bài giảng sinh vật đại cương

MỤC LỤC CHƯƠNG I MỞ ĐẦU VỀ VI SINH VẬT HỌC 10 ĐỐI TƯỢNG VÀ NHIỆM VỤ CỦA VI SINH VẬT HỌC.10 1.1 Đối tượng vi sinh vật học đại cương .10 1.2 Sự phân bố vi sinh vật 11 1.3 Vai trò vi sinh vật 11 1.4 Nhiệm vụ vi sinh vật học đại cương .12 KHÁI LƯỢC VỀ LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT HỌC .13 2.1 Giai đoạn trước phát minh kính hiển vi .13 2.2 Giai đoạn sau phát minh kính hiển vi (Phát vi sinh vật) 13 2.3 Giai đoạn vi sinh vật học thực nghiệm với Pasteur .14 2.4 Giai đoạn sau Pasteur vi sinh học đại .16 CÁC ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA VI SINH VẬT .18 3.1.Kích thước nhỏ bé 18 3.2 Hấp thu nhiều, chuyển hoá nhanh 19 3.3 Sinh trưởng nhanh, phát triển mạnh 19 3.4 Có lực thích ứng mạnh dễ dàng phát sinh biến dị 20 3.5 Phân bố rộng, chủng loại nhiều 21 3.6 Là sinh vật xuất trái đất 21 CHƯƠNG II VI SINH VẬT NHÂN NGUYÊN THỦY 24 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI VÀ CẤU TẠO TẾ BÀO VI SINH VẬT 24 1.1 Kính hiển vi 24 1.1.1 Kính hiển vi quang học 24 1.1.2 Kính hiển vi điện tử 25 1.2 Phương pháp làm tiêu hiển vi .26 1.2.1 Phương pháp làm tiêu soi tươi (giọt ép, giọt treo) 26 1.2.2 Phương pháp làm tiêu nhuộm soi kính hiển vi quang học 27 1.2.3 Phương pháp quan sát kính hiển vi điện tử 28 VI KHUẨN 29 2.1 Hình dạng kích thước 29 2.1.1 Cầu khuẩn (Coccus) 29 2.1.2 Trực khuẩn (Bacillus, Bacterium) 31 2.1.3 Cầu trực khuẩn (Cocco-Bacillus) 33 2.1.4 Phẩy khuẩn (Vibrio) 33 2.1.5 Xoắn thể (Spirillum) .33 2.1.6 Xoắn khuẩn (Spirochaeta) 34 2.2 Cấu tạo tế bào vi khuẩn .35 2.2.1 Thành tế bào (Cell wall) .36 2.2.2 Màng tế bào chất 39 2.2.3 Tế bào chất (Cytoplasm) .41 2.2.4 Mesosom .41 2.2.5 Ribosom 42 2.2.6 Các hạt dự trữ .43 2.2.7 Thể nhân (nuclear body) .44 2.2.8 Bao nhầy (capsula) .46 2.2.9 Tiêm mao (Flagella) nhung mao (pilus hay fimbria) 47 2.2.10 Nha bào hình thành nha bào (spore) 51 MỘT SỐ NHÓM VI KHUẨN ĐẶC BIỆT 55 3.1 Xạ khuẩn 55 3.2 Mycoplasma dạng L vi khuẩn 58 3.3 Rickettsia .59 SỰ SINH SẢN Ở VI KHUẨN 60 4.1 Sinh sản vô tính 60 4.2 Sinh sản hữu tính 60 61 CHƯƠNG III VI SINH NHÂN THẬT 63 NẤM MEN 63 1.1 Hình thái, cấu tạo nấm men 63 1.1.1 Hình thái, kích thước nấm men 63 1.1.2 Cấu tạo tế bào nấm men 64 1.2 Sinh sản nấm men 72 1.2.1 Sinh sản vô tính 72 NẤM MỐC (NẤM SỢI) 78 2.1 Hình thái nấm mốc .78 2.2 Cấu tạo nấm mốc 80 2.2.1 Khuẩn ty .80 2.2.2 Bào tử 86 TẢO 91 3.1 Ngành Tảo đỏ (Rhodophyta) .91 3.2 Nhóm Tảo nâu .92 3.2.1 Ngành Khuê tảo hay Tảo cát (Bacillariophyta) .92 3.2.2 Ngành Tảo giáp (Pyrrophyta) 93 3.2.3 Ngành Tảo nâu (Phaeophyta) 94 3.3 Nhóm Tảo lục 95 3.3.1 Ngành Tảo lục (Chlorophyta) 95 3.3.2 Ngành Tảo vòng (Charophyta) 96 3.3.3 Ngành Euglenophyta (Tảo mắt) .96 CHƯƠNG IV SINH LÝ HỌC VI SINH VẬT 100 DINH DƯỠNG Ở VI SINH VẬT 100 1.1 Thành phần hóa học tế bào vi khuẩn 100 1.1.1 Nước 100 1.1.2 Vật chất khô 101 CÁC KIỂU DINH DƯỠNG Ở VI SINH VẬT 108 2.1 Nhu cầu thức ăn vi sinh vật .108 2.2 Nguồn thức ăn nitơ vi khuẩn 112 2.3 Nguồn thức ăn khoáng vi sinh vật 114 2.4 Nhu cầu chất sinh trưởng vi sinh vật .116 CƠ CHẾ VẬN CHUYỂN CÁC CHẤT DINH DƯỠNG VÀO TẾ BÀO VI SINH VẬT .117 3.1 Khuếch tán thụ động 118 118 Hình 4.1 Cơ chế khuếch tán thụ động 118 3.2 Vận chuyển nhờ permease 118 TRAO ĐỔI VẬT CHẤT VÀ NĂNG LƯỢNG 122 Khái niệm trao đổi chất 122 4.1 Quá trình trao đổi lượng 122 4.1.1 Bản chất hô hấp vi sinh vật .123 4.1.2 Các loại hô hấp 123 Hình 4.11 Năng lượng ATP tạo thành tự hô hấp hiếu khí chất hữu 129 b Năng lượng hóa học 130 4.2 Sự phân giải hợp chất hữu 131 4.2.1 Phân giải hợp chất không chứa Nitơ 131 + Lên men acid acetic (dấm) 143 4.2.2 Phân giải hợp chất hữu chứa Nitơ 143 d Quá trình Nitrat hóa 146 e Quá trình phản Nitrat hóa 146 4.3 Tổng hợp hợp chất hữu 147 4.3.1 Tổng hợp hợp chất hữu có Nitơ .147 4.3.2.Tổng hợp hợp chất hữu không chứa Nitơ 150 SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT 151 5.1 Sinh trưởng, sinh sản phát triển vi khuẩn .151 5.2 Phương pháp nghiên cứu phát triển vi sinh vật 151 5.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật .151 5.2.2 Nuôi cấy vi khuẩn 153 5.3 Các phương pháp định lượng vi khuẩn .154 5.3.1 Đếm trực tiếp kính hiển vi 154 5.3.2 Đếm số tế bào sống (khuẩn lạc đĩa thạch) 156 5.3.3 Phương pháp đo độ đục huyền phù vi khuẩn 157 5.4 Lý thuyết phát triển vi khuẩn .159 5.5 Biểu đồ phát triển vi khuẩn 161 5.5.1 Sinh trưởng phát triển vi khuẩn điều kiện nuôi cấy tĩnh 161 5.5.2 Hiện tượng sinh trưởng kép 164 5.5.3 Sinh trưởng phát triển vi khuẩn điều kiện nuôi cấy liên tục 165 CHƯƠNG V ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT 168 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC TÁC NHÂN VẬT LÝ 168 1.1 Độ ẩm 168 1.2 Nhiệt độ .168 1.2.1 Nhiệt độ thấp 169 1.2.2 Nhiệt độ cao 170 1.3 Áp suất thẩm thấu 171 1.4 Sóng siêu âm .171 1.5 Sức căng bề mặt 172 1.6 Tia xạ 172 1.6.1 Ánh sáng mặt trời .173 1.6.2 Tia tử ngoại (tia cực tím -UV) 173 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ HÓA HỌC .174 2.1 Ảnh hưởng pH môi trường 174 2.2 Thế oxi hóa khử (Eh) 175 2.3 Các chất diệt khuẩn (sát trùng) 176 2.3.1 Phenol 176 2.3.2 Ethanol 177 2.3.3 Các halogen tác dụng độc với vi khuẩn 177 2.3.4 Kim loại nặng 177 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ SINH HỌC HAY TƯƠNG TÁC GIỮA VI SINH VẬT VỚI VI SINH VẬT VÀ VỚI VI SINH VẬT KHÁC 179 3.1 Kháng sinh 179 3.1.1 Khái niệm phân loại chất kháng sinh .179 3.2 Tế bào diệt tự nhiên yếu tố hòa tan 186 3.3 Kháng thể 187 3.4 Tiêu độc khử trùng 188 3.4.1 Tiêu độc phương pháp tiêu độc 188 3.4.2 Khử trùng phương pháp khử trùng 189 CHƯƠNG VI DI TRUYỀN HỌC VI SINH VẬT 193 MỘT SỐ KHÁI NIỆM CHUNG 193 CƠ SỞ VẬT CHẤT DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN .194 2.1 ADN nhiễm sắc thể, ARN protein 194 2.1.1 Sao chép (tự sao) 194 2.1.2 Phiên mã 196 2.1.3 Dịch mã 197 2.2 Khái niệm phân loại Plasmid 200 2.3 Biến dị vi khuẩn 202 2.3.1 Sự thích nghi .202 2.3.2 Các loại biến dị 203 VẬN CHUYỂN VÀ TÁI TỔ HỢP THÔNG TIN DI TRUYỀN .207 3.1 Chuyển nạp 208 3.1.1 Những thí nghiệm F Griffith chuyển nạp 1928 .209 3.1.2 Thí nghiệm in vitro tượng chuyển nạp 210 3.1.3 Bản chất nhân tố chuyển nạp 211 3.1.4 Điều kiện để có chuyển nạp 212 3.1.5 Các giai đoạn trình chuyển nạp .213 3.1.6 Ứng dụng chuyển nạp nghiên cứu di truyền học 215 3.2 Tải nạp .217 3.2.1 Khái niệm phage vi khuẩn vi khuẩn sinh tan 218 3.2.2 Các kiểu tải nạp 222 3.2.3 Cơ chế chung tải nạp 224 3.2.4 Ứng dụng trình tải nạp 224 3.3 Giao nạp (tiếp hợp) 225 3.3.1 Chứng minh có tượng lai vi khuẩn 225 3.3.2 Sự phân hóa giới tính 226 3.3.3 Episome plasmid 226 3.3.4 Nhân tố F/ 226 3.3.5 Tái tổ hợp 227 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH TRUYỀN NHIỄM 227 4.1 Quy trình thường quy để chẩn đoán bệnh vi sinh vật 227 4.2 Những trở ngại chẩn đoán vi khuẩn học 228 4.3 Phương pháp nhân ADN (PCR: polymerase chain reaction) .228 CHƯƠNG VII KỸ THUẬT BẢO QUẢN GIỐNG VI SINH VẬT 232 PHIẾU THÔNG TIN VỀ CHỦNG VI SINH VẬT BẢO QUẢN 232 CHỨC NĂNG CỦA BỘ SƯU TẬP VI SINH VẬT 233 MỘT SỐ ĐIỂM LƯU Ý ĐỐI VỚI MỘT BỘ SƯU TẬP GIỐNG VI SINH VẬT 234 3.1 Duy trì khả sống vi sinh vật bảo quản 234 3.2 Quan tâm đến số lượng tế bào tiến hành bảo quản234 3.3 Duy trì đặc tính di truyền ổn định chủng vi sinh vật bảo quản 234 3.4 Tính chủng vi sinh vật bảo quản .234 3.5 Kinh phí cần cho Bộ sưu tập vi sinh vật 234 3.6 Bảo quản chủng có giá trị 235 3.7 Cung cấp chủng giống cho khách hàng .235 3.8 Cung cấp thông tin liên quan đến chủng bảo quản 235 3.9 Kiểm tra chất lượng chủng vi sinh vật bảo quản .236 3.10 Cơ sở liệu Bộ sưu tập vi sinh vật 236 GIỚI THIỆU CHUNG MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN GIỐNG VI SINH VẬT 236 4.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật 236 4.2 Phương pháp đông khô vi sinh vật phương pháp đông khô trực tiếp 238 4.2.1 Phương pháp đông khô .238 4.2.2 Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp (L-drying) 239 4.2.3 Phương pháp bảo quản lạnh sâu 240 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHỔ BIẾN SỬ DỤNG TRONG BẢO QUẢN CÁC NHÓM VI SINH VẬT CỤ THỂ 241 5.1 Các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn xạ khuẩn 241 5.1.1 Bảo quản vi khuẩn .241 a Phương pháp đông khô (Freeze drying/ lyophilization) 241 * Nuôi vi khuẩn cho đông khô: .241 * Chuẩn bị đệm mẫu: 241 * Chuẩn bị dịch tế bào: 242 * Chuẩn bị ống đông khô: .242 * Chuẩn bị mẫu trước đông khô: 242 * Bước tiền đông khô: 242 * Tạo chỗ thắt ống đông khô: 243 * Hậu đông khô: 243 * Hàn ống đông khô: 243 * Kiểm tra độ chân không ống đông khô: 243 * Kiểm tra khả sống mẫu: 243 * Bảo quản mẫu: 243 5.1.2 Bảo quản xạ khuẩn: 244 5.2 Bảo quản vi tảo 245 5.3 Các phương pháp dùng cho bảo quản nấm sợi 245 5.4 Phương pháp bảo quản nấm men 251 CHƯƠNG I MỞ ĐẦU VỀ VI SINH VẬT HỌC ĐỐI TƯỢNG VÀ NHIỆM VỤ CỦA VI SINH VẬT HỌC 1.1 Đối tượng vi sinh vật học đại cương Xung quanh chúng ta, sinh vật lớn mà nhìn thấy được, có vi sinh vật nhỏ bé, muốn nhìn thấy chúng phải sử dụng kính hiển vi, người ta gọi chúng vi sinh vật Môn khoa học nghiên cứu hoạt động sống vi sinh vật gọi Vi sinh vật học Vi sinh vật học phát triển nhanh dẫn đến việc hình thành lĩnh vực khác nhau: vi khuẩn học (Bacteriology), nấm học (Mycology), tảo học (Algology) virus học (Virolory), Việc phân chia lĩnh vực dựa vào phương hướng ứng dụng Do thấy có y sinh vi sinh vật học, vi sinh vật học thú y, vi sinh vật công nghiệp, vi sinh vật học nông nghiệp Ngay vi sinh vật học nông nghiệp có nhiều chuyên ngành: vi sinh vật lương thực, vi sinh vật thực phẩm, Mỗi lĩnh vực có đối tượng cụ thể riêng, cần sâu Tuy nhiên mức độ định chuyên ngành có điểm giống Vi sinh vật học đại cương, nghiên cứu quy luật chung vi sinh vật Đối tượng nghiên cứu vi sinh vật học vi khuẩn, xạ khuẩn (Actinomycetes), virus, Bacteriophage (thể thực khuẩn), nấm, tảo, nguyên sinh động vật Vi khuẩn: nhóm vi sinh vật có nhân nguyên thủy, thể đơn bào, sinh sản chủ yếu hình thức trực phân, thể nhỏ bé, muốn quan sát phải sử dụng kính hiển vi quang học Virus: sinh vật mà kích thước chúng vô nhỏ bé, ký sinh nội bào tuyệt đối, muốn quan sát chúng phải sử dụng kính hiển vi điện tử 10 Tuy nhiên, nhược điểm lớn phương pháp giá thành thiết bị Độ ổn định chủng vi sinh vật bảo quản theo đợt đông khô khác Hơn chủng trước đem sử dụng phải hoạt hoá môi trường thích hợp số lần để phục hồi đặc tính sinh học 4.2.3 Phương pháp bảo quản lạnh sâu Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu vi sinh vật bảo quản môi trường dịch thể nước cần cho hoạt động sống vi sinh vật bị bất hoạt nhiệt độ lạnh sâu (-196°C -> -80 °C) Hình 7.3 Bảo quản lạnh sâu Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu nitơ lỏng phương pháp vạn Phương pháp thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo dòng tế bào động vật Tuy nhiên, phương pháp bộc lộ số nhược điểm đầu tư kinh phí cho thiết bị điện, nitơ lỏng rủi ro cháy nổ Đặc biệt phương pháp không thích hợp với chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến Nói chung phương pháp thường dùng với chủng vi sinh vật có đặc tính quí mà không thích hợp với phương pháp đông khô 240 Hình 7.4 Bảo quản nitơ lỏng MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHỔ BIẾN SỬ DỤNG TRONG BẢO QUẢN CÁC NHÓM VI SINH VẬT CỤ THỂ 5.1 Các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn xạ khuẩn 5.1.1 Bảo quản vi khuẩn a Phương pháp đông khô (Freeze drying/ lyophilization) Đây phương pháp phổ biến sử dụng bảo tàng vi sinh vật giới Phương pháp đông khô hạn chế thay đổi đặc tính vi sinh vật bảo quản thời gian dài Phương pháp đông khô trình bày phương pháp dùng NCTC (National Colleciton Type Culture, Anh) * Nuôi vi khuẩn cho đông khô: Vi khuẩn cấy môi trường ống thạch nghiêng thích hợp Tuy nhiên, chuẩn bị dịch vi khuẩn môi trường dịch thể phải làm đậm đặc tế bào li tâm Tuổi tế bào quan trọng thường chọn tế bào nằm pha sinh trưởng log * Chuẩn bị đệm mẫu: Có thể dùng hai loại đệm sau: 241 + Đệm huyết thanh- inositol; Meso-inositol: gam Huyết ngựa (số 3): 100 ml Thanh trùng phương pháp lọc vi khuẩn, sau phân 5ml vào bình vô trùng + Đệm inositol: Môi trường dinh dưỡng bột số 2: 2.5 gam Meso-inositol: gam Nước cất: đủ 100 ml Phân ml vào bình khử trùng nhiệt độ 121OC * Chuẩn bị dịch tế bào: Mật độ tế bào có ý nghĩa quan trọng chất lượng bảo quản Thông thường thu sinh khối từ ống thạch nghiêng dùng cho 1-2 ml đệm pha mẫu để tạo dịch huyền phù tế bào Mật độ vi khuẩn thông thường cần đạt 1010 (đối với vi sinh vật bào tử) Mật độ giảm với vi sinh vật có bào tử Hai đệm pha mẫu dùng với vi khuẩn trường hợp enterobacteria không dùng đệm huyết gây thay đổi đặc tính miễn dịch vi khuẩn * Chuẩn bị ống đông khô: Ống đông khô rửa sau ngâm qua đệm với dịch acid loãng (HCl 2%) lại rửa sạch, làm khô chuẩn bị nút bông, ống trùng khô khử trùng theo phương pháp thông thường * Chuẩn bị mẫu trước đông khô: Lượng dịch huyền phù vi khuẩn đưa cẩn thận pipet pasteur vào ống đông khô khoảng 0.1- 0.2 ml Chú ý thao tác phải cẩn thận tránh dính mẫu vào thành hay phía ống đông khô * Bước tiền đông khô: Mục tiêu bước làm bay bị lạnh đông tạo đá Trước tiến hành đông khô mẫu chuẩn bị qua bước tiền đông (như trình bày trên) sau bước tiền đông khô tiến hành mẫu lắp vào hệ thống đông khô trình làm nước điều kiện lạnh tiến hành khoảng 242 * Tạo chỗ thắt ống đông khô: Sau bước tiền đông khô, yêu cầu phải tạo vết thắt Việc tạo vết thắt thực với hệ thống đèn hàn Tuy nhiên, sở bảo quản vi sinh vật sử dụng hệ thống hàn tạo vết thắt thiết bị tự động * Hậu đông khô: Trong bước mẫu lại tiếp tục làm khô độ ẩm cuối đạt khoảng 1% Thời gian cho bước thay đổi từ 1-2 * Hàn ống đông khô: Việc hàn ống trực tiếp thiết bị đông khô (manifold) cần có kinh nghiệm cẩn thận Trước hết phải tiến hành khoá van sau thực thao tác hàn ống đông khô * Kiểm tra độ chân không ống đông khô: Người ta sử dụng thiết bị đèn phát mức độ chân không Với mẫu đạt độ chân không cần thiết xuất màu xanh tím nhạt Đối với mẫu không đạt tiêu chuẩn tín hiệu màu tím đậm * Kiểm tra khả sống mẫu: Đếm số lượng tế bào phương pháp chủ yếu để đánh giá chất lượng bảo quản Việc đếm thực trước sau đông khô Các bước kiểm tra thực sau năm để đánh giá chất lượng mẫu đông khô Nói chung khả sống vi sinh vật có bào tử cao vi sinh vật bào tử loại gram dương cao vi sinh vật gram âm Tuy nhiên, với vi sinh vật kỵ khí yêu cầu phải tiến hành theo qui trình, tránh vi sinh vật tiếp xúc với oxy * Bảo quản mẫu: Mẫu thông thường bảo quản 4OC hay nhiệt độ phòng b Phương pháp giữ lạnh sâu - Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu: Tế bào nuôi cấy môi trường nhiệt độ thích hợp đầu pha log 243 - Pha dịch tế bào với glycerol DMSO trùng trước để đạt nồng độ cuối 10% mật độ tế bào 106 - Dịch huyền phù tế bào đưa vào ống lạnh sâu đóng nắp (trong trường hợp hàn ống thuỷ tinh, cần để dịch xanh metylene 0.05% để phát ống bị rò rỉ) Toàn mẫu để nhiệt độ phòng 30 phút cân áp suất thẩm thấu tế bào Trong trường hợp có nitơ lỏng mẫu chuyển sang bình nitơ lỏng Mẫu đưa vào lạnh sâu cần theo tốc độ định Thông thường tốc độ lạnh dao động 1-3 OC/phút để đạt tới nhiệt độ -30OC ban đầu Sau mẫu làm lạnh tiếp với tốc độ cao 10-15 OC/phút để đạt tới nhiệt độ lạnh cần thiết (-100 OC đến -80 OC) Hiện nay, có thiết bị làm lạnh sâu chương trình hoá với tốc độ mong muốn Tuy nhiên, đơn giản mẫu ban đầu đặt đá khô sau lại đưa vào tủ lạnh sâu đặt thời gian vài để đạt nhiệt độ -65OC - Hoạt hoá mẫu: mẫu lạnh (lạnh sâu hay nitơ lỏng) hoạt hoá cách làm tan nhanh tới mức (thông thường đưa vào tủ ấm 37 OC 40-60 giây) Như vậy, theo cách đạt khả sống 95% tế bào sau 10 năm bảo quản c Một số phương pháp bảo quản khác: Bảo quản gelatin silicagel 5.1.2 Bảo quản xạ khuẩn: Xạ khuẩn mang đặc tính vi khuẩn nấm sợi (có sợi bào tử) cần có phương pháp bảo quản thích hợp Thông thường xạ khuẩn bảo quản theo cách thông thường cấy truyền, đông khô lạnh sâu với vi khuẩn Tuy nhiên, có phương pháp kinh tế mà đảm bảo chất lượng chủng bảo quản mà trình bày đây, phương pháp bảo quản đất Các bước tiến hành bảo quản đất: - Chuẩn bị đất: lấy đất vườn làm khô 150 OC để làm chết vi sinh vật có bào tử trứng giun có Đất sau trùng nghiền nhỏ qua lưới có kích thước 30 mesh Đất sau nghiền đưa vào ống nghiệm chuẩn bị nút trùng 244 60 phút Trước tiến hành bảo quản phải kiểm tra nhiễm khuẩn đất cách cấy vòng que cấy đất từ ống nghiệm đặt vào môi trường giàu dinh dưỡng cho vi khuẩn giữ 24 OC, 28 OC 37 O C, kiểm tra sau 2-4 ngày - Chuẩn bị dịch huyền phù xạ khuẩn Nước cất vô trùng dùng để tạo dịch huyền phù xạ khuẩn (hay bào tử xạ khuẩn) từ ống thạch nghiêng Lấy ml dịch huyền phù cho vào ống nghiệm để khô nhiệt độ phòng (24 OC) thời gian tháng Đập nhẹ vào thành ống cho hạt tách bảo quản mẫu OC - Hoạt hoá mẫu đơn giản cách lấy vòng que cấy mẫu đưa lên môi trường (thạch dịch thể) để nhiệt độ thích hợp 5.2 Bảo quản vi tảo Vi tảo thông thường bảo quản theo phương pháp: Cấy truyền, lạnh sâu đông khô Các phương pháp trình bày chi tiết phần vi khuẩn Một số điểm cần ý bảo quản vi tảo chỗ: Nên dùng tế bào già pha cân bằng, phương pháp lạnh sâu cho kết tốt phương pháp đông khô 5.3 Các phương pháp dùng cho bảo quản nấm sợi a Phương pháp cấy truyền: Phương pháp thường ứng dụng với sợi nấm có bào tử Các chủng nấm sợi nuôi môi trường thạch thích hợp sợi nấm phát triển đến mức độ cực đại, sau trình hình thành bào tử, ống giống bảo quản theo cách khác nhau: - Các ống thạch để tủ lạnh (4-7 OC) - Bảo quản thạch lớp dầu: Các ống thạch bảo quản lớp dầu parafin có tỷ trọng tương đối 0.83- 0.89 khử trùng nhiệt độ 121 OC 15 phút Lớp dầu cách bề mặt thạch khoảng cm Nhiệt độ bảo quản 15-20 OC - Bảo quản nước, nấm sợi nuôi môi trường thạch đĩa Sau sợi phát triển cực đại cắt thành miếng nhỏ kích thước khoảng mm2 cho vào lọ nước trùng Bảo quản nhiệt độ phòng b Bảo quản nấm sợi có bào tử silicagel: 245 Chuẩn bị: - Lọ đựng silicagel (10-15ml) có nắp chịu nhiệt (sắt hay nhựa) trùng nhiệt độ 170 OC - Silicagel: Loại suốt, màu, kích thước số lượng hạt silicagel đưa vào không 1/3 thể tích lọ, trùng nhiệt độ 170 °C - Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt O (115 C/20 phút) - Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo chủng, môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác (10-15 ngày) Cách tiến hành: - Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao (đối với số chủng có số lượng bào tử thấp tạo dịch bào tử từ vài ống thạch bào tử khác nhau) - Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào lọ đựng silicagel Chú ý silicagel hút nước sinh nhiệt việc đưa dịch bào tử vào phải thực chậu nước đá Lượng dịch bào tử đưa vào không vượt 1/3 thể tích hạt silicagel lọ Sau dùng tay lắc đảm bảo hạt silicagel dính dịch bào tử nấm sợi Dán nhãn, ghi thông tin cần thiết số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường nhiệt độ thích hợp - Lọ silicagel đậy nắp cẩn thận không vặn chặt (nới 1,5 vòng) sau giữ bình hút ẩm (độ ẩm 35-40%), 25 OC tuần Vặn chặt nút quấn giấy parafil giữ 4OC -Kiểm tra độ sống sót sau bảo quản: -Mẫu silicagel °C, dùng que cấy vô trùng lấy hạt silicagel để mặt thạch môi trường mầm thóc (Maltagar), lắc cho hạt silicagel tiếp xúc lên mặt môi trường Để nhiệt độ thích hợp, kiểm tra tra khuẩn lạc nấm theo thời gian thích hợp c -Bảo quản nấm sợi có bào tử theo phương pháp đông khô (freez-drying): Chuẩn bị: 246 - Ống đông khô rửa (sonic cleaner) 15 phút sau khử trùng 170OC - Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115OC/20 phút) - Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác (10-15 ngày) -Cách tiến hành: - Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao (đối với số chủng có số lượng bào tử thấp tạo dịch bào tử từ vài ống thạch bào tử khác nhau) - Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 0,3 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho chủng Dán nhãn, ghi thông tin cần thiết mã số chủng, ngày bảo quản, môi trường nhiệt độ thích hợp Sau đậy nút hay giấy bạc - Giữ -80°C trước tiến hành đông khô, đồng thời bật máy Dura-Stop, nhiệt độ đạt -40 OC, đưa mẫu vào tủ đông khô Dura-Stop, bật máy Dura-Dry, mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ -55OC, tăng nhiệt độ Dura-Stop lên -5OC, để qua đêm - Tăng nhiệt độ Dura-Stop lên 25°C, đạt nhiệt độ cần thiết, tắt máy hút chân không không tắt Dura-Dry - Tắt Dura-Stop, nối tube mẫu vào hệ thống manifold, bật máy Dura-Dry, tiến hành hàn ống độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55OC Chú ý: Trong trường hợp dùng Dura-Dry thực sau: - Tiến hành bước 1,2,3,4 - Mẫu để tiền đông khô -80 °C Bật máy DuraDry, đạt nhiệt độ -60oC đến -55oC, độ chân không 45 minitor, gắn ống mẫu với hệ thống manifold tiến hành hàn ống độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55oC Kiểm tra độ sống sót sau đông khô: - Mở ống đông khô cách đốt nóng đầu hàn đèn cồn làm lạnh đột ngột cồn đốt 247 - Dùng pipet pasteur lấy khoảng 1ml nước cất vô trùng từ ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất vô trùng làm tan mẫu đông khô Hút toàn dịch huyền phù sang ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất Trộn nhỏ vào vị trí khác (mỗi vị trí giọt) môi trường thạch đĩa thích hợp nghiêng cho dịch chảy dọc theo hướng hình vẽ: Hình 7.5 PP kiểm tra độ sống sót vi sinh vật sau đông khô - Sau đậy nắp đĩa, bao quanh parafil để nhiệt độ thích hợp - Cách đánh giá: Rất tốt: ≥ 100 khuẩn lạc Khá: 50 – 100 khuẩn lạc Trung bình: 10-50 khuẩn lạc Kém: < 10 khuẩn lạc Không mọc Bảo quản thực với mẫu từ trở lên Tuy nhiên, có số nấm sợi mà khuẩn lạc mọc tràn lan đánh sau: Nếu khuẩn lạc mọc khắp bề mặt đĩa tốt Mẻ đông khô thành công số khuẩn lạc mọc chiếm nửa bề mặt môi trường đĩa petri Các mẫu có số lượng khuẩn lạc mọc mức phải làm tăng mật độ bào tử trước đông khô thay đổi môi trường sinh bào tử, chuẩn bị dịch huyền phù bào tử từ 3-4 ống nghiệm bào tử nấm sợi d Bảo quản nấm sợi phương pháp đông khô trực tiếp: 248 Phương pháp đông khô trực tiếp thực tương tự phương pháp đông khô trình bày thực sau: Chuẩn bị: - Ống đông khô rửa (sonic cleaner) 15 phút sau khử trùng 170oC - Môi trường L-drying chuẩn có thành phần sau: Đệm phosphat: 0.1M : 100 ml Monosodium glutamat: g Adonitol: 1.5 g (Khử trùng 115oC/20 phút) - Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác (10-15 ngày) Cách tiến hành: - Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml môi trường trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử nấm có mật độ cao (đối với số chủng có số lượng bào tử thấp tạo dịch bào tử từ vài ống thạch bào tử khác nhau) - Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho chủng, dán nhãn, ghi thông tin cần thiết số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường nhiệt độ thích hợp Sau đậy nút hay giấy bạc - Đồng thời bật máy Dura-Dry, mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ -75oC, nối ampoule mẫu vào hệ thống manifold (chú ý khoá van chân không nối ampoule mẫu với tube manifold sau lại mở ra, để đảm bảo độ chân không cần thiết làm đông khô phải đưa mẫu vào tín hiệu đèn thị cho phép) Khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55 oC tiến hành trình làm khô - Hàn kín ampoule mẫu: -Khi máy cô Dura-Dry chạy để đảm bảo độ chân không cần thiết, khoá van cho ampoule mẫu tiến hành hàn với mẫu vị trí ống bị thắt Dùng lửa gas để đốt nóng phần ống 249 thắt cho phía xoay cho thuỷ tinh chảy bịt kín ống Sau dùng lửa gas để cắt rời phần (nối với manifold) phần chứa mẫu Hết đợt lại khoá van ampoule mẫu hàn Kiểm tra chất lượng sau bảo quản: - Để kiểm tra độ sống sót mẫu nấm sợi bảo quản, thực theo cách mô tả phần đông khô - Kiểm tra độ chủng: mẫu cấy môi trường thích hợp quan sát hình thái đặc điểm sinh học đặc trưng cần thiết để đánh giá khả tạp nhiễm đặc tính sinh học - Thí nghiệm đánh giá nhanh thời gian bảo quản: mẫu sau đông khô trực tiếp giữ 37 oC tuần Độ sống sót mẫu bảo quản giảm tuần 37oC tương đương với bảo quản 10 năm 4oC e Bảo quản nấm sợi phương pháp lạnh sâu -80 oC nitơ lỏng (-196 oC): Chuẩn bị: - Chuẩn bị dung dịch glycerol 10% (3 ml ống nghiệm) khử trùng 121 oC 15 phút Ống nhựa nút xoáy (2 ml), rửa sonic cleaner, khử trùng 170 oC - Chuẩn bị mẫu nấm sợi môi trường thạch đĩa có lượng bào tử lớn Cách tiến hành: - Dùng pipet pasteur hút khoảng 0,3 ml glycerol trùng vào ống nhựa đựng mẫu Sau dùng dao vô trùng cắt lấy miếng nhỏ môi trường chứa sợi bào tử nấm sợi cho vào ống nhựa Lượng glycerol đủ để phủ lên miếng thạch mẫu, đậy nút bao băng parafil sau dán nhãn - Mẫu trước tiên phải để 5oC (tạo điều kiện cho glycerol vào tế bào), sau làm lạnh sâu tử 25 oC xuống -55oC với tốc độ -1oC/phút Trong trường hợp thiết bị làm lạnh để -20oC giờ, sau chuyển sang -80oC hay nitơ lỏng (-196oC) Chú ý: Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu thích hợp với hầu hết nấm sợi sinh bào tử tế bào có vách ngăn Nhưng phương pháp tỏ không thích hợp với nấm sợi không sinh bào tử 250 vách ngăn Trong trường hợp cần nuôi cấy nấm sợi môi trường thích hợp để tạo bào tử Nếu không khắc phục phải tiến hành nuôi môi trường dịch thể để thu lấy sinh khối giữ glycerol 10% Đánh giá khả sống mẫu bảo quản: - Làm tan mẫu (mẫu lấy từ tủ lạnh sâu -80 oC nitơ lỏng -196oC) bể ổn nhiệt 37oC phút - Dùng que cấy lấy miếng môi trường thạch đặt vào vị trí khác môi trường thạch đĩa thích hợp Để nhiệt độ thích hợp xem khả mọc sau thời gian thích hợp (2-4 ngày) Chú ý lấy mẫu cần lấy sợi nấm để đưa vào môi trường thạch đĩa Một số điều ý bảo quản nấm sợi: - Ảnh hưởng ánh sáng với trình hình thành bào tử: Phần lớn trường hợp thành công phương pháp bảo quản phụ thuộc vào số lượng bào tử Ánh sáng tác nhân quan trọng trình hình thành bào tử nấm sợi, ánh sáng có bước sóng ngắn có tác dụng kích thích trình hình thành bào tử, ánh sáng gần vùng cực tím (3100 – 4000 nm) có tác dụng thay đổi màu sắc kích thước khuẩn lạc - Thành phần môi trường: Nói chung môi trường có thành phần dinh dưỡng nghèo thường cho lượng bào tử lớn - Tránh nhiễm tạp mạt (mite), chủng nấm sợi lưu giữ thường bị mạt phá hoại Đầu tiên chúng ăn chủng giống làm hỏng, sau gây tạp nhiễm mang bào tử vi khuẩn thể từ ống sang ống khác Vì lý mà cần có biện pháp hạn chế mạt, thông thường chủng giống phải bảo quản nơi sạch, nhiệt độ 4-8 oC 5.4 Phương pháp bảo quản nấm men Tương tự nấm sợi, có nhiều phương pháp bảo quản nấm men Chúng đề cập đến phương pháp thông dụng sử dụng sưu tập nấm men lớn giới a Phương pháp cấy truyền: Cấy truyền phương pháp đơn giản, nhanh rẻ tiền thông dụng nhất, nhiên hạn chế phương pháp dễ tạp nhiễm thay đổi đặc điểm sinh học, tính trạng di truyền bất lợi bảo quản theo phương pháp 251 Cấy truyền môi trường dịch thể: - Cách tiến hành đơn giản chuẩn bị 10 ml môi trường nuôi cấy nấm men (thông thường môi trường YM Yeast extract – Maltose) lọ McCartney khử trùng nhiệt độ 121 oC 15 phút Thường làm lọ cho chủng bảo quản - Một vòng que cấy chủng nấm men bảo quản đưa vào môi trường thao tác vô trùng giữ 25 oC 72 Phải kiểm tra phát triển chủng bảo quản - Sau mẫu giữ 4oC - Thông thường theo cách thời gian bảo quản chủng thường thay đổi từ 2- tháng Cấy truyền môi trường thạch: Cấy truyền môi trường thạch tương tự môi trường dịch thể môi trường bổ sung thạch (1.6%) Giống sau cấy giữ 72 nhiệt độ thích hợp để đạt độ phát triển cần thiết, sau để 4-8oC Theo phương pháp giống có thời gian sống lâu phương pháp cấy truyền dịch thể, thông thường giống bảo quản từ 3-6 tháng Thời gian bảo quản kéo dài từ 2-3 năm ống giống bảo quản dầu parafin trùng đổ lên môi trường thạch cho tạo lớp dày khoảng 1cm b Phương pháp bảo quản lạnh sâu đông khô (xem phần phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn xạ khuẩn) Tóm tắt Các vi sinh vật sinh trưởng phát triển môi trường, chịu tác động nhân tố môi trường, đặc tính sinh lý chung dễ dàng bị biến đổi Các phương pháp bảo quản chủng giống vi sinh vật nhằm mục đích lưu trữ giống vi sinh vật phân lập được, giống vi sinh vật có đặc tính quý giống vi sinh vật quan tâm Mục tiêu phương pháp bảo quản kéo dài tuổi thọ vi sinh vật không làm thay đổi làm thay đổi tính chất chúng Câu hỏi ôn tập Trình bày phương pháp bảo quản giống vi khuẩn? 252 2, Trình bày phương pháp bảo quản giống nấm mốc 253 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyền, Phạm Văn Ty Vi sinh vật học Nhà xuất Giáo dục 1998 Nguyễn Thành Đạt Cơ sở học Vi sinh vật Nhà xuất Đại học Sư phạm 2002 Phạm Thành Hổ Sinh học đại cương Nhà xuất Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.2002 Biền Văn Minh, Phạm Văn Ty, Kiều Hữu ảnh, Phạm Hồng Sơn, Phạm Ngọc Lan, Nguyễn Thị Thu Thủy Giáo trình vi sinh vật học Nhà xuất Đại học Huế 2006 Trần Linh Thước Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm Nhà xuất Giáo dục 2002 254 [...]... nên vi sinh vật có tác dụng rất lớn trong việc tham gia các vòng tuần hoàn vật chất trên trái đất cũng như tham gia vào các quá trình sản xuất nông nghiệp Vi sinh vật học đại cương, nghiên cứu những quy luật chung nhất về vi sinh vật 1.3 Vai trò của vi sinh vật Trong thiên nhiên, vi sinh vật giữ những mắt xích trọng yếu trong sự chu chuyển liên tục và bất diệt của vật chất, nếu không có vi sinh vật hay... về vi sinh vật được thể hiện qua 4 giai đoạn: trước khi phát minh ra kính hiển vi, kính hiển vi ra đời, Pasteur với các thực nghiệm, giai đoạn sau Pasteur và sinh học hiện đại Ngày nay con người đã có thể có nhiều nghiên cứu chuyên sâu về vi sinh vật nhờ sự phát triển của sinh học phân tử và các kỹ thuật di truyền hiện đại Câu hỏi ôn tập 1 Trình bày đối tượng, nhiệm vụ của vi sinh vật học đại cương. .. lẽo 11 Vi sinh vật còn là nhân tố tham gia vào việc giữ gìn tính bền vững của các hệ sinh thái trong tự nhiên Đối với sản xuất nông nghiệp, vi sinh vật có vai trò rất lớn, vi sinh vật tham gia vào việc phân giải các hợp chất hữu cơ, chuyển hóa các chất khoáng, cố định nitơ phân tử để làm giàu thêm dự trữ nitơ của đất Trong quá trình sống, vi sinh vật còn sản sinh ra rất nhiều chất có hoạt tính sinh học... với quá trình sinh trưởng, phát triển của cây trồng, vật nuôi Người ta nhận thấy nếu không có vi sinh vật tiêu thụ các sản phẩm trao đổi chất do cây trồng tiết ra quanh bộ rễ thì một số sản phẩm này sẽ đầu độc trở lại cây trồng Trong chăn nuôi và ngư nghiệp, vi sinh vật cũng có tác dụng rất to lớn, trong cơ thể của các loài động vật đều có một hệ vi sinh vật rất phong phú, hệ vi sinh vật này giúp cho... vi sinh vật thú y đã cùng môn dịch tễ học đã đề ra những biện pháp phòng dịch bệnh của súc vật và một số bệnh có thể lây sang người, như dại, lao, nhiệt thán, Hiện nay vi sinh vật là một môn khoa học mũi nhọn trong cuộc cách mạng sinh học Nhiều vấn đề quan trọng của sinh học hiện đại như, nguồn gốc sự sống, cơ chế thông tin, cơ chế di truyền, cơ chế điều khiển học và các tổ chức sinh vật học, vi sinh. .. chức sinh vật học, vi sinh vật học đang có những bước tiến vĩ đại, đang trở thành vũ khí sắc bén trong tay con người để nhằm chinh phục thiên nhiên phục vụ đắc lực cho sản xuất và đời sống 1.4 Nhiệm vụ của vi sinh vật học đại cương - Nghiên cứu các đặc điểm cơ bản về hình thái, cấu tạo, di truyền, hoạt động sinh lý hóa học, của các nhóm vi sinh vật - Sự phân bố của vi sinh vật trong tự nhiên và mối... răng của miệng của tôi có rất nhiều sinh vật tý hon hoạt động, chúng nhiều hơn so với vương quốc Hà Lan hợp nhất'' 13 Phát minh của Leewenhoek củng cố quan niệm về khả năng tự hình thành của vi sinh vật Thời gian này người ta cho rằng sinh vật quan sát được là từ các vật vô sinh, thịt, cá sinh ra dòi và sau đó người ta cho ra đời thuyết tự sinh (hay thuyết ngẫu sinh) Hình 1.1 Anton Van Leeuwenhoek... nhóm sinh vật khác Bên cạnh khả năng phân giải, vi sinh vật còn có khả năng tổng hợp nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp, trong điều kiện nhiệt độ, áp suất bình thường 1.2 Sự phân bố của vi sinh vật Vi sinh vật phân bố rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, nước, không khí, trên cơ thể các sinh vật khác, trên lương thực, thực phẩm và các loại hàng hóa Chẳng những thế, sự phân bố của chúng còn theo một hệ sinh. .. 2.3 Giai đoạn vi sinh vật học thực nghiệm với Pasteur Đến thế kỷ XIX cùng với sự phát triển của chủ nghĩa tư bản, các ngành khoa học kỹ thuật nói chung và vi sinh vật học nói riêng, phát triển mạnh mẽ, nhiều nhà khoa học đã quan sát và nghiên cứu về một số vi sinh vật gây bệnh và sáng tạo ra một số phương pháp mới để nghiên cứu về vi sinh vật Đóng góp cho sự phát triển của vi sinh vật ở giai đoạn này... sinh vật có mặt ở khắp mọi nơi trên Trái đất, trong không khí, trong đất, trên núi cao, dưới biển sâu, trên cơ thể, người, động vật, thực vật, trong thực phẩm, trên mọi đồ vật Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc thực hiện các vòng tuần hoàn sinh- địa-hoá học (biogeochemical cycles) như vòng tuần hoàn C, vòng tuần hoàn n, vòng tuần hoàn P, vòng tuần hoàn S, vòng tuần hoàn Fe Trong nước vi sinh vật