Tách dòng và biểu hiện interleukin 3 người lái tổ hợp trong chủng escherichia coli

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài : Tách dòng biểu Interleukin-3 người tái tổ hợp chủng Escherichia coli Người hướng dẫn : TS Lê Thị Thu Hồng Sinh viên thực : Nguyễn Thị Hồng Vân Lớp : 11-04 Hà Nội - 2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS Lê Thị Thu Hồng, phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học người hướng dẫn quan tâm giúp đỡ, bảo truyền đạt cho em kinh nghiệm quý báu suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Khóa luận phần nội dung đề tài khoa học công nghệ cấp nhà nước “Nghiên cứu sản xuất Interleukin-3 Interleukin-11 tái tổ hợp chất lượng cao dùng y học (điều trị)” GS.TS Trương Nam Hai làm chủ nhiệm Với tình cảm chân thành, em xin cảm ơn hướng dẫn giúp đỡ toàn thể cán phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, đặc biệt ThS Dương Thu Hương, NCS Nguyễn Thị Quý, KS Đặng Thị Ngọc Hà NCS Nguyễn Minh Giang, người hướng dẫn, hỗ trợ bảo nhiệt tình chuyên môn kĩ suốt trình em hoàn thành khóa luận Em xin bày tỏ biết ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội truyền đạt cho em kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt bốn năm học tập trường Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè bên, động viên giúp đỡ em suốt trình học tập hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Hồng Vân i MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Interleukin-3 2.1.1 Giới thiệu chung 2.1.2 Đặc tính phân tử cấu trúc IL-3 2.1.3 Vai trò ứng dụng IL-3 2.1.4 Nghiên cứu sản xuất IL-3 tái tổ hợp 2.1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng IL-3 nước 2.2 Tách dòng gen 2.2.1 Chủng vi khuẩn E coli dùng để tách dòng 2.2.2 Vector tách dòng pJET1.2 2.3 Hệ biểu E coli 10 2.3.1 Chủng biểu E coli 10 2.3.2 Vector biểu pET 22b(+) 12 PHẦN II : PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 14 3.1.1 Các chủng vi sinh vật plasmid 14 3.1.2 Hóa chất enzyme 14 3.1.3 Các môi trường dung dịch 14 3.2 Phương pháp nghiên cứu 16 3.2.1 Phương pháp PCR 16 3.2.2 Phương pháp điện di gel agarose .17 3.2.3 Biến nạp ADN plasmid vào tế bào E coli phương pháp sốc nhiệt 19 3.2.4 Tách chiết ADN plasmid từ tế bào E coli .20 3.2.5 Phương pháp xử lý ADN plasmid enzyme hạn chế 21 ii 3.2.6 Tinh ADN từ gel agarose cột Qiagen 22 3.2.7 Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào ADN plasmid .23 3.2.8 Cảm ứng biểu protein tái tổ hợp .23 3.2.9 Điện di protein gel polyacrylamide (SDS-PAGE) 24 3.2.10 Phương pháp lai Western blot .25 3.1 Nhân gen il-3 kỹ thuật PCR 27 3.2 Thiết kế vector tách dòng pJET1.2_il-3 28 3.2.1 Ghép nối gen il-3 vào vector tách dòng pJET1.2 blunt 28 3.2.2 Tạo tế bào E coli DH10B mang vector tách dòng pJET1.2_il-3 28 3.2.3 Tách chiết ADN plasmid từ dòng biến nạp pJET1.2_il-3 30 3.2.4 Kiểm tra có mặt gen il-3 vector tách dòng pJET1.2 enzyme hạn chế giải trình tự 31 3.3 Thiết kế vector biểu pET22b(+) mang gen il-3 33 3.3.1 Nối ghép gen il-3 vào vector pET 22b(+) 33 3.3.2 Tạo tế bào E coli DH10B mang vector biểu pET22_il-3 34 3.3.3 Tách chiết ADN plasmid từ dòng biến nạp pET22b_il-3 34 3.3.4 Kiểm tra có mặt gen il-3 vector biểu pET22b(+) enzyme hạn chế .35 3.4 Biểu gen il-3 tái tổ hợp chủng E.coli JM109 (DE3) 36 3.4.1 Tạo tế bào E coli JM109(DE3) mang vector biểu pET22b_il-3 36 3.4.2 Biểu gen il-3 tái tổ hợp chủng E coli JM109 (DE3) .37 3.4.3 Kiểm tra tính kháng nguyên IL-3 tái tổ hợp phản ứng lai Western blot 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 Kết luận 40 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN Axit deoxyribo nucleic Amp Ampicillin Bp Base pair CSF Colony-stimulating factor dNTP 2’- deoxyribonucleotit 5’- triphossphat EDTA Ethylen diamin tetra axit axetic EtBr Ethidium bromide E coli Escherichia coli GM-CSF Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor IPTG Isopropylthio –β–D – galactoside IL-3 Interleukin - Kb Kilo base kDa Kilo Dalton PCR Polymerase Chain Rection SDS Sodium dodeccyl sunfate TAE Tris- axetat- EDTA iv DANH MỤC BẢNG Bảng Cấu trúc gen vector tách dòng pJET1.2 .10 Bảng Thành phần gel điện di biến tính SDS-PAGE 16 Bảng Thành phần phản ứng PCR 17 Bảng Công thức lai .23 v DANH MỤC HÌNH Hình Mô cấu trúc không gian IL-3 [10] Hình pJET 1.2 blunt vector [24] 10 Hình Vector pET 22b(+) 13 Hình Sơ đồ tách dòng biểu gen mã hóa IL-3 người tái tổ hợp chủng E coli 26 Hình Điện di kiểm tra sản phẩmPCR nhân gen il-3 gel agarose 0,8% 27 Hình Điện di kiểm tra kết tinh sản phẩm PCR gen il-3 28 Hình Tế bào khả biến E coli DH10B trải đĩa LB thường (a) LB có bổ sung ampicillin 100 µg/µl (b) 29 Hình Kết biến nạp ADN plasmid pJET1.2_il-3 vào tế bào E.coli DH10B 30 Hình Điện di sản phẩm tách chiết ADN plasmid từ dòng biến nạp E coli DH10B 30 Hình 10 Điện di kiểm tra sản phẩm cắt ADN plasmid enzyme BglII 31 Hình 11 So sánh trình tự gen il-3 thiết kế với trình tự gen ngân hàng gen quốc tế 32 Hình 12 Điện di sản phẩm tinh plasmid pET22b(+) gen il-3 xử lý với cặp enzyme NdeI NotI 33 Hình 13 Đĩa biến nạp sản phẩm nối ghép gen pET22_il-3 vào tế bào khả biến DH10B 34 Hình 14 Điện di kiểm tra ADN plasmid tách từ dòng biến nạp pET22_il-3 tế bào E coli DH10B 35 Hình 15 Điện di kiểm tra sản phẩm cắt dòng ADN plasmid cặp enzyme hạn chế NdeI NotI 36 Hình 16 Đĩa biến nạp pET22b_il-3 vào tế bào E coli JM109 (DE3) 37 Hình 17 SDS-PAGE kiểm tra biểu protein IL-3 tái tổ hợp chủng E coli JM109 38 Hình 18 Western blot xác định protein tái tổ hợp IL-3 biểu từ dòng E coli JM109 tái tổ hợp mang gen il-3 39 vi MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, việc nghiên cứu áp dụng kỹ thuật công nghệ sinh học vào lĩnh vực y dược ngày quan tâm phát triển mạnh mẽ Các kỹ thuật ADN tái tổ hợp trở nên phổ biến sở cho loạt kỹ thuật phương pháp đại khác áp dụng việc bảo vệ chăm sóc sức khỏe người Liệu pháp miễn dịch liệu pháp gen biết đến phương pháp hữu hiệu thay bổ sung cho phương pháp truyền thống khác lĩnh vực điều trị bệnh Trong liệu pháp miễn dịch, protein tái tổ hợp có giá trị insulin, interferon, interleukin, cytokine, protein enzyme, kháng nguyên, kháng thể sử dụng để điều trị cho bệnh nhân ung thư, bệnh nhân tiểu đường bệnh nhân bị mắc chứng bệnh hiểm nghèo khác Việc sản xuất protein đường tái tổ hợp góp phần giải toán thực tiễn nhằm giảm chi phí giá thành, nâng cao lực chữa trị tăng cường khả chống lại bệnh tật người Với chất protein glycoprotein, Interleukin ( IL) bốn nhóm cytokine (Interferron, Interleukin, nhân tố hoại tử ung thư, nhân tố sinh trưởng) Tính đến thời điểm tại, số lượng Interleukin phát lên tới 37 loại Trong thực tế, hầu hết loại IL phát tạo đường tái tổ hợp chúng sử dụng không việc điều trị bệnh mà dùng vào mục đích chẩn đoán nghiên cứu khác Chính vậy, việc tạo loại sinh phẩm IL phát triển phương thức điều trị hữu hiệu dựa loại sản phẩm hướng nghiên cứu quan tâm Trong số IL, IL-3 loại cytokine có phổ tác dụng rộng hệ thống tạo máu tham gia vào nhiều chức thể Chính đa dạng chức đó, hoạt tính IL-3 nghiên cứu nhiều dòng tế bào khác Ở người, IL-3 yếu tố tăng trưởng tạo máu, có vai trò quan trọng việc tăng sinh hoạt hóa tế bào tiền thân tạo máu Ngoài ra, IL-3 có phổ hoạt động rộng ảnh hưởng đến tế bào trưởng thành, đặc biệt đáp ứng miễn dịch phản ứng dị ứng thể Một vài nghiên cứu chứng minh vai trò IL-3 làm gia tăng số lượng tế bào bạch cầu, bạch cầu trung tính, bạch cầu ưa axit, bạch cầu đơn nhân, hồng cầu lưới tiểu cầu Hiện nay, nước ta chưa sản xuất IL-3 tái tổ hợp Các sản phẩm IL-3 phải nhập với chi phí đắt đỏ ví dụ hãng Invitrogen (691 USD/100 µg), hãng CST (585 USD/50 µg), hãng Sigma-Aldrich có IL-3 tạo từ tế bào E coli (204 USD/ 10 µg, khó khăn việc chi trả kinh phí nhiều đối tượng bệnh nhân Vì vậy, để chủ động nguồn nguyên liệu nước giảm giá thành sản phẩm IL-3, Viện Công nghệ sinh học nhà nước đầu tư cho chủ trì đề tài: Nghiên cứu sản xuất Interleukin-3 Interleukin-11 tái tổ hợp chất lượng cao dùng y học (điều trị) Trong đó, nội dung tách dòng biểu IL-3 nội dung quan trọng đề tài cấp nhà nước nêu Tôi hướng dẫn thực nội dung cho khóa luận tốt nghiệp với tên đề tài khóa luận “Tách dòng biểu Interleukin - người tái tổ hợp chủng Escherichia coli” Các thí nghiệm tiến hành phòng Kỹ thuật di truyền - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Thời gian thực đề tài tốt nghiệp từ tháng năm 2013 đến tháng năm 2015 Mục tiêu đề tài tách dòng biểu thành công protein IL-3 người tái tổ hợp tế bào vi khuẩn E coli, tạo sở cho việc nghiên cứu sản xuất IL-3 người tái tổ hợp dùng hỗ trợ điều trị bệnh máu PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Interleukin-3 2.1.1 Giới thiệu chung Interleukin xác định chất tác động bạch cầu, hoạt hóa lympho bào Nó sản phẩm dòng tế bào T hỗ trợ tiết đại thực bào hay tế bào khác hệ miễn dịch Các IL có vai trò trung gian việc liên kết với thụ thể đặc hiệu để điều khiển trình hoạt động tế bào, trình chết tế bào theo chương trình (apoptosis) trình phân chia tế bào Mỗi nhóm IL có vai trò khác hệ thống miễn dịch chúng tạo tế bào khác Ví dụ, IL-1 tác dụng hoạt hóa tế bào Th, tăng sinh trưởng thành tế bào B; IL-2 có tác dụng kích thích phát triển tế bào T, đồng kích thích tế bào B phát triển biệt hóa, tăng cường tế bào NK (natural killer) LAK (Lymphokine-activated killer); IL-3 kích thích biệt hóa tế bào gốc tạo máu đa thành tế bào tiền thân dòng tủy kích thích phân chia tất tế bào thuộc dòng tủy; IL-4 có tác dụng tăng sinh biệt hóa lên nhiều loại tế bào T, B, đại thực bào, tế bào mast; IL-5 tác dụng hiệp đồng với IL-4 để sản xuất kháng thể IgE, kích thích sinh trưởng biệt hóa bạch cầu toan; IL-7 tăng cường tiết IL-2, kích thích tăng sinh tế bào B; IL-11 có tác dụng kích thích tủy xương tạo tiểu cầu, giúp cải thiện tình trạng giảm tiểu cầu trình hóa trị liệu [1] Do có tác động đa hướng, đa đa dạng, có nhiều loại IL nghiên cứu tạo theo đường tái tổ hợp Chúng có nhiều chức ví dụ cho mục đích điều trị lâm sàng, IL-2 tái tổ hợp sử dụng điều trị hắc tố ác tính, ung thư biểu mô tế bào thận, IL-3 thúc đẩy phục hồi dòng bạch cầu tủy xương sau ghép tủy xương phục hồi dòng bạch cầu suy tủy xương thứ phát thuốc/hóa chất độc hại IL-11 kích thích gia tăng tiểu cầu tủy xương, sử dụng cho bệnh nhân giảm tiểu cầu sau xạ trị, sau hóa trị liệu [2] Hơn nữa, loại IL dùng kết hợp để đạt hiệu điều trị tốt nhất, ví dụ IL-2, IL-5, IL-7 điều trị bệnh nhân HIV, IL-4 IL-13 điều trị bệnh ung thư [3] Trong IL IL-3 có phổ tác dụng rộng với hệ tạo máu thể, nguồn sản xuất IL-3 tế bào lympho T hoạt hóa [4] Tế bào mast bạch cầu toan (eosinophil) tiết IL-3 kích thích hoạt hóa [5] Sản phẩm IL-3 tạo theo đường tế bào mast có ý nghĩa quan trọng với trình biệt hóa phân phép ADN ngoại lại di chuyển qua màng sau sốc nhiệt Các tế bào E coli DH10B khả biến tạo theo quy trình mô tả phần phương pháp kiểm tra sức sống độ cách cấy trải đĩa môi trường LB đĩa môi trường LB có bổ sung ampicillin (100 µg/µl) (LBA) Kết nuôi cấy tế bào khả biến hai môi trường LB LBA cho thấy tế bào khả biến tạo phát triển tốt môi trường thạch LB không mọc đĩa LBA (Hình 7) Điều chứng tỏ tế bào không bị nhiễm có chất lượng tốt Như tạo thành công tế bào khả biến E coli DH10B, sẵn sàng sử dụng để biến nạp ADN plasmid Hình Tế bào khả biến E coli DH10B trải đĩa LB thường (a) LB có bổ sung ampicillin 100 µg/µl (b) Sau tạo tế bào khả biến, sản phẩm phản ứng lai ghép gen il-3 vector tách dòng pJET1.2 biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH10B phương pháp sốc nhiệt mô tả phần phương pháp Sau biến nạp, dịch tế bào trải đĩa môi trường sàng lọc LB có bổ sung ampicillin (LBA) Chỉ tế bào nhận plasmid mang gen kháng ampicillin mọc môi trường chứa chất kháng sinh Kết biến nạp thể Hình 29 Hình Kết biến nạp ADN plasmid pJET1.2_il-3 vào tế bào E.coli DH10B Kết trải đĩa từ Hình cho thấy nhiều khuẩn lạc mọc bề mặt đĩa Các khuẩn lạc mọc riêng rẽ, có kích thước tương đối đồng nhất, sáng bóng đặc trưng cho khuẩn lạc E coli Những khuẩn lạc quan sát thấy đĩa thạch chọn lọc dòng tế bào nhận plasmid chứa gen kháng ampicillin, nghĩa chứa vector mang gen pJET1.2_il-3 Do vậy, để kiểm tra chắn dòng biến nạp nhận plasmid tái tổ hợp mang gen il-3 mong muốn , tiến hành tách chiết ADN plasmid từ dòng biến nạp, sau cắt kiểm tra gen chèn vào enzyme hạn chế giải trình tự gen 3.2.3 Tách chiết ADN plasmid từ dòng biến nạp pJET1.2_il-3 Để kiểm tra có mặt plasmid pJET1.2_il-3 dòng biến nạp, số khuẩn lạc mọc môi trường chọn lọc lựa chọn ngẫu nhiên để nhân lên riêng rẽ môi trường LB lỏng có ampicillin tách ADN plasmid theo bước mô tả phần phương pháp Sản phẩm tách ADN plasmid điện di kiểm tra gel agarose 0,8 % (Hình 9) 10 Hình Điện di sản phẩm tách chiết ADN plasmid từ dòng biến nạp E coli DH10B 1-10: ADN plasmid tách từ 10 dòng biến nạp Hình kết điện di sản phẩm tách ADN plasmid từ 10 dòng biến nạp Quan sát điện di đồ, nhận thấy mẫu tách chiết có kích thước tương đối đồng Để kết luận 30 xác plasmid có chứa gen il-3 hay không, tiến hành cắt kiểm tra số dòng ADN plasmid enzyme cắt hạn chế giải trình tự gen 3.2.4 Kiểm tra có mặt gen il-3 vector tách dòng pJET1.2 enzyme hạn chế giải trình tự Trong số dòng ADN plasmid tách, lựa chọn ngẫu nhiên dòng số để cắt kiểm tra kích thước đoạn chèn vào vector pJET1.2 enzyme BglII Sản phẩm phản ứng cắt điện di gel agarose 0,8 %, thu băng ADN thể Hình 10 Hình 10 Điện di kiểm tra sản phẩm cắt ADN plasmid enzyme BglII 1: ADN plasmid dòng số cắt BglII; M: Marker 100 bp (Fermentas) Trên vector pJET1.2 có hai điểm nhận biết enzyme BglII gần vị trí chèn gen ngoại lai Nếu dòng lựa chọn vector pJET1.2 chứa gen il-3 quan tâm, sau xử lý với enzyme hạn chế BglII tạo đoạn ADN có kích thước gen il-3 cộng thêm số nucleotide thuộc vector hai đầu đoạn gen điện di thể băng ADN có kích thước tương ứng Quan sát kết điện di đồ (Hình 10) cho thấy sản phẩm phản ứng cắt enzyme xuất băng: băng thứ có kích thước gần 500 bp tương đương với kích thước gen il-3 (402 bp) cộng với khoảng 51 nucleotide vector pJET1.2 hai đầu đoạn gen; băng thứ hai có kích thước khoảng 2,9 kb tương ứng với kích thước vector pJET1.2 cắt enzyme BglII Như bước đầu nhận định plasmid tái tổ hợp kiểm tra pJET1.2 mang gen il-3 Để khẳng định chắn có mặt gen il-3 dòng ADN 31 plasmid lựa chọn, gửi mẫu giải trình tự cặp mồi đặc hiệu Kết giải trình tự sau: GCTCCCATGACCCAGACAACGCCCTTGAAGACAAGCTGGGTTAACTGCTCTAACATGAT CGATGAAATTATAACACACTTAAAGCAGCCACCTTTGCCTTTGCTGGACTTCAACAACCTCAAT GGGGAAGACCAAGACATTCTGATGGAAAATAACCTTCGAAGGCCAAACCTGGAGGCATTCAAC AGGGCTGTCAAGAGTTTACAGAACGCATCAGCAATTGAGAGCATTCTTAAAAATCTCCTGCCAT GTCTGCCCCTGGCCACGGCCGCACCCACGCGACATCCAATCCATATCAAGGACGGTGACTGGAA TGAATTCCGGAGGAAACTGACGTTCTATCTGAAAACCCTTGAGAATGCGCAGGCTCAACAGAC GACTTTGAGCCTCGCGATCTTTTGA Kết so sánh mức độ tương đồng phần mềm Blast cho thấy trình tự gen đọc trình tự có độ tương đồng 100 % với gen il-3 (Hình 11) il-3_NM GCTCCCATGACCCAGACAACGCCCTTGAAGACAAGCTGGGTTAACTGCTCTAACATGATC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| il-3_pJET il-3_NM GCTCCCATGACCCAGACAACGCCCTTGAAGACAAGCTGGGTTAACTGCTCTAACATGATC 61 GATGAAATTATAACACACTTAAAGCAGCCACCTTTGCCTTTGCTGGACTTCAACAACCTC 60 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| il-3_pJET il-3_NM 61 GATGAAATTATAACACACTTAAAGCAGCCACCTTTGCCTTTGCTGGACTTCAACAACCTC 120 121 AATGGGGAAGACCAAGACATTCTGATGGAAAATAACCTTCGAAGGCCAAACCTGGAGGCA 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| il-3_pJET 121 AATGGGGAAGACCAAGACATTCTGATGGAAAATAACCTTCGAAGGCCAAACCTGGAGGCA 180 il-3_NM 240 181 TTCAACAGGGCTGTCAAGAGTTTACAGAACGCATCAGCAATTGAGAGCATTCTTAAAAAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| il-3_pJET 181 TTCAACAGGGCTGTCAAGAGTTTACAGAACGCATCAGCAATTGAGAGCATTCTTAAAAAT 240 il-3_NM 300 241 CTCCTGCCATGTCTGCCCCTGGCCACGGCCGCACCCACGCGACATCCAATCCATATCAAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| il-3_pJET 241 CTCCTGCCATGTCTGCCCCTGGCCACGGCCGCACCCACGCGACATCCAATCCATATCAAG 300 il-3_NM 360 301 GACGGTGACTGGAATGAATTCCGGAGGAAACTGACGTTCTATCTGAAAACCCTTGAGAAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| il-3_pJET 301 GACGGTGACTGGAATGAATTCCGGAGGAAACTGACGTTCTATCTGAAAACCCTTGAGAAT il-3_NM 361 GCGCAGGCTCAACAGACGACTTTGAGCCTCGCGATCTTTTGA 360 402 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| il-3_pJET 361 GCGCAGGCTCAACAGACGACTTTGAGCCTCGCGATCTTTTGA 402 Hình 11 So sánh trình tự gen il-3 thiết kế với trình tự gen ngân hàng gen quốc tế il-3_NM: trình tự gen il-3 ngân hàng gen quốc tế mã số NM_000588; il-3_pJET: trình tự gen il-3 vector pJET1.2_il-3 Như vậy, tạo dòng biến nạp E coli DH10B mang plasmid pJET1.2 chứa gen il-3 quan tâm Vector tách dòng mang gen il-3 32 sử dụng làm nguyên liệu cung cấp gen il-3 việc thiết kế vector biểu để biểu gen il-3 tế bào E coli JM109 3.3 Thiết kế vector biểu pET22b(+) mang gen il-3 3.3.1 Nối ghép gen il-3 vào vector pET 22b(+) Với mục đích đưa gen il-3 vào vector biểu pET22b(+) vị trí cắt NdeI NotI, trước hết, tiến hành xử lý đồng thời vector pET22b(+) vector tách dòng pJET1.2_il-3 cặp enzyme hạn chế NdeI NotI để tạo đầu dính tương thích Sản phẩm cắt sau điện di phân tách gel thu nhận băng ADN quan tâm Các băng ADN tinh kit gel Qiagen điện di kiểm tra gel agarose 0,8 % (Hình 12) Hình 12 Điện di sản phẩm tinh plasmid pET22b(+) gen il-3 xử lý với cặp enzyme NdeI NotI 1: il-3 cắt NdeI NotI ; 2: pET22b(+) NotI NdeI ; M: Marker 1kb (Fermentas) Kết tinh plasmid pET22b(+) gen il-3 Hình 12 cho thấy sản phẩm sau tinh băng ADN với kích thước kb tương ứng với kích thước vector pET22b(+) (5371 bp) sau cắt với cặp enzyme NdeI NotI; băng ADN khoảng 400 bp tương ứng với kích thước đoạn gen il-3 theo tính toán lý thuyết (402 bp) Các băng ADN có độ cao Như tinh thành công vector gen với đầu dính tương thích sẵn sàng cho phản ứng nối gen vào vector biểu Cả hai nguồn ADN nối với T4 ligase phản ứng lai mô tả phần phương pháp nghiên cứu để tạo thành vector tái tổ hợp pET22_il-3 Để kiểm tra phản ứng nối ghép gen có thành công hay không, hỗn hợp phản ứng lai ghép 33 sau biến nạp vào tế bào khả biến DH10B tiến hành chọn dòng chứa vector biểu mang gen mong muốn 3.3.2 Tạo tế bào E coli DH10B mang vector biểu pET22_il-3 Sản phẩmm lai ghép gen il-3 vào vector pET22b(+) biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH10B phương pháp sốc nhiệt mô tả phần phương pháp nghiên cứu Sản phẩm biến nạp cấy trải môi trường thạch đĩa LBamp qua đêm 37oC Plasmid pET22b(+) không mang gen biến nạp song song để làm đối chứng Chỉ dòng tế bào nhận plasmid chứa trình tự gen kháng ampicillin có khả mọc môi trường chứa kháng sinh tế bào không mang plasmid không sống môi trường Hình 13 kết sau biến nạp pET22_il-3 vào tế bào E coli DH10B Hình 13 Đĩa biến nạp sản phẩm nối ghép gen pET22_il-3 vào tế bào khả biến DH10B Kết biến nạp cho thấy đĩa nuôi cấy chứa kháng sinh chọn lọc ampicillin, khuẩn lạc mọc riêng rẽ, kích thước tương đối đồng nhất, bề mặt nhẵn sáng bóng điển hình tế bào E coli Để xác định dòng biến nạp có nhận plasmid tái tổ hợp mang gen il-3 hay không, tiến hành tách ADN plasmid từ dòng biến nạp cắt kiểm tra kích thước đoạn chèn cặp enzyme hạn chế NdeI NotI 3.3.3 Tách chiết ADN plasmid từ dòng biến nạp pET22b_il-3 Sau biến nạp vector biểu pET22b(+) mang gen il-3 vào tế bào E coli DH10B, lựa chọn ngẫu nhiên 16 khuẩn lạc mọc đĩa biến nạp để tiến hành tách ADN plasmid điện di kiểm tra gel agarose 0,8 % Hình 14 kết tách chiết ADN plasmid tái tổ hợp từ 16 dòng biến nạp pET22_il-3 34 Theo lý thuyết, vector pET22b(+) có kích thước khoảng 5,4 kb, đoạn gen il-3 có kích thước 402 bp nên vector tái tổ hợp có kích thước gần kb Theo nguyên lý điện di, điện trường không đổi, ADN có kích thước khác có tốc độ chạy nhanh hay chậm khác nhau, phân tách thành băng khác gel agarose Do đó, plasmid tái tổ hợp có kích thước lớn di chuyển chậm so với plasmid đối chứng không mang gen Hình 14 Điện di kiểm tra ADN plasmid tách từ dòng biến nạp pET22_il-3 tế bào E coli DH10B 1-16: 16 dòng biến nạp pET22_il-3; pET: plasmid pET22b(+) (đối chứng) Kết tách chiết ADN plasmid Hình 14 cho thấy, số 16 dòng chọn, ngoại trừ dòng hầu hết tất dòng băng kích thước ADN cao so với mẫu đối chứng plasmid pET22b(+) không mang gen Theo tính toán trên, vector pET22b(+) mang gen il-3 có kích thước khoảng kb, điện di cho băng ADN cao chút so với đối chứng pET22b(+) có kích thước khoảng 5,4 kb Vì vậy, dòng có khả lớn mang thêm đoạn chèn vào vector Để kiểm tra ADN plasmid tách chiết có thực mang gen il-3 hay không, sử dụng cặp enzyme hạn chế NotI NdeI để cắt đoạn chèn khỏi vector đánh giá kích thước đoạn chèn 3.3.4 Kiểm tra có mặt gen il-3 vector biểu pET22b(+) enzyme hạn chế Sau tách chiết ADN plasmid, 14 dòng xác định có kích thước lớn plasmid pET22b(+) nghĩa có khả nhận thêm đoạn chèn xử lý cặp enzyme hạn chế NdeI NotI để kiểm tra kích thước đoạn gen chèn vào vector pET22b(+) Sản phầm từ phản ứng cắt điện di kiểm tra gel agarose 0,8 % (Hình 15) 35 Hình 15 Điện di kiểm tra sản phẩm cắt dòng ADN plasmid cặp enzyme hạn chế NdeI NotI 1,3,4,5,6,7,8.10,11,12,13,14,15,16: 14 dòng ADN plasmid cắt NdeI NotI; M: ADN marker 1kb (Fermentas) Hai đầu gen il-3 thiết kế có điểm nhận biết cặp enzyme NdeI NotI Vì theo tính toán, dòng ADN plasmid vector pET22b(+) chứa gen il-3 sau cắt cặp enzyme hạn chế NdeI NotI tạo băng ADN có kích thước tương ứng với đoạn gen Hình 15 cho thấy, ngoại trừ đường chạy dòng số 6, 13 đường chạy lại xuất băng: băng thứ có kích thước khoảng 5,4 kb tương ứng với kích thước plasmid pET22b(+); băng thứ hai có kích thước 400 bp phù hợp với kích thước gen il-3 Điều chứng tỏ 13 dòng ADN plasmid vector pET22b(+) mang gen il-3 quan tâm Như tạo vector biểu pET22b(+) mang gen il-3 Công việc biến nạp ADN plasmid tái tổ hợp pET22_il-3 vào tế bào biểu E coli JM109 để tạo chủng tái tổ hợp có khả tổng hợp protein IL-3 tiến hành nghiên cứu biểu thử gen 3.4 Biểu gen il-3 tái tổ hợp chủng E.coli JM109 (DE3) 3.4.1 Tạo tế bào E coli JM109(DE3) mang vector biểu pET22b_il-3 Sau tạo vector biểu pET22b(+) mang gen il-3, tiến hành biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào biểu E coli JM109 phương pháp sốc nhiệt Sản phẩm biến nạp cấy trải môi trường chọn lọc có chứa ampicillin Chỉ dòng tế bào nhận plasmid tái tổ hợp phát triển môi trường chứa kháng sinh Plasmid pET22b(+) không mang gen biến nạp 36 song song vào tế bào khả biến E coli JM109 để làm đối chứng Kết biến nạp trình bày Hình 16 Hình 16 Đĩa biến nạp pET22b_il-3 vào tế bào E coli JM109 (DE3) Kết biến nạp cho thấy có 28 khuẩn lạc mọc môi trường chọn lọc có chất kháng sinh ampicillin Các khuẩn lạc có kích thước đồng nhất, mọc riêng rẽ, có bề mặt sáng bóng điển hình tế bào E coli Như vậy, chuyển thành công plasmid tái tổ hợp pET22_il-3 vào chủng biểu E coli JM109 Công việc nuôi cấy dòng mang gen il-3 cảm ứng để biểu protein IL-3 quan tâm 3.4.2 Biểu gen il-3 tái tổ hợp chủng E coli JM109 (DE3) Trong vector biểu pET22b(+), hoạt động gen il-3 điều khiển operon lac với chế kiểm soát chặt chẽ chất cảm ứng IPTG Sau biến nạp, lựa chọn ngẫu nhiên dòng biến nạp E coli JM109 mang gen il-3 nuôi cấy qua đêm môi trường LBAmp lỏng 37oC, 200 vòng/phút, sau cấy chuyển sang môi trường LBamp cảm ứng tổng hợp protein IL-3 0,5 mM IPTG 30oC mô tả phần phương pháp nghiên cứu Chủng đối chứng không mang gen (đối chứng âm) nuôi cấy điều kiện Sau lên men, tế bào thu lại để kiểm tra mức độ biểu protein IL-3 tái tổ hợp Mật độ tế bào (OD600) chủng sau cảm ứng dao động khoảng 0,9 - Tất mẫu sau ly tâm thu sinh khối tế bào, đưa giá trị OD600 = 10 dH2O để đánh giá khả tổng hợp protein đơn vị tế bào mẫu với tiến hành điện di biến tính gel SDS-PAGE 14 % Các băng protein phát phương pháp nhuộm Coomassie (Hình 17) 37 Hình 17 SDS-PAGE kiểm tra biểu protein IL-3 tái tổ hợp chủng E coli JM109 1-3: Các dòng biến nạp mang gen il-3; ĐC: Chủng đối chứng không mang gen; M: Thang protein chuẩn (Fermentas) Quan sát so sánh kết kiểm tra biểu protein Hình 17 cho thấy khác biệt băng protein dòng biến nạp (dòng số 1-3) so với chủng đối chứng không mang gen (ĐC) Như vậy, dự đoán protein IL3 chủng E coli tái tổ hợp biểu mức độ yếu nên khó nhận ảnh kết điện di nhuộm Coomassie Vì vậy, để kiểm tra mức độ biểu gen khẳng định chủng E coli tái tổ hợp mang gen il-3 có tổng hợp protein IL-3 hay không, phản ứng liên kết miễn dịch với kháng thể đặc hiệu kháng IL-3 thực 3.4.3 Kiểm tra tính kháng nguyên IL-3 tái tổ hợp phản ứng lai Western blot Chúng sử dụng kháng thể kháng IL-3 người đặc hiệu để tiến hành phản ứng lai Western blot Sau điện di gel biến tính SDS-PAGE 14 %, tất protein chuyển sang màng PVDF phủ màng với kháng thể đặc hiệu kháng IL-3 Tiếp tục phủ màng với kháng thể cộng hợp gắn enzyme peroxidaza kháng thể nhận biết kháng thể kháng IL-3 Enzyme có phản ứng với chất tạo màu, phát phức hợp kháng nguyên kháng thể nói 38 Hình 18 Western blot xác định protein tái tổ hợp IL-3 biểu từ dòng E coli JM109 tái tổ hợp mang gen il-3 1-3: dòng biến nạp mang gen il-3; ĐC: Chủng đối chứng không mang gen; IL3: hIL-3 người chuẩn; M: Thang protein chuẩn (Fermentas) Kết liên kết miễn dịch từ Hình 18 cho thấy tất các dòng biểu (1-3) có băng protein bắt cặp với kháng thể đặc hiệu kháng IL-3 Băng có kích thước khoảng gần 15 kDa, tương ứng với kích thước protein IL-3 chuẩn Trong đó, chủng đối chứng không mang gen (đường chạy ĐC) không cho tín hiệu kháng thể đặc hiệu Điều chứng tỏ gen il-3 biểu từ chủng biến nạp E coli Tuy nhiên đối chiếu với kết nhuộm Coomassie, thấy mức độ biểu protein IL-3 tương đối thấp 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Với mục tiêu đặt trình thực đề tài: “Tách dòng biểu gen interleukin-3 người tái tổ hợp chủng Escherichia coli”, hoàn thành công việc sau : - Tách dòng thành công gen il-3 vector tách dòng pJET1.2 - Thiết kế vector biểu pET22b(+) mang gen il-3 - Biểu thành công protein IL-3 chủng biểu E coli JM109 (DE3) Kiến nghị Để tiếp tục hướng nghiên cứu này, có kiến nghị sau: Khảo sát điều kiện lên men thích hợp cho biểu protein IL-3 E coli tái tổ hợp môi trường lên men, nhiệt độ biểu hiện, nồng độ chất cảm ứng, pH môi trường,… 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Anh Kotb Malak Calandra Thierry (2003), Cytokines and Chemokines in Infectious Diseases Handbook (Humana Press)., Antony G.K and Dudek A.Z (2010) Interleukin in cancer therapy Curr Med Chem, 17(29), 3297–3302 Leone A., Picker L.J., Sodora D.L (2009) IL-2, IL-7 and IL-15 as immunomodulators during SIV/HIV vaccination and treatment Curr HIV Res, 7(1), 83–90 Niemeyer C.M., Sieff C.A., Mathey-Prevot B et al (1989) Expression of human interleukin-3 (multi-CSF) is restricted to human lymphocytes and T-cell tumor lines Blood, 73(4), 945–951 Jamur M.C and Oliver C (2011) Origin, maturation and recruitment of mast cell precursors Front Biosci Sch Ed, 3, 1390–1406 Rissoan M.C., Soumelis V., Kadowaki N et al (1999) Reciprocal control of T helper cell and dendritic cell differentiation Science, 283(5405), 1183–1186 Higgins, D.R and Cregg, J.M (1998), Pichia Protocols (Humana Press), Klein, B.K., Feng, Y., McWherter, C.A., et al (1997) The receptor binding site of human interleukin-3 defined by mutagenesis and molecular modeling J Biol Chem.272 22630–22641 Ziltener H.J., Clark-Lewis I., Jones A.T et al (1994) Carbohydrate does not modulate the in vivo effects of injected interleukin-3 Exp Hematol, 22(11), 1070– 1075 10 Lindemann A Mertelsmann R (1993) Interleukin-3: structure and function Cancer Invest, 11(5), 609–623 11 Schrader, J.W (2003) Chapter - Interleukin-3.In The Cytokine Handbook (Fourth Edition), Angus W Thomson, and Michael T Lotze, eds Academic Press, London, pp 201–225 12 Korenaga M., Watanabe N., Abe T et al (1996) Acceleration of IgE responses by treatment with recombinant interleukin-3 prior to infection with Trichinella spiralis in mice Immunology, 87(4), 642–646 41 13 De Wilt J.H., Bout A., Eggermont A.M et al (2001) Adenovirus-mediated interleukin beta gene transfer by isolated limb perfusion inhibits growth of limb sarcoma in rats Hum Gene Ther, 12(5), 489–502 14 Schroeder J.T., Chichester K.L., Bieneman A.P (2009) Human basophils secrete IL-3: evidence of autocrine priming for phenotypic and functional responses in allergic disease J Immunol Baltim Md 1950, 182(4), 2432–2438 15 Urdal D.L and Sassenfeld H.M (1992) Nonglycosylated human interleukin-3 analog proteins , accessed: 08/04/2015 17 Rosenberg S.A and Lotze M.T (1986) Cancer immunotherapy using interleukin-2 and interleukin-2-activated lymphocytes Annu Rev Immunol, 4, 681– 709 18 Rosenberg S.A., Anderson W.F., Blaese M et al (1993) The development of gene therapy for the treatment of cancer Ann Surg, 218(4), 455–464 19 Cooper, M.A., and Caligiuri, M.A (2003) Chapter 53 - Cytokines and cancer In The Cytokine Handbook (Fourth Edition), Angus W Thomson, and Michael T Lotze, eds Academic Press, London, pp 1213–XLIV 21 Cohen S.N., Chang A.C.Y., Boyer H.W et al (1973) Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmids In Vitro Proc Natl Acad Sci U S A, 70(11), 3240–3244 22 G M Bhopale R K Nanda (2005), (G M Bhopale and R K Nanda (2005) Recombinant DNA expression products for human therapeutic use Current Science 89.)., Current Sinen 89 23 Glick, B.R Pasternak, J.J Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press).) , 24 Blattner F.R., Plunkett G., Bloch C.A et al (1997) The complete genome sequence of Escherichia coli K-12 Science, 277(5331), 1453–1462 25 Baneyx F (1999) Recombinant protein expression in Escherichia coli Curr Opin Biotechnol, 10(5), 411–421 26 CloneJETTM PCR Cloning Kit ABO - Odczynniki i wyposażenie laboratoryjne., , accessed: 04/05/2015 42 27 Terpe K (2006) Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems Appl Microbiol Biotechnol, 72(2), 211–222 28 Guengerich F.P., Gillam E.M., Ohmori S and et al (1993) Expression of human cytochrome P450 enzymes in yeast and bacteria and relevance to studies on catalytic specificity Toxicology, 82(1-3), 21–37 29 Studier F.W Moffatt B.A (1986) Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes J Mol Biol, 189(1), 113– 130 30 Dubendorff J.W and Studier F.W (1991) Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor J Mol Biol, 219(1), 45–59 31 Sockolosky J.T Szoka F.C (2013) Periplasmic production via the pET expression system of soluble, bioactive human growth hormone Protein Expr Purif, 87(2), 129–135 Tài liệu tiếng Viêt 16 Nguyễn Thanh Đạm (2004), Miễn dịch điều trị bênh ung thư, Nhà xuất Y học 20 Phạm Văn Ty (2001) Miễn dịch học nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 43 [...]... pJET1.2_il -3 3219 bp pET22b + 54 93 bp lacI AmpR PlacUV5 O ri Rep(pMB1) NdeI +NotI T4 DNA ligase Il -3 Gen il -3 pET22b+_il3 5918 bp lacI AmpR O ri Biểu hiện gen il -3 trong E Coli JM109 Hình 4 Sơ đồ tách dòng và biểu hiện gen mã hóa IL -3 người tái tổ hợp trong chủng E .coli 26 3. 1 Nhân gen il -3 bằng kỹ thuật PCR Để nhân gen il -3 cho mục đích tách dòng gen trong hệ biểu hiện E coli, vector pUC57_il -3 mang gen il -3. .. vector biểu hiện pET22b_il -3 - Biểu hiện gen il -3 tái tổ hợp trong chủng E coli JM109 Dưới đây là sơ đồ khái quát của quá trình thực hiện đề tài tách dòng và biểu hiện gen mã hóa IL -3 người tái tổ hợp trong chủng E coli Gen il -3 BgIII PT7 R Amp pUC57_il3 31 35bp Bla (ApR ) Rep(pMB1) V?trí chèn gen BgIII pJET1.2/blunt 2974bp Eco47IR P lacUV5 Dream Taq polymerase PCR Gen il3 Rep(pMB1) T4 DNA ligase PT7... phòng trong 1 giờ Lặp lại bước rửa màng như trên và hiện màu quan sát sự xuất hiện của băng protein quan tâm bằng dung dịch TMB 25 PHẦN III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Với đề tài nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen mã hóa IL -3 người tái tổ hợp trong E coli JM109, chúng tôi tiến hành những nội dung nghiên cứu sau: - Nhân gen mã hóa IL -3 người - Tạo vector tách dòng pJET1.2_il -3 - Tạo vector biểu hiện pET22b_il -3. .. His-tag [31 ] Đuôi His-tag giúp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng sắc kí ái lực 12 Hình 3 Vector pET 22b(+) 13 PHẦN II : PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3. 1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 3. 1.1 Các chủng vi sinh vật và plasmid - Chủng E coli DH10B được sử dụng cho mục đích tách dòng gen Chủng E coli JM109 (DE3) được sử dụng làm chủng biểu hiện gen - Plasmid pJET1.2/ Blunt được sử dụng làm vector tách dòng Plasmid... il -3 chèn vào; gen il -3 chưa được gắn vào vector; và vector tái tổ hợp pJET1.2 mang gen il -3 Do đó để kiểm tra phản ứng nối gen có thành công hay không và sàng lọc được dòng vector tái tổ hợp mang gen mong muốn, chúng tôi biến nạp sản phẩm của phản ứng lai ghép vào tế bào E coli DH10B để tiến hành chọn dòng 3. 2.2 Tạo tế bào E coli DH10B mang vector tách dòng pJET1.2_il -3 Để biến nạp ADN plasmid vào... tại và tái bản nhiều lần trong tế bào E coli Hơn nữa, những đặc điểm di truyền và sinh lý của E coli đã được nghiên cứu đầy đủ qua nhiều năm Vì vậy trên thị trường đã tạo ra nhiều loại vector và các chủng E coli đột biến đa dạng, trở thành một vật chủ hữu hiệu trong kỹ thuật tách dòng và biểu hiện gen [25] Chủng vi khuẩn E coli DH10B là một chủng như vậy, nó đã được cải biến để phục vụ cho mục đích tách. .. E .coli chứa ADN tái tổ hợp Gen gây chết, dùng để chọn lọc tế bào mang plasmid tái tổ hợp Vị trí trên vector 1148-1762 284 -32 8 1922-2782 16-7 53 Promoter Plac đã được biến đổi cho việc biểu hiện gen PlacUV5 eco471IR để tăng tính chọn lọc mà không cần cảm 761-892 ứng bởi IPTG Vị trí nhân dòng Vị trí đầu bằng của vector để nối với đoạn ADN ngoại lai cần cài vào 32 8-422 2 .3 Hệ biểu hiện E coli 2 .3. 1 Chủng. .. trình biểu hiện gen đó E coli không có khả năng sửa đổi sau khi dịch mã, dó đó gây hạn chế ở các protein được phosphoryl hóa, glycosyl hóa…hoặc kết hợp với lipid để tạo lipoprotein Hiện tại, có nhiều chủng E coli và mỗi chủng lại có một đặc điểm khác nhau, tùy theo đặc tính protein muốn biểu hiện trong vector nào mà lựa chọn chủng biểu hiện E coli cho phù hợp với từng mục đích sử dụng Một số chủng. .. alkaline phosphatases và nucleases là không thể thiếu được trong trong công nghệ ADN tái tổ hợp [ 23] Hầu hết các loại IL đều có thể được nghiên cứu để tạo ra dưới dạng tái tổ hợp Tuy nhiên, dựa vào cấu trúc và trình tự khác biệt trong chuỗi amino acid cấu thành nên phân tử IL mà người ta có thể lựa chọn phương pháp cũng như hệ tế bào chủ khác nhau để biểu hiện tạo sản phẩm tái tổ hợp đó Tách dòng gen (gene... biến để biểu hiện protein ngoại lai như: Chủng vi khuẩn SoluBL21 E coli là chủng chủ BL21 được cải thiện đáng kể tính hòa tan của protein biểu hiện ra trong hầu hết các trường hợp trong khi chủng gốc BL21(DE3) hầu như không tạo ra protein hòa tan nào ngay cả ở hàm lượng thấp nhất Chủng vi khuẩn JM109 (DE3), có nguồn gốc từ JM109, có một bản copy gen mã hóa cho T7 RNA polymerase Chủng JM109 (DE3) được