ĐỀ CƯƠNG THỰC HÀNH VI SINH y học

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều - Là phương pháp xác định sự có mặt của kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên của vi sinh vật trong huyết thanh của bệ

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều

ĐỀ CƯƠNG THƯ C HÀ NH VI SINH Y HỌ C (ĐỐI TƯỢNG SV Y2 CHÍNH QUY)

Câu 1 Kể tên các loại hình thể vi khuẩn và cho ví dụ minh họa với các loại

vi khuẩn mà anh (chị) đã biết qua học thực hành?

Các loại hình thể vi khuẩn : cầu khuẩn, trực khuẩn, xoắn khuẩn

- Cầu khuẩn: là những vi khuẩn có hình cầu, ví dụ: tụ cầu vàng, liên cầu A, lậu cầu, phế cầu…

- Trực khuẩn: là những vi khuẩn có hình que, ví dụ: trực khuẩn lao, trực khuẩn shigella gây bệnh lỵ, trực khuẩn salmonella gây bệnh thương hàn…

- Xoắn khuẩn: là những vi khuẩn xoắn theo dạng lò xo, ví dụ: xoắn khuẩn giang mai, leptospira…

Câu 2 Nêu các phương pháp chẩn đoán vi sinh vật, cho ví dụ minh họa?

Các phương pháp chẩn đoán vi sinh vật gồm: chẩn đoán trực tiếp và chẩn đoán gián tiếp:

1 Chẩn đoán trực tiếp: là phương pháp nhằm xác định sự có mặt của vi sinh vật, thành phần cấu tạo của vi sinh vật (enzym, thành phần kháng nguyên: lông,

vỏ, vách), các sản phẩm do vi sinh vật tạo ta (độc tố, độc lực)

- Bao gồm các kỹ thuật:

Soi tươi: Soi trực tiếp vi khuẩn sống

Nhuộm soi: Giết vi khuẩn rồi nhuộm màu

Nuôi cấy: tạo môi trường dinh dưỡng cho vi sinh vật phát triển tồi cấy lên môi trường để xác định tính chất, định danh

Gây bệnh trên thực nghiệm: lên các loài động vật

Phát hiện kháng nguyên bằng các phản ứng miễn dịch bằng kháng thể mẫu Kỹ thuật sinh học phân tử: phát hiện AND/ARN (quá trình tổng hợp AND thực hiện bên ngoài phân tử sống)

VD: để chẩn đoán vi khuẩn lao:

Nhuộm Ziel-Neelsen

Nuôi cấy (từ 2 đến 8 tuần mới tạo được khuẩn lạc)

Gây bệnh thực nghiệm trên chuột lang

Phản ứng miễn dịch (nhuộm miễn dịch huỳnh quang)

PCR để xác định DNA của vi khuẩn lao

2 Chẩn đoán gián tiếp:

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều

- Là phương pháp xác định sự có mặt của kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên của vi sinh vật trong huyết thanh của bệnh nhân

- Kháng thể này được tìm thấy trong huyết thanh của bệnh nhân nên phản ứng này còn được gọi là phản ứng huyết thanh học

- Nguyên lý: dùng kháng nguyên mẫu để tìm kháng thể

- Tùy theo từng loại vi sinh vật có thể áp dụng các kỹ thuật hiệu quả nhất, phù hợp nhất

Câu 3 Tiệt trùng là gì? Nêu các phương pháp được sử dụng trong tiệt trùng?

1 Khái niệm: Tiệt trùng là tiêu diệt tất cả các vi sinh vật (kể cả nha bào) và bất hoạt virus hoặc loại bỏ hoàn toàn ra khỏi vật cần tiệt trùng

- Áp dụng: để tiệt trùng các vật dụng chịu nhiệt như kim loại, thủy tinh, đồ

gốm Không dùng để tiệt trùng các vật dễ cháy như nhựa, cao su…

2.2 Hơi nước ở áp suất cao (to cao)

- Sử dụng lò hấp (nồi hấp) tạo hơi nước căng và bão hòa ở nhiệt độ >100oC

- Là bức xạ ion hóa giàu năng lượng có thể tiêu diệt vi sinh vật

- Áp dụng: tiệt trùng chỉ katgut và các vật dụng nhạy cảm với Ethylenoxid

hay nhiệt độ cao như catheter và các mảnh ghép

- Tiệt trùng các dụng cụ và bông băng trong những túi đóng sẵn

2.4 Sử dụng hóa chất

- Thường dùng là ethylenoxid và Formaldehyd

- Hạn chế: ethylenoxid là chất độc, gây dị ứng, kích thích niêm mạc mạnh

và dễ gây cháy, ung thư Vì vậy khi sử dụng phải cẩn thận, đề phòng cháy nổ 2.5 Lọc vô trùng

- Lọc bằng màng: dùng màng lọc với khe hở nhỏ đủ để giữ lại vi sinh vật

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều

- Lọc sâu: dòng chảy đi qua 1 lớp vật liệu có cấu tạo sợi, hạt và gắn những

vi sinh vật vào cấu trúc mạng

- Áp dụng: chỉ để lọc chất khí, lỏng, những sản phẩm sinh học không thể

áp dụng các biện pháp tiệt trùng khác

Câu 4 Khử trùng là gì? Các phương pháp được sử dụng trong khử trùng ?

1 Định nghĩa: khử trùng là làm cho vật được khử trùng không còn khả năng gây nhiễm trùng (tiêu diệt mầm bệnh mà không phải là tất cả vi sinh vật) Nguyên tắc: bất hoạt không phục hồi lại các mầm bệnh

Vai trò: Có vai trò quan trọng khi các tác nhân gây bệnh có thể tồn tại ở nhiều

nơi mà việc tiệt trùng vì nhiều lý do kinh tế và thực thế không thể áp dụng rộng rãi được

2 Các biện pháp vật lý

2.1 Hơi nước nóng

- Thường dùng luồng hơi nước nóng 80-100o

C vì nó tiêu diệt tế bào sinh

trưởng ở trạng thái tự do trong vài phút

- Áp dụng: khử trùng chăn, màn, quần áo, các dụng cụ đã dùng của người

bệnh

2.2 Tia cực tím

- Cơ chế: tia cực tím làm biến đổi cấu trúc các phân tử của vi sinh vật như acid nucleic dẫn đến đột biến làm hỏng vật liệu di truyền và chết

- Áp dụng: khử trùng không khí hay nước sạch

- Hạn chế: - diệt được hầu hết vi khuẩn nhưng không tiêu diệt được nha bào và bào tử nấm, có thể gây viêm kết mạc và giác mạc

3 Các biện pháp hóa học

3.1 Cồn

- Cơ chế: làm biến tính protein và phá hủy cấu trúc màng tế bào

- Áp dụng: khử trùng da, nhất là khử trùng bàn tay trong phẫu thuật và vệ

sinh phòng bệnh

- Hạn chế: không tiêu diệt được nha bào, tác dụng diệt virus có nhiều ý kiến khác nhau Cồn dễ cháy và dễ bay hơi Khi sử dụng dùng cồn 70o để tránh

bỏng da

3.2 Phenol và dẫn xuất phenol

- Cơ chế: phá hủy màng tế bào, bất hoạt enzym và biến tính protein

- Áp dụng: chỉ dùng để đánh giá tác dụng sát khuẩn của 1 hóa chất

- Chỉ số phenol là [P]min/[chất sát khuẩn]min cùng có tác dụng như nhau

lên 1 loài vi khuẩn trong một thời gian nhất định

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều

- Hạn chế: không diệt được nha bào và virus, có thể ăn da, niêm mạc và

còn có thể gây độc với thần kinh

3.3 Nhóm Halogen

- Cơ chế: phá hủy màng tế bào, gây bất hoạt enzym

- Một số halogen thường dùng: clo thường dùng trong thanh khuẩn nước ăn

và nước hồ bơi

- Clorua vôi dùng để khử trùng chất nôn, chất thải và dụng cụ thô hoặc rắc

hố xí

3.4 Muối của kim loại nặng

- Hoạt tính kháng khuẩn theo thứ tự Hg, Ag, Cu, Zn

- Cơ chế: làm bất hoạt protein

- Hạn chế: không diệt được nha bào, virus và khả năng tiêu diệt các vi

khuẩn kháng acid còn yếu

- Áp dụng: các hợp chất hữu cơ của Hg thường được dùng sát trùng vết thương, da và niêm mạc hoặc dùng trong lưu trữ chế phẩm sinh học (vaccine,

kháng huyết thanh)

- Nitrat bạc được pha chế dung dịch nhỏ mắt cho trẻ sơ sinh

- Sulfat kẽm hoặc kem/mỡ oxid kẽm thường dùng để điều trị bệnh ngoài da

do da nhiễm vi khuẩn hoặc nấm

3.5 Aldehyd

- Dung dịch Formaldehyd: tiêu diệt cả vi khuẩn, nấm và virus, nếu đủ thời

gian và nhiệt độ cao nó còn tiêu diệt được cả nha bào

- Áp dụng: dung dịch nước để lau chùi sàn nhà và đồ dùng, khi dùng để

khử trùng không khí và máy móc lớn

- Hạn chế: gây kích thích da, niêm mạc, có thể dẫn tới dị ứng và nghi ngờ

có thể gây ung thư Nó làm tủa protein nên không dùng để khử trùng chất thải 3.6 Một số chất khác

- Các chất oxi hóa (H2O2, KmnO4) và thuốc nhuộm (ví dụ: xanh methylen, tím tinh thể) được pha chế thành dung dịch lỏng, thường dung làm chất sát

khuẩn, có tác dụng ức chế hoặc giết chế vi khuẩn

- Acid và base có tác dụng diệt vi khuẩn vì tính điện phân thành H+ và

OH- mạnh

Câu 5 Trình bày các bước chuẩn bị một tiêu bản nhuộm?

Sau khi chuẩn bị đầy đủ vi khuẩn hoặc bệnh phẩm để nhuộm cùng các dụng cụ khác như đèn cồn, que cấy, máy lửa, nước muối sinh lý, lam kính sạch… Để đảm bảo có được một tiêu bản tốt sau khi nhuộm, quá trình làm tiêu bản để

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều

nhuộm được chia ra 4 bước theo đúng trình tự sau: dàn phiến đồ, để khô, cố định và nhuộm

1 Dàn phiến đồ: nhằm mục đính rải đều một lớp mỏng và đều vi khuẩn hoặc bệnh phẩm lên lam kính, giúp cho việc quan sát vi khuẩn được rõ ràng Nếu dàn phiến đồ dày hoặc không đều thì vi khuẩn sẽ chồng đống hoặc chỗ thưa chỗ dày, khó quan sát

- Với phương pháp nhuộm Gram: dàn hình tròn theo vòng xoáy trôn ốc, từ trong ra ngoài, đường kính 1 cm

- Với phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen: dàn theo hình elip, đường kính 2-3 cm

2 Để khô phiến đồ: nhằm mục đích giúp cho vi khuẩn dính chặt vào lam kính, chúng không bị rửa trôi đi khi rửa nước và khi cố định bằng hóa chất Ngoài ra để khô còn có tác dụng giữ cho hình thể vi khuẩn không bị biến dạng khi cố định bởi nhiệt độ Bởi vì, khi phiến đồ còn ướt nếu cố định bằng nhiệt độ (thường dùng ngọn lửa đèn cồn) thì vi khuẩn sẽ bị mất nước đột ngột, gây biến dạng hình thể vi khuẩn và tế bào có trong bệnh phẩm Khi đó việc nhận định hình thể vi khuẩn và các tế bào sẽ gặp khó khăn

3 Cố định: nhằm giết chế vi khuẩn trước khi nhuộm Phải giết chết vi khuẩn trước khi nhộm là vì: khả năng bắt màu thuốc nhuộm của vi khuẩn sẽ là tốt nhất khi chúng đã bị chết, khi còn sống thì khả năng này của chúng là rất kém Có thể cố định bằng hóa chất hoặc bằng nhiệt độ

4 Nhuộm: nhằm mục đích cho vi khuẩn có màu sắc do sự bắt màu các thuốc nhuộm của chúng

Câu 6 Trình bày kỹ thuật nhuộm đơn (nhuộm xanh methylen) và cách nhận định kết quả

Có nhiều kỹ thuật nhuộm khác nhau, tuy nhiên, về cơ bản, người ta chia ra làm hai phương pháo là nhuộm đơn và nhuộm kép:

- Nhuộm đơn: là kỹ thuật nhuộm chỉ dùng một loại thuốc nhuộm trong quá trình nhuộm Ví dụ như nhuộm đơn bằng xanh methylen, đỏ fucxin, tím

gentian… Nhuộm đơn chỉ đơn giản cho biết được hình thể và cách sắp xếp của

vi khuẩn, không cho biết được khả năng bắt màu khác nhau giữa các vi khuẩn

Vì vậy, nhuộm đơn ít có ý nghĩa trong việc phân loại và chẩn đoán vi khuẩn

- Kỹ thuật nhuộm đơn là rất đơn giản, sau khi cố định tiêu bản, nhỏ thuốc nhuộm phủ kín phiến đồ, để 1 phút, rửa nước, để khô

- Nhận định vi khuẩn: các vi khuẩn có trong bệnh phẩm đều bắt màu xanh

Câu 7 Trình bày kỹ thuật nhuộm Gram và cách nhận định kết quả?

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều

1 Các hóa chất và thuốc nhuộm:

Các hóa chất và thuốc nhuộm được dùng trong kỹ thuật nhuộm Gram gồm có:

- Thuốc nhuộm gentian có màu tím

- Dung dịch lugol: là hỗn hợp của iod và KI pha trong cồn, nó có tác dụng tạo phức hợp màu tím với thuốc nhuộm gentian

- Dung dịch cồn – aceton (pha theo thể tích 1:1) dùng để tẩy màu của phức hợp tím

- Thuốc nhuộm fucxin có màu đỏ

2 Trình tự các bước tiến hành nhuộm Gram

Sau khi chuẩn bị xong tiêu bản nhuộm trình tự các bước được thực hiện như sau:

- Bước 1: nhuộm màu vi khuẩn bằng thuốc nhuộm gentian (30s)

- Bước 2: nhỏ dung dịch lugol (30s)

- Bước 3: tẩy màu tím bằng nhỏ dung dịch cồn – aceton: khi thấy ánh tím

từ phiến đồ vừa hòa tan hết trong cồn aceton là được (30s)

- Bước 4: nhuộm màu vi khuẩn bằng thuốc nhuộm fucxin (30s)

Chú ý: sau mỗi bước trên đều phải rửa nhẹ phiến đồ bằng nước sạch Sau khi nhuộm xong, phải để khô tiêu bản rồi mới nhỏ dầu để soi

3 Nhận định kết quả nhuộm Gram

- Các vi khuẩn có màu tím là vi khuẩn Gram (+)

- Các vi khuẩn có màu đỏ là Gram (-)

Câu 8: Trình bày cơ chế bắt màu thuốc nhuộm của vi khuẩn trong kỹ thuật nhuộm Gram

Tùy theo cấu tạo hóa học của vách vi khuẩn, ở bước 2 đã tạo ra phức hợp tím tạo vách tế bào vi khuẩn Phức hợp tím này có khả năng là bền hay không bền với cồn aceton

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều

- Phức hợp tím bền với cồn aceton: khi tẩy bằng cồn ở bước 3, phức hợp màu tím ở vách tế bào vi khuẩn không bị hòa tan trong cồn Do đó khi nhuộm tiếp bằng đỏ fucxin ở bước 4, vách không bắt màu đỏ của fucxin và vi khuẩn có màu tím Các vi khuẩn có khả năng này là vi khuẩn G (+) (do lớp peptidoglycan

ở thành tế bào của vi khuẩn G (+) dày hơn G(-)

- Phức hợp tím không bền với cồn aceton: khi tẩy cồn ở bước 3, phức hợp màu tím ở vách tế bào vi khuẩn bị hòa tan trong cồn, sẽ bị trôi đi khi rửa nước

và vách mất màu Vì vậy, khi nhuộm tiếp bằng đỏ fucxin ở bước 4 thì vách vi khuẩn sẽ bắt màu đỏ của fucxin Các vi khuẩn bắt màu đỏ này được gọi là vi khuẩn G (-)

Câu 9 Trình bày kỹ thuật nhuộm Ziehl-Neelsen và cách nhận định kết quả?

1 Các hóa chất và thuốc nhuộm

- Thuốc nhuộm đỏ fucxin: nồng độ đặc hơn fucxin dùng trong kỹ thuật nhuộm Gram

- Dung dịch cồn acid: cồn 90 độ pha loãng với H2SO4 4% theo tỷ lệ bằng nhau: dùng để tẩy màu thuốc nhuộm từ vách vi khuẩn

- Thuốc nhuộm xanh methylen có màu xanh

2 Trình tự các bước nhuộm Ziehl-Neelsen

Sau khi chuẩn bị xong tiêu bản nhuộm, trình tự các bước được thực hiện như sau:

- Bước 1: Nhuộm màu vi khuẩn bằng thuốc nhuộm fucxin: sau đó dùng ngọn đèn cồn hơ nóng ở phía dưới tiêu bản, khi thấy hơi bốc lên là được Hơ nóng là dùng nhiệt để làm giãn nở cấu trúc lớp sáp bao bọc ở ngoài vách của các vi khuẩn kháng cồn kháng acid, tạo điều kiện cho thuốc nhuộm ngấm được vào vách vi khuẩn

- Bước 2: Tẩy màu bằng cồn acid: tẩy đến khi thấy hết màu đỏ là được

- Bước 3: Nhuộm màu vi khuẩn bằng thuốc nhuộm methylen: giúp cho các

vi khuẩn bị mất màu đỏ khi tẩy cồn sẽ bắt màu xanh

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều

màu xanh ( được tạo ra từ các tạp khuẩn và các tế bào…có trong bệnh phẩm),

có các trực khuẩn mảnh bắt màu đỏ nằm rải rác với số lượng khác nhau tùy theo

- Ở bước 1, tất cả phiến đồ đều bắt màu đỏ fucxin

- Khi tẩy cồn ở bước 2, các vi khuẩn kháng cồn kháng acid sẽ không bị dung dịch cồn acid tẩy mất màu đỏ tại vách Trong khi đó, các vi khuẩn khác không có khả năng này sẽ bị dung dịch cồn acid hòa tan và bị nước rửa trôi hết màu đỏ tại vách

- Khi nhuộm bằng xanh methylen ở bước 3, vách của những vi khuẩn

kháng cồn kháng acid vẫn giữ được màu đỏ nên không bắt màu thuốc nhuộm nữa Trong khi đó các vi khuẩn bị mất màu đỏ ở bước tẩy cồn acid sẽ bắt màu của methylen và có màu xanh

 Trực khuẩn lao là vi khuẩn kháng cồn kháng acid nên bắt màu đỏ fucxin khi nhuộm

Câu 11 Kể tên các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán vi sinh mà anh (chị) đã nhận biết được trong quá trình học thực hành?

Các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán vi sinh gồm:

1 Chẩn đoán trực tiếp

- Là phương pháp nhằm xác định sự có mặt của vi sinh vật, thành phần cấu tạo của vi sinh vật ( enzym, thành phần kháng nguyên: lông, vỏ, vách), các sản phẩm do vi sinh vật tạo ra (độc lực, độc tố)

- Bao gồm các kỹ thuật

Soi tươi: soi trực tiếp vi khuẩn sống

Nhuộm soi: giết vi khuẩn rồi nhuộm màu (bao gồm nhuộm đơn (nhuộm xanh methylen), và nhuộm kép (Nhuộm Gram và nhuộm Ziehl-Neelsen)

Nuối cấy: tạo môi trường dinh dưỡng cho vi sinh vật phát triển rồi cấy lên môi trường để xác định tính chất, định danh

Gây bệnh thực nghiệm: lên các loài động vật

Phát hiện kháng nguyên bằng các phản ứng miễn dịch bằng kháng thể mẫu Kỹ thuật sinh học phân tử: phát hiện AND/ARN (quá trình tổng hợp AND thực hiện bên ngoài phân tử sống)

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều

2 Chẩn đoán gián tiếp

- Là xác định sự có mặt của kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên của vi sinh vật trong huyết thanh của bệnh nhân

- Kháng thể này được tìm thấy trong huyết thanh của bệnh nhân nên phản ứng này còn được gọi là phản ứng huyết thanh học

- ASLO, RPR, ELISA, Sắc ký miễn dịch, MDHQ gián tiếp

Câu 12 Kể tên các loại bệnh phẩm thường được lấy từ các bệnh nhân để nuôi cấy tìm vi khuẩn gây bệnh? Cho ví dụ minh họa?

Các loại bệnh phẩm thường được lấy từ các bệnh nhân để nuôi cấy tìm vi khuẩn gây bệnh gồm

- Bệnh phẩm phân: Sallmonela, Shigella, E coli, V cholera, S aureus

- Bệnh phẩm máu: liên cầu A, HIV, HBC,…

- Bệnh phẩm mủ dịch: dịch tiết, ổ áp xe vỡ, ổ áp xe kín, dịch trong khoang

cơ thể (dịch màng bụng, màng phổi, màng tim) như lao, lậu cầu, mủ xanh,…

Câu13 Trình bày cách lấy bệnh phẩm mủ dịch?

Để đảm bảo cho kết quả xét nghiệm chính xác, việc lấy bệnh phẩm là khâu đầu tiên đóng vai trò rất quan trọng Nguyên tắc của lấy bệnh phẩm mủ dịch giống nguyên tắc chung là lấy bệnh phẩm càng sớm càng tốt, lấy trước khi dùng

kháng sinh, phải đảm bảo vô trùng và gửi ngay đến phòng xét nghiệm, chậm nhất là 2 giờ sau khi lấy bệnh phẩm

Ở phòng xét nghiệm nếu chưa xét nghiệm được ngay, phải bảo quản bệnh phẩm trong ngăn mát của tủ lạnh Một số bệnh phẩm ở quá xa phòng xét nghiệm phải được giữ trong môi trường bảo quản riêng để giữ cho vi khuẩn không chết trong thời gian vận chuyển Riêng cấy mủ tìm lậu cầu phải tiến hàng ngay ở phòng thí nghiệm vì vi khuẩn lậu chết rất nhanh khi ra ngoài môi trường

Trường hợp bệnh nhân đang được điều trị bằng kháng sinh toàn thân hoặc tại chỗ, phải ngừng kháng sinh ít nhất sau 48h trước khi lấy mủ và dịch để xét nghiệm

1 Lấy bệnh phẩm từ các ổ áp xe kín và các dịch trong khoang vô trùng Trong các trường hợp trên, việc lấy bệnh phẩm phải đảm bảo tuyệt đối vô trùng Bởi vì, nếu làm được nhưng vậy thì việc xác định căn nguyên gây nhiễm trùng

sẽ rất dễ dàng Nếu để vi khuẩn bên ngoài nhiễm vào bệnh phẩm sẽ gây khó khăn cho việc xác định căn nguyên vi khuẩn gây bệnh

Để thực hiện vô trùng khi lấy bệnh phẩm, người ta thường dùng cồn iot 2% sát khuẩn da trước khi chọc hút mủ hoặc dịch bằng bơm tiêm vô khuẩn Ống

nghiệm chứa bệnh phẩm mủ hoặc dịch phải là ống vô trùng và có nút đậy kín

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều

Động tác bơm bệnh phẩm từ bơm tiêm vào ống nghiệm tốt nhất phải được thực hiện ngay cạnh ngọn lửa đèn cồn để đảm bảo vô trùng Trong trường hợp hút được ít mủ hoặc dịch thì phả gửi cả bơm tiêm đến phòng xét nghiệm, không nên bơm bệnh phẩm vào ống nghiệm

2 Lấy bệnh phẩm từ ổ áp xe đã vỡ và các tổn thương hở có tiết mủ hoặc dịch

Trong những trường hợp này, khi lấy bệnh phẩm phải cố gắng thực hiện theo nguyên tắc càng vô trùng được càng tốt

Nếu thương tổn là ổ áp xe có vẩy khô bao phủ và có nhiều mủ thì phải dùng gạc

vô khuẩn làm bong vẩy rồi dùng bơm tiêm vô khuẩn chọc hút mủ ở vị trí sát đáy hoặc ở giữa ổ áp xe hoặc dùng tăm bông chấm lấy mủ hoặc dịch tiết

Nếu tổn thương không có vẩy khô bao phủ và có nhiều mủ hoặc dịch thì dùng bơm tiêm vô khuẩn hút mủ ở vị trí sát đáy hoặc giữa ổ áp xe hoặc của các tổn thương có chiều sâu Nếu tổn thương nông và ít mủ hoặc dịch thì dùng tăm bông vô khuẩn chấm vào chỗ có mủ

Chú ý: tăm bông và ống nghiệm vô khuẩn do khoa Vi sinh vật cung cấp

Câu 14 Trình bày cách lấy bệnh phẩm phân? Khi nào cần thiết lấy bệnh phẩm này làm xét nghiệm?

Cách lấy bệnh phẩm phân:

1 Nguyên tắc: giống như nguyên tắc chung Để đảm bảo cho kết quả xét nghiệm chính xác, việc lấy bệnh phẩm là khâu đầu tiên đóng vai trò rất quan trọng Nguyên tắc của lấy bệnh phẩm mủ dịch giống nguyên tắc chung là lấy bệnh phẩm càng sớm càng tốt, lấy trước khi dùng kháng sinh, phải đảm bảo vô trùng và gửi ngay đến phòng xét nghiệm, chậm nhất là 2 giờ sau khi lấy bệnh phẩm

- Ở phòng xét nghiệm nếu chưa xét nghiệm được ngay, phải bảo quản bệnh phẩm trong ngăn mát tủ lạnh Một số bệnh phẩm ở quá xa phòng xét

nghiệm phải được giữ trong môi trường bảo quản riêng để giữ cho vi khuẩn không chết trong thời gian vận chuyển

- Trường hợp bệnh nhân đang được điều trị bằng kháng sinh toàn thân hoặc tại chỗ, phải ngừng kháng sinh ít nhất sau 48h trước khi lấy mủ và dịch để xét nghiệm

2 Dụng cụ:

- Que tăm bông đóng trong typ thủy tinh đã được hấp vô trùng

- Sonde thủy tinh: gồm một typ thủy tinh nhỏ, đường kính khoảng 0.6 – 0.7

cm, có một lỗ hở hình ovan kích thước 0.4*0.6 cm cách phần đầu tròn kín

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều

khoảng 0.7-0.8 cm Typ thủy tinh nhỏ này được đựng trong typ thủy tinh lớn đường kính 1.5 cm

Chú ý: tăm bông vô trùng và dụng cụ lấy phân thủy tinh đều do khoa vi sinh của bệnh viện cung cấp

3 Lấy bệnh phẩm

Có thể lấy phân sau khi bệnh nhân đã đi đại tiện, hoặc có thể lấy phân từ trực tràng của người bệnh bằng dụng cụ thủy tinh

3.1 Lấy phân sau khi bệnh nhân đi đại tiện

Cho bệnh nhân đi đại tiện vào bô đã được rửa sạch và tráng lại bằng nước sôi,

để nguội Dùng que tăm bông thấm quệt vào phân, cho vào typ thủy tinh và đóng chặt nút bông Nếu trong phân có biểu hiện tổn thương bệnh lý, phải quệt tăm bông nhiều lần vào những chỗ có nhày, máu

3.2 Lấy phân từ trực tràng

Dùng dụng cụ thủy tinh, chấm nhẹ phía đầu tròn kín của typ thủy tinh nhỏ vào dầu parafin rồi đưa từ từ vào hậu môn bệnh nhân với chiều sâu khoảng 3-4 cm (qua cơ thắt hậu môn), xoay tròn vài ba vòng để cho phân từ trực tràng vào được bên trong typ thủy tinh nhỏ qua lỗ hình ovan, rút ra cho vào typ to và đóng chặt nút bông

 Cần lấy bệnh phẩm phân để làm xét nghiệm trong các trường hợp bệnh nhân bị rối loạn tiêu hóa, ra nhầy, ra nước, tiêu chảy

Câu 15 Tại sao môi trường phân lập bệnh phẩm phân lại phải có chất ức chế? Nêu ý nghĩa của sự có mặt của bạch cầu trong phân của bệnh nhân tiêu chảy?

Trong phân thường có rất nhiều loại vi khuẩn khác nhau: trực khuẩn Gram (+), trực khuẩn Gram (-), các loại cầu khuẩn Gram (+), vì vậy, người ta phải dùng các môi trường phân lập có chất ức chế Các chất này sẽ ức chế hầu hết các vi khuẩn không thuộc họ vi khuẩn đường ruột, tạo điều kiện cho các vi khuẩn họ đường ruột phát triển

- Ý nghĩa của sự có mặt của bạch cầu trong phân của bệnh nhân tiêu chảy: Làm tiêu bản nhuộm Gram: Đồng thời với cấy bệnh phẩm vào môi trường phân lập là làm tiêu bản nhuộm Gram trực tiếp từ phân để quan sát tế bào bạch cầu (nếu có) và xem sơ bộ các loại vi khuẩn trong phân Kết quả nhuộm Gram có ý nghĩa định hướng phần nào nhóm căn nguyên gây tiêu chảy: theo cơ chế độc tố hay theo cơ chế xâm nhập của vi khuẩn Nếu trong phân có nhiều bạch cầu thì hướng đến các vi khuẩn gây bệnh theo cơ chế xâm nhập, ví dụ như Shigella, nếu trong phân không có bạch cầu thì nghĩ đến các vi khuẩn gây bệnh bằng

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều

ngoại độc tố như V cholerae, S aureus…, nếu trong phân có rất nhiều cầu khuẩn Gram (+) hoặc nấm men thì nguyên nhân là do loạn vi khuẩn đường ruột

Câu 16 Nêu nguyên tắc cấy máu, thời gian theo dõi bình máu và trả kết quả cấy máu?

Nguyên tắc cấy máu

Nhiễm trùng máu hay nhiễm trùng huyết là một bệnh lý thường gặp trên lâm sàng Căn nguyên gây nhiễm trùng máu có thể là vi khuẩn, virus, nấm, đơn bào

ký sinh trùng…

Bình thường máu là môi trường vô trùng Khi nhiễm trùng huyết, cơ thể thường

có các triệu chứng nhiễm trùng toàn thân, sự hiện diện của vi sinh vật trong máu lúc đó được coi là căn nguyên gây nhiễm trùng máu Vì vậy, để xác định đúng

và sớm căn nguyên gây nhiễm trùng máu thì việc cấy máu phải tuân thủ nghiêm ngặt các nguyên tắc cấy máu, cụ thể là phải đảm bảo vô trùng và đúng lúc

1 Vô trùng khi cấy máu

Vô trùng khi cấy máu nhằm để tránh các trường hợp các vi khuẩn từ trên da, trong không khí hoặc từ dụng cụ lấy máu nhiễm vào bình máu…dẫn đến sai lạc kết quả cấy máu

Để đảm bảo vô trùng trong cấy máu, ngoài việc dùng bơm kim tiêm vô trùng, các thao tác trong cấy máu đều phải đảm bảo vô trùng như: trước khi lấy máu phải sát khuẩn kỹ nhiều lần bằng tăm bông tẩm cồn iod tại vùng da chỗ lấy máu; động tác mở nắp bình canh thang và bơm máu vào bình luôn luôn được tiến hành bên cạnh ngọn lửa đèn cồn; trước khi cấy máu phải rửa tay, đội mũ, đeo khẩu trang, tắt quạt…

2 Cấy máu đúng lúc

Muốn có kết quả nhanh, chính xác phải cấy máu vào thời điểm vi khuẩn có mặt trong máu nhiều nhất Vì vậy, chỉ cấy máu khi bệnh nhân đang bị sốt, nhất là khi sốt cao (trừ bệnh Osler, phải cấy máu nhiều lần mới có thể tìm được vi khuẩn gây bệnh) Trường hợp bệnh nhân đang dùng kháng sinh, phải ngừng thuốc kháng sinh ít nhất 48h, sau đó mới tiến hành cấy máu

Để tránh trường hợp nghi ngờ vi khuẩn phân lập được không rõ là căn nguyên nhiễm trùng máu hay chỉ là vi khuẩn nhiễm vào, tốt nhất là nên cấy máu 2 lần trở lên Khi kết quả ở các lần cấy máu là giống nhau thì việc xác định vi khuẩn gây bệnh sẽ dễ dàng và chính xác hơn

 Thời gian theo dõi bình máu và trả kết quả cấy máu:

Sau khi cấy máu, thực ra người xét nghiệm viên mới chỉ hoàn thành công việc lấy bệnh phẩm máu cho vào môi trường nuôi cấy Sau đó bình máu được để

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều

vào tủ ấm 37 độ và được quan sát hằng ngày trong vòng 7 ngày (trừ bệnh Osler phải theo dõi trong vòng 15 ngày) Mục đích chủ yếu là tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển nếu trong máu có vi khuẩn Thực chất đây chính là giai đoạn đơn thuần chỉ là phong phú về mặt số lượng vi khuẩn có trong bình máu, khẳng định rõ ràng về sự hiện diện của vi khuẩn trong bình máu, giúp cho việc phân lập và xác định vi khuẩn được thực hiện chính xác chỉ với các mẫu máu có

vi khuẩn, các mẫu máu không có vi khuẩn sẽ được khẳng định qua thời gian theo dõi và không phải phân lập, tránh gây lãng phí môi trường nuôi cấy

1 Nếu bình máu không lọc vi khuẩn

Bình cấy máu hoàn toàn trong, tức là không có hiện tượng vi khuẩn phát triển trong bình máu thì trả lời là kết quả cấy máu âm tính

2 Nếu bình cấy máu có mọc vi khuẩn

Trong bình máu có xuất hiện các hiện tượng như: có váng mỏng trên bề mặt canh thang hoặc có váng vòng nhẫn quanh thành bình, phần canh thang hơi đục, đục đều, đục có sắc tố xanh, đục nhanh hoặc vẫn trong nhưng có hạt nhỏ ở phần nước trong hay ở phần tiếp xúc giữa hồng cầu lắng và canh thang…thì đều là biểu hiện về sự phát triển của vi khuẩn trong bình máu, khi đó cần tiếp tục các bước phân lập và xác định vi khuẩn để trả lời kết quả cho thầy thuốc lâm sàng Trên thực tế, nếu bình máu không mọc vi khuẩn sau 4 ngày sẽ được trả lời kết quả sơ bộ là “âm tính sau 4 ngày” Sau đó theo dõi tiếp, nếu đủ 7 ngày mà vẫn không mọc vi khuẩn thì coi như chính thức là âm tính và không phải trả lời kết quả âm tính lại lần nữa Nếu có vi khuẩn mọc sau 4 ngày thì tiếp tục tiến hành phân lập và xác định vi khuẩn, sau đó phải trả kết quả bổ sung cho bên lâm sàng

Câu 17 Kể tên các môi trường thường dùng để phân lập vi khuẩn mà anh chị biết được qua học thực hành? Nêu ý nghĩa của bước cấy phân lập?

Các môi trường thường dùng để phân lập vi khuẩn

- Thạch máu: phân lập các vi khuẩn của bệnh phẩm máu, mủ dịch

- Thạch Socholate (có màu nâu)

- MC, DC: có chất ức chế như đỏ fucxin (MC), muối mật (DC), phân lập vi khuẩn bệnh phẩm phân, có đường lactose để xác định khả năng lên men lactose Khuẩn lạc lên men đường lactose có màu tím củ

- TCBS, pepton kiềm: phân lập vi khuẩn tả

 Ý nghĩa của bước cấy phân lập: tạo khuẩn lạc riêng rẽ

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều

Môi trường thạch máu

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều

Môi trường TCBS

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều

Môi trường MC, có lên men đường lactose

Câu 18 Nêu trình tự các bước của quá trình nuôi cấy bệnh phẩm tìm vi khuẩn gây bệnh? Ý nghĩa của từng bước?

1 Phân lập vi khuẩn

Cấy bệnh phẩm vào môi trường phân lập (thường là đĩa thạch máu, có thể gồm

cả đĩa thạch Socholate) Khi cấy bệnh phẩm lên mặt thạch, yêu cầu phải cấy phân vùng tốt để vi khuẩn đủ thưa và cho các khuẩn lạc riêng rẽ sau khi mọc Thực chất của việc cấy phân vùng là phải thực hiện đốt que cấy giữa chừng trong quá trình ria cấy bệnh phẩm, làm sao để mật độ vi khuẩn trên đường ria cấy ở các vùng sau ngày càng thưa Như vậy, sau khi vi khuẩn mọc chắc chắn

sẽ có được khuẩn lạc riêng rẽ Nếu trong bệnh phẩm không có vi khuẩn thì trên tất cả các vùng cấy đều không có khuẩn lạc Nếu trong bệnh phẩm có vi khuẩn

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều

thì tùy theo số lượng vi khuẩn có trong bệnh phẩm ít hay nhiều mà khuẩn lạc riêng rẽ sẽ được tạo ra ở vùng 1, vùng 2 hay vùng 3

Sau khi cấy, để đĩa thạch ở tủ ấm 37 độ/18-24h (nghi dịch hạch thì để ở 28 độ) Nếu mủ nghi do lậu cầu hay não mô cầu, H inluenzae thì để đĩa thạch đã cấy vào tủ ấm có thêm điều kiện khí trường 5-10% CO2

2 Xác định vi khuẩn

Nếu có vi khuẩn mọc (tạo các khuẩn lạc riêng rẽ) ở trên các đĩa thạch trong bước phân lập thì tiếp tục xác định tên của chúng bằng cách:

Cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ cào các môi trường chẩn đoán

Môi trường chẩn đoán là các môi trường xác định tính chất sinh vật hóa học của

vi khuẩn, thường gọi tắt là bộ SINH VẬT HÓA HỌC Việc chọn các môi

trường chẩn đoán để cấy chuyển vi khuẩn là tùy thuộc vào kết quả nhuộm Gram

và đặc điểm của khuẩn lạc trên đĩa thạch nuôi cấy ở bước phân lập

Ví dụ:

- Nếu kết quả nhuộm soi là cầu khuẩn G (+) xếp đám , khuẩn lạc trên thạch máu là dạng S, có sắc tố vàng thì phải hướng đến tụ cầu Khi đó môi trường chẩn đoán phải là Chapman, huyết tương thỏ tươi để kiểm tra tính chất lên men đường manitol và khả năng gây đông huyết tương của vi khuẩn

- Trường hợp nhuộm soi là trực khuẩn Gram (-), khuẩn lạc ở bước phân lập

có oxidase (-) thì phải hướng tới các vi khuẩn thuộc họ đường ruột Khi đó môi trường chẩn đoán lại là bộ SINH VẬT HÓA HỌC của vi khuẩn đường ruột, cụ thể gồm: ống thạch KIA, ure-indol, H2S, Clack-clubs, thạch mềm, Simon…để kiểm tra các tính chất như lên men đường glucose và lactose, phân hủy

tryptophan thành indol, phân hủy ure thành amoniac, khả năng sinh khí H2S, tính di động

3 Xác định tên vi khuẩn

Tên của vi khuẩn được xác định chủ yếu dựa vào các tính chất sinh vật hóa học được thể hiện trên các môi trường chẩn đoán Ngoài ra, trong một số trường hợp còn dựa thêm vào tính chất kháng nguyên để xác định tên của vi khuẩn tới

nhóm hoặc typ hoặc dưới typ huyết thanh Tính chất kháng nguyên của vi khuẩn được biết thông qua phản ứng ngưng kết giữa vi khuẩn phân lập được với kháng thể mẫu

Chú ý:

- Trường hợp thấy có nhiều loại vi khuẩn mọc trên đĩa thạch ở bước phân lập thì chọn loại vi khuẩn nào có số lượng chiếm đa số để cấy chuyển vào các

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều

môi trường chẩn đoán ở bước xác định tên vi khuẩn, vì loại vi khuẩn chiếm đa

số đó được coi là thủ phạm gây bệnh

- Một số trường hợp vi khuẩn có thể mọc chậm (sau 24h) Vì vậy, ở bước phân lập nếu sau 24h nuôi cấy mà vi khuẩn không mọc thì giữ tiếp mẫu bệnh phẩm đó ở tủ ấm thêm 24h nữa Chỉ trả lời kết quả không mọc vi khuẩn sau 48h nuôi cấy Say khi xác định được tên vi khuẩn, phải làm ngay kháng sinh đồ

Câu 19 Kể tên một số môi trường dùng để nhận biết được các tính chất sinh vật hóa học của vi khuẩn? Cho ví dụ minh họa từ các bài thực hành

mà anh chị đã học?

1 Môi trường KIA ( Kligler Iron Agar): Đây là môi trường tổng hợp gồm có 2 loại đường là lactose và glucose, trong đó tỷ lệ giữa lactose và glucose là 10/1 Ngoài ra, chất chỉ thị pH là đỏ phenol cũng được đưa vào trong môi trường Nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường, để nhiệt độ 37 độ C trong 24h, chúng ta thấy

- Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường glucose mà không lên men đường lactose thì phần chân ống thạch chuyển từ màu đỏ sang màu vàng và phần thạch nghiêng vẫn là màu đỏ Do trong môi trường KIA, chuyển hóa đường yếm khí chỉ thực sự xảy ra ở phần chân thạch, bởi vì ở đây không khí không xâm nhập được vào Do vậy, glucose sẽ lên men ở đây tạo ra các acid rất mạnh dẫn đến

pH tại vị tró đó trở thành acid và làm cho chất chỉ thị đỏ phenol chuyển sang màu vàng

Nếu vi khuần có khả năng lên men đường lactose thì toàn bộ môi trường chuyển sang màu vàng Cũng giống như lên men glucose, lên men lactose chỉ xảy ra ở phần chân thạch và tạo ra rất nhiều acid ở đây Khác với glucose, trong môi trường KIA đường lactose gấp 10 lần glucose về số lượng nên lượng acid tạo ra

sẽ rất nhiều và nó ngấm cả lên phần nghiêng của ống thạch, làm cho phần

nghiêng của ống thạch cũng có pH acid Kết quả là chất chỉ thị phenol sẽ

chuyển sang màu vàng trong toàn bộ môi trường (vì vậy, trong làm môi trường KIA thì tỷ lệ đường phải rất được lưu ý)

- Khả năng sinh H2S: nếu phần thạch có màu đen là dương tính

- Khả năng sinh hơi: nếu có khoảng trống ở đáy ống thạch, thạch nứt hoặc

có bóng là dương tính

 Citrat: để phát hiện khả năng sử dụng citrate của vi khuẩn người ta nuôi cấy vi khuẩn vào trong môi trường Simmons có natri citrate, đây là phân tử có chứa một anion, cũng là nguồn carbon duy nhất Nếu vi khuẩn có khả năng sửa dụng citrate từ natri citrate thì sẽ kéo theo sự khử được nitro từ muối amoni với

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều

sản phẩm tạo thành aminonium hydroxide (NH4OH) làm kiềm hóa môi trường,

do đó sẽ làm cho chất chỉ thị màu xanh bromthymol trong môi trường chuyển sang màu xanh nước biển (Từ xanh lá cây sang xanh nước biển + )

 Thạch mềm: đánh giá khả năng di động của vi khuẩn: nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường thạch mềm bằng cách chọc que cấy đầu nhọn xuống 2/3 quãng đường giữa ống Nếu di động, vi khuẩn sẽ mọc xung quanh đường cấy, làm đục môi trường và có thể lan cả trên bề mặt môi trường thì phản ứng là dương tính Còn nếu vi khuẩn chỉ mọc trên đường cấy thì âm tính

 Ure-indol: xác định 2 tính chất 1 là có enzym urease không 2 là có khả năng sinh indol không?

- Urease là một enzyme có ở một số loài vi khuẩn, nó có khả năng thủy

phân ure sinh NH3 Để phát hiện khả năng này của vi khuẩn, người ta thường nuôi cấy chúng vào môi trường có ure, nếu vi khuẩn có enzym urease thì sẽ xuất hiện sản phẩm NH3 trong môi trường, những NH3 này phản ứng với dung dịch tạo thành amonium carbonat [(NH4)2CO3] làm cho môi trường bị kiềm hóa Do vậy làm màu đỏ phenol của môi trường chuyển sang màu đỏ cánh sen

Thuốc không phải luôn luôn cần thiết nhưng niềm tin khỏi bệnh là điều

- Khả năng sinh indol: một số vi khuẩn có chứa enzyme tryptophanase, enzyme này có khả năng phân hủy tryptophan tạo ra các sản phẩm là indol, acid pyruvic và hợp chất amoni Để xác định khả năng này, người ta nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường có tryptophan (ure-indol), nếu vi khuẩn có enzym này thì trong môi trường sẽ xuất hiện indol và nó được phát hiện khi nhỏ thuốc thử Kovac hoặc Erhlich Nếu phản ứng dương tính, indol tan trong cồn isoamylic sẽ bắt màu đỏ thẫm nổi lên thành một vòng tròn trên bề mặt môi trường