoạn rửa (Hình 12) Do lượng protein SUMO_IL-11 phân đoạn thu tăng lên đáng kể tương đối ngoại trừ băng SUMO_IL-11 không nguyên vẹn 37 Hình 12 SDS-PAGE kiểm tra kết tinh SUMO_IL-11 sắc ký lực với thể tích đệm rửa CV (1) protein tổng số pha tan trước đưa lên cột; (2-3) Flow through đưa mẫu lên cột; (4, 5) Mẫu rửa nồng độ imidazol 10 mM phân đoạn đầu phân đoạn cuối; (6, 7) Mẫu rửa nồng độ imidazol 100 mM phân đoạn đầu phân đoạn cuối; (8 -14) Mẫu thu nồng độ imidazol 400 mM; (M): Protein marker Sau chuẩn hóa điều kiện phù hợp cho việc bám protein SUMO_IL-11 lên cột rửa protein bám không đặc hiệu cột sắc ký lực ml, tiến hành tinh lượng lớn cột sắc ký lực có kích thước tăng gâp 10 lần (50 ml) với lượng mẫu đưa lên cột tương ứng tăng gấp 10 lần so với cột ml Các điều kiện sắc ký áp dụng tối ưu cột ml, có nghĩa đệm đưa mẫu lên cột chứa 50 mM PBS 500 mM NaCl; rửa cột CV đệm 10 mM imidazol, đến CV đệm 100 mM imidazol; thu mẫu nồng độ đệm chứa 400 mM imidazol Kết sắc ký đồ (Hình 13) cho thấy hầu hết protein tạp không bám cột bước đưa mẫu lên cột Khi rửa cột với đệm chứa 100 mM imidazol có nhiều protein bám không đặc hiệu rửa khỏi cột Ở phân đoạn mẫu 400 mM imidazol, SUMO IL-11 khỏi cột với giá trị hấp phụ đạt 630 mAU 38 Hình 13 Sắc ký đồ kết tinh SUMO_IL-11 cột sắc ký lực His-tag 50 ml Kết kiểm tra sản phẩm sau tinh điện di protein gel polyacrylamid (Hình 14) cho thấy bước đưa mẫu lên cột bước rửa tới nồng độ 100 mM imidazol loại bỏ hầu hết protein tạp, protein đích không bị phân đoạn rửa Lượng protein SUMO_IL-11 thu hồi sau tinh chế nhiều tương đối sạch, ngoại trừ băng SUMO_IL-11 không nguyên vẹn có mặt đồng thời với SUMO_IL-11 nguyên vẹn Các băng tạo số phân từ SUMO_IL-11 bị phân cắt không đặc hiệu protease tế bào trình lên men Tối ưu điều kiện sắc ký lực Histag loại bỏ băng không nguyên vẹn chúng có đuôi Histag Vì sử dụng phương pháp tinh để loại bỏ chúng 39 Hình 14 SDS – PAGE kiểm tra kết tinh SUMO_IL-11 cột sắc ký lực 50 ml (1) protein tổng số pha tan trước đưa lên cột; (2) Flow through đưa mẫu lên cột; (3) Mẫu rửa nồng độ imidazol 100 mM; (4-13) Mẫu thu nồng độ imidazol 400 mM; (M): Protein marker 3.3.2 Tiếp tục tinh SUMO_IL-11 tủa phân đoạn muối (NH4)2SO4 Như trình bày phần trên, sau tinh SUMO_IL-11 từ hỗn hợp protein tổng số pha tan cột sắc ký lực His-tag, loại bỏ phần lớn protein tạp thu phân đoạn chứa SUMO_IL-11 sạch, ngoại trừ số băng SUMO_IL-11 bị cắt không đặc hiệu Với mục đích loại bỏ protein không nguyên vẹn này, đồng thời tiếp tục loại bỏ protein không mong muốn, mẫu SUMO_IL-11 thu sau qua cột sắc ký lực tiếp tục trải qua bước tinh phương pháp tủa phân đoạn muối ammonium sulfate Các nồng độ muối từ 5% đến 60% sử dụng để tủa protein khác Tại nồng độ, mẫu ly tâm thu tủa, phần dịch tiếp tục tủa nồng độ cao Tất phân đoạn điện di biến tính SDS-PAGE để kiểm tra có mặt protein Kết điện di Hình 15 cho thấy băng protein SUMO-IL11 không nguyên vẹn tách khỏi mẫu SUMO_IL-11 nguyên vẹn có tính chất hòa tan muối ammonium sulphate khác SUMO_IL-11 nguyên vẹn tủa nồng độ muối 20%, SUMO_IL-11 không nguyên vẹn tan nồng độ muối 20% Khi nồng độ muối tăng lên phân tử protein bị 40 tủa Như vậy, mẫu SUMO_IL-11 tinh cách tủa phân đoạn muối ammonium sulphate, nồng độ ammonium sulphate để thu mẫu SUMO_IL-11 20% (Hình 15) Hình 15 SDS-PAGE kiểm tra khả loại protein tạp khỏi SUMO_IL-11 phương pháp tủa phân đoạn ammonium sulphate (1-7): Protein tủa phân đoạn 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% dịch pha tan sau 60%, tương ứng (M): protein marker 41 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Với mục tiêu đặt trình thực đề tài: “Tinh chế thành công protein dung hợp SUMO Interleukin-11 người tái tổ hợp biểu chủng Escherichia coli”, hoàn thành công việc sau: - Đã biểu SUMO_IL-11 tái tổ hợp dạng tan chủng E coli R2; - Đã tối ưu phương pháp tách chiết SUMO_IL-11 chủng E coli R2 tái tổ hợp siêu âm; - Tinh thành công SUMO_ IL-11 sắc ký lực tủa phân đoạn ammonium sulphate nồng độ 20 % 4.2 Kiến nghị Để tiếp tục hướng nghiên cứu này, có kiến nghị sau: Tiếp tục nghiên cứu điều kiện cắt SUMO_IL-11 SUMO protease để thu protein tái tổ hợp IL-11 cho nghiên cứu 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Thanh Đạm (2004), Miễn dịch điều trị bệnh ung thư, Nhà xuất Y học Paul S.R., Bennett F., Calvetti J.A cộng (1990) Molecular cloning of a cDNA encoding interleukin 11, a stromal cell-derived lymphopoietic and hematopoietic cytokine Proc Natl Acad Sci, 87(19), 7512–7516 McKinley D., Wu Q., Yang-Feng T cộng (1992) Genomic sequence and chromosomal location of human interleukin-11 gene (IL11) Genomics, 13(3), 814–819 Sims N.A., Jenkins B.J., Nakamura A cộng (2005) Interleukin-11 Receptor Signaling Is Required for Normal Bone Remodeling J Bone Miner Res, 20(7), 1093–1102 Dykstra K.H., Rogge H., Stone A cộng (2000) Mechanism and amelioration of recombinant human interleukin-11 (rhIL-11)-induced anemia in healthy subjects J Clin Pharmacol, 40(8), 880–888 Leng S.X Elias J.A (1997) Interleukin-11 inhibits macrophage interleukin12 production J Immunol, 159(5), 2161–2168 Schwertschlag U.S., Trepicchio W.L., Dykstra K.H cộng (1999) Hematopoietic, immunomodulatory and epithelial effects of interleukin-11 Leukemia, 13(9), 1307–1315 Kaye J.A (1998) FDA licensure of NEUMEGA to prevent severe chemotherapyinduced thrombocytopenia Stem Cells Dayt Ohio, 16 Suppl 2, 207–223 Weich N.S., Fitzgerald M., Wang A cộng (2000) Recombinant human interleukin-11 synergizes with steel factor and interleukin-3 to promote directly the early stages of murine megakaryocyte development in vitro Blood, 95(2), 503–509 10 Yonemura Y., Kawakita M., Masuda T cộng (1992) Synergistic effects of interleukin and interleukin 11 on murine megakaryopoiesis in serum-free culture Exp Hematol, 20(8), 1011–1016 11 Blattner F.R., Plunkett G., Bloch C.A cộng (1997) The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12 Science, 277(5331), 1453–1462 43 12 Terpe K (2006) Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems Appl Microbiol Biotechnol, 72(2), 211–222 13 Yin J., Li G., Ren X cộng (2007) Select what you need: A comparative evaluation of the advantages and limitations of frequently used expression systems for foreign genes J Biotechnol, 127(3), 335–347 14 Makrides S.C (1996) Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli Microbiol Rev, 60(3), 512–538 15 William Studier F., Rosenberg A.H., Dunn J.J cộng (1990) [6] Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes Methods in Enzymology Academic Press, 60–89 16 Chương 7: Biểu gen tái tổ hợp Escherichia coli , accessed: 17/04/2015 17 Marblestone J.G., Edavettal S.C., Lim Y cộng (2006) Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: Enhanced expression and solubility with SUMO Protein Sci Publ Protein Soc, 15(1), 182–189 18 Studier F.W Moffatt B.A (1986) Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes J Mol Biol, 189(1), 113–130 19 Ikura K., Kokubu T., Natsuka S cộng (2002) Co-overexpression of folding modulators improves the solubility of the recombinant guinea pig liver transglutaminase expressed in Escherichia coli Prep Biochem Biotechnol, 32(2), 189–205 20 Pryor K.D Leiting B (1997) High-level expression of soluble protein in Escherichia coli using a His6-tag and maltose-binding-protein double-affinity fusion system Protein Expr Purif, 10(3), 309–319 21 Wang C., Castro A.F., Wilkes D.M cộng (1999) Expression and purification of the first nucleotide-binding domain and linker region of human multidrug resistance gene product: comparison of fusions to glutathione S-transferase, thioredoxin and maltose-binding protein Biochem J, 338(Pt 1), 77–81 44 22 Melchior F (2000) SUMO nonclassical ubiquitin Annu Rev Cell Dev Biol, 16, 591–626 23 Müller S., Matunis M.J., Dejean A (1998) Conjugation with the ubiquitinrelated modifier SUMO-1 regulates the partitioning of PML within the nucleus EMBO J, 17(1), 61–70 24 Bayer P., Arndt A., Metzger S cộng (1998) Structure determination of the small ubiquitin-related modifier SUMO-1 J Mol Biol, 280(2), 275–286 25 Malakhov M.P., Mattern M.R., Malakhova O.A cộng (2004) SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins J Struct Funct Genomics, 5(1-2), 75–86 26 Butt T.R., Edavettal S.C., Hall J.P cộng (2005) SUMO fusion technology for difficult-to-express proteins Protein Expr Purif, 43(1), 1–9 27 Sun Z., Xia Z., Bi F cộng (2008) Expression and purification of human urodilatin by small ubiquitin-related modifier fusion in Escherichia coli Appl Microbiol Biotechnol, 78(3), 495–502 28 Zuo X., Li S., Hall J cộng (2005) Enhanced expression and purification of membrane proteins by SUMO fusion in Escherichia coli J Struct Funct Genomics, 6(2-3), 103–111 29 Su Z., Huang Y., Zhou Q cộng (2006) High-level expression and purification of human epidermal growth factor with SUMO fusion in Escherichia coli Protein Pept Lett, 13(8), 785–792 30 Ritchie C (2012) Protein Purification Mater Methods, 31 Ersson B., Rydén L., Janson J.-C (2011) Introduction to Protein Purification Protein Purification John Wiley & Sons, Inc., 1–22 32 Pettersson S.W (2011) High-Resolution Reversed-Phase Chromatography of Proteins Protein Purification John Wiley & Sons, Inc., 135–164 33 Bornhorst J.A Falke J.J (2000) [16] Purification of Proteins Using Polyhistidine Affinity Tags Methods Enzymol, 326, 245–254 45 34 Schmitt J., Hess H., Stunnenberg H.G (1993) Affinity purification of histidine-tagged proteins Mol Biol Rep, 18(3), 223–230 35 Janknecht R., Martynoff G de, Lou J cộng (1991) Rapid and efficient purification of native histidine-tagged protein expressed by recombinant vaccinia virus Proc Natl Acad Sci, 88(20), 8972–8976 36 Tinh Protein phương pháp tủa , accessed: 17/04/2015 37 Wingfield P (2001) Protein precipitation using ammonium sulfate Curr Protoc Protein Sci Editor Board John E Coligan Al, Appendix 3, Appendix 3F 38 Jakoby (1971) Crystallization as a purification technique Acad Press, 22 39 Tsumoto K., Ejima D., Senczuk A.M cộng (2007) Effects of salts on protein-surface interactions: applications for column chromatography J Pharm Sci, 96(7), 1677–1690 40 Andrews (1970) Estimation of molecular size and molecular weights of biological compounds by gel filtration Lnterscience N Y, 18, 1–53 41 Michael Blaber (1998) Protein Purification: Gel Filtration 42 Sambrook Russell, D (2001), Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 43 Tsai Y.-L., Wang M.-H., Gao C cộng (2009) Small heat-shock protein HspL is induced by VirB protein(s) and promotes VirB/D4-mediated DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens Microbiology, 155(Pt 10), 3270–3280 46 [...]... mọc được trên đĩa chọn lọc chính là các dòng tế bào E coli mang ADN plasmid tái tổ hợp pESUMO_il -11 Như vậy, chúng tôi đã tạo được dòng tế bào biểu hiện mang dung hợp SUMO_ il -11 Công việc tiếp theo là tiến hành biểu hiện gen mã hóa protein dung hợp SUMO_ IL -11 trong chủng E coli R2 3.1.2 Biểu hiện SUMO_ IL -11 tái tổ hợp trong chủng E coli R2 Sau khi tạo được chủng E coli R2 tái tổ hợp mang gen il -11 dung. .. hiện màu quan sát sự xuất hiện của băng protein quan tâm bằng dung dịch TMB 25 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Biểu hiện SUMO_ IL -11 trong chủng E coli R2 3.1.1 Tạo chủng E coli R2 mang vector biểu hiện pESUMO_il -11 Để có thể thu được lượng lớn protein IL -11 người tái tổ hợp, chúng tôi đã thiết kế vector biểu hiện pESUMO_il -11 Việc sử dụng pESUMOpro3 như là vector biểu hiện protein dưới dạng dung hợp. .. thiện đáng kể sự biểu hiện protein tái tổ hợp trong E coli, bao gồm xây dựng các promoter mạnh [18], biểu hiện đồng thời với các chaperone [19] và sử dụng các protein dung hợp Các protein dung hợp có tác dụng đáng kể trong tăng cường sự biểu hiện và độ hòa tan của protein tái tổ hợp Hệ thống dung hợp được đặc trưng bởi khả năng tăng cường sự biểu hiện của protein, giảm sự phân giải của protein tái tổ. .. IL -11 (khoảng 19,1 kDa) Như vậy, từ kết quả nhuộm coomassie ở trên có thể thấy SUMO_ IL -11 đã được biểu hiện thành công trong chủng E coli R2 tái tổ hợp Để chứng minh chủng E coli tái tổ hợp đã biểu hiện protein SUMO_ IL -11, chúng tôi kiểm tra bằng phản ứng liên kết với kháng thể đặc hiệu kháng IL -11 trong phản ứng lai Western blot (Hình 4) 28 SUMO_ IL -11 Hình 4 Western blot kết quả biểu hiện SUMO_ IL -11. .. dung hợp với SUMO nằm trong vector pESUMO_il -11, chúng tôi tiến hành biểu hiện protein SUMO_ IL -11 đối với các dòng biến nạp Một khuẩn lạc E coli R2 mang pESUMO_il -11 trên đĩa biến nạp được lựa chọn ngẫu nhiên và được nuôi cấy trong môi trường TB chứa kháng sinh chọn lọc ampicillin ở 37oC Trên vector biểu hiện pESUMO_il -11, hoạt động của gen dung hợp SUMO_ il -11 được điều khiển bởi operon lac với cơ chế. .. đặc hiệu với kháng thể IL -11 Như vậy tóm lại, chúng tôi đã biểu hiện được SUMO_ IL -11 trong tế bào tái tổ hợp E coli R2 và thu được lượng sinh khối tế bào đáng kể tổng hợp protein tái tổ hợp SUMO_ IL -11 Các công việc tiếp theo là tách chiết protein từ dịch nuôi cấy tế bào và tinh sạch để loại bỏ các protein không mong muốn, thu hồi protein SUMO_ IL -11 29 ... theo đặc tính protein muốn biểu hiện trong vector nào mà chọn chủng E coli phù hợp với từng mục đích sử dụng Ví dụ chủng E coli BL21(DE3) là chủng biểu hiện protein tốt Chủng này bị đột biến khuyết sản phẩm OmpT và lon nên hạn chế tối đa sự thủy phân không mong muốn của protein được tổng hợp [15] Đối với biểu hiện các protein ngoại lai có nguồn gốc từ sinh vật nhân chuẩn, sử dụng các chủng có nguồn... khả năng tổng hợp protein trên đơn vị một tế bào giữa các mẫu với nhau Tiếp theo dịch tế bào được điện di biến tính trên gel SDS-PAGE 14% để phát hiện các băng protein bằng phương pháp nhuộm Coomassie Kết quả biểu hiện protein SUMO_ IL -11 được thể hiện trên hình 3 27 Hình 3 SDS-PAGE kiểm tra kết quả biểu hiện SUMO_ IL -11 trong tế bào E coli R2 R: dòng biến nạp E coli R2 mang vector pESUMO_il -11 ĐC: dòng... hệ biểu hiện này đối với biểu hiện các protein trị liệu là sự 7 tích lũy của thành phần lipopolysaccharide (LPS), được biết đến là nội độc tố gây ra phản ứng phụ cho người và các động vật khi dùng Do đó, protein dùng cho mục đích trị liệu phải được tinh sạch lần nữa để loại độc tố [12] 1.2.1 Chủng biểu hiện E coli Hiện nay, có nhiều chủng E coli đã được cải biến cho mục đích biểu hiện gen và mỗi chủng. .. khả năng mọc và tạo khuẩn lạc trên đĩa LBAmp Thực hiện song song với đối chứng âm là tế bào E Coli khả biến không bổ sung ADN plasmid tái tổ hợp, cấy trải trên đĩa LBAmp và LB 2.2.2 Cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp - Cơ sở lý thuyết: Lac operon là môt hệ thống được sử dụng phổ biến để biểu hiện protein tái tổ hợp trong vi khuẩn E coli Gen đích được chèn vào ngay sau trình tự promoter T7, lac O