Bài giảng các kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật, thực vật, vi sinh vật và tạo ADN tái tổ hợp

Một số phương pháp đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủHóa biến nạpĐiện biến nạpBiến nạp tế bào trần (protoplast)Phương pháp bắn genPhương pháp vi tiêmTải nạpKỹ thuật tách dòng (tạo dòng)Tạo DNA tái tổ hợp (Vector tái tổ hợp)Việc tạo DNA tái tổ hợp bằng cách ghép DNA lạ vào vector đã được cắt cùng một enzyme cắt hạn chế loại II, khi đó, chúng sẽ ghép đôi những đầu dính lại với nhau nhờ bắt cặp bổ sung.Một phản ứng ghép nối xảy ra với sự có mặt của enzyme DNA ligase của E. Coli hoặc phage T4 để hoàn chỉnh phân tử lai.

Sự kết hợp giữa DEAE-dextran và DNAPhương pháp này được sử dụng thành công trong việc chuyển DNA vào các tế bào biểu hiện nhấtthời, có nghĩa là thời gian biểu hiện ngắn chỉ vài ngày trong quá trình nghiên cứu Tuy nhiên,phương pháp này nói chung là không hữu ích đối với các nghiên cứu cần sự chuyển nhiễm ổn địnhdựa vào sự hợp nhất của DNA ngoại lai vào nhiễm sắc thể, hiệu quả biến nạp thấp, chỉ được sửdụng cho một số loại tế bào và cho kết quả tốt đối với tế bào ex vivo.

Các polycation khác cũng đã được sử dụng để chuyển DNA vào tế bào như polybrene,polyethyleneimine và dendrimers

Kỹ thuật calcium phosphate

Kỹ thuật calcium phosphate (calcium phosphate technique) đã được phát triển đầu tiên là để xácđịnh sự lây nhiễm của DNA virus (Graham,1973) và hiện nay được sử dụng rông rãi để thử nghiệmhoạt động biến nạp của DNA virus cũng như DNA tách chiết từ các tế bào eukaryote (Wigler, 1978;Graham, 1979; Pellicer, 1980)

Kỹ thuật này yêu cầu ủ các tế bào nhận với các chất đồng kết tủa DNA và calcium phosphat (Hình2) Kết tủa này bám vào tế bào và sau đó sẽ hấp thụ vào tế bào qua quá trình ẩm bào (Loyter,1982) Trong tế bào, các phân tử DNA ngoại lai nằm trong không bào được tạo thành do ẩm bào vàlysosome thứ hai nhưng rất ít DNA đi đến nhân vả hợp nhất vào genome chủ

Phức hợp DNA-calcium phosphatCho đến nay, đây là kỹ thuật vô cùng có giá trị đối với các nghiên cứu chuyển gen vào các tế bàosoma nuôi cấy và đang được sử dụng nhiều để chuyển các dòng genome vào tế bào đích Tỉ lệ các

tế bào được biến nạp ổn định của kỹ thuật này là tương đương với phương pháp vi tiêm nhưngkhác với vi tiêm là nhiều tế bào được biến nạp cùng một lần Hơn nữa, biến nạp DNA tách chiết từcác tế bào ung thư vào các tế bào nhận không ung thư đã cho thấy đây là phương pháp duy nhất

để nghiên cứu sự kiểm soát di truyền của ung thư Phương pháp này được sử dụng phổ biến bởi vìđơn giản, protocol dễ thực hiện, ít tốn kém, số tế bào chết sau biến nạp không đáng kể, sự biểuhiện gen có thể là nhất thời hoặc ổn định và quan trọng trong việc thiết kế vector virus tái tổ hợp.Tuy nhiên hiệu quả biến nạp và mức độ biểu hiện của gen chuyển thấp

Chuyển gen qua liposome

Vào thập niên 1980, liposome nhân tạo đã được sử dụng để đưa DNA vào tế bào Lipid với toàn bộlưới tích điện dương ở pH sinh lý là thành phần lipid tổng hợp phổ biến nhất của liposome đượcphát triển cho chuyển gen (Hình 3) Thường thì lipid cation được trộn với một lipid trung tính như L-dioleoyl phosphatidyl-ethanolamine (DOPE) (Hình 4) Phần cation của phân tử lipid kết hợp với DNAtích điện âm và kết quả là chứa đầy DNA trong phức hợp liposome-DNA (Hình 5) Ðối với các tếbào nuôi cấy, toàn bộ lưới tích điện dương của phức hợp liposome-DNA nói chung là gây ra hiệuquả chuyển gen cao hơn bởi vì nó cho phép phức hợp này kết hợp với màng tế bào tích điện âmbền hơn Nhờ cơ chế nhập bào, các phức hợp xuất hiện trong endosome và sau đó đi vào nhân(Hình 2.6) Chưa rõ DNA được phóng thích từ endosome và đi qua màng nhân như thế nào DOPEđược xem là một lipid kích thích sự dung hợp và vai trò của nó là phóng thích các phức hợp này từendosome cũng như làm cho sự dung hợp của màng tế bào phía ngoài với phức hợp liposome-DNA xảy ra dễ dàng Trong phương pháp này, các đại phân tử trước hết được đưa vào trong các túiphospholipid Các loại túi khác nhau đã được mô tả, nhưng túi một lớp mỏng là thích hợp nhất chochuyển gen vì chúng có tỉ lệ khoảng trống chứa nước ở bên trong tương đối cao đối với mỗi đơn vịlipid và bởi vì chúng có tỉ lệ phân phối cao hơn Sự dung hợp của liposome với màng plasma là một

sự kiện hiếm Hiệu quả biến nạp của phương pháp này thấp hơn so với phương pháp vi tiêm vàotiền nhân Các nổ lực nghiên cứu đang được tiến hành để tìm ra các điều kiện thí nghiệm mà cóthể làm tăng sự phóng thích các phân tử đã kết nang từ con đường ẩm bào

Cấu trúc tổng quát của lipid cation tổng hợp

Cấu trúc của DOPE

hợp liposome-DNA

Sơ đồ hoạt động của vector liposome

Liposome đã được sử dụng để đưa protein, lipid và các phân tử nhỏ vào nhiều loại tế bào nuôi cấy,tuy nhiên hiệu quả thấp hơn vi tiêm đối với RNA hoặc protein Cũng như thế, chuyển gen qualiposome và sự biểu hiện của gen chuyển là không vượt qua được các phương pháp chuyển genthông thường (như hệ thống virus), sự biểu hiện gen chuyển thường nhất thời, sự ức chế bởi cácthành phần của huyết thanh có thể xảy ra Bên cạnh đó, kỹ thuật này có nhiều ưu điểm là genchuyển sẽ không hợp nhất vào genome chủ, có hiệu quả tốt đối với cả tế bào in vitro và in vivo, cóthể mang được các DNA có kích thước rất lớn, độ tinh khiết cao, không gây miễn dịch, có thể sửdụng với các tế bào mà biến nạp bằng kỹ thuật calcium phosphat không có hiệu quả

Ứng dụng trong tương lai của kỹ thuật này chủ yếu sẽ là khả năng phân phối thuốc vào các tế bàocủa cơ thể sống Hiện nay kỹ thật này đang được phát triển để cải tiến sự phân phối đặc hiệu củaliposome bằng cách ghép các kháng thể đặc hiệu với bề mặt của liposome đích

Phương pháp vi tiêm

Sự thành công đầu tiên trong nghiên cứu tạo chuột chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm vào tiềnnhân đã được công bố vào năm 1980 (Gordon, 1980) Mặc dầu cấu trúc tổ hợp gen chuyển đượcchứng minh là đã tích hợp vào genome của chuột, nó đã được sắp xếp lại nhưng gen ngoại laikhông được biểu hiện Các công bố tiếp theo (Brister, 1981; Costantini và Lacy; 1981) chứng minh

rằng với phương pháp vi tiêm, các gen chuyển đã tích hợp và có khả năng biểu hiện Vào năm

1982, lần đầu tiên sự thay đổi kiểu hình có thể nhìn thấy ở chuột nhắt chuyển gen đã được mô tả(Palmiter, 1982) Ðây là kết quả biểu hiện của gen hormon sinh trưởng chuột cống ở chuột nhắt Từ

đó đến nay đã có rất nhiều các công trình về chuyển gen, trong đó phần lớn là các nghiên cứu hiệuquả của gen vi tiêm với sự sinh trưởng của động vật có vú và bệnh học

Nguyên tắc của phương pháp vi tiêm là một lượng nhỏ DNA được tiêm trực tiếp vào nhân tế bàophôi trần hoặc tế bào nguyên vẹn một cách cơ học dưới kính hiển vi Phương pháp này cho phépđưa gen vào đúng vị trí mong muốn ở từng tế bào với hiệu quả tương đối cao.Tuy nhiên do đòi hỏiphải tinh vi, tỉ mỉ và cực kỳ chính xác nên hạn chế số lượng tế bào vi tiêm và ngoài ra còn có thểlàm tổn thương đến tế bào phôi do tác nhân cơ học gây ra khi tiến hành vi tiêm

Ðể biến nạp gen vào tế bào bằng phương pháp vi tiêm trước hết phải chế tạo kim tiêm và kim giữ.Kim được tạo ra từ những ống thuỷ tinh dẻo capillar đường kính 0,1-1,5 mm có sợi bằng wolframmảnh ở trong nhờ hệ thống thiết bị làm kim Hệ thống này gồm có máy kéo kim tự động (pipettepuller), máy mài kim và máy gia cố kim

Vi tiêm gen ngoại lai vào tiền nhân của trứng thụ tinh

Ðể tạo kim tiêm trước hết phải tạo ra đầu kim nhọn nhờ máy kéo kim Sau đó sử dụng máy gia cố

để cắt đầu nhọn của ống capillar sau khi kéo tạo ra mũi kim tiêm có đường kính thích hợp Ðườngkính bên trong mũi kim tiêm tuỳ thuộc vào loại tế bào chuyển gen Ðối với trứng tiền nhân động vật

có vú có đường kính khoảng 70 µm thì đường kính của kim tiêm khoảng 0,75 µm là thích hợp, đốivới phôi cá một tế bào đường kính của kim tiêm là khoảng 3-4 µm Cuối cùng đưa kim lên máy mài

để làm sắc nhọn và trơn láng đầu kim

Kim giữ được chế tạo từ những ống capillar có đầu nhẵn bình thường để cố định trứng trong quátrình vi tiêm Ðể tạo kim giữ, dùng máy kéo kim tự động để tạo ra đầu kim nhỏ sau đó dùng bút kimcương hoặc sợi platin đốt nóng cắt bớt đầu nhọn để tạo ra đầu kim với đường kính thích hợp Làmnhẵn đầu kim giữ bằng cách để đứng kim này ngay trên mặt đoạn cong platin của máy gia cố Ðốt

nóng sợi platin và điều chỉnh đầu kim giữ cho nó chảy từ từ Quan sát dưới kính hiển vi và dừng lạikhi đầu kim đã đạt yêu cầu.

Vi tiêm được tiến hành trên hệ thống thiết bị vi tiêm Hệ thống này gồm có hai bộ phận chính là kínhhiển vi và máy vi thao tác

Các máy làm kim (Hãng Narishige)

1 Máy gia cố kim Microforge

2 Máy mài kim

3 Máy kéo kim tự động Pipette Puller

Kính hiển vi dùng cho mục đích này là kính hiển vi soi ngược (vật kính xoay ngược lên) Ðộ phóngđại thích hợp cho việc tiến hành vi tiêm vào phôi cá một tế bào là khoảng từ 40-60 lần Máy vi thaotác gồm 2 phần giống hệt nhau được bố trí hai bên kính hiển vi, một dùng để điều chỉnh kim tiêm,một dùng cho kim giữ Tính năng của máy này là cho phép điều chỉnh các kim theo không gian 3chiều Kim tiêm và kim giữ được lắp vào máy vi thao tác và được nối với syringe qua ống bằng chấtdẻo được nạp đầy dầu parafin

Chuẩn bị dung dịch gen chuyển: gen chuyển được xen vào trong một vector plasmid và tạo dòngtrong E.coli Các vi khuẩn biến nạp mang plasmid tái tổ hợp được phát hiện trong môi trường nuôicấy có thuốc kháng sinh do plasmid mang các gen kháng thuốc đặc hiệu Các vi khuẩn sống sótđược sinh trưởng trong môi trường dinh dưỡng thích hợp và plasmid tái tổ hợp mang gen chuyển

sẽ được sao chép mỗi khi tế bào vi khuẩn phân chia Sau đó, hàng triệu bản sao của plasmid tái tổhợp mang gen chuyển được tách chiết từ các tế bào vi khuẩn này và các đoạn gen chuyển đượctách ra từ plasmid tái tổ hợp nhờ sử dụng enzym hạn chế Ðể tinh sạch, gen chuyển được điện ditrên gel agarose Hoà tan gen chuyển trong dung dịch đệm đặc trưng (như dung dịch Tris-EDTA;dung dịch TE ) và tính nồng độ dung dịch gen chuyển nhờ quang phổ kế Nồng độ dung dịch DNA

sử dụng cho vi tiêm thường là 1-5 µg/ml Trước khi chuyển vào phôi, gen chuyển được kiểm tra sựbiểu hiện trong các tế bào nuôi cấy bằng sự chuyển nhiễm (transfection)

Máy vi thao tác Olympus (Hãng Narishige)

1 Kính hiển vi soi ngược 2 Máy vi điều chỉnh

Vi tiêm được tiến hành qua các bước: nạp gen vào kim tiêm bằng phương pháp capillar (ngâm đầukim tiêm vào dung dịch gen khoảng 10-12 giờ) hoặc bơm trực tiếp dung dịch gen vào, lắp kim tiêm

và kim giữ vào máy vi thao tác, chuyển trứng tiền nhân vào đĩa petri có chứa môi trường được đặtdưới kính hiển vi, giữ trứng tiền nhân vào đầu kim giữ bằng lực hút của syringe, điều chỉnh kínhhiển vi để xác định đĩa phôi và điều chỉnh máy vi thao tác để đưa kim tiêm vào vị trí của trứng tiềnnhân, đẩy gen vào trứng tiền nhân bằng cách vặn nhẹ syringe Khi thấy trứng tiền nhân hơi phồng

to và trở nên sáng hơn thì dừng lại và kéo nhanh kim tiêm ra Trứng tiền nhân sau khi tiêm được dichuyển xa đến cuối đĩa petri trước khi tiêm trứng tiền nhân tiếp theo Mỗi một nhóm trứng tiền nhân

đã hoàn thành được chuyển sang một đĩa môi trường khác để ấp và đánh giá bằng mắt trong mộtvài tiếng Sau đó tất cả các trứng tiền nhân được nhìn thấy rõ ràng và được chuyển vào ống dẫntrứng của con cái nhận

Cho đến nay, trong các kỹ thuật chuyển gen vào động vật thì phương pháp vi tiêm dung dịch DNAvào hợp tử là phương pháp có hiệu quả nhất trên động vật có vú và hiện là phương pháp chủ yếuđược sử dụng để chuyển gen vào vật nuôi

Ðối với thực vật thì phương pháp này được sử dụng đối với các tế bào tiền phôi của hợp tử hoặccác tế bào tiền phôi của hạt phấn

Tuy nhiên sự xâm nhập của gen chuyển vào DNA tế bào vật chủ là một quá trình ngẫu nhiên và xácsuất để gen chuyển xen vào vị trí DNA vật chủ mà sẽ cho phép nó biểu hiện là thấp Hiệu quả của vitiêm là không cao (Bảng 1)

Số lượng con sinh ra từ trứng

vi tiêm

Số lượng con chuyển gen

Cừu 1032 73 (7,1%) 1(0,1%)

Chuyển gen bằng vi tiêm

Phương pháp chuyển gen nhờ vector virus

Vào năm 1974, lần đầu tiên các nhà khoa học phát hiện thấy rằng, sau khi tiêm DNA của retrovirusSV40 vào khoang phôi (blastocoel) của túi phôi chuột, DNA này có thể được tìm thấy sau đó trongcác tế bào của chuột trưởng thành (Jaenisch,1974; Jaenisch và Mintz,1974) DNA provirus Mo-Mulv

sử dụng trong các thí nghiệm như thế này đã tích hợp vào genome và truyền lại cho thế hệ sau, do

đó đã tạo nên các dòng chuột ổn định (Stuhlmann, Jahner và Jaenisch,1981) Từ đó, việc sử dụngvirus làm vector cho các DNA ngoại lai đã được phát triển

Phương pháp này tuy thao tác hơi phức tạp nhưng có ưu điểm là hiệu quả chuyển gen cao Hơnnữa gen cấu trúc gắn vào vector virus sẽ sử dụng promoter của virus, các promoter này thường cóhoạt tính cao do đó gen cấu trúc này sẽ được biểu hiện mạnh trong tế bào chủ

Về nguyên tắc, bất kỳ loại virus nào cũng có thể được sử dụng làm vector để chuyển vật liệu ditruyền vào trong tế bào Nhiều nhóm trong số đó, các papovavirus, adenovirus, retrovirus được sửdụng vào những mục đích chuyên biệt Ðể sử dụng làm vector, các phần khác nhau của genomevirus được thay thế bằng gen cấu trúc quan tâm Virus có thể được sử dụng để lây nhiễm vào tếbào giai đoạn sớm của phôi trước khi được chuyển ghép vào con mẹ Gen chuyển với vectorretrovirus xâm nhập một cách hiệu quả vào hệ gen của vật chủ nhưng virus sử dụng phải là virus antoàn, không gây bệnh.

Các cơ thể chuyển gen sinh ra từ phương pháp này là ở dạng khảm, có nghĩa là không phải tất cảcác tế bào của cơ thể đều mang retrovirus Gen chuyển chỉ có thể di truyền được nếu retrovirus hợpnhất vào một số tế bào sinh dục Ðối với phương pháp này tỉ lệ sống của các động vật chuyển gen

sơ sinh là rất thấp Nếu như các thao tác di truyền là chuẩn xác, không gây ra sự sẩy thai, thì thế hệđộng vật đầu tiên (F1) cần kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển Khi gen chuyển đã hợp nhất trongcác tế bào sinh dục thì được gọi là thể khảm dòng mầm và sau đó chúng được lai cùng dòngkhoảng 10-20 thế hệ cho đến khi thu được các động vật chuyển gen đồng hợp tử và gen chuyển cómặt ở trong tất cả mọi tế bào Ở giai đoạn này, phôi mang gen chuyển có thể được đông lạnh vàđược bảo quản cho các quá trình cấy chuyển về sau

Chuyển gen nhờ vector là virus

Chuyển gen bằng cách sử dụng tế bào gốc phôi

Xuất phát từ lý do các tế bào gốc phôi (tế bào phôi ở giai đoạn 16-32 tế bào) là các tế bào đa năng(totipotent) nghĩa là có thể phân hoá thành bất kỳ loại mô nào và từ đó sẽ tạo nên cơ thể hoànchỉnh Từ các túi phôi nuôi cấy in vitro, người ta đã tiến hành tách chiết các tế bào gốc phôi và biếnnạp gen ngoại lai vào những tế bào này

Sau khi chọn ra những tế bào đã được biến nạp gen lạ người ta đưa nó vào phôi khác ở giai đoạnphôi nang để tạo ra động vật chuyển gen thể khảm Trên 30% động vật chuyển gen tạo thành lànhững động vật chuyển gen thể khảm dòng mầm mang kiểu gen của dòng tế bào này Ở đây các tếbào gốc phôi được sử dụng như là một phương tiện để chuyển gen (Mintz, 1977)

Ưu điểm của phương pháp chuyển gen này là tỉ lệ phôi sống sót sau thao tác, sự tích hợp và biểuhiện tính trạng của gen mới khá cao Ðiều quan trọng hơn là trong thực tế việc chuyển gen có thểđược tiến hành thông qua sự thao tác với phôi dâu và túi phôi Phôi ở các giai đoạn này có thể thunhận mà không cần phẫu thuật (đặc biệt là đối với bò), do vậy công việc chuyển gen được tiến hànhrất dễ dàng

Phương pháp này có ý nghĩa đặc biệt đối với sự nghiên cứu kiểm tra di truyền của các quá trìnhphát triển Sự thuận lợi của nó là cho phép tạo ra một cách chính xác các đột biến gen xác địnhbằng tái tổ hợp đồng dạng

Trong tương lai phương pháp sử dụng tế bào gốc phôi sẽ được sử dụng rộng rãi để tạo động vậtchuyển gen

Có ba cách tạo động vật chuyển gen từ các tế bào gốc phôi mang gen chuyển:

-Thứ nhất, phương pháp được dùng trước mắt là bơm một số tế bào gốc phôi (khoảng 5-10 tế bào)vào trong xoang phôi nang của tế bào động vật

-Thứ hai, xen một số tế bào gốc phôi vào giữa bào thai thời kỳ 8 tế bào

-Thứ ba, nuôi cấy chung tế bào gốc phôi với phôi qua đêm

Phương pháp chuyển gen bằng cách sửdụng tế bào gốc phôi

Chuyển tế bào gốc phôi vào túi phôi

Chuyển gen trực tiếp vào protoplast

Ðể DNA dễ xâm nhập được vào tế bào thực vật, phải loại bỏ vách tế bào tạo protoplast Protoplast

có thể được duy trì trong môi trường nuôi cấy như các tế bào sinh trưởng một cách độc lập hoặc vớimột môi trường đặc hiệu, vách tế bào có thể được tạo thành và toàn bộ các cây có thể được tái sinh

từ các tế bào này Quá trình chuyển gen như thế này được thực hiện một cách trực tiếp bằng một

cơ chế vật lý đơn giản, không cần có vector

Ðể nâng cao hiệu quả biến nạp, người ta đã đã xử lý protoplast với PGE (polyethylene glycol) hoặcbằng xung điện

Phương pháp chuyển gen này rất có hiệu quả, đặc biệt đối với những loài thực vật mà phươngpháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium không thể thực hiện được Tuy nhiên, việc tạoprotoplast cũng như tái sinh cây từ protoplast không đơn giản, tốn nhiều công sức, bị ảnh hưởngcủa nhiều yếu tố môi trường Với phương pháp này, các nhà khoa học đã chuyển gen thành côngvào một số loài cây một lá mầm như loài lúa phụ Japonica (Datta, 1990), ngô (Doon, 1990), lúa mì(Vassil, 1992)

Chuyển gen bằng kỹ thuật xung điện

Kỹ thuật xung điện (electroporation) là một phương pháp cơ học được sử dụng để đưa các phân tửphân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào Trong phương pháp này, một xung điện cao thếtrong khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả năng làm rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid,tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bêntrong tế bào

Nhiều kỹ thuật nghiên cứu trong sinh học phân tử yêu cầu đưa gen hoặc protein ngoại lai vào trong

tế bào chủ Vì lớp phospholipid kép của màng sinh chất có một đầu ưa nước phía ngoài và một đầu

ưa nước phía trong , nên bất kỳ phân tử phân cực nào, bao gồm cả DNA và protein, đều không cókhả năng đi qua màng một cách tự do (Farabee, 2001).

Sơ đồ màng phospholipid kép

Sơ đồ này cho thấy các thành phần hóa học của màng sinh chất Các đầu ưa nước phân cựchướng về phía ngoài trong khi các đuôi kỵ nước hướng về phía trong và tương tác với đuôi kỵnước khác để cùng bám giữ màng Các phân tử phân cực không thể đi qua màng này nếu nhưkhông có sự hỗ trợ bên ngoài

Nhiều phương pháp đã được phát triển để vượt qua rào cản này, cho phép đưa DNA và các phân

tử khác vào trong tế bào đã được nghiên cứu Một trong những phương pháp này là kỹ thuật xungđiện

Kỹ thuật xung điện dựa trên trạng thái tương đối yếu của các tương tác kỵ nước của phospholipidkép và khả năng tập hợp lại một cách tự động của nó sau khi bị rối loạn (Purves, 2001) Vì vậy, mộtxung điện chớp nhoáng có thể gây ra rối loạn ở các vị trí của màng một cách nhất thời, làm cho cácphân tử phân cực có thể đi qua, nhưng sau đó màng có thế đóng kín lại nhanh chóng và tế bàokhông bị ảnh hưởng gì cả

Các tế bào chủ và DNA ngoại lai được tạo thành dịch huyền phù và cho vào trong một cuvette nhựa

có điện cực (Hình dưới)

Cuvette nhựa có điện cựcHình 2.15: Cuvette nhựa có điện cực

Ðể tạo ra xung điện cao thế trong một thời gian ngắn người ta sử dụng một thiết bị gọi là máy xunggen (gene pulser) (Hình 2.16) Quá trình cơ bản diễn ra bên trong máy này có thể được trình bàybằng sơ đồ hình 2.17

Máy xung gen (Gene pulser) (Hãng

Sơ đồ này cho thấy mạch điện cơ bản cung cấp điện cho kỹ thuật xung điện

Khi công tắc thứ nhất đóng, tụ điện nạp điện vào và tích một điện áp cao Khi công tắc thứ hai đóng,điện áp này phóng qua dịch huyền phù tế bào Một xung điện cần thiết cho kỹ thuật này thường làkhoảng 10.000-100.000 v/cm (thay đổi tùy theo kích thước của tế bào) trong vài phần triệu giây đếnmột phần ngàn giây Xung điện này làm rối loạn phospholipid kép của màng tế bào và tạo ra các lỗtạm thời Khả năng điện qua màng tế bào cùng lúc tăng lên 0,5-1,0 v vì vậy các phân tử đã đượcnạp điện này đi qua màng tế bào thông qua các lỗ bằng cách thức tương tự như điện di (Hìnhdưới)

Sơ đồ plasmid chứa DNA ngoại lai đi qua các lỗ tạm thời trên màng bào chất

Lối DNA đi vào tế bào không thể quan sát thấy dưới kính hiển vi, nhưng hình vẽ này cho thấy kháiniệm cơ bản của sự tạo thành các lỗ trên màng mà DNA có thể đi qua

Khi các ion đã nạp điện và các phân tử đi qua các lỗ, màng tế bào phóng điện và các lỗ này đóng lạimột cách nhanh chóng và phospolipid kép phục hồi lại cấu trúc cũ (Weaver, 1995) Lúc này cácphân tử mong muốn đã ở trong tế bào và chúng được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

Phương pháp này có thể sử dụng đối với gần như tất cả các loại tế bào của các loài

Lúc đầu phương pháp này được sử dụng để chuyển gen vào các tế bào động vật có vú, về saucho cả tế bào thực vật ở dạng protoplast Với một số cây một lá mầm quan trọng (loài lúa phụJaponica, ngô, lúa mì) mà không thể thể thực hiện được bằng phương pháp chuyển gen gián tiếpnhờ Agrobacterium thì người ta đã thành công với phương pháp này Hiệu quả biến nạp cao Trongmột nghiên cứu ở E.coli, 80% số tế bào nhận được DNA ngoại lai (Miller và Nickoloff, 1995) LượngDNA ngoại lai cần thiết là ít hơn so với các phương pháp khác (Withers, 1995) Phương pháp này

có thể thực hiện với các mô in vivo còn nguyên vẹn (Weaver, 1995) Ðoạn DNA ngoại lai được biếnnạp có kích thước lớn Tuy nhiên nếu các xung điện có cường độ và chiều dài không đúng thì một

số lỗ của tế bào sẽ trở nên quá lớn hoặc bị hỏng không thể đóng lại sau khi tế bào phóng điện, làmcho tế bào bị tổn thương hoặc bị thủng (Weaver, 1995) Một hạn chế nữa là sự vận chuyển DNAngoại lai vào và ra khỏi tế bào trong suốt thời gian điện biến nạp là tương đối không đặc hiệu Ðiềunày dẫn đến kết quả là không cân bằng ion mà sau đó sẽ làm rối loạn chức năng của tế bào và tếbào chết (Weaver, 1995)

Kỹ thuật xung điện được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của sinh học phân tử và yhọc Các ứng dụng của kỹ thuật xung điện bao gồm:

- Biến nạp DNA: các gen đặc hiệu có thể được tạo dòng trong plamid và sau đó plasmid này đượcđưa vào tế bào chủ để nghiên cứu cấu trúc và chức năng của gen và protein

- Chuyển plasmid trực tiếp giữa các tế bào: tế bào vi khuẩn đã chứa plasmid có thể được ủ với mộtdòng khác không mang plasmid nhưng lại có đặc tính mong muốn khác Ðiện áp của xung điện sẽtạo ra các lỗ, cho phép một số plasmid đi ra khỏi tế bào và lại đi vào tế bào khác Sau đó các tế bàomong muốn sẽ được chọn lọc bằng tính kháng thuốc kháng sinh hoặc bằng phương pháp tương tự

khác (Withers, 1995) Kiểu chuyển gen này cũng có thể được thực hiện giữa các loài khác nhau Vìvậy, một lượng lớn plasmid sinh trưởng trong các khuẩn lạc vi khuẩn được nhân lên một cáchnhanh chóng và sau đó được chuyển vào các tế bào nấm men bằng kỹ thuật xung điện để nghiêncứu (Gunn, 1995).

- Dung hợp tế bào đã kích thích: sự tạo thành các lỗ thủng trên màng xảy ra do xung điện chớpnhoáng tạo ra cho thấy đã kích thích sự dung hợp tế bào (Weber và Berrg, 1995)

- Phân phối thuốc qua da: Chỉ khi xung điện gây ra các lỗ tạm thời trên màng sinh chất, các lỗ tương

tự đã tạo ra ở màng lipid kép của lớp da chết ở phía ngoài cùng Các lỗ này cho phép thuốc đi qua

da đến các mô đích Các bệnh nhân thích phương pháp này hơn phương pháp tiêm (không cần kimtiêm) và có thể tránh được các vấn đề phân hủy hoặc hấp thu không đúng của liệu pháp uống thuốc(oral medication) trong hệ tiêu hóa (Praustmitz, 1993)

- Liệu pháp hóa điện khối u ung thư (cancer tumor electrochemotherapy): các nhà khoa học đangnghiên cứu tiềm năng của kỹ thuật xung điện để tăng tính hiệu quả của liệu pháp hóa học Khi sửdụng kỹ thuật xung điện để biến nạp DNA, xung điện này sẽ phá vỡ màng tế bào ung thư và làmtăng lượng thuốc đi đến các vị trí Một số nghiên cứu cho rằng đã làm giảm sự phát triển khối u khi

áp dụng phương pháp này cho các tế bào ung thư ở hệ thống mô hình động vật (Maeda, 1998)

- Liệu pháp gen: kỹ thuật xung điện cho phép các vector mang các gen quan tâm được biến nạpqua da đến các mô đích Khi đã hợp nhất vào các tế bào của cơ thể, các protein được tổng hợp từcác gen này có thể thay thế gen sai hỏng và vì vậy đã điều trị các rối loạn di truyền (Hình dưới)(Inovio, 2002)

Ứng dụng của kỹ thuật xung điện trong liệu pháp gen

Chuyển gen bằng súng bắn gen

Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, được thiết

kế đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật và được phát triển vào đầu thập niên

1980 do các nhà thực vật học ở Ðại học Corrnell cùng với các nhà nghiên cứu ở CorrnellNanofabrication Facility, Newyork, USA Súng bắn gen được bán trên thị trường vào năm 1990 Ðạn

sử dụng cho loại súng này là các hạt kim loại nặng cơ bản được bao bọc DNA Tên chính xác vàđầy đủ của súng bắn gen là hệ thống phân phối hạt biolistics (biolistic particle delivery system) và kỹthuật này thường được gọi một cách đơn giản là biolistics (sự kết hợp giữa hai thuật ngữ biology(sinh học) và ballistics (sự bắn tung)) Mặc dù có nhiều thiết kế kỹ thuật khác nhau nhưng nguyên lýchung của phương pháp này là sử dụng áp lực xung của khí helium để gia tốc các hạt.

Ứng dụng của kỹ thuật xung điện trong liệu pháp genSúng bắn gen bao gồm hai buồng bằng thép không gỉ, kích thước 6“x7“x10“ nối với hai bơm chânkhông DNA ngoại lai được gắn vào các hạt tungsten có đường kính rất nhỏ, khoảng 1μm (các kimm (các kimloại năng khác như vàng và bạc cũng được sử dụng nhưng không thường xuyên do giá cả đắt).Các hạt này được đặt trên một cái đĩa ở mặt bên trong của súng Sự bùng nổ khí helium ở 1000psilàm cho cái đĩa bắn về phía trước với tốc độ 1300 food/s, tương đương với tốc độ khi một viên đạnrời khỏi nòng súng Một tấm chắn làm dừng đĩa lại và các hạt vàng hay tungsten được phóng vềphía các tế bào đích Chúng xuyên qua vách tế bào và phóng thích các phân tử DNA (Hình 2.21).Súng bắn gen sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp để hợp nhất sự biểu hiện các gen đã phân phối Các

tế bào biến đổi di truyền có thể được sử dụng để tạo thực vật bao gồm cả sự sửa đổi di truyềnmong muốn ở trong tất cả các tế bào của chúng (Voiland, 1999)

Sơ đồ nguyên lý hoạt động của súng bắn gen Mục tiêu của súng bắn gen thường là callus của các tế bào thực vật giống nhau sinh trưởng trongmôi trường gel trên đĩa petri Sau khi các hạt tungsten đã va chạm vào đĩa, gel và callus bị phá vỡnhiều Tuy nhiên một số tế bào không bị phá vỡ khi va chạm mạnh và đã tiếp nhận các hạt tungstenđược bao bọc DNA và cuối cùng các phân tử DNA ngoại lai đã xâm nhập và hợp nhất vào nhiễmsắc thể thực vật Các tế bào từ đĩa petri được tập hợp lại và chọn lọc các tế bào đã hợp nhất thànhcông và biểu hiện DNA ngoại lai bằng các kỹ thuật hóa sinh hiện đại như sử dụng gen chọn lọc nốitiếp và Northern blots.

Các tế bào đơn đã chọn lọc từ callus có thể được xử lý với một số hormone thực vật như auxin,gibberelin và mỗi một tế bào có thể phân chia, biệt hóa thành các tế bào mô, cơ quan, tế bàochuyên hóa của toàn bộ cây Cây mới có nguồn gốc từ một tế bào nảy mầm thành công có thểmang các đặc tính di truyền mới

Chuyển gen bằng súng bắn gen

Phương pháp này có ưu điểm là thao tác dễ dàng, có thể chuyển gen vào nhiều loại tế bào và mô,các tế bào được biến nạp có tỉ lệ sống sót cao, cho phép đưa các gen vào tế bào ở vị trí mongmuốn Do vậy nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Các ứng dụng của kỹ thuật bắn genbao gồm

- Tạo thực vật chuyển gen: đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay trong lĩnh vựctạo ngũ cốc chuyển gen Bacillus thuringiensis là loài vi khuẩn tổng hợp ra protein crystal (crys1Ab

và crys1Ac) có khả năng giết một cách chọn lọc các nhóm côn trùng nhất định Gen mã hoá proteincrystal được gọi là gen Bt Gen Bt đã được bắn vào mô sẹo của cây ngũ cốc(Rassmussen, 1994) Trong khi các tế bào này sửa chữa tổn thương, DNA ngoại lai xâm nhập vàogenome tế bào chủ Vì vậy cho phép tế bào chủ phiên mã và giải mã gen Bt Sau mỗi lần quá trìnhbiến nạp được hoàn thành người ta cũng tiến hành sàng lọc theo phương pháp truyền thống là dựatrên cơ sở các marker chọn lọc được xen vào DNA cấu trúc (Brettschneider, 1997) Các markerchọn lọc mang tính kháng (kháng thuốc kháng sinh hay kháng thuốc diệt cỏ) như kanamycin là một

là một trong những marker phổ biến nhất được sử dụng

- Tiêm chủng vaccine di truyền: các gen được đưa vào cơ thể bằng súng bắn gen với mục đích gây

ra phản ứng miễn dịch với protein biểu hiện bởi gen chuyển Phương pháp tiêm chủng vaccine này

an toàn hơn các phương pháp khác bởi vì chỉ DNA ngoại lai được đưa vào và không có các proteinngoại lai (Lin, 2000)

- Liệu pháp gen tự sát (Suicide gene therapy): phương pháp bắn gen đã được sử dụng trong điều trịbệnh ung thư Một gen biểu hiện protein gây độc có promoter đặc hiệu khối u được đưa vào các tếbào khối u Khi protein này được biểu hiện thì tế bào khối u chết Protein này chỉ gây độc đối với các

tế bào khối u bởi vì promoter đặc hiệu cần cho sự biểu hiện chỉ được tạo ra trong các tế bào khối u(Lin, 2000)

- Sự điều biến miễn dịch (Immunomodulation): phương pháp này còn được sử dụng để chống lạiung thư Sử dụng súng bắn gen, một protein chỉ biểu hiện trong tế bào khối u nhưng làm cho phảnứng miễn dịch tăng lên được đưa vào tế bào Phản ứng miễn dịch tăng lên nhắm vào các tế bàokhối u và hiển nhiên gây ra hiệu quả mong muốn (Lin,2000)

- Dược lý di truyền: súng bắn gen có thể được sử dụng để đưa các gen tổng hợp protein hữu íchhay protein liệu pháp vào cơ thể Ví dụ như các yếu tố đông máu ở các cơ thể rối loạn sự đông máuhoặc tăng sự tổng hợp hồng cầu trong các cơ thể thiếu máu Sự biểu hiện kéo dài của các gen đưavào là một vấn đề, trong nhiều trường hợp thường đòi hỏi sự phân phối gen phức tạp (Lin, 2000)

- Súng bắn gen là một công cụ nghiên cứu: súng bắn gen có thể được sử dụng để xen các promoter

mà sẽ dẫn đến sự biểu hiện của các gen nhất định Hiệu quả khuyếch đại các protein nhất định làmột phương pháp có giá trị lớn đối với các nhà khoa học để nghiên cứu chức năng của các proteinnày (Lin, 2000)

Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium

Agrobacterium có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng cách chuyển một đoạn DNA của nóvào tế bào thực vật Khi DNA vi khuẩn được hợp nhất với nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn côngvào hệ thống tổ chức của tế bào một cách có hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sôi

của quần thể vi khuẩn Thật không may mắn cho các nhà trồng cây ăn quả khi gặp phải loài vikhuẩn này Bởi vì nó chính là thủ phạm gây ra bệnh khối u hình chóp và bệnh lông rễ ở nhiều loàicây cảnh và cây ăn quả.

Mặc dù hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium là có hiệu quả đối với một số loài nhưngkhông phải tất cả thực vật có thể được biến nạp bằng con đường này Ðặc biệt, lớp một lá mầm baogồm các cây ngũ cốc chính trên thế giới như lúa, lúa mì và ngô là không được biến nạp dễ dàngnhờ A tumefaciens

Ðể khai thác và sử dụng A tumefaciens như là một vector chuyển gen các nhà khoa học đã loại bỏcác gen gây khối u và gen mã hoá opine của T - DNA và thay thế vào đó là các marker chọn lọc,trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của T-DNA và các gen vir Gen chuyển được xenvào giữa các vùng bờ của T-DNA Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễmsắc thể tế bào thực vật

Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium đã được kiểm tra đối với sự xâm nhập bềnvững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen chuyển đặc biệt Tuy nhiên, một vài yếu tố ảnhhưởng đến hiệu quả biến nạp là loại mô được biến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức độ khởiđầu của vi khuẩn A tumefaciens sử dụng, môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp, markerđược sử dụng để chọn lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật

Tạo thực vật chuyển gen bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium

Chuyển gen vào tinh trùng và các tiền thể của tinh trùng

Chuyển gen vào tinh trùng

Tinh trùng trưởng thành có genome bất hoạt không có khả năng tái bản DNA của nó được bao phủbởi protamine làm cho DNA ngoại lai rất khó đi vào trong genome tinh trùng Vì vậy DNA ngoại laikhông có cơ hội để hợp nhất vào DNA tinh trùng.

Các thí nghiệm thực hiện cách đây khoảng gần một thập kỷ cho thấy rằng tinh trùng ủ với DNA cóthể mang DNA đến trứng trong quá trình thụ tinh dẫn đến kết quả là tạo ra chuột chuyển gen Cácnghiên cứu hóa sinh học cho thấy DNA bám vào tinh trùng một cách dễ dàng nhưng không chứngminh được rằng điều này xảy ra do sự xâm nhập của DNA Vì thế tinh trùng đóng vai trò là một thểtruyền đối với DNA ngoại lai

Sau một vài năm, phương pháp này được áp dụng rộng rãi với bò, lợn, cừu và cá medaka (Hình2.24) Trong tất cả các trường hợp này không hiểu tại sao các thí nghiệm rất khó thành công Hơnnữa, phần lớn các trường hợp, DNA ngoại lai hợp nhất vào genome vật chủ đã được sắp xếp lại ởmức độ cao Một nghiên cứu đã cho thấy rằng ngay cả sau khi đã rửa cẩn thận, tinh trùng chứaDNAse đã phân hủy DNA ngoại lai DNAse có rất nhiều trong nguyên sinh chất của tinh trùng vàlượng enzyme này bám vào tinh trùng là thay đổi đã giải thích tại sao thí nghiệm này không thànhcông và tại sao DNA ngoại lai bị phân cắt DNA ngoại sinh dường như gây ra hoạt tính DNAse ởtinh trùng đã tách chiết ra Có thể giải thích hiện tượng này là DNAse một phương tiện để bảo vệtinh trùng tránh khỏi sự nhiễm DNA ngoại sinh trên đường từ mào tinh hoàn đến tế bào trứng(Baccetti và Spadafora, 2000)

Các thử nghiệm để tăng DNA xâm nhập vào tinh trùng đã được thực hiện Sự xung điện hoặcchuyển nhiễm với các tác nhân hóa học đã làm tăng sự hấp thu DNA vào tinh trùng Hiện tượng nàythường được kèm theo do khả năng thụ tinh cho bào trứng của tinh trùng

Ở Xenopus, chuyển gen vào phôi bằng vi tiêm dẫn đến sự biểu hiện của gen ngoại lai và nó tồn tại

từ vài ngày đến vài tuần nhưng lại không hợp nhất vào genome vật chủ Ðể khắc phục khó

Chuyển gen vào tinhtrùng

Tinh trùng đã rửa ủ với DNA được sử dụng để thụ tinh in vivo hoặc in vitro Phương pháp này không

có hiệu quả đặc hiệu đối với việc tạo động vật chuyển gen và các gen đã hợp nhất thường bất hoạt

do sự sắp xếp lại DNA

Màng tinh trùng bị tổn thương bởi chất tẩy nhẹ DNA ngoại lai đi vào tinh trùng một cách tự do Cáctinh trùng này được sử dụng để thụ tinh in vitro bằng phương pháp ICSI khăn này, các nhà nghiêncứu đã sử dụng tinh trùng làm thể mang (carrier) Protocol đã được xác định sớm hơn cho động vật

có vú đã chứng tỏ không hiệu quả ở Xeponus Ðể tăng khả năng hấp thu DNA, tinh trùng được xử

lý với Triton, một chất tẩy nhẹ Ðiều này dẫn đến sự không ổn định của màng tinh trùng làm choDNA tự do đi vào tinh trùng Kết quả tương tự cũng đạt được khi làm lạnh và ấm tinh trùng.Chromatin đã bị phân hủy do enzyme hạn chế nhận biết một vài vị trí ở chromatin của tinh trùngnhưng đối với DNA ngoại lai thì không xảy ra Ðiều này gây ra cơ chế sửa chữa và làm tăng cơ hộihợp nhất DNA ngoại lai vào genome của phôi Phương pháp này có tên gọi là REMI (restrictionenzyme mediated intergration=sự hợp nhất qua trung gian ezyme hạn chế), một phương pháp làmtăng sự biến nạp của tế bào Sau các xử lý này, tinh trùng mất khả năng thụ tinh cho trứng Tiêmtrực tiếp tinh trùng vào trứng (intra-cytoplasmic sperm ịnjection=ICSI) được sử dụng đối với sự thụtinh in vitro ở người Phương pháp này đã được áp dụng cho Xeponus và đã tạo ra Xeponuschuyển gen với kết quả có thể chấp nhận (Hình 2.12B) Ðặc biệt hiện nay các nhà sinh học đã ứngdụng chuyển gen vào loài này để nghiên cứu sự phát triển (Marrsh-Arrmstrong, 1999; Perrny, 2001).Phương pháp này, trước tiên được sử dụng cho Xeponus, đã chứng tỏ thành công ở chuột Tuynhiên nó không cho kết quả cao hơn phương pháp vi tiêm vào tiền nhân là một phương pháp đơngiản hơn nhiều Phương pháp ISCI đã được sử dụng thành công hoàn toàn ở chuột khi chuyển cácđoạn DNA dài được thiết kế trong các vector BAC và YAC (Perry, 2001) Vì vậy phương pháp này

có thể được áp dụng rộng rãi đối với các loài khác kể cả gia súc lớn Hiện nay hạn chế của việc sửdụng ICSI ở các loài này là khó khăn Dường như là không thể áp dụng với các loài không thuộc bộLinh trưởng mà việc chuyển gen là khó khi sử dụng các phương pháp khác

Gần đây, một phương pháp tuyệt vời đã được đề xuất (Qian, 2001) DNA bám vào kháng thể đơndòng nhận biết một protein trên bề mặt tinh trùng hình thành nên một phức hợp ổn định với tinhtrùng Phương pháp này đã được sử dụng để thụ tinh in vitro ở chuột, gà bằng thụ tinh nhân tạo vàlợn bằng cách tiêm vào sừng tử cung Trong ba trường hợp này, khoảng 30% cá thể con sinh ra làđộng vật chuyển gen Gen chuyển đã không bị sắp xếp lại Nó đã biểu hiện và truyền lại cho thế hệsau Ðiều quan tâm là kháng thể đơn dòng giống nhau nhận biết tinh trùng của động vật có xươngsống thấp hơn và cao hơn kể cả con người Phương pháp này có thể được dùng để tạo Linh trưởngchuyển gen

Chuyển gen vào tiền thể tinh trùng in vitro

Tinh trùng thành thục được tạo ra từ các tế bào gốc thông qua các giai đoạn khác nhau của sự biệthóa (Hình 2.25) Các tế bào gốc tinh trùng có thể được tách chiết, nuôi cấy in vitro trong một thờigian ngắn và được cấy chuyển vào tinh hoàn nhận Các tế bào cấy chuyển này hoạt động theochương trình biệt hóa của chúng làm cho tinh trùng hoạt động chức năng Tỉ lệ tinh trùng tạo thành

từ các tế bào gốc cấy chuyển được tăng lên nhiều nhờ sự xử lý các con đực nhận với bisulfan.Bisulfan là một loại thuốc ngăn cản sự biệt hóa của tế bào gốc tinh hoàn Protocol này đã được sửdụng một cách thành công để chuyển gen vào tế bào gốc trong quá trình nuôi cấy Ðiều này đạtđược nhờ sử dụng vector retrovirus hiệu quả Các tế bào gốc cấy chuyển vào con đực nhận đã xử

lý bisulfan dẫn đến kết

Sử dụng các tế bào tiền thể của tinh trùng để chuyển gen

Các bước khác nhau của sự biệt hóa tế bào gốc thành tinh trùng

Các tế bào gốc hoặc các tế bào đã biệt hóa một cách cục bộ được tách chiết, nuôi cấy và chuyểnDNA chọn lọc vào Tinh trùng mang DNA ngoại lai này được sử dụng để thụ tinh bằng phương phápICSC

Tế bào gốc được tách chiết, nuôi cấy dưới những điều kiện ngăn cản sự biệt hóa của chúng, đượcchuyển DNA ngoại lai vào, được chọn lọc và đưa vào lại một tinh hoàn nhận, nơi mà chúng biệthóa Tinh trùng tạo ra được sử dụng để thụ tinh trứng bằng phương pháp thông thường quả là tạo

ra chuột chuyển gen với tỉ lệ cao, khoảng 4%(Nagano, 2001) Phương pháp này là hữu dụng đểnghiên cứu ảnh hưởng sinh học của gen trong quá trình thành thục tế bào gốc tinh trùng và để tạođộng vật chuyển gen Có thể suy ra phương pháp này ít thành công hơn đối với các loài lớn hơnchuột Dường như cần thiết phải sử dụng các tế bào đã được biến nạp cao hơn để tăng cơ hội định

cư ở tinh hoàn với một tỉ lệ chấp nhận được

Chuyển gen vào tiền thể của tinh trùng in vivo

DNA liên kết với thể chuyển nhiễm có thể được tiêm vào các ống sinh tinh (Hình dưới) Một sốnhóm nghiên cứu đã thành công trong việc tạo chuột chuyển gen bằng cách sử dụng tinh trùng củacác động vật đã được xử lý (Sato, 2002) Những kết quả khích lệ này có hiệu quả vừa phải và hãycòn chưa đạt chuẩn Hiện chúng đang được cải tiến nhưng chắc chắn là chưa có cách nào làm cho

có thể áp dụng rộng rãi phương pháp này đối với các động vật lớn hơn chuột Quả thực cấu trúccủa các ống dẫn tinh khác nhau và việc tiêm DNA là khó Mặt khác, lượng DNA tiêm vào có thể làrất lớn và khó điều khiển

Chuyển gen vào tiềnthể của tinh trùng một cách trực tiếp

DNA bình thường hoặc DNA bám vào thể chuyển nhiễm được tiêm trực tiếp vào các ống sinh tinh.Các tế bào đã hợp nhất DNA ngoại lai sẽ tạo ra động vật chuyển gen sau khi thụ tinh bìnhthường

Một điểm khác cũng cần được nghiên cứu Ðó là ở chuột, gen chuyển vào tiền thể của tinh trùng invivo xảy ra một cách độc lập trong các tế bào khác nhau dẫn đến tạo ra các động vật sơ sinh có sựhợp nhất khác nhau Ðây là một thuận lợi vì sự hợp nhất khác nhau có thể cho các kiểu hình hơikhác biệt Với phương pháp này, các nhà nghiên cứu có thể đánh giá các dòng động vật chuyểngen phức tạp từ một thí nghiệm đơn giản

Kỹ thuật viên gen (Gene pill)

Kỹ thuật viêm gen một phương pháp điều trị bệnh bằng liệu pháp gen thông qua đường uống thuốc.Một lượng DNA liệu pháp (dạng plasmid hay phức hợp DNA-peptid) được bọc bởi một màng lipidhỗn hợp đặc hiệu như màng bọc các viên thuốc thông thường tạo ra viên gen Viên gen được đưavào cơ thể theo đường miệng bằng cách uống Sau khi được được phóng thích, gen liệu pháp đượchấp thụ qua màng đi vào tế bào biểu mô ruột Ở đây gen liệu pháp được phiên mã và dịch mã thànhprotein dược phẩm Protein dược phẩm tiết vào máu, đến các mô bệnh để ức chế sự hoạt động củacác gen bệnh

Kỹ thuật viên gen là một phương pháp mới (được cấp bằng phát minh vào ngày 3/5/2001) lần đầutiên được sử dụng để chữa bệnh tiểu đường bằng cách sử dụng một viên gen được tạo thành từDNA mã hóa inssulin Phương pháp này đã khắc phục được các hạn chế của các phương pháptruyền thống như vấn đề liều lượng và phân phối thuốc Nó có thể cách mạng hóa liệu pháp gen vàcho các bệnh nhân một sự chọn lựa để đưa insulin vào cơ thể hàng ngày

Tuy nhiên, tính có ích của viên gen sẽ phụ thuộc vào sự biểu hiện và phân phối của gen trong các tếbào ruột non và hãy còn chưa chắc chắn là có thích hợp đối với các protein cần thiết với liều lượngkhớp một cách tinh vi không

Sơ đồ cơ chế hoạt động của viên gen

1 Viên gen phân phối DNA đến ruột non

2 DNA được hấp thụ vào các tế bào ruột

3 Protein dược phẩm tổng hợp trong các tế bào

4 Protein dược phẩm tiết vào máu

Kỹ thuật viên gen khai thác một cách tích cực khoảng thời gian sống ngắn của các tế bào biểu mô

và tính có lợi của sự phân chia một cách nhanh chóng của các tế bào đích xếp thành hàng trongruột non Về mặt lý thuyết, liệu pháp gen thông qua đường uống có thể phân phối gen tổng hợp bất

cứ protein nào cho một loại tế bào đơn trong ruột non, đáp ứng được yêu cầu tìm ra vector hoặcchiến lược biến nạp mới cho mỗi một loại tế bào đích Tuy nhiên phương pháp này cho hiệu quảchưa cao do sự sử dụng các tế bào ruột non làm các tế bào đích bị giảm bởi nhiều nhóm tế bào cóthời gian sống ngắn (2-3 ngày), môi trường acid và DNAse trong hệ dạ dày ruột Mặt khác, viên genchỉ có thể mang các gen ngoại lai có kích thước nhỏ Hiện nay người ta mới chỉ tạo ra được một sốloại viên gen sử dụng trong điều trị thử nghiệm Trong tương lai viên gen sẽ trở thành một kỹ thuật

có hiệu quả để điều trị bệnh bằng liệu pháp gen

Công nghệ DNA tái tổ hợp

DNA tái tổ hợp

Khái niệm

DNA

DNA là chữ viết tắt của axit 2’-deoxyribonucleic, được nhà sinh học người Thụy Điển Miescher tìm

ra vào năm 1869 trong nhân tế bào bạch cầu (tế bào mủ) Đầu tiên ông gọi nó là nuclein có nghĩa làhạch nhân Sau đó, ông đã phát hiện ra nó có bản chất axit và gọi nó là axit nucleic Sau hơn 80

năm cùng với sự tranh cãi của nhiều nhà khoa học, đến năm 1952, người ta mới công nhận DNA làvật chất di truyền.

DNA gồm 3 thành phần chính: bazơ nitơ dạng purine và pyrimidine (A,T,C,G), đường pentose(đường 5 carbon) và axit phosphoric (H3PO4) Ba thành phần này có tỷ lệ 1:1:1 và chúng liên kếtvới nhau tạo thành một nucleotide

Cấu tạo một nucleotideCấu trúc của DNA được Watson-Crick khám phá ra Đó là chuỗi xoắn kép cong nhẹ nhàng, có cấutrúc không gian 3 chiều, gồm hai sợi song song,đối xứng và bổ sung cho nhau theo một qui luậtnghiêm ngặt: A bắt cặp với T và C bắt cặp với G nhờ các liên kết hydro Cấu trúc xoắn kép củaWatson- Crick là chiếc chìa khóa để mở ra những kỹ thuật của sự sống

DNA tái tổ hợp

Với cấu trúc đặc biệt của phân tử DNA và sự bắt cặp nghiêm ngặt của các bazơ nitơ, nhiều nhànghiên cứu đã nảy ra ý tưởng: nếu tạo ra được những đuôi ở một trong hai sợi của phân tử DNAkhác nhau thì chúng có thể nối lại với nhau nhờ bắt cặp bổ sung

Vào những năm 70, bằng những phương pháp khác nhau, người ta đã tạo được những phân tửDNA tái tổ hợp đầu tiên

Năm 1972, nhóm nghiên cứu của trường đại học Stranford (Paul-Berg) đã đưa ra phương phápđuôi để nối các phân tử DNA khác nhau Để tạo đầu dính, người ta sử dụng enzyme terminaltransferase Dưới tác dụng của enzyme này, người ta đã tạo được những đuôi poly nucleotidekhoảng 50 đến 100 gốc adenine (polyA) ở đầu OH (3’) của mạch đơn DNA SV 40 (Simian virus 40)

và đuôi polyT ở DNA plasmid đã được mở bởi enzyme Sau khi trộn lẫn hai loại DNA này, các đuôi

bổ sung adinine và thymine bắt cặp lại với nhau và với sự có mặt của enzyme ligase, hai DNA nàyđược nối lại và tạo ra plasmid tái tổ hợp vòng Vì sự an toàn cho cộng đồng nên sản phẩm tái tổhợp này không được biến nạp trong tế bào chủ Tuy chưa hoàn tất, nhưng thực nghiệm của Berg

đã cho ta hai vấn đề mấu chốt về DNA tái tổ hợp Ông cho rằng, có thể dùng enzyme để cắt DNAmột cách định trước và các đoạn DNA ở các loài khác nhau có thể nối lại với nhau

Năm 1973, Staley Cohen và Annie Chang đã tạo ra những phân tử DNA tái tổ hợp từ các loài khácnhau, có nhiều ưu điểm và đã được biến nạp trong tế bào chủ Và từ đây, công nghệ DNA tái tổ hợp