Đánh giá đặc tính thành thành phần tinh dầu một số loài bạch đàn (eucalyptus) trồng ở việt nam và mối liên hệ của nó với một số vấn đề sinh thái môi trường điển hình

Mục tiêu của đề tài nhằm đánh giá vai trò của các chất chính có mặttrong tinh dầu một số loài Bạch đàn trồng ở Việt Nam đối với môi trườngsinh thái; đồng thời trên cơ sở một số hoạt tính

MỞ ĐẦU

Bạch đàn (Eucalyptus) là loài cây bản địa của Australia được trồng phổ

biến trên thế giới với hơn 700 loài khác nhau Tại Việt Nam, Bạch đàn cũng

là loài cây được trồng khá phổ biến để lấy nguyên liệu, tuy nhiên thực tế chothấy các loài cây khác phát triển dưới tán rừng Bạch đàn rất chậm, đặc biệt làcác loài cỏ dại Đồng thời những nghiên cứu cho thấy có sự nghèo nàn về tính

đa dạng sinh học dưới tán rừng Bạch đàn, đặc biệt là một số loài côn trùng

Do đó đã có rất nhiều các quan điểm khác nhau của các nhà khoa học trong vàngoài nước giải thích về vấn đề này và cho đến nay các quan điểm đó vẫnchưa thật thống nhất Trong khi đó Bạch đàn được biết là loài cây có hàmlượng tinh dầu trong lá khá lớn Vậy phải chăng tinh dầu của nó có liên quanđến các vấn đề trên, nó có tác động như thế nào đối với sinh vật trong hệ sinhthái? Các tính chất của tinh dầu phụ thuộc hoàn toàn vào thành phần các chất

có mặt trong tinh dầu Thành phần, cũng như hàm lượng của các chất trongtinh dầu rất khác nhau giữa các loài Bạch đàn, tuổi của cây và các điều kiện tự

nhiên Do đó việc thực hiện đề tài: “Đánh giá đặc tính thành thành phần tinh dầu một số loài Bạch đàn (Eucalyptus) trồng ở Việt Nam và mối liên

hệ của nó với một số vấn đề sinh thái môi trường điển hình’’ là rất cần thiết,

góp phần giải quyết các vấn đề nêu trên

Mục tiêu của đề tài nhằm đánh giá vai trò của các chất chính có mặttrong tinh dầu một số loài Bạch đàn trồng ở Việt Nam đối với môi trườngsinh thái; đồng thời trên cơ sở một số hoạt tính sinh học của các chất sẽ đềxuất hướng sử dụng các loài Bạch đàn theo hướng thân thiện với môi trường

Để thực hiện được các mục tiêu trên, luận văn tập trung giải quyết cácnội dung chính sau:

- Khảo sát các phương pháp tách chiết tinh dầu từ lá Bạch đàn;

- Xác định và đánh giá các hoạt tính sinh học của các chất chính cótrong tinh dầu các loài Bạch đàn nghiên cứu;

- Bước đầu đánh giá một số ảnh hưởng của tinh dầu Bạch đàn đến môitrường sinh thái

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Một vài nét về cây Bạch đàn

Bạch đàn còn gọi là cây Khuynh diệp, tên khoa học là Eucalyptus thuộc

họ Sim (Myrtaceae) Tên Bạch đàn là tên có từ lâu ở vùng Nghệ An, Hà Tĩnh,tên Khuynh diệp là do mùi tinh dầu có mùi tinh dầu Tràm Hiện nay tên Bạchđàn được dùng phổ biến hơn [2]

Bạch đàn là một chi có số lượng loài khá lớn, theo Lã Đình Mỡi vàcộng sự, Bạch đàn ước có khoảng trên 500 loài, theo Dairy R.Batish và cộng

sự Bạch đàn có khoảng 700 loài khác nhau, còn theo Lê Văn Truyền và cộng

sự Bạch đàn có tới 800 loài khác nhau Hầu hết số loài trong chi là đặc hữucủa Australia Chỉ có hai loài phân bố tự nhiên trong khu vực Malesian (NewGuinea, Moluccas, Sulawesi, quần đảo Lesser Sunda và Philippin) Một vàiloài có biên độ sinh thái rộng, phân bố trong khu vực kéo dài từ miền BắcAustralia đến miền Đông Malesian Những nghiên cứu gần đây đã phát hiệnđược khoảng trên 10 loài có phân bố ở miền Nam New Guinea Người ta chorằng, việc điều tra, nghiên cứu, khai thác các thảm thực vật rừng gió mùa vàcác savan tại khu vực rộng lớn phía Đông Nam của vùng Đông Nam Á chắcchắn sẽ còn phát hiện thêm nhiều loài mới nữa thuộc chi Bạch đàn Tính đãdạng của chi Bạch đàn tại vùng ven biển của New Sounth Wales và miền TâyNam Australia đã và đang được đánh giá cao [3]

Hiện nay rất nhiều loài đã được đưa trồng ngoài vùng phân bố tự nhiêncủa chúng Nhiều dải rừng Bạch đàn đã được hình thành ở nước ta; các nướclục địa châu Á; các nước nhiệt đới, cận nhiệt đới châu Phi, khu vực Địa TrungHải và miền Nam châu Âu đến các khu vực Nam và Trung châu Mỹ [2]

Ở Việt Nam, lần đầu tiên Bạch đàn được Brochet tìm thấy ở Cốc Lếutỉnh Lào Cai vào năm 1904 (Hoàng Hòe, 1996) Ngày nay có khoảng trên 20

loài Bạch đàn đã được trồng ở Việt Nam trong đó Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis Dehn) được coi như loài có giá trị kinh tế cao, được trồng rộng

rãi ở cả các vùng đất thấp và cao, trừ những đỉnh núi có độ cao trên 1000 mét

so với mực nước biển [10]

Theo Lã Đình Mỡi một số loài Bạch đàn đã được nhập và trồng tươngđối rộng rãi ở Việt Nam như:

- Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis Dehnl., 1832 Tên đồng nghĩa: E rostrata Sch., 1847) Một vài địa phương khác còn gọi là

Bạch đàn camal, Bạch đàn Úc, Khuynh diệp đỏ;

- Bạch đàn chanh (Eucalyptus citriodora Hook., 1848) Còn có các tên đồng nghĩa khác: E melissiodara Lindley, 1848; E variegata E.

v Mueller, 1859; E maculata Hook var citriodora (Hook.) Bailey, 1990; Corymbia citriodora (Hook.) Có nơi ở nước ta còn gọi là

Bạch đàn đỏ;

- Bạch đàn uro (Eucalyptus urophylla S.T Blake, 1977 Còn có tên đồng nghĩa: E alba auct non Reinw.ex Blume, E decaisneana

auct Non Blume);

- Bạch đàn long duyên (Eucalyptus exserta F v Muell.,1859) Có nơi

ỏ nước ta còn gọi là Bạch đàn liễu;

- Bạch đàn lá nhỏ (Eucalyptus tereticornis J E Smith, 1795 Tên đồng nghĩa: E subulata Cunn ex Schauer, 1843);

- Bạch đàn vỏ dày (Eucalyptus robusta Smith, 1849 Các tên đồng nghĩa: E multiflora Rich ex A Gray non Poir (1854); E naudiniana F v Mueller, 1886; E schlechteri Diels, 1992).

Hiện nay với sự phát triển của công nghệ sinh học nên có rất nhiều cácdòng Bạch đàn nuôi cấy mô đã và đang được đưa vào trồng tại các lâm trườngcủa các tỉnh ở nước ta với mục đích chính vẫn là dùng để lấy nguyên liệu cho

sản xuất giấy, gỗ cho xây dựng Các giá trị khác vẫn chưa được nghiên cứu vàquan tâm đúng mức.

Gỗ Bạch đàn thuộc loại có tỉ trọng nhẹ hoặc nặng vừa phải, trong gỗkhông có silica, không mùi vị, dễ gia công chế biến Gỗ Bạch đàn được sửdụng khá rộng rãi trong xây dựng với cấu trúc nhẹ hoặc nặng trung bình(khung cửa, trang trí nội thất, làm sàn nhà) Những năm qua gỗ Bạch đànđược coi là nguồn nguyên liệu quan trọng trong công nghiệp giấy sợi [3]

Một đặc điểm quan trọng của loài Bạch đàn là nó thuộc loài cây chứatinh dầu Tinh dầu được chứa trong lá của rất nhiều loài thuộc chi Bạch đàn.1,8-cineol thường là thành phần chính trong tinh dầu của nhiều loài Bạch đàn.Đây là một nguyên liệu có giá trị trong công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm.Tinh dầu của một số loài đã được dùng làm cao xoa, làm thuốc sát trùng.Nhiều loại tinh dầu lại được dùng làm nguyên liệu để sản xuất thuốc trừ sâubệnh thảo mộc [3] Các loài cung cấp tinh dầu chủ yếu trong chi Bạch đàn là:

Eucalyptus globulus Labil., Eucalyptus polybractea R T Backer, Eucalyptus citriodora Hook Trung Quốc là nước sản xuất tinh dầu Bạch đàn lớn nhất,

tiếp đến là Bồ Đào Nha, Nam Phi và Tây Ban Nha

Về sinh thái, sinh trưởng và phát triển của Bạch đàn: Hầu hết các loàithuộc chi Bạch đàn đều thích nghi với điều kiện khí hậu gió mùa Rất nhiềuloài lại có thể sinh trưởng ở các khu vực có một mùa khô khắc nghiệt trong

năm Bạch đàn vỏ dày (E deglupta) là loài duy nhất trong chi thích nghi với

những vùng đất thấp và sinh trưởng tự nhiên trong các kiểu rừng mưa trên núi

thấp E deglupta cũng sinh trưởng tốt ở những khu vực có tổng lượng mưa

hàng năm lớn (2500 – 5000 mm) Do đó loài này đã được đưa trồng rộng rãi ởkhắp các khu vực có điều kiện nhiệt đới ẩm

Thời kỳ 1960 – 1975, một số loài Bạch đàn như Bạch đàn long duyên

(E exserta), Bạch đàn lá nhỏ (E tereticornis), Bạchddàn đỏ (E robusta),

Bạch đàn chanh (E citriodora) và Bạch đàn trắng (E camaldulensis) đã được

nhập trồng tại nhiều khu vực miền núi và trung du phía Bắc nước ta Riêng

rừng Bạch đàn long duyên (E exserta) có thời kỳ đã lên tới hàng vạn hecta

nhưng năng suất còn thấp, thậm chí có nơi không tạo thành rừng Nhiều nhậnđịnh trái chiều về Bạch đàn đã xuất hiện như năng suất rừng trồng thấp nhưngvẫn cao hơn từ 1,5 đến 3 lần so với Thông nhựa ở thời kỳ khai thác ngắn, 10 -

12 năm Rừng Bạch đàn thường làm khô đất, cạn nguồn nước và diệt lớp câybụi, cây cỏ dưới tán, ) Một số kết quả nghiên cứu của Hoàng Xuân Tý và

cộng sự (1997) đã cho biết Bạch đàn lá nhỏ (E tereticornis) và Bạch đàn long duyên (E exserta) đều có thể sinh trưởng bình thường trên các đất feralit

vùng đồi có nguồn gốc đá mẹ rất khác nhau (như: phiến thạch sét, sa thạch,gownai, phiến thạch mica, phù sa cổ, acgilit, phylit, rhiolit) nếu tầng đất còndày và cung cấp đủ nước

Bạch đàn là một chi lớn thuộc nhóm các chi có dạng quả nang trong họ

Sim (Myrtaceae) Một số tác giả đã đưa ra nhận xét và những đề nghị chia

tách chi Bạch đàn thành những phân chi hoặc nhiều nhóm loài khác nhau (cóthể tới 7-10 nhóm loài tùy thuộc vào từng quan điểm của từng tác giả) Người

ta cũng cho rằng chi Bạch đàn có quan hệ họ hàng rất gần gũi với các chi

Angophora, Arillastrum và Eucalyptopsis trong họ Myrtaceae Kết quả nghiên

cứu về hệ thống phát sinh ở chi Bạch đàn đã cho thấy, chi Bạch đàn

(Eucalyptus) cực kỳ đa dạng và đây cũng là chi có nhiều nguồn gốc (polyphyletic) Nói cách khác, các loài trong chi Bạch đàn (Eucalyptus) có thể

có những lịch sử tiến hóa khác nhau Cũng chính vì vậy mà một số tác giả đã

đề nghị tách chi Bạch đàn thành một số chi khác nhau Hill K.D và Johnson

L.A.S (1995) đã chuyển Bạch đàn chanh (E citriodora Hook.) vào một chi mới là Corymbia citriodora (Hook) [3].

Bạch đàn có thể nhân giống dễ dàng từ hạt và đôi khi bằng cành giâm.Hạt nảy mầm trong vòng 4 - 20 ngày sau khi gieo Hạt Bạch đàn thường rấtnhỏ và nhiều loại đã trở thành thương phẩm ở Australia Tại Thái Lan mỗinăm cũng sản xuất một lượng lớn cho việc gây trồng rừng Theo Lã Đình MỡiBạch đàn sinh trưởng rất nhanh và chế độ chăm sóc, quản lý có quan hệ tớimục đích sử dụng Nếu trồng để lấy nguyên liệu cho công nghiệp giấy sợi thì

có thể thu hoạch ở giai đoạn 6 - 10 năm tuổi Trường hợp để làm gỗ xẻ thì cầntrồng thưa và thu hoạch muộn hơn Hiện nay việc hái lá để cất tinh dầuthường là tận dụng Trường hợp hái lá là chủ yếu thì cần tạo tán sao cho câythấp, sinh cành nhiều để cho khối lượng lá lớn [3]

Như vậy nguồn gen của các loài trong chi Bạch đàn là rất phong phú,

đa dạng trong đó nhiều loài có hàm lượng tinh dầu cao, rất có giá trị Hiện nay

đã xuất hiện nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã bắt đầu đi sâu vàocác ứng dụng của tinh dầu Bạch đàn để sản xuất hóa mỹ phẩm đặc biệt là chếbiến thuốc trừ sâu có nguồn gốc thực vật Như vậy tinh dầu Bạch đàn có rấtnhiều các tính chất khác nhau, trong đó có các độc tính chống lại các loài visinh vật, côn trùng Xét ở một khía cạnh khác thì đây lại là nguyên nhân cóthể dẫn tới suy giảm đa dạng sinh học, tác động kìm hãm sự phát triển của cácloài cây dưới tán và có tác động xấu đến môi trường đất Việc nghiên cứu mộtcách thấu đáo về tinh dầu của loài cây này là cơ sở khoa học rất quan trọng đểgiải thích các vấn đề đã đặt ra ở trên

1.2 Tình hình nghiên cứu về tinh dầu Bạch đàn trên thế giới

Tinh dầu của Bạch đàn đã được biết đến và sử dụng từ hàng trăm nămnay Hiện nay trên thế giới cũng đã có một số nghiên cứu về thành phần vàhoạt tính của tinh dầu Bạch đàn cũng như tác động của nó đến môi sinh.Trong các nghiên cứu đó phải kể đến công trình nghiên cứu của Daizy R

Batish và cộng sự (2008) Trong nghiên cứu này tác giả đã chỉ ra rằng tinh

dầu Bạch đàn có tính chất như một loại thuốc trừ sâu tự nhiên do nó có khảnăng tiêu diệt được nhiều loài sâu bệnh hại cây trồng, nhiều loài vi khuẩn vànấm, muỗi [6] Tuy nhiên tác giả chưa chỉ ra được đâu là hoạt chất có trongtinh dầu Bạch đàn có khả năng đó Tác giả cũng đã liệt kê một số hợp chấtchính trong tinh dầu của một số loài Bạch đàn nhưng chưa chỉ rõ hàm lượngphần trăm có trong tinh dầu, đồng thời trong công trình này tác giả chưa mô tả

rõ phương pháp tách chiết, chưng cất để đạt được hiệu suất cao nhất

Một số tác giả khác như Duke (2004), Brooker và Kleinig (2006), Liu,(2008), đã tập trung nghiên cứu thành phần hóa học trong tinh dầu một sốloài Bạch đàn cùng với một số tính chất của nó Các tác giả đã chỉ ra đượcmột số hợp chất hóa học chính trong tinh dầu một số loài Bạch đàn tuy nhiênchưa thấy các tác giả mô tả phương pháp tách chiết và phân tích tinh dầu.Trong khi đó đây là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nghiêncứu Đặc biệt các tác giả đều thừa nhận rằng thành phần và hàm lượng tinhdầu phụ thuộc rất lớn vào tuổi của lá cây, khí hậu, loại đất trồng, chế độ trồng

và chăm sóc, nguồn gốc giống,

1.2.1 Các hợp chất tự nhiên của tinh dầu Bạch đàn

Theo nghiên cứu của Brooker và Kleinig (2006), tinh dầu Bạch đàn làmột hỗn hợp phức tạp của nhiều monoterpenes và sesquiterpenes khác nhau,cùng với các phenol và oxit, este, rượu, ete, andehyt và keton Thành phầnnày phụ thuộc vào từng loài, khu vực trồng, khí hậu, loại đất và tuổi của lá,chế độ phân bón, đồng thời còn phụ thuộc vào phương pháp tách chiết tinhdầu Hoạt tính trừ sâu hại của tinh dầu Bạch đàn do các thành phần như 1,8-cineole, citronellal, citronellol, citronellyl acetate, p-cymene, eucamalol,limonene, linalool,  -pinene, -terpinene,  -terpineol, alloocimene vàaromadendrene (Watanable, 1993; Li, 1995, 1996; Cimanga, 2002; Deke,2004; Batish., 2006; Liu., 2008) [6] Các hợp chất chính trong tinh dầu Bạch

đàn với hoạt tính trừ sâu tách chiết từ rất nhiều các loại Bạch đàn khác nhaucho ở Bảng 1 [6].

Bảng 1 Thành phần chính của tinh dầu tách chiết từ một số

loài Bạch đàn

1 E camaldulensis Eucamalol Watanabe và cộng sự, 1993

2 E citriodora Citronella Ramezani và cộng sự, 2002

3 E globulus 1,8-Cineole Yang etal, 2004

4 E grandis α-Pinene, 1,8-cineole Lucia etal, 2007

5 E robusta α-Pinene Sartorelli và cộng sự, 2007

6 E urophylla γ-Terpin, Su và cộng sự, 2006

7 E urophylla Alloocimene,α-pinene Liu etal, 2008

Các nghiên cứu tại Trung Quốc đã chỉ ra rằng hàm lượng tinh dầutrong lá tươi của Bạch đàn chanh thay đổi từ 0,5 - 2,0 % Tinh dầu thường cómàu vàng nhạt, tỉ trọng ở 150C từ 0,915 - 0,925; chỉ số chiết quang ở 200C từ -

10 đến -50C Tinh dầu có thành phần chủ yếu là citronellal (65 – 80 %),citronellol (15 – 20 %) và một lượng nhỏ geraniol [3]

Nghiên cứu thành phần hóa học trong tinh dầu Bạch đàn chanh trồng ởAustralia, Boland và cộng sự (1991) đã cung cấp các dẫn liệu sau: citronellal(80,1 %), isoisopulegol (3,4 %), linalool (0,7 %), ß-caryophyllen (0,4 %), ß-pinene (0,4 %), α-pinene (0,1 %) và α-para-dimethylstyren (0,1 %) Các hợpchất còn lại như α-terpineol, geraniol, 1,8-cineole, globulol và viridiflorol chỉ

ở dạng vết [11]

Các thành phần khác nhau của tinh dầu Bạch đàn có tác dụng bổ trợcho các hoạt tính sinh học trừ sâu bệnh (Cimanga et al., 2002) Trong tổng sốcác thành phần khác nhau của tinh dầu Bạch đàn thì 1,8-cienole là thành phầnquan trọng nhất và là một hợp chất đặc trưng cho chi Bạch đàn (Duke, 2004)

1.2.2 Hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn của tinh dầu Bạch đàn

Theo Fiori và cộng sự, (2000), Oluma và Garba (2004), tinh dầu Bạchđàn với các thành phần chính của nó có độc tính kháng rất nhiều các loài vi

khuẩn, nấm và cả mầm bệnh ủ trong đất Chúng làm giảm sự phát triển củanấm sợi [6] Một vài nghiên cứu hiệu quả chống nấm của tinh dầu Bạch đànđược mô tả ở trong Bảng 2.

Năm 2002, Ramezani và cộng sự đã chỉ ra dầu bay hơi của Bạch đànchanh với thành phần chính monoterpene citronelle có một phổ hoạt tính rộngchống nấm, ức chế sự phát triển và có tác dụng làm khô mạch rây của 6 loạinấm Gần đây Lee và cộng sự (2007) đã kết luận rằng dầu thơm của Bạch đànchanh có khả năng kiểm soát được bệnh mốc xám ở táo đến 70% Các nghiêncứu đã kết luận rằng tinh dầu Bạch đàn có thể được sử dụng để hạn chế khảnăng hô hấp của vi khuẩn [6]

Su và cộng sự (2006) đã chứng minh hoạt tính chống nấm của tinh dầu

một số loài Bạch đàn như E grandis, E camaldulensis và E citriodora kháng lại nấm Mildew và nấm gây thối ở gỗ như Aspergillus clavatus, A.niger, Chaetomium alobosum, Penicillium citrinum, Trichoderma viride, Theo

nghiên cứu này các tác giả cho rằng tinh dầu Bạch đàn chanh có thể là sự lựachọn tuyệt vời như một chất bảo quản gỗ, đồ da và vật dụng bằng gỗ [6].Tzortzakis (2007) đã chứng minh rằng tinh dầu Bạch đàn xanh là một sự lựachọn tốt cho bảo quản dâu tây và cà chua trong suốt quá trình vận chuyển,không làm thay đổi độ ngọt, các axit hữu cơ và hàm lượng tổng số cácphenolic [6] Khả năng kháng nấm và vi khuẩn của một số loài Bạch đànđược mô tả trong Bảng 2 [6]

Bảng 2 Hoạt tính kháng kháng nấm và vi khuẩn của tinh dầu

một số loài Bạch đàn

E camaldulensis

(2004)

Nấm ngoài da-Microsporum canis, Microsporum

gypseum, Trichophyton rubrum, Trichophyton

Epidermophyton floccosum

Dhaliwal (2004)

Ngăn ngừa nấm giống Borne: Colletotrichum

graminicola, Phoma sorghina, Fusarium moniliforme

Somda et al (2007)

E citriodora

Microsporum nanum, Trichophyton mentagrophytes

và T.rubrum

Shahi et al (1999)

Sự phát triển và nảy mần của bào tử Didymella

bryoniae

Fiori et al, (2000)

Làm khô mầm bệnh hại lúa Helminthosporium

oryae và Rhizoctonia solani DC

Ramezani, (2002)

Aspergillus sp, Penicilium sp., Fusarium sp và Mucor sp.

Alfazairy (2004)

Phytophthora cactorum, Cryphonectria parasitica

và Fusarium cicrinatum

Lee et al, (2008)

(2002)

Gloeoporium musarum và Phytophthora capsici

Liu al, 2008

(1996)

1.2.3 Hoạt tính xua đuổi, diệt trừ côn trùng của tinh dầu bạch đàn

Tinh dầu Bạch đàn có hoạt tính như một loại thuốc trừ côn trùng tựnhiên để chống lại muỗi và các loài chân đốt gây hại hoặc một vài loài độngvật ăn cỏ Yang và cộng sự (2004) đã công bố rằng tinh dầu của loài Bạch đàn

xanh (E globulus) với hợp chất chính là 1,8-cineole có biểu hiện tính độc chống lại chấy hại da đầu Pediculus humanus capitis Hoạt tính trừ chấy rận

của tinh dầu Bạch đàn tốt hơn cả deltaphenothrin hoặc pyrethrum Giá trị LT50

của tinh dầu Bạch đàn là 0,125 mg/cm2, trong khi đó của delta-phenothrin là0,25 mg/cm2 [6] Năm 2006, Ceferino cũng đã chứng minh trong tinh dầu ởmột số loài Bạch đàn có hoạt tính chống lại một số loài chấy rận hại da đầu.Theo nghiên cứu đó Ceferino đã kết luận rằng tinh dầu bạch đàn có thể được

sử dụng để phát triển các sản phẩm mới cho chữa trị các loài chấy rận hại dađầu [6] Hoạt tính trừ côn trùng của tinh dầu một số loài Bạch đàn được mô tảtrong Bảng 3 [6]

Bảng 3 Hoạt tính trừ côn trùng của tinh dầu một số loài Bạch đàn

E camaldulensis

Xua đuổi muỗi vằn trưởng thành Erler et al (2006)

Giết chết loài Callosobruchus, Sitophilus oryzae và Tribolium castaneum trưởng thành từ 1-7 ngày.

Moharramipour(2007)

Độc với ấu trùng Aedes aegypti. Lucia et al (2007)

Eucalypstus sp Trừ ấu trùng Aedes albopictus, A.

aegypi và Culex pipiens pallens.

Zhu et al (2006)

Vào cuối những năm 1990, một số công trình nghiên cứu công bố chothấy các sản phẩm tinh dầu Bạch đàn chủ yếu sử dụng để xua đuổi các loàicôn trùng Sau đó vào năm 2002 Fraduin và Day cho rằng 30 % tinh dầu Bạchđàn có thể dùng trong xua đuổi muỗi trong 2 giờ, tuy nhiên tinh dầu phải có ítnhất 70 % hàm lượng cineole Lucia và cộng sự, (2007) đã chứng minh rằng

tinh dầu Bạch đàn xanh (E globulus) thì độc với ấu trùng Aedes aegypi và có

giá trị LC50 là 32,4 ppm Năm 2005, Trung tâm Kiểm soát và ngăn chặn bệnh

ở Mỹ đã đề nghị sử dụng tinh dầu Bạch đàn chanh trong đó có p-methane-3,8diol có hoạt tính chống lại virus West Nile gây bệnh Neuological do muỗi.

1.2.4 Hoạt tính trừ cỏ của tinh dầu Bạch đàn

Theo Kohli và cộng sự (1998), Singh và cộng sự (2005), Batish vàcộng sự (2007), Setia và cộng sự (2007) cho rằng tinh dầu của một số loàiBạch đàn có biểu hiện kháng lại các loài cỏ dại và có một tiềm năng tốt cho

kiểm soát cỏ dại Cũng theo Kohli (1998), tinh dầu của loài E tereticornis và

E citriodora khi ở dạng hơi có khả năng làm giảm sự nảy mầm của cỏ hại Parthenium hysterophorus Hơi tinh dầu Bạch đàn có khả năng làm giảm sự

phát triển chlorophyll và hàm lượng nước, sự hô hấp của tế bào trong các loàithực vật trưởng thành Hoạt tính ức chế đó phụ thuộc vào thời gian tiếp xúc vàhiện tượng suy giảm sự phát triển của cỏ dại quan sát được trong thời kỳ tiếpxúc với tinh dầu Sau 14 ngày tiếp xúc với hơi tinh dầu, thực vật đã có nhữngbiểu hiện của sự tổn thương được quan sát như sự úa vàng và chết hoặc sự

gây tổn hại đến mô Tinh dầu của loài E citriodora có tính độc hơn loài E tereticornis và thuộc tính này do sự khác nhau về cấu tạo hóa học của các hợp

chất trong tinh dầu Nghiên cứu của Kohli và cộng sự đã kết luận rằng tinhdầu Bạch đàn đang hứa hẹn tốt cho công tác quản lý cỏ dại Tuy nhiên các tácgiả lại chưa định lượng được những độc tính của nó đối với các loài thực vậtliên đới và các vi sinh vật Theo Batish và cộng sự (2004) cho rằng việc xácđịnh tác động của tinh dầu Bạch đàn tách chiết từ Bạch đàn chanh đối với

một số loài cây trồng như Triticum aestivum, Zea mays, Raphanus sativus và các loài cỏ dại như Cassia occidentalis, Amaranthus viridis và Echinochloa crus-galli Cũng theo nhóm tác giả đã chứng minh tinh dầu đã bộc lộ những

độc tính rất rõ ràng đối với một số loài và ảnh hưởng của tính độc đó rõ hơn

đối với sự nảy mầm của các loài cây nhỏ như A viridis [6].

1.3 Tình hình nghiên cứu về tinh dầu Bạch đàn ở Việt Nam

Hiện nay ở nước ta cây Bạch đàn vẫn là loài cây được trồng chủ yếu đểphủ xanh đất trống đồi núi trọc và để cung cấp nguồn nguyên liệu cho côngnghiệp giấy và xây dựng, cho nên việc nghiên cứu về loài cây này phần lớntập trung vào quá trình trồng và chăm sóc Tuy nhiên bên cạnh giá trị về cungcấp gỗ thì tinh dầu trong lá của chúng còn có một số tính chất rất quý, đặc biệt

là loài Bạch đàn chanh là loài có tinh dầu đáng quan tâm nhất trong chi Bạchđàn ở nước ta Tinh dầu của nó cũng đã được một số tác giả quan tâm vànghiên cứu Theo Lã Đình Mỡi, Bạch đàn không chỉ là loài cây cung cấp gỗcho công nghiệp giấy sợi mà còn là nguồn nguyên liệu lấy tinh dầu cho côngnghiệp dược phẩm, hoá mỹ phẩm và công nghiệp chế biến thuốc trừ sâu cónguồn gốc từ thực vật Do đó Bạch đàn đã và đang là những đối tượng đượcquan tâm nghiên cứu để trồng rừng tại nhiều khu vực khác nhau trên thế giới[4] Đỗ Tất Lợi đã mô tả lá Bạch đàn được dùng để chữa ho, giúp tiêu hóa,ngoài ra còn dùng để chữa cảm sốt [2]

Trong các công trình nghiên cứu về tinh dầu của loài cây này phải kểđến công trình nghiên cứu của Nguyễy Xuân Dũng và cộng sự (1995) Tácgiả đã xác định được khoảng 30 hợp chất trong tổng số khoảng 40 hợp chất có

trong tinh dầu Bạch đàn chanh (Eucalyptus citriodora), hàm lượng tinh dầu

trong lá tươi từ 1,8 - 2,0 %, tỉ trọng 0,87235, tỉ số chiết quang nD20 là 1,45852.Hàm lượng các chất trong tinh dầu như sau: citronellal (72,53 %), isopulegol(12,5 %), citronellol (5,61 %), neo- isopulegon (1,63 %), caryophyllen (1,16

%), 1,8-cineole (0,63 %) [3] Tuy nhiên tác giả cũng chưa mô tả rõ phươngpháp tách chiết và đặc biệt là độ tuổi của cây được chọn lấy mẫu lá nghiêncứu cũng như loại lá nghiên cứu (lá non, lá già hay lá bánh tẻ) Trong khi đócác nghiên cứu về thành phần hoá học trong tinh dầu của loài Bạch đàn này ởAustralia có tỉ lệ các hợp chất so với nghiên cứu của Nguyễn Xuân Dũng có

sự khác nhau đáng kể Đặc biệt trong tất cả các nghiên cứu này các tác giảcũng chưa đánh giá đặc tính của các chất vừa xác định được.

Theo Nguyễn Thị Thái Hằng (1995) thì tinh dầu Bạch đàn trắng

(Eucalyptus camaldulensis) chứa tới 64,79 % hoạt chất 1.8-cineole trong khi

đó hợp chất này theo nghiên cứu của Nguyễn Xuân Dũng chỉ ở dạng vết trong

tinh dầu lá Bạch đàn chanh Đối với Bạch đàn liễu (Eucalyptus exserta), tác

giả Nguyễn Thị Thái Hằng cho rằng hợp chất này chiếm tới 40 % – 82 % tinhdầu trong khi đó theo E Guenther IV, 1950 thì chỉ có 29 % Nguyễn Thị TháiHằng cũng dẫn ra các hợp chất hóa học trong tinh dầu Bạch đàn trắng vàBạch đàn liễu, tuy nhiên cũng như các tác giả khác trên thế giới, ở đây tác giảcũng chưa đề cập đến đặc điểm của mẫu lá được nghiên cứu như về loại lá,tuổi của cây, vị trí địa lý trồng cây và đặc biệt là phương pháp chưng cất, táchchiết tinh dầu cũng như phương pháp phân tích Theo nghiên cứu của NguyễnThị Thái Hằng thì Bạch đàn liễu lá có 0,4 % - 2,0 % tinh dầu, trong đó hợpchất chính là 1,8- cineole chiếm từ 40 % - 82 %

Theo Lã Đình Mỡi, chất Citronella được coi là thành phần chủ yếutrong tinh dầu Bạch đàn chanh Song Bạch đàn chanh không chỉ đa dạng vềhình thái mà còn đa dạng về hoạt động sinh tổng hợp và tích lũy tinh dầu.Hàm lượng citronellal biến động rất rộng (từ 1 % đến 91 %) Căn cứ vàothành phần hóa học chính trong tinh dầu người ta cho rằng ở Australia loàiBạch đàn chanh có thể gồm bốn dạng hóa học:

- Dạng Bạch đàn chanh trong tinh dầu chứa chủ yếu là citronellal (65

- 91 %): loại citronellal;

- Dạng Bạch đàn chanh có các thành phần chính trong tinh dầu gồmcitronellol (khoảng 50 %) và citronellal (1 – 14 %): loại citronellol

và citronellal;

- Dạng Bạch đàn chanh mà thành phần chính trong tinh dầu chỉ gồmcitronellal (20 – 50 %) và guaiol: loại citronellal và guaiol;

- Dạng Bạch đàn chanh với các hydrocacbon là thành phần chủ yếucủa tinh dầu: loại hydrocacbon

Đối với loài Bạch đàn trắng, theo Lã Đình Mỡi hàm lượng tinh dầutrong lá tương đối thấp, chỉ từ 0,14 – 0,28 % và các thành phần chính trongtinh dầu là ß-cymen, phellandren, cuminal, phellandral, geraniol và cineol

Như vậy các nghiên cứu về tinh dầu Bạch đàn ở nước ta cho thấy nó cómột số tính chất quý, có thể dùng làm thuốc Thành phầnh hóa học rất đadạng và phức tạp, đặc biệt có sự khác nhau giữa các loài, tuổi của cây và vị tríđịa lý trồng cây Tuy nhiên trong các nghiên cứu trên chưa thấy các tác giả

mô tả phương pháp chưng cất và tách chiết trong khi đó yếu tố này ảnh hưởngrất lớn đến thành phần và hàm lượng các chất hóa học trong tinh dầu của lá.Trong các loài Bạch đàn mà các tác giả lựa chọn nghiên cứu cũng chưa chỉ rõđược lấy từ các địa phương nào của nước ta

Một trong những vấn đề mà trong hầu tất cả những nghiên cứu của cáctác giả đã dẫn ra ở trên chưa đề cập đến đó là việc nghiên cứu và đánh giáhoạt tính sinh học của các chất chính trong tinh dầu Khi đã dự đoán đượchoạt tính sinh học của các chất chính có mặt trong tinh dầu thì nó sẽ tạo ramột cơ sở khoa học hết sức quan trọng để lựa chọn ra những tính chất cầnthiết tạo thành các sản phẩm thương mại sau khi đã nghiên cứu thử nghiệmtrên các loài động thực vật Đồng thời nó sẽ đóng góp vào cơ sở khoa học đểgiải thích các tác động đến môi trường sinh thái của rừng trồng Bạch đàn ởnước ta và trên thế giới

1.4 Các phương pháp nghiên cứu chưng cất và phân tích tinh dầu

1.4.1 Các phương pháp chưng cất tinh dầu

1.4.1.1 Phương pháp tẩm trích

Phương pháp tẩm trích bằng dung môi dễ bay hơi có nhiều ưu điểm vìtiến hành ở nhiệt độ phòng, nên thành phần hóa học của tinh dầu ít bị thayđổi Phương pháp này không những được áp dụng để trích ly cô kết từ hoa màcòn dùng để tận trích khi các phương pháp khác không trích ly hết hoặc dùng

để trích ly các loại nhựa dầu (oleoresin), gia vị

- Nguyên tắc của phương pháp

Dựa trên hiện tượng thẩm thấu, khuếch tán và hòa tan của tinh dầu cótrong các mô cây bằng các dung môi hữu cơ

- Yêu cầu của dung môi

Yếu tố quan trọng nhất cho sự thành công của phương pháp này là đặctính của dung môi sử dụng, do đó dung môi dùng trong tẩm trích cần phải đạtđược những yêu cầu sau đây:

+ Hòa tan hoàn toàn và nhanh chóng các cấu phần có mùi thơm trongnguyên liệu;

+ Hòa tan kém các hợp chất khác như sáp, nhựa dầu có trong nguyênliệu;

+ Không có tác dụng hóa học với tinh dầu;

+ Không biến chất khi sử dụng lại nhiều lần;

+ Hoàn toàn tinh khiết, không có mùi lạ, không độc, không ăn mònthiết bị, không tạo thành hỗn hợp nổ với không khí và có độ nhớt kém;

+ Nhiệt độ sôi thấp vì khi chưng cất dung dịch trích ly để thu hồi dungmôi, nhiệt độ sôi cao sẽ ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu Điểm sôi củadung môi nên thấp hơn điểm sôi của cấu phần dễ bay hơi nhất trong tinh dầu

+ Ngoài ra, cần có thêm những yếu tố phụ khác như: giá thành thấp,nguồn cung cấp dễ tìm, …

Thường thì không có dung môi nào thỏa mãn tất cả những điều kiện kểtrên Người ta sử dụng cả dung môi không tan trong nước như dietyl ete, ete

dầu hỏa, hexan, cloroform,… lẫn dung môi tan trong nước như etanol, aceton.Trong một số trường hợp người ta còn dùng một hỗn hợp dung môi.

- Quy trình tẩm trích

Phương pháp trích ly thích hợp cho các nguyên liệu có chứa lượng tinhdầu không lớn lắm hoặc có chứa những cấu phần tan được trong nước vàkhông chịu được nhiệt độ quá cao Quy trình kỹ thuật gồm các giai đoạn sau:

+ Tẩm trích: nguyên liệu được ngâm vào dung môi trong bình chứa.Trong một số trường hợp, để gia tăng khả năng trích ly, nguyên liệu cần đượcxay nhỏ trước Hỗn hợp nguyên liệu và dung môi cần được xáo trộn đều trongsuốt thời gian trích ly Nên khảo sát trước xem việc gia nhiệt có cần thiết haykhông, nếu cần, cũng không nên gia nhiệt quá 50oC để không ảnh hưởng đếnmùi thơm của sản phẩm sau này

+ Xử lý dung dịch ly trích: sau khi quá trình tẩm trích kết thúc, dungdịch ly trích được lấy ra và có thể thay thế bằng dung môi mới sau mộtkhoảng thời gian nhất định, tùy theo nguyên liệu Tách nước (nếu có) ra khỏidung dịch, rồi làm khan bằng Na2SO4 và lọc Dung môi phải được thu hồi ởnhiệt độ càng thấp càng tốt để tránh tình trạng sản phẩm bị mất mát và phânhủy Do đó, nên loại dung môi ra khỏi sản phẩm bằng phương pháp cô quaychân không Dung môi thu hồi có thể dùng để trích ly lần nguyên liệu kế tiếp

+ Xử lý sản phẩm trích ly: sau khi thu hồi hoàn toàn dung môi, sảnphẩm là một chất đặc sệt gồm có tinh dầu và một số hợp chất khác như nhựa,sáp, chất béo, cho nên cần phải tách riêng tinh dầu ra Chất đặc sệt này đem đichưng cất bằng hơi nước để tách riêng tinh dầu ra Tinh dầu có mùi thơm tựnhiên, nhưng khối lượng thu được kém, ngoài ra tinh dầu này có chứa một sốcấu phần thơm có nhiệt độ sôi cao nên có tính chất định hương rất tốt

+ Tách dung dịch từ bã: sau khi tháo hết dung dịch trích ly ra khỏi hệthống, trong bã còn chứa một lượng dung dịch rất lớn (khoảng 20 – 30%

lượng dung môi trích ly) Phần dung dịch còn lại nằm trong nguyên liệuthường được lấy ra bằng phương pháp chưng cất hơi nước (trường hợp dungmôi không tan trong nước), hoặc ly tâm, lọc ép (trường hợp dung môi tantrong nước) Sau đó dung dịch này cũng được tách nước, làm khan và nhậpchung với dung dịch trích ly

Chất lượng thành phẩm và hiệu quả của phương pháp trích ly này phụthuộc chủ yếu vào dung môi dùng để trích ly Để đạt kết quả tốt thì dung môi

sử dụng phải thoả mãn được các yêu cầu đã được trình bày ở trên

Vì dung môi dễ bay hơi nên chúng ta cần phải lưu ý đến tỉ lệ thất thoátdung môi trong quy trình trích ly vì việc này có thể ảnh hưởng rất lớn đến giáthành sản phẩm

Trong điều kiện phòng thí nghiệm, khi muốn tiến hành phương pháptẩm trích với dung môi dễ bay hơi thì tiến hành sử dụng phương pháp truyềnthống như khuấy từ ở nhiệt độ phòng hoặc đun – khuấy từ (kèm ống hoànlưu) hay phương pháp dùng Soxhlet Ngoài ra, cùng với sự phát triển ngàycàng mạnh mẽ của “hóa học xanh”, mà ngày nay, chúng ta còn áp dụng cácphương pháp mới như là: tẩm trích có sự hỗ trợ của siêu âm và vi sóng

- Ưu và nhược điểm

+ Ưu điểm: sản phẩm thu được theo phương pháp này thường có mùi

thơm tự nhiên Hiệu suất sản phẩm thu được thường cao hơn các phươngpháp khác

+ Khuyết điểm: yêu cầu cao về thiết bị; thất thoát dung môi; quy trình

tương đối phức tạp và tốn kém chi phí

1.4.1.2 Phương pháp chưng cất hơi nước

Phương pháp này dựa trên sự thẩm thấu, hòa tan, khuếch tán và lôicuốn theo hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các

mô khi tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao Sự khuếch tán sẽ dễ dàng khi tế

bào chứa tinh dầu trương phồng do nguyên liệu tiếp xúc với hơi nước bão hòatrong một thời gian nhất định Trường hợp mô thực vật có chứa sáp, nhựa,axít béo thì khi chưng cất phải được thực hiện trong một thời gian dài vìnhững hợp chất này làm giảm áp suất hơi chung của hệ thống và làm cho sựkhuyếch tán trở nên khó khăn.

- Lý thuyết chưng cất

Chưng cất có thể được định nghĩa là: Sự tách rời các cấu phần của mộthỗn hợp nhiều chất lỏng dựa trên sự khác biệt về áp suất hơi của chúng.Trong trường hợp đơn giản, khi chưng cất một hỗn hợp gồm 2 chất lỏngkhông hòa tan vào nhau, áp suất hơi tổng cộng của hỗn hợp là tổng của hai ápsuất hơi riêng phần Do đó, nhiệt độ sôi của hỗn hợp sẽ tương ứng với áp suấthơi tổng cộng xác định, không tùy thuộc vào thành phần phần trăm của hỗnhợp, miễn là lúc đó hai pha lỏng vẫn còn tồn tại Nếu vẽ đường cong áp suấthơi của từng chất theo nhiệt độ, rồi vẽ đường cong áp suất hơi tổng cộng, thìứng với một áp suất, ta dễ dàng suy ra nhiệt độ sôi tương ứng của hỗn hợp vànhận thấy là nhiệt độ sôi của hỗn hợp luôn luôn thấp hơn nhiệt độ sôi củatừng hợp chất Thí dụ, ở áp suất 760 mmHg nước sôi ở 100oC và benzen sôi ở

80oC và chúng là hai chất lỏng không tan vào nhau Thực hành cho thấy, nếuđun hỗn hợp này dưới áp suất 760 mmHg nó sẽ sôi ở 69oC cho đến khi nàocòn hỗn hợp hai pha lỏng hoà tan vào nhau với bất kì tỉ lệ nào Giản đồ nhiệt

độ sôi theo áp suất cho thấy, tại 69oC, áp suất hơi của nước là 225 mmHg vàbenzen là 535 mmHg Chính vì đặc tính làm giảm nhiệt độ sôi này mà từ lâuphương pháp chưng cất hơi nước là phương pháp đầu tiên dùng để tách tinhdầu ra khỏi nguyên liệu thực vật

- Những ảnh hưởng chính trong sự chưng cất hơi nước

+ Sự khuếch tán

Ngay khi nguyên liệu được làm vỡ vụn thì chỉ có một số mô chứa tinhdầu bị vỡ và cho tinh dầu thoát tự do ra ngoài theo hơi nước lôi cuốn đi Phầnlớn tinh dầu còn lại trong các mô thực vật sẽ tiến dần ra ngoài bề mặt nguyênliệu bằng sự hòa tan và thẩm thấu Von Rechenberg đã mô tả quá trình chưngcất hơi nước như sau: “Ở nhiệt độ nước sôi, một phần tinh dầu hòa tan vàotrong nước có sẵn trong tế bào thực vật Dung dịch này sẽ thẩm thấu dần ra bềmặt nguyên liệu và bị hơi nước cuốn đi Còn nước đi vào nguyên liệu theochiều ngược lại và tinh dầu lại tiếp tục bị hòa tan vào lượng nước này Quytrình này lặp đi lặp lại cho đến khi tinh dầu trong các mô thoát ra ngoài hết

Như vậy, sự hiện diện của nước rất cần thiết, cho nên trong trường hợpchưng cất sử dụng hơi nước quá nhiệt cần tránh để nguyên liệu bị khô Nhưngnếu lượng nước sử dụng thừa cũng không có lợi, nhất là trong trường hợp tinhdầu có chứa những cấu phần tan dễ trong nước

Ngoài ra, vì nguyên liệu được làm vỡ vụn ra càng nhiều càng tốt, nênkhi đó cần làm cho lớp nguyên liệu có một độ xốp nhất định để hơi nước cóthể đi xuyên ngang lớp này đồng đều và dễ dàng

+ Sự thủy phân

Những cấu phần este trong tinh dầu thường dễ bị thủy phân tạo ra axit

và rượu khi đun nóng trong một thời gian dài với nước Do đó, để hạn chếhiện tượng này, sự chưng cất hơi nước phải được thực hiện trong một thờigian càng ngắn càng tốt

+ Nhiệt độ

Nhiệt độ cao làm phân hủy tinh dầu Do đó, khi cần thiết phải dùng hơinước quá nhiệt (trên 100oC) và thực hiện việc này trong giai đoạn cuối cùngcủa sự chưng cất sau khi các cấu phần dễ bay hơi đã lôi cuốn đi hết Thực ra,hầu hết các tinh dầu đều kém bền dưới tác dụng của nhiệt nên vấn đề là làmsao cho thời gian chịu nhiệt độ cao của tinh dầu càng ngắn càng tốt

Tóm lại, dù ba ảnh hưởng trên được xem xét độc lập nhưng thực tế thìchúng có liên quan với nhau và quy về ảnh hưởng của nhiệt độ Khi tăng nhiệt

độ, sự khuếch tán thẩm thấu sẽ tăng, sự hòa tan tinh dầu trong nước sẽ tăngnhưng sự phân hủy cũng tăng theo

Trong công nghiệp người ta chia các phương pháp chưng cất hơi nước

ra thành ba loại chính: chưng cất bằng nước, chưng cất bằng hơi nước vàchưng cất bằng hơi nước

Đối với trường hợp chưng cất bằng nước, trong trường hợp này nướcphủ kín nguyên liệu nhưng phải chừa một khoảng không gian tương đối lớnphía bên trên lớp nước để tránh khi nước sôi mạnh làm văng chất nạp qua hệthống hoàn lưu Nhiệt cung cấp có thể đun trực tiếp bằng củi lửa hoặc bằnghơi nước dẫn từ nồi hơi vào (sử dụng bình có hai lớp đáy) Trong trường hợpchất nạp quá mịn, lắng chặt xuống đáy nồi, lúc đó nồi phải trang bị nhữngcánh khuấy trộn đều bên trong trong suốt thời gian chưng cất Sự chưng cấtnày không thích hợp với những tinh dầu dễ bị thủy phân Những nguyên liệuxốp và rời rạc rất thích hợp cho phương pháp này Những cấu tử có nhiệt độsôi cao, dễ tan trong nước sẽ khó hóa hơi trong khối lượng lớn nước phủ đầy,khiến cho tinh dầu sản phẩm sẽ thiếu những chất này Thí dụ điển hình là mùitinh dầu hoa hồng thu được từ phương pháp chưng cất hơi nước kém hơn sảnphẩm tẩm trích vì eugenol và ancol phenetil nằm lại trong nước khá nhiều, vìthế người ta chỉ dùng phương pháp này khi không thể sử dụng các phươngpháp khác

- Nhược điểm

+ Không có lợi đối với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp;+ Chất lượng tinh dầu có thể bị ảnh hưởng nếu trong tinh dầu có nhữngcấu phần dễ bị phân hủy;

+ Không lấy được các loại nhựa và sáp có trong nguyên liệu (đó lànhững chất định hương thiên nhiên rất có giá trị);

+ Trong nước chưng luôn luôn có một lượng tinh dầu tương đối lớnnằm dưới hai dạng phân tán và hòa tan Dạng phân tán thì có thể dùngphương pháp lắng hay ly tâm, còn dạng hòa tan thì phải chưng cất lại Nếutrọng lượng riêng của tinh dầu và nước quá gần nhau thì có thể thêm NaCl đểgia tăng tỉ trọng của nước làm tinh dầu tách ra dễ dàng;

+ Những tinh dầu có nhiệt độ sôi cao thường cho hiệu suất rất kém

1.4.1.3 Các phương pháp mới trong chưng cất tinh dầu

- Vi sóng

+ Cơ sở của phương pháp

Một số phân tử, thí dụ như nước, phân chia điện tích trong phân tử mộtcách bất đối xứng Như vậy các phân tử này là những lưỡng cực có tính địnhhướng trong chiều của điện trường Dưới tác động của điện trường một chiều,các phân tử lưỡng cực có khuynh hướng sắp xếp theo chiều điện trường này.Nếu điện trường là một điện trường xoay chiều, sự định hướng của các lưỡngcực sẽ thay đổi theo chiều xoay đó Cơ sở của hiện tượng phát nhiệt do visóng là sự tương tác giữa điện trường và các phân tử phân cực bên trong vậtchất Trong điện trường xoay chiều có tần số rất cao (2,45x109 Hz), điệntrường này sẽ gây ra một xáo động ma sát rất lớn giữa các phân tử, đó chính

là nguồn gốc sự nóng lên của vật chất

Với một cơ cấu có sự bất đối xứng cao, phân tử nước có độ phân cựcrất lớn, do đó nước là một chất rất lý tưởng dễ đun nóng bằng vi sóng Ngoài

ra, các nhóm định chức phân cực như: -OH, -COOH, -NH2 … trong các hợpchất hữu cơ cũng là những nhóm chịu sự tác động mạnh của trường điện từ.

Do đó, những hợp chất càng phân cực càng rất mau nóng dưới sự chiếu

xạ của vi sóng Việc này có liên quan đến hằng số điện môi của hợp chất đó.Tóm lại, sự đun nóng bởi vi sóng rất chọn lọc, trực tiếp và nhanh chóng

+ Quá trình trích ly dưới sự hỗ trợ của vi sóng

Dưới tác dụng của vi sóng, nước trong các tế bào thực vật bị nóng lên,

áp suất bên trong tăng đột ngột làm các mô chứa tinh dầu bị vỡ ra Tinh dầuthoát ra bên ngoài, lôi cuốn theo hơi nước sang hệ thống ngưng tụ (phươngpháp chưng cất hơi nước) hoặc hòa tan vào dung môi hữu cơ đang bao phủbên ngoài nguyên liệu (phương pháp tẩm trích)

Mức độ chịu ảnh hưởng vi sóng của các loại mô tinh dầu không giốngnhau do kiến tạo của các loại mô khác nhau, ngay khi nguyên liệu được làmnhỏ Kết quả này được phản ánh qua thời gian trích ly

Trong sự chưng cất hơi nước, việc trích ly tinh dầu có thể thực hiệntrong điều kiện có thêm nước hay không thêm nước vào nguyên liệu (trườnghợp nguyên liệu chứa nhiều nước, đây là đặc điểm của phương pháp chưngcất hơi nước dưới sự hỗ trợ của vi sóng) Ngoài ra, nước có thể thêm một lầnhoặc thêm liên tục (trường hợp lượng nước thêm một lần không đủ lôi cuốnhết tinh dầu trong nguyên liệu) cho đến khi sự trích ly chấm dứt

Ngoài việc nước bị tác dụng nhanh chóng, các cấu phần phân cực (hợpchất có chứa oxi) hiện diện trong tinh dầu cũng bị ảnh hưởng bởi vi sóng.Ngược lại các cấu phần hidrocarbon ít chịu ảnh hưởng của vi sóng (do chúng

có độ phân cực kém) nên sự trích ly chúng tựa như trong sự chưng cất hơinước bình thường nhưng với vận tốc nhanh hơn rất nhiều vì nước được đunnóng nhanh bởi vi sóng

Trong phòng thí nghiệm, nhóm tác giả Nguyễn Văn Minh và cộng sự Viện nghiên cứu dầu và cây có dầu đã nghiên cứu, sữa chữa và cải tiến lò visóng gia dụng để cho lò này có thể sử dụng trong cả việc trích ly tinh dầubằng phương pháp chưng cất hơi nước, và cho cả phương pháp tẩm trích ở ápsuất thường

-Năm 1998, Luque de Castro và cộng sự đã đưa ra kiểu lò vi sóng tiêuđiểm hỗ trợ cho sự trích ly bằng Soxhlet (FMASE – Focused MicrowaveAssisted Soxhlet Extraction) Hệ thống này giúp cho thời gian trích ly hợpchất thiên nhiên sử dụng Soxhlet giảm xuống đáng kể và khả năng bảo vệnhững hợp chất dễ bị phân hủy tăng lên

- Siêu âm

+ Nguyên tắc của phương pháp

Siêu âm là âm thanh có tần số nằm ngoài ngưỡng nghe của con người(16 Hz – 18 kHz), siêu âm được chia làm hai vùng:

Vùng có tần số cao (5–10 MHz), ứng dụng trong y học để chuẩn đoánbệnh

Vùng có tần số thấp hơn (20 – 100 kHz), ứng dụng trong các ngànhkhác (kích hoạt phản ứng hóa học, hàn chất dẻo, tẩy rửa, cắt gọt, …) dựa trênkhả năng cung cấp năng lượng của siêu âm

Siêu âm cung cấp năng lượng thông qua hiện tượng tạo và vỡ “bọt”(khoảng cách liên phân tử) Trong môi trường chất lỏng, bọt có thể hình thànhtrong nửa chu kỳ đầu và vỡ trong nữa chu kỳ sau, giải phóng một năng lượngrất lớn Năng lượng này có thể sử dụng tẩy rửa chất bẩn ngay trong những vịtrí không thể tẩy rửa bằng phương pháp thông thường, khoan cắt những chitiết tinh vi, hoạt hóa nhiều loại phản ứng hóa học, làm chảy và hòa tan lẫn vàonhau trong việc chế tạo những sản phẩm bằng nhựa nhiệt dẻo, …

Hiện tượng tạo bọt và vỡ bọt: Trong lĩnh vực hợp chất thiên nhiên, siêu

âm chủ yếu sử dụng để hỗ trợ cho phương pháp tẩm trích giúp thu ngắn thờigian trích ly Trong một số trường hợp, phương pháp siêu âm cho hiệu suấtcao hơn phương pháp khuấy từ

1.4.2 Các phương pháp phân tích tinh dầu

Các phương pháp phân tích tinh dầu nói chung và tinh dầu Bạch đànnói riêng được sử dụng là phương pháp phân tích Sắc ký khí với detector ionhóa ngọn lửa (GC-FID) và Sắc ký khí với detectơ khối phổ (GC-MS)

1.4.2.1 Phương pháp phân tích Sắc ký khí với detectơ ion hoá ngọn lửa

Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dùng để tách các thànhphần của một hỗn hợp Sự tách sắc ký dựa vào sự phân chia khác nhau củacác chất vào hai pha luôn tiếp xúc với nhau và hai pha đó không hoà lẫn vớinhau Một pha là pha tĩnh, một pha là pha động

Bản chất của phương pháp sắc ký chính là sự tách chất Các chất đượctách ra khỏi nhau dựa vào sự tương tác của chất giữa pha động và pha tĩnh.Pha động mang các chất đi dọc hệ thống sắc ký (là cột hoặc bản phẳng) cóđược phủ pha tĩnh đều khắp Các chất trong mẫu khi đó sẽ chịu sự tương tác(phân bố) lặp lại giữa pha động và pha tĩnh dẫn đến kết quả chúng bị tách dầnthành những dải trong pha động và vào lúc cuối của quá trình sắc ký các cấu

tử sẽ bị tách biệt hẳn ra theo trật tự tăng dần tương tác với pha tĩnh Cấu tửnào tương tác yếu với pha tĩnh sẽ theo pha động ra khỏi pha tĩnh trước, cấu tửnào tương tác mạnh với pha tĩnh sẽ ra sau Các cấu tử khi ra khỏi pha tĩnh sẽđược ghi lại dưới dạng các đỉnh (pic) tách riêng rẽ và được in trên giấy gọi làsắc ký đồ

Đối với phương pháp sắc ký khí pha động ở đây là chất khí (còn gọi làkhí mang), pha tĩnh là chất rắn được nhồi vào phần trong của cột tách (đối vớicột nhồi) hoặc là chất rắn hay chất lỏng được tẩm lên thành trong của cột tách

(đối với cột mao quản hở) Ngày nay sắc ký khí đã trở thành một phươngpháp phân tích công cụ quan trọng nhất để tách và phát hiện các chất trongthành phần của hỗn hợp phức tạp Năm 1952 máy sắc ký khí đầu tiên được rađời dưới sự chủ trì của giáo sư Keulemann và các cộng tác viên Từ đó kỹthuật sắc ký khí được hoàn chỉnh và phát triển rất mạnh, được ứng dụng rộngrãi trong nhiều ngành khoa học: hóa học, sinh học, y học, dược học, khoa họchình sự và đặc biệt trong nghiên cứu môi trường, thực phẩm,

- Sơ đồ khối của máy Sắc ký khí

Hình 1 Sơ đồ khối của máy sắc ký khí

- Cơ chế phát hiện các chất của detectơ FID

Ngọn lửa trong detectơ được tạo ra bởi hỗn hợp của khí hyđrô và oxy.Khi chưa có chất phân tích đi vào detectơ thì thành phần trong ngọn lửa củadetectơ chỉ có hyđrô, oxy và khí mang Khi đó ngọn lửa tạo ra rất ít cácelectron Dưới tác dụng của một điện trường các electron này được chuyểnđộng về các điện cực trái dấu và sinh ra một dòng điện có cường độ rất nhỏkhoảng 10-12A gọi là dòng điện nền

Khi có chất phân tích đi vào detectơ (các hydrocacbon) chúng sẽ bịnăng lượng nhiệt của ngọn lửa bẻ gẫy mạch tạo thành các nhóm CH*, các

nhóm CH* này sẽ bị oxy hóa bởi oxy có trong ngọn lửa tạo thành các gốcCHO+ và e- Khi đó cường độ dòng điện sẽ tăng đột biến và chúng đượckhuếch đại, ghi lại dưới dạng các đỉnh pic Mỗi pic đó là một chất

Ví dụ cơ chế phát hiện benzen khi phân tích của detector FID như sau:

C6H6 → 6CH*

6CH* + 3O2 → 6CHO+ + 6e

-Khi đó số lượng các điện tử tăng lên đột biến làm cường độ dòng điệnnền tăng lên đột biến và được ghi lại dưới dạng đỉnh pic ứng với một thời gianlưu nhất định

1.4.2.2 Phương pháp phân tích Sắc ký khí với detecơ khối phổ

Phổ khối lượng - MS (mass spectrometry) là phương pháp được sửdụng rộng rãi hiện nay trong nghiên cứu hóa học, môi trường, sinh học, độchọc và rất nhiều ngành khoa học khác nhau,

Nguyên tắc chung của phương pháp là khi cho các phân tử ở trạng tháikhí va chạm với một dòng electron có năng lượng cao thì từ các phân tử sẽ bật

ra một hay 2 electron và nó trở thành các ion có điện tích +1 (chiếm tỷ lệ lớn)

và +2

ABC + e → ABC+* + 2e (1)ABC + e → ABC+2 + 3e (2)Loại ion (1) được gọi là ion gốc hay ion phân tử

Nếu các ion phân tử tiếp tục va chạm với dòng electron có năng lượnglớn thì chúng sẽ bị phá vỡ thành nhiều mảnh ion, thành các gốc hoặc các phân

tử trung hòa khác nhau, quá trình này được gọi là quá trình phân mảnh(fragmentation)

ABC+* → A+ + BC*

ABC+* → AB+ + C*

AB+ → A+ + B

Năng lượng của quá trình phân mảnh chỉ vào khoảng 30-100 eV, caohơn năng lượng ion hóa phân tử (8-15 eV) Quá trình biến các phân tử trunghòa thành các ion gọi là sự ion hóa Các ion có khối lượng m và điện tích e, tỉ

số m/e được gọi là số khối z Bằng cách nào đó tách các ion có số khối khácnhau ra khỏi nhau và xác định được xác suất có mặt của chúng rồi vẽ đồ thịbiểu diễn mối liên quan giữa xác suất có mặt và số khối z thì đồ thị này đượcgọi là phổ khối lượng [5] Việc so sánh phổ khối lượng của chất nghiên cứuvới thư viện phổ được lưu giữ trong máy tính sẽ xác định được công thức cấutạo của chất

Như vậy với kỹ thuật phân tích GC/MS khi các chất trong hỗn hợpđược tách ra khỏi nhau sau khi lần lượt đi ra khỏi cột sắc ký khí chúng đi vào

hệ thống khối phổ Khí mang sẽ được tách ra khỏi hỗn hợp và đi vào vùngchân không để được hút ra ngoài Chất nghiên cứu sẽ được bắn phá để tạothành các mảnh ion có số khối khác nhau sau đó sẽ thu được phổ khối lượngcủa từng chất, từ đó qua thư viện phổ sẽ xác định được công thức cấu tạo củachất

1.5 Phương pháp đánh giá hoạt chất sinh học của chất

Phổ hoạt tính sinh học của chất (Biological activity spectra – BAS) mô

tả sự sự phức hợp của các hiệu ứng dược lý, sinh lý học và cơ chế hóa sinhcủa các tác động đặc biệt (đột biến, sinh ung thư, quái thai) có thể biểu lộtrong các tương tác với hệ sinh thái của chất BAS mô tả thuộc tính bên trongcủa chất phụ thuộc vào cấu trúc đặc biệt của nó Một chất có thể có rất nhiềucác hoạt tính sinh học khác nhau Một số hoạt tính có thể được tìm thấy trongnghiên cứu lý thuyết, một số hoạt tính được phát hiện ra trong các thử nghiệmlâm sàng, một số hoạt tính được phát hiện trong nhiều năm kể từ khi chúngđược sử dụng làm thuốc Ví dụ như Fluorouracil có 10 hoạt tính được lần lượtkhám phá ra kể từ năm 1962 đến 1997 được mô tả ở Bảng 4 [15]

Hoạt tính sinh học là kết quả của sự tương tác giữa hợp chất hóa họcvới thực thể sinh học Trong nghiên cứu lâm sàng, thực thể sinh học là conngười, trong nghiên cứu tiền lâm sàng nó được thử nghiệm trên cơ thể sống là

động vật (in vivo) hoặc thử nghiệm trong ống nghiệm (in vitro) Hoạt tính

sinh học phụ thuộc vào những nét đặc trưng của hợp chất (về cấu trúc phân tử

và đặc tính hóa lý), thực thể sinh học (loài, tuổi, giới tính, ) và cách tiếnhành nghiên cứu (liều lượng, con đường nghiên cứu, )

Bảng 4 Hoạt tính sinh học của Fluorouracil [15]

4 Ức chế tổng hợp Thimidine Tiriphosphate 1971

cơ bản, cơ chế tác động và các độc tính đặc trưng

Như vậy để xác định chính xác được hoạt tính sinh học của một chất thìnghiên cứu cuối cùng phải tiến hành đưa chất đó vào thử nghiệm Tuy nhiênmột chất có thể có rất nhiều các hoạt tính sinh học khác nhau và có nhữnghoạt tính mà nó chưa có điều kiện được bộc lộ, do vậy các nhà nghiên cứuhóa sinh sẽ gặp rất nhiều khó khăn để tìm ra các hoạt tính bằng con đườngthử nghiệm lâm sàng Vì vậy nếu bằng tính toán mà có thể dự đoán được hoạt

tính sinh học của chất thì nó là cơ sở lý thuyết rất quan trọng và giảm bớtđược rất nhiều công sức cho các nhà nghiên cứu hóa sinh khi đưa vào thửnghiệm lâm sàng trên sinh vật.

Để dự đoán phổ hoạt tính sinh học của chất (BAS) hiện nay người ta sửdụng phầm mền tính toán PASS (Prediction of Activity Spectra forSubstances) dựa trên quan điểm cho rằng hoạt tính là hàm của cấu trúc phân

tử của chất (Activity=f(Structure)) Do vậy việc so sánh cấu trúc của một hợp

chất cần nghiên cứu với cấu trúc của các chất có hoạt tính sinh học đã biết thìhoạt tính sinh học của chất mới có thể xác định được nếu như chất mới có tácdụng đặc biệt

Chương 2 MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là:

- Đánh giá được đặc tính thành phần hóa học tinh dầu trong lá một số

loài Bạch đàn trồng ở Miền Bắc Việt Nam;

- Bước đầu xác định, đánh giá mối liên hệ của thành phần chất trongtinh dầu Bạch đàn với một số vấn đề sinh thái môi trường

2.2 Đối tượng và giới hạn nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận văn là tinh dầu trong lá của ba loài Bạch

đàn: Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis); Bạch đàn xanh (Eucalyptus

globulus) và Bạch đàn chanh (Eucalyptus citriodora) được trồng tại miền Bắc

Việt Nam Mỗi một loài Bạch đàn nghiên cứu ở một cấp tuổi và tại một thờiđiểm nhất định trong năm

2.3 Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện được các mục tiêu trên đề tài tiến hành nghiên cứu các nộidung sau:

1 Khảo sát các phương pháp tách chiết tinh dầu từ lá Bạch đàn;

2 Xác định và đánh giá các hoạt tính sinh học của các chất chính cótrong tinh dầu các loài Bạch đàn nghiên cứu;

3 Bước đầu đánh giá một số ảnh hưởng của tinh dầu Bạch đàn đến môitrường sinh thái

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thu thập và kế thừa tài liệu

Các tài liệu liên quan đến vấn đề nghiên cứu ở trong và ngoài nướcđược thu thập, chọn lọc và sử dụng để phân tích, đánh giá thực trạng trồngrừng Bạch đàn ở nước ta Các nghiên cứu về thành phần và đặc tính tinh dầuBạch đàn trên thế giới cũng được nghiên cứu sử dụng để so sánh, đánh giácùng với kết quả nghiên cứu của đề tài Trong nghiên cứu còn tham khảo cácphương pháp phân tích tinh dầu bằng phương pháp phân tích Sắc ký khí vàSắc ký khí ghép nối khối phổ

2.4.2 Phương pháp điều tra, lấy mẫu ngoài thực địa

Căn cứ vào tài liệu thu thập được nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sáttại hai địa phương có trồng các loài Bạch đàn đó là thị trấn Xuân Mai, huyệnChương Mỹ thành phố Hà Nội và tại xã Trường Sơn, huyện Lục Nam, tỉnhBắc Giang Từ đó chọn ra các loài Bạch đàn đặc trưng để lấy mẫu về phòngthí nghiệm tách chiết tinh dầu và phân tích thành phần hóa học của nó Trướckhi lấy mẫu cần tiến hành khảo sát toàn bộ khu vực trồng rừng Bạch đàn

Công việc khảo sát bao gồm quan sát đánh giá một cách định tính sự đa dạngthành phần các loài cây dưới tán.

Tại rừng thực nghiệm của trường Đại học Lâm nghiệp, loài Bạch đàn

trắng (Eucalyptus camaldulensis) 20 năm tuổi và loài Bạch đàn xanh (Eucalyptus globulus) 20 năm tuổi đã được lựa chọn để lấy mẫu nghiên cứu,

Hình 2

Hình 2 Lấy mẫu lá tại rừng thực nghiệm tại Xuân Mai, Hà Nội

Tại xã Trường Sơn, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang loài Bạch đàn

chanh (Eucalyptus citriodora) đã được lựa chọn để lấy mẫu lá nghiên cứu.

Mẫu lá của mỗi loài được lấy trên cùng một cây nhưng lấy ở ba tầngkhác nhau gồm tầng ngọn, tầng giữa và tầng tán dưới Mẫu lá ở mỗi tầng này

có số lượng bằng nhau và được tách riêng biệt, đựng trong túi nilon, mã hóa

và bảo quản ở nhiệt độ tử 2 - 40C Thời điểm tiến hành lấy mẫu nghiên cứutrong tháng 8 năm 2010

Ngoài mẫu lá đề tài còn tiến hành lấy thêm mẫu rễ của loài Bạch đàntrắng để nghiên cứu đánh giá tìm hiểu về sự có mặt của các chất hóa họctương ứng với tinh dầu mẫu lá của nó Mẫu rễ được lấy trên cùng một cây lấymẫu lá và cũng được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 - 40C trước khi phân tích

2.4.3 Phương pháp tách chiết và phân tích tinh dầu

2.4.3.1 Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu

+ Máy sắc ký khí Master GC sử dụng detectơ FID, Italya;

+ Máy sắc ký khí Hewlet Parkard 6890 sử dụng detector MS, Mỹ;+ Xylanh bơm mẫu dung tích 10 µl, 20 µl;

+ Thiết bị chiết dòng ngưng liên tục;

+ Thiết bị chưng cất lôi cuốn hơi nước;

+ Cân phân tích có sai số d = 0,1 mg;

+ Bếp ổn nhiệt, nhiệt độ max 3000 C;

+ Nhiệt kế có nhiệt độ tối đa 3000 C của Nga;

Dụng cụ dùng cho chuẩn bị mẫu xác định các chất ở lượng vết, máy sắc

ký có độ nhạy cao 10-11- 10-12g nên để tránh nhiễu kết quả thì khâu chuẩn bịdụng cụ có ý nghĩa rất quan trọng Tất cả các dụng cụ thủy tinh được làm sạchtheo các bước sau:

+ Rửa sạch bằng xà phòng;

+ Tráng nhiều lần bằng nước thường;

+ Tráng 3 lần bằng nước cất 2 lần;

+ Tráng 3 lần bằng dung môi CH2Cl2;

+ Sấy toàn bộ dụng cụ trong tủ sấy ở nhiệt độ 2000C trong 2 giờ;

Tất cả các dụng cụ trước khi sử dụng phải được tráng lại nhiều lần bằngbằng dung môi CH2Cl2 hoặc n – hexan

- Chuẩn bị mẫu phân tích

Mẫu lá dùng để phân tích là mẫu tổ hợp của ba loại mẫu lấy ở tầngngọn, tầng giữa và tầng tán trộn lại với nhau theo cùng một tỷ lệ Trước khiphân tích mẫu lá và rễ được rửa bằng nước lạnh rồi được bảo quản trong tủlạnh sâu có nhiệt độ -180C

- Tách tinh dầu

Đề tài sử dụng hai phương pháp cất lôi cuốn hơi nước và chiết dòngngưng liên tục để tách chiết tinh dầu trong mẫu nghiên cứu

+ Phương pháp cất lôi cuốn hơi nước

Phương pháp này cho phép chiết khá triệt để các chất có mặt trong các

bộ phận của cây Phương pháp cất lôi cuốn hơi nước tốn ít thời gian, khônggây độc đối với môi trường

Hệ thống cất lôi cuốn hơi nước (Hình 3) gồm hai bình nối tiếp nhau,bình trên đựng mẫu cần chiết, bình dưới đựng nước Khi đun sôi nước ở nhiệt

độ 2000C sẽ tạo ra một luồng hơi nước nóng có áp suất cao sục qua mẫu lálàm cuốn đi các thể tinh dầu đến ống sinh hàn Tại đây hơi nước và tinh dầuđược làm lạnh rồi ngưng tụ vào phần thu mẫu tinh dầu Quá trình phân lớpxảy ra tại đây Tinh dầu có tỉ khối nhẹ hơn nước nên nổi lên phía trên cònnước chìm xuống phía dưới Tách nước ta sẽ thu được phần tinh dầu của mẫunghiên cứu

Hình 3 Thiết bị cất lôi cuốn hơi nước

Trong suốt quá trình cất tinh dầu nhiệt độ của bếp đun được giữ ổn định

ở 2000C, hơi nước đo được có nhiệt độ 980C Đề tài tiến hành cất lôi cuốntrong các khoảng thời gian khác nhau cho các mẫu khác nhau để đánh giá sựbiến đổi thành phần hóa học trong tinh dầu theo thời gian cất, xác định tỉ khối

và hàm lượng phần trăm của tinh dầu trong mẫu nghiên cứu Khối lượng mẫu

lá (lá tươi) cho một lần cất hơi nước là 200 g Thời gian tiến hành cất lôi cuốnhơi nước cho mỗi loại mẫu (mẫu lá Bạch đàn trắng và mẫu lá Bạch đàn xanh)thực hiện trong 5 khoảng thời gian khác nhau, đó là: 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ và 4giờ và 5 giờ kể từ lúc nước sôi

+ Phương pháp cất dòng ngưng liên tục

Hệ thống cất dòng ngưng liên tục được bố trí như hình 4

Hình 4 Thiết bị cất dòng ngưng liên tục

Hệ thống cất dòng ngưng gồm 2 bình cầu đặt song song cùng nối vàoống sinh hàn Mẫu lá tổ hợp được cắt nhỏ có kích thước 1x3 cm, cân lấy 5gam mẫu cho vào bình cầu đựng mẫu (bình 1) và mẫu được ngâm trong nướccất 2 lần đến khoảng 3/5 bình, bình cầu còn lại (bình 2) cho vào 7 ml dungmôi điclometan Cả hai bình cầu này được nối với cùng một ống sinh hàn.Khi đung nóng bình cầu với nhiệt độ của bếp là 1000C làm sôi nước trongbình cầu, bình cầu đựng điclometan được cấp nhiệt ở 600C Hơi nước trongbình cầu đựng mẫu sẽ bay lên cuốn theo cả các phân tử tinh dầu cùng với

Bình

2 Sinh hàn

dung môi điclometan cũng được bay lên và gặp nhau ở bề mặt sinh hàn Tạiđây quá trình chiết bắt đầu xảy ra, tinh dầu sẽ tự động hòa tan vào dung môiđiclometan và tách ra khỏi nước Cả tinh dầu, điclometan và nước được làmlạnh và ngưng lại phần thu Điclometan nặng hơn nước lên chìm xuống dướicòn nước nổi lên trên Phần nước sẽ quay ngược lại bình cầu đựng mẫu cònphần điclometan chứa tinh dầu sẽ quay lại bình cầu đựng đựng điclometan.Quá trình cứ thế diễn ra trong một khoảng thời gian nhất định tùy thuộc vàotừng nghiên cứu Mỗi một loài Bạch đàn cũng tiến hành nghiên cứu cất nhiềumẫu của cùng một loài trong các khoảng thời gian khác nhau như phươngpháp lôi cuốn hơi nước để khảo sát đánh giá khả năng tách chiết của phươngpháp theo thời gian.

Đối với mẫu rễ của loài Bạch đàn trắng đề tài lựa chọn phương phápcất dòng ngưng liên tục để nghiên cứu Khối lượng của mẫu rễ trong mỗi lầnchiết là 10 gam, tiến hành chiết liên tục 3 mẫu rồi gộp toàn bộ 3 phần dungthu được thành một mẫu, đem đi làm giầu xuống còn 1,0 ml Mẫu này đượcdùng để phân tích trên GC/FID và GC/MS Tất cả các mẫu thu được trước khiphân tích trên các hệ thống máy sắc ký đều được cho chạy qua cột Na2SO4

khan đã được sấy khô để loại nước

2.4.3.4 Phương pháp phân tích thành phần hóa học tinh dầu Bạch đàn

- Phương pháp phân tích bằng kỹ thuật GC/FID

Đây là phương pháp phân tích hiện đại được ứng dụng rộng rãi để xácđịnh các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi, bền nhiệt Mẫu tinh dầu sau khi táchchiết được hòa tan vào trong dung môi n-hecxan để bơm vào hệ thống sắc kýGC-Master của Italia tại trường Đại học Lâm nghiệp Phương pháp này sẽphát hiện được số các hợp chất có trong tinh dầu ở mức hàm lượng rất nhỏ cỡppm đến ppb đồng thời sử dụng để khảo sát các chương trình phân tích mẫutrước khi phân tích trên hệ thống GC/MS

Chương trình làm việc của hệ thống sắc ký như sau:

+ Cột mao quản DN 17, nhiệt độ cao nhất 3500C, kích thước cột: 30m x320µm x 0,25 µm (chiều dài x đường kính trong x bề dầy lớp hấp phụ);

+ Chương trình nhiệt độ của cột tách: nhiệt độ ban đầu 600C giữ trong 1phút, nâng lên đến 900C với tốc độ gia nhiệt 30C/phút, nâng tiếp lên 1200Cvới tốc độ gia nhiệt 150C/phút, nâng tiếp lên 2000C với tốc độ gia nhiệt

50C/phút, giữ trong 10 phút;

+ Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 2500C

+ Nhiệt độ của detectơ: 2500C

+ Khí mang: N2 (99,9999%)

+ Tốc độ dòng khí mang: 1,3 ml/phút

+ Chế độ bơm mẫu chia dòng 1:24

+ Thể tích bơm mẫu: 1 µl

- Phương pháp sắc ký khí với detertơ khối phổ

Đây là phương pháp phân tích hiện đại hiện nay trong việc xác định cáchợp chất hóa học hữu cơ Các hợp chất hữu cơ khác nhau sau khi được tách rakhỏi nhau bằng kỹ thuật sắc ký sẽ được đưa vào hệ thống khối phổ để xácđịnh khối lượng các mảnh ion được bắn phá trong hệ thống ion hóa, trên cơ

sở đó có thể xác định được tên và công thức cấu tạo của chất Thư viện phổ sẽgiúp xác định công thức cấu tạo của hợp chất cần nghiên cứu

Chương trình làm việc của hệ thống sắc ký khí khối phổ như sau:

+ Cột mao quản BD-5, 19091z - 413, nhiệt độ cao nhất 3550C , kíchthước: chiều dài, đường kính trong, bề dầy lớp hấp phụ tương ứng là 30 m,

320 µm, 0,25 µm;

+ Chương trình nhiệt độ cột tách: : nhiệt độ ban đầu 600C giữ trong 1phút, nâng lên đến 900C với tốc độ gia nhiệt 30C/phút, nâng tiếp lên 1200C

với tốc độ gia nhiệt 150C/phút, nâng tiếp lên 2000C với tốc độ gia nhiệt

50C/phút, giữ trong 10 phút;

+ Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 2500C;

+ Chế độ bơm mẫu chia dòng 1:24;

+ Thể tích bơm mẫu: 1 µl;

+ Sử dụng chế độ đo chọn lọc ion;

+ Ion hóa chất theo nguyên tắc va đập điện tử

2.4.4 Phương pháp tin sinh học dự đoán hoạt tính sinh học của chất

Việc sử dụng phần mềm Phổ dự đoán hoạt tính sinh học của chất PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) dựa trên quan điểm cho

-rằng hoạt tính là hàm của cấu trúc phân tử của chất (Activity = f(Structure).

Do vậy việc so sánh cấu trúc của một hợp chất cần nghiên cứu với cấu trúccủa các chất có hoạt tính sinh học đã biết thì hoạt tính sinh học của chất cầnnghiên cứu có thể xác định được

Trong cơ sở dữ liệu của PASS bao gồm khoảng 46000 hợp chất có hoạttính sinh học, trong đó khoảng 16000 chất đã được sử dụng làm thuốc, 30000chất đang được đề nghị cho kiểm tra lâm sàng hoặc tiền lâm sàng

Chương trình tính toán PASS có thể dự đoán đồng thời 400 loại hoạttính cùng một lúc với độ chính xác đạt 85% bằng cách dựa trên công thức cấutạo của hợp chất Trong cơ sở dữ liệu của PASS chứa tới 6825 loại hoạt tínhsinh học bao gồm các hiệu ứng dược lý, cơ chế hóa sinh của các tác động, cácđộc tính cụ thể Một vài hoạt tính có mặt trong cơ sở dữ liệu của PASS chỉ có

ở một hoặc hai hợp chất và những hoạt tính này không nằm trong phổ dựđoán của PASS Sau khi đưa thông tin về cấu trúc phân tử của hợp chấtnghiên cứu hoạt tính sinh học vào chương trình tính toán của PASS, phầnmềm tính sẽ so sánh cấu trúc của phân tử này với cấu trúc của các chất cótrong cơ sở dữ liệu với các hoạt tính sinh học đã được mô tả để từ đó sẽ tự