Nghiên cứu đặc điểm sinh học và công nghệ nuôi vi tảo biển nannochloropsis oculata (DROOP) HIBBERD sử dụng làm thực phẩm chức năng

Trong đó vi tảo là nguồn dinh dưỡng quan trọng cho động vật nuôi, nuôi trồng thủy sản, nguồn nguyên liệu cho phân bón, sản xuất nhiên liệu sinh học, bảo vệ môi trường và đặc biệt được dù

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

PHẠM ĐỨC THUẬN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NUÔI VI TẢO BIỂN Nannochloropsis oculata (DROOP)

Công trình được hoàn thành tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Đặng Diễm Hồng

Viện Công nghệ sinh học

Phản biện 1: PGS TS Vương Trọng Hào

Phản biện 2: PGS TS Nguyễn Đình San

Phản biện 3: PS TS Nguyễn Trung Thành

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sỹ cấp nhà nước tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Số 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

Vào hồi giờ phút, ngày tháng năm 2016

Có thể tìm thấy luận án tại:

- Thư viện Công nghệ sinh học

- Thư viện Quốc Gia

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Theo xu thế thị trường hiện nay việc sử dụng thảo dược và các nguyên liệu

có nguồn gốc thiên nhiên để chăm sóc sức khỏe con người là rất quan trọng và mang lại nhiều lợi ích to lớn Trong đó vi tảo là nguồn dinh dưỡng quan trọng cho động vật nuôi, nuôi trồng thủy sản, nguồn nguyên liệu cho phân bón, sản xuất nhiên liệu sinh học, bảo vệ môi trường và đặc biệt được dùng làm thực phẩm chức năng tăng cường dinh dưỡng cho người đang được đánh giá là một trong những ứng dụng quan trọng và có triển vọng lớn

Hàng năm trên thế giới sản suất khoảng 6000 tấn vi tảo khô và đã cho doanh thu 1,25 tỷ USD (Gross và Pulz, 2004) Các sản phẩm này được thương mại dưới dạng nguyên liệu hoặc dạng thành phẩm như sản phẩm của hãng Green Sun (Mỹ) Thành phần dinh dưỡng của các thương phẩm vi tảo do công ty Green Growth (Mỹ) bào chế đã được ứng dụng hỗ trợ điều trị bệnh mãn tính, đặc biệt ung thư (www.greengrowthnutri.com) Trong số các loài vi tảo biển (VTB) đang được tập

trung nghiên cứu và khai thác hiện nay, sinh khối VTB Nannochloropsis oculata

giàu axit béo eicosapentaenoic (C20:5 ω-3) - một axit béo không bão hòa đa nối đôi thiết yếu cho người và động vật nuôi, hiện được sử dụng rộng rãi làm thức ăn sống cho các đối tượng nuôi trồng thủy sản ở các giai đoạn ấu trùng khác nhau, làm thực phẩm chức năng, làm nhiên liệu sinh học…và đã đạt được nhiều thành tựu khả quan

Tuy nhiên ở Việt Nam, mặc dù có rất nhiều công trình nghiên cứu về VTB

N oculata có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhưng các kết quả

nghiên cứu nhìn chung chưa mang tính hệ thống và chủng giống chủ yếu là nhập ngoại; chưa nuôi trồng trên qui mô lớn Việc làm sáng tỏ tính an toàn của sinh khối tảo nuôi được; sử dụng sinh khối tảo giàu dịnh dưỡng làm viên thực phẩm chức năng bổ sung cho sức khỏe của người; nghiên cứu về tác dụng sinh học - dược học của sinh khối tảo ở Việt Nam là hoàn toàn chưa có

Vì vậy, nhằm nâng cao chất lượng và giá trị của sản phẩm thực phẩm chức

năng từ VTB nói chung và từ vi tảo N oculata được phân lập từ vùng biển của Việt

Nam, tối ưu hóa điều kiện nuôi tảo này ở các hệ thống nuôi hở (HTNH) và hệ thống nuôi kín (HTNK) tự thiết kế để đủ sinh khối để sản xuất viên nang thực phẩm chức

năng có tác dụng bảo vệ sức khỏe, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên

cứu đặc điểm sinh học và công nghệ nuôi vi tảo biển Nannochloropsis oculata (Droop) Hibberd sử dụng làm thực phẩm chức năng”

2 Mục tiêu của đề tài

1 Tuyển chọn, sàng lọc, định tên khoa học và nghiên cứu các đặc điểm sinh

học của các loài VTB thuộc chi Nannochloropsis;

2 Chọn được 1 chủng/loài VTB thuộc chi Nannochloropsis có khả năng

nhân nhanh sinh khối, nuôi trồng trong các HTNK 20, 50, 100 L và đủ tiêu chuẩn làm nguyên liệu cho sản xuất viên thực phẩm chức năng

3 Nội dung nghiên cứu

1 Tuyển chọn, sàng lọc và nghiên cứu đặc điểm sinh học, thành phần dinh

dưỡng của các chủng VTB N oculata ở điều kiện nhân nuôi trong HTNH

2 Nghiên cứu sinh trưởng của chủng N oculata QN1 trong HTNK kín 20,

50 và 100 L và xây dựng quy trình thu hoạch, chế biến, bảo quản sinh khối chủng tảo này

3 Đánh giá tác động sinh học – dược lý, xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của sinh

khối tảo N oculata QN1 và bào chế, xây dựng tiêu chuẩn cơ sở viên thực phẩm

chức năng thành phẩm

4 Những đóng góp mới của luận án

1 Sàng lọc thành công và dựa trên các đặc điểm hình thái và giải mã đoạn

gen 18S rRNA đã xác định được tên chủng N oculata QN1;

2 Xây dựng thành công quy trình nuôi sinh khối chủng N oculata QN1 ở

hệ thống nuôi kín dạng ống tự thiết kế (với điều kiện không sử dụng bơm chỉ dùng máy nén khí và nâng bình chứa lên cao) có dung tích 50, 100 L đạt mật độ tế bào

245,13 ±3,96 và 246,31 ±4,21 x 106 TB/mL sau 15 ngày nuôi cấy

3 Đã nghiên cứu được độc tính cấp và bán trường diễn, dược lý của sinh

khối VTB N oculata QN1 đạt tiêu chuẩn sản xuất thực phẩm chức năng Đã xây

dựng được bộ tiêu chuấn cơ sở cho nguyên liệu tảo dạng lỏng, nguyên liệu tảo dạng bột khô của chủng QN1, và tiêu chuẩn cơ sở của viên nang thực phẩm chức năng có chứa sinh khối chủng QN1 được Cục An toàn Thực phẩm – Bộ Y tế cấp phép

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

1 Kết quả nghiên cứu thu được trong Luận án này là cơ sở khoa học để

nghiên cứu sâu về đặc điểm sinh học của chủng N oculata QN1 phân lập được từ

vùng biển Quảng Ninh và bổ sung cơ sở dữ liệu cho tập đoàn giống VTB có nguồn gốc của Việt Nam; cung cấp số liệu khoa học cho phép làm chủ quy trình nhân nuôi chủng QN1 trong điều kiện phòng thí nghiệm, khả năng sử dụng hệ thống nuôi kín tự thiết kế 20, 50 và 100 L để cung cấp sinh khối làm nguyên liệu sản xuất viên thực phẩm chức năng đạt tiêu chuẩn cơ sở, có tác dụng dược lý - sinh

học tốt

2 Các kết quả của Luận án có ý nghĩa thực tiễn đối với các cơ sở sản xuất sinh khối tảo làm chủ được quy trình nuôi, thu sinh khối và bảo quản sinh khối tảo đạt chất lượng làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng

6 Bố cục của luận án

Luận án gồm 147 trang, trong đó phần mở đầu 3 trang, tổng quan tài liệu 27 trang, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 24 trang, kết quả và thảo luận 90 trang, kết luận và kiến nghị 3 trang, danh mục các công trình đã công bố 1 trang, tài liệu tham khảo 12 trang với 130 tài liệu tham khảo Trong luận án có 43 Bảng và 74 Hình

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

Trong tự nhiên, vi tảo là thành phần cơ bản của chuỗi thức ăn của thủy vực Chúng được coi là nguồn thực phẩm quan trọng cho con người và động vật, cung cấp protein, lipit, các axit béo không bão hòa đa nối đôi (PUFAs - Polyunsaturated fatty acids) như EPA (axit eicosapentaenoic, C20:5 ω-3), DHA (axit docosahexaenoic, C22:6 ω − 3); là nguyên liệu cho sản xuất nhiên liệu sinh học, cung cấp các chất có hoạt tính sinh học được dùng làm thuốc, mỹ phẩm và dược phẩm, nguồn phân bón sinh học Gần đây, sinh khối tảo được sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng

VTB N oculata có kích thước nhỏ, dao động từ 2-4 μm, không có roi, màu xanh, phân bố khá rộng ở nước ngọt, lợ và mặn (Hu và Gao, 2003) N oculata rất

giàu các axit béo bão hòa và không bão hòa đa nối đôi, trong đó chủ yếu là EPA với hàm lượng dao động trong khoảng 20-29,9 % so với axit béo tổng số, tùy theo điều kiện nuôi cấy và pha sinh trưởng của tế bào (Pal và cs., 2011; Chen và cs., 2013) EPA đã được chứng minh có vai trò quan trọng trong việc tăng cường sức

đề kháng và phòng tránh bệnh cho người và động vật EPA giúp chống suy nhược

cơ thể (Babcock và cs., 2000), ngăn chặn tình trạng máu nhiễm mỡ, chống các bệnh về tim mạch, xơ vữa động mạch, làm giảm viêm nhiễm (Nordoy, 1991; Gill

và Valivety, 1997) EPA là thành phần quan trọng trong nhiều loại thực phẩm và thuốc hỗ trợ phát triển trí não ở trẻ em và chống bệnh suy giảm trí nhớ ở người già Theo Senzaki và cs., (1998); Bonaa và cs., (1992), EPA giúp kháng ung bướu

và được xem như là yếu tố hỗ trợ phòng ngừa và điều trị ung thư Chính vì vậy,

nhu cầu sử dụng sinh khối VTB N oculata sạch, đạt tiêu chuẩn làm nguyên liệu sử

dụng trong lĩnh vực dược phẩm và mỹ phẩm ngày càng tăng

Hiện nay, nhu cầu sử dụng sinh khối tảo N oculata sạch, đáp ứng tiêu chuẩn

làm nguyên liệu cho sản xuất thuốc và thực phẩm chức năng ngày càng cao Vì vậy, các giải pháp như nuôi tảo trong các hệ thống nuôi kín đã được triển khai, nhằm mục đích nâng cao hiệu quả nuôi trồng và chất lượng sinh khối tảo Trên thế

giới, nuôi tảo N oculata trong các hệ thống nuôi kín đã được tiến hành khá phổ

biến (Briassoulis và cs., 2010; Feng và cs., 2011) Tuy nhiên, ở Việt Nam việc

nuôi tảo N oculata trong các hệ thống nuôi kín cũng đã được triển khai nhưng với

mục đích chủ yếu là cung cấp giống nhân nuôi ban đầu cho hệ thống nuôi hở, làm thức ăn sống cho các đối tượng nuôi trồng thủy sản (Đặng Tố Vân Cầm và cs.,

2013; Ngô Thị Hoài Thu, 2015) Các nghiên cứu sử dụng hệ thống nuôi kín để nuôi VTB cung cấp nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng hầu như không

có và chưa có tính hệ thống

Chính vì vậy, nhằm nâng cao chất lượng và giá trị của sản phẩm chức năng từ

VTB nói chung và từ vi tảo N oculata để phục vụ cho sức khỏe cộng động thì hướng nghiên cứu phân lập N oculata từ vùng biển Việt Nam, tìm điều kiện nhân

nuôi tảo này trong các hệ thống nuôi hở và kín tự thiết kế để sản xuất viên nang thực phẩm chức năng là rất cần thiết Ngoài ra, sinh khối tảo cần phải được kiểm tra theo các quy định về an toàn thực phẩm và kiểm nghiệm các chỉ tiêu quan trọng ảnh hưởng đến sức khỏe con người; cần phải tiến hành nghiên cứu tác dụng dược lý- sinh học của sinh khối tảo nêu trên đến sức khỏe con người thông qua đánh giá tác động của sinh khối tảo lên hành vi của động vật thực nghiệm cũng như đánh giá chất lượng của viên nang tảo thành phẩm dùng làm thực phẩm chức năng

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chuột nhắt trắng giống Swiss 18 – 20 g/con do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương cung cấp Hai giống thỏ trắng (đực và cái) cân nặng từ 2,0 đến 2,5 kg/con

do Bộ phận chăn nuôi G1 của Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương cung cấp để nghiên cứu, đánh giá độc tính của sinh khối tảo trên mô hình động vật thực nghiệm

Chuột nhắt trắng, giống đực, khỏe mạnh 10 – 12 tuần tuổi, trọng lượng 20 –

30 g/con, do Ban chăn nuôi động vật Học viện Quân y cung cấp để tiến hành thử nghiệm đánh giá tính an toàn dược lý của sinh khối vi tảo

Trình tự cặp mồi nhân đoạn gen 18S rRNA với kích thước khoảng 1100 bp

do Phòng Công nghệ Tảo, Viện CNSH thiết kế được sử dụng với Primer F: TACCACATCTAAGGAAGGCAGCAG-3’ (24nu) và Primer R: 5’- GGCATCACAGACCTGTTATTGC-3’ (22 nu)

5’-2.2 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là thông dụng trong phòng thí nghiệm, đạt độ tinh khiết cần thiết cho các nghiên cứu do Việt Nam, Trung Quốc và Mỹ cung cấp

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chụp ảnh hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học (Light Microcope) và kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscope –SEM); cố định mẫu bằng glutaradehyde trước khi chụp ảnh dưới kính JEOL, JSM-6400 (Nhật Bản)

2.3.2 Các phương pháp sinh học phân tử: đọc và so sánh trình tự nucleotide

đoạn gen 18S rRNA của chủng Nannochloropsis sp QN1 tiềm năng được tiến

hành theo Sambrook và Rusell, (2001) Các chương trình phần mềm chuyên dụng như DNA Club, ClustalX 1.83, DNASTAR, MEGA4 và BLAST được sử dụng cho phân tích, so sánh và xây dựng cây phát sinh chủng loại của chủng

Nannochloropsis sp QN1 trong nghiên cứu

2.3.3 Khảo sát điều kiện nhân nuôi N oculata QN1 ở quy mô phòng thí nghiệm: nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng (với ba môi trường

Walne, F/2 và Erd), nồng độ muối (dao động từ 5 – 60 ‰), nhiệt độ (15 – 40 C), ánh sáng (60 - 800 mol/m2/s), pH (3 - 11), mật độ tế bào (MĐTB) ban đầu (7, 11,

13 và 15 triệu TB/mL), tỉ lệ CO2 (với nồng độ 1, 2, 5, 10 và 15 % v/v) lên sinh trưởng và phát triển của chủng QN1

2.3.4 Khảo sát điều kiện nhân nuôi chủng QN1 trong HTNK 20, 50 và 100 L: nghiên cứu ảnh hưởng của 3 môi trường dinh dưỡng (F/2, Erd và Walne), nồng

độ muối (từ 20- 40 ‰), nhiệt độ (25-28 0

C và 35 0C), ánh sáng trắng với CĐAS là

100 mol/m2s, pH (từ 5 đến 9), tỉ lệ CO2 (2 và 5 % v/v) với MĐTB ban đầu

(10-25 triệu TB/mL) lên sinh trưởng của chủng QN1 trong HTNK nói trên

2.3.5 Xác định sinh trưởng của chủng QN1: bằng đo mật độ quang ở bước

sóng 680nm, đếm mật độ tế bào (MĐTB) sử dụng buồng đếm Burker-Turk (Đức), xác định tốc độ sinh trưởng đặc trưng (Guillard và Sieracki, 2005) sinh khối khô (sấy ở 105 C), hàm lượng chlorophyll a và carotenoit, xác định kích thước tế bào bằng phần mềm MapInfo Professional 7.5

2.3.6 Phân tích thành phần và hàm lượng dinh dưỡng, kim loại nặng, lipit tổng số và các axít béo trong sinh khối chủng QN1

- Xác định hàm lượng lipit trong sinh khối tảo: theo phương pháp của Bligh

và Dyer, (1959) có một số cải tiến cho phù hợp với điều kiện của Việt Nam

- Thành phần và hàm lượng các axít béo trong sinh khối của QN1: được xác

định bằng máy sắc kí khí HP-6890 theo mô tả của Đặng Diễm Hồng và cs., (2007)

- Phân tích thành phần dinh dưỡng và kim loại nặng của chủng QN1: được

tiến hành theo Horwitz, (2000)

2.3.7 Nghiên cứu quy trình thu hoạch sinh khối chủng QN1: sử dụng kỹ

thuật làm lắng (sử dụng các chất trợ lắng như Al2 (SO4)3.18H2O; phèn nhôm kali sulfate dạng muối kép: KAl (SO4)2.12H2O và FeCl3; kỹ thuật ly tâm và sinh khối tảo sau khi thu hoạch sẽ được kiểm tra đánh giá đánh giá hàm lượng lipit và EPA, protein, cacbohydrate, chlorophyll a, carotenoit và kim loại nặng

2.3.8 Nghiên cứu quy trình chế biến bảo quản sinh khối chủng QN1: sinh

khối tảo sau khi thu hoạch bằng chất tạo kết bông sẽ được sấy khô theo các phương pháp khác nhau (sấy phun, sấy đông khô, sấy bằng tủ sấy nhiệt, phơi khô) Đánh giá ảnh hưởng của các phương pháp sấy qua độ ẩm và sự biến đổi của các thành phần dinh dưỡng của tảo trong quá trình chế biến và bảo quản

Sinh khối tảo khô có mức hàm ẩm khác nhau được bảo quản trong các túi nilon dán kín ở các điều kiện bảo quản khác nhau Đánh giá độ ổn định của vi tảo trong quá trình bảo quản thông qua theo dõi sự biến đổi của các thành phần dinh dưỡng trong tảo như lipit, protein, cacbohydrat, hàm lượng EPA…

2.3.9 Nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của sinh khối vi tảo N oculata QN1: tiến hành thử độc tính của sinh khối tảo khô N oculata QN1

theo Quy chế đánh giá tính an toàn và hiệu lực thuốc cổ truyền của Bộ Y tế (Bộ Y

tế, 1996) Các thử nghiệm được tiến hành gồm thử độc tính cấp trên chuột nhắt trắng và độc tính bán trường diễn trên thỏ theo các hướng dẫn hiện hành (Đỗ

Trung Đàm, 1996; WHO, 2000; OECD, 2001; OEDC, 2008)

2.3.10 Nghiên cứu tác động dược lý của sinh khối tảo N oculata QN1 lên động vật thực nghiệm: thông qua các bài tập môi trường mở; bài tập mê lộ chữ Y;

bài tập nhận thức đồ vật

2.3.11 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của sinh khối tảo QN1 làm nguyên liệu cho sản xuất viên thực phẩm chức năng:

+ Với các chỉ tiêu đã có phương pháp kiểm tra được quy định trong các tiêu

chuẩn ngành, dược điển các nước: áp dụng kiểm tra mẫu thử

+ Với các chỉ tiêu chưa có sẵn phương pháp: dựa trên các tính chất của hoạt chất cần kiểm tra và các phương tiện phân tích sẵn có để đề xuất phương pháp kiểm tra Phương pháp đề xuất được hiệu lực hóa bằng các phép thử độ đặc hiệu (định tính) hoặc độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác (định lượng)

2.3.12 Nghiên cứu công thức bào chế, xây dựng tiêu chuẩn thành phẩm và sản xuất thử nghiệm viên nang chứa thành phẩm vi tảo N oculata QN1:

+ Dựa trên công dụng, tác dụng của các dược liệu để đưa ra công thức viên

và dạng bào chế

+ Dựa trên tính chất hóa lý của các thành phần hoạt chất và tá dược để lựa chọn phương pháp bào chế và công thức bào chế phù hợp Đánh giá sự phù hợp của các lựa chọn thông qua khả năng tạo hạt, làm viên và độ ổn định của chế phẩm trong quá trình bào chế

+ Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và hiệu lực hóa phương pháp kiểm tra chất lượng như đã mô tả trong mục “Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở”, áp dụng với thành phẩm là viên nang vi tảo

2.3.12 Xử lý số liệu

Số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm Excel So sánh thống kê được thực hiện qua phân tích one-way ANOVA với giá trị P<0,01 và so sánh các giá trị trung bình với hàm t-test được dùng với độ tin cậy p<0,05

Xử lý số liệu độc tính cấp của sinh khối tảo trên động vật thực nghiệm theo phương pháp thống kê sinh y học, dùng phép kiểm định t-student và test “trước - sau”(Avant - Après) để so sánh các chỉ số Số liệu được biểu diễn dưới dạng: Giá trị trung bình ± Es (sai số chuẩn) với độ tin cậy P 95 %

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tuyển chọn, sàng lọc và nghiên cứu đặc điểm sinh học, thành phần dinh

dưỡng của các chủng VTB N oculata ở điều kiện nhân nuôi trong HTNH

3.1.1 Đặc điểm của các chủng vi tảo biển Nannochloropsis spp nghiên cứu

Các chủng Nannochoropsis spp phân lập ở vùng biển Quảng Ninh, Nha

Trang, tỉnh Khánh Hòa năm 2009 có tế bào ở dạng đơn bào, hình cầu, màu xanh, không có roi và có kích thước 1,5 -3,6 ±0,5µm (Hình 3.1 và 3.2)

Hình 3.1 Hình thái tế bào của 6 chủng Nannochloropsis spp phân lập ở vùng

biển Nha Trang và Quảng Ninh dưới kính hiển vi quang học

Dựa trên các đặc điểm hình thái (quan sát dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử quét), chúng tôi đã định tên sơ bộ được 6 chủng

Nannochloropsis spp ở các vùng biển Quảng Ninh và Nha Trang - Khánh Hòa

thuộc về loài Nannochloropsis oculata (Droop) Hibberd 1981

Hình 3.2 Hình thái tế bào của 6 mẫu Nannochloropsis spp dưới kính hiển vi

điện tử quét (SEM)

3.1.2 Lựa chọn chủng VTB Nannochloropsis spp phù hợp cho sản xuất thực

phẩm chức năng

Chủng Nannochloropsis spp tiềm năng được sử dụng làm nguyên liệu để

sản xuất thực phẩm chức năng cần phải có một số đặc điểm như khả năng sinh trưởng nhanh, giàu dinh dưỡng, đặc biệt là hàm lượng EPA cao và có khả năng nuôi trồng trên quy mô lớn Trong số 6 chủng VTB được sử dụng nghiên cứu, dựa trên khả năng sinh trưởng của các chủng đã phân lập được trong môi trường lỏng (đánh giá qua MĐTB, thời gian đạt mật độ cực đại và tốc độ sinh trưởng đặc trưng), thành phần dinh dưỡng (hàm lượng protein, lipit và hydratcacbon), chúng

tôi đã chọn được Nannochloropsis sp QN1 phân lập từ vùng biển Quảng Ninh

làm đối tượng nghiên cứu cho các thí nghiệm tiếp theo

3.1.3 Định tên khoa học chủng Nannochloropsis sp QN1 bằng kỹ thuật đọc

và so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen 18S rRNA

Kết quả tách dòng và đọc trình tự đoạn gen 18S rRNA của chủng

Nannochloropsis sp QN1 được trình bày ở Hình 3.3

Hình 3.3 Tách dòng đoạn gen 18S rRNA của chủng Nannochloropsis sp QN1

A: DNA tổng số của chủng QN1 (giếng 1); B: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen 18S rRNA của chủng QN1 (giếng 2); C: Sản phẩm PCR tinh sạch của chủng QN1 (giếng 3); D: PCR checking chủng QN1 (giếng 4, 5 và 6) Giếng M: Thang DNA chuẩn 1 kb Plus Ladder

Kết quả cho thấy độ tương đồng của các loài thuộc chi Nannochloropsis dao động từ 83,0 % đến 99,9 % Chủng Nannochloropsis sp QN1 phân lập ở Quảng Ninh có độ tương đồng cao nhất với loài N oculata (AF045045) đạt 99,9 %, tiếp theo là N granulate MBIC10054 (AB052272), N limnetica (AF251496) và N

oceanica MBIC10440 (AB052277) đạt 99,5 % và thấp nhất là loài N gaditana

(AF133819) đạt 98,3 % Kết hợp tỷ lệ phần trăm tương đồng và cây phát sinh

chủng loại (Hình 3.4), chúng tôi có thể kết luận chủng Nannochloropsis sp QN1 phân lập được từ vùng biển Quảng Ninh thuộc về loài N oculata vì chúng có độ tương đồng đạt 99,9 % với loài N oculata (Droop) Hibberd 1981 có mã số

(AF045045) Trình tự đoạn gen 18S rRNA của chủng QN1 đã được đăng ký trên GenBank với mã số được cấp là KU 342 038

Hình 3.4 Cây phát sinh chủng loại của chủng Nannochloropsis sp QN1 phân

lập từ vùng biển Quảng Ninh

3.1.4 Sinh trưởng của chủng N oculata QN1 trong điều kiện phòng thí

nghiệm

Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng của chủng N oculata QN1 là

môi trường dinh dưỡng Erd, độ mặn 30 ‰, nhiệt độ 25-30C, CĐAS 100 μmol/m2

/s, pH 7, sục khí CO2 có nồng độ 2% (v/v) với tốc độ 0,25 L/phút, mật độ

tế bào ban đầu để nhân nuôi đạt 11 triệu TB/mL

3.2 Nghiên cứu sinh trưởng của chủng N oculata QN1 trong HTNK kín 20,

50 và 100 L và xây dựng quy trình thu hoạch, chế biến, bảo quản sinh khối chủng tảo này

Điều kiện sinh trưởng thích hợp của chủng QN1 trong HTNK 20, 50 và 100

L là: môi trường dinh dưỡng Walne; nồng độ muối 30 ‰; nhiệt độ 25-28 ºC; ánh sáng trắng với cường độ 100 µmol/m2/s; pH 7; sục không khí có bổ sung CO2 ở

nồng độ 2 % (v/v) với tốc độ sục khí 0,25 L/phút; mật độ tế bào ban đầu tối ưu cho nhân nuôi trong hệ thống nuôi kín là 15-20 triệu TB/mL

So sánh với HTNH, sau 25 ngày nuôi cấy thì MĐTB của tảo N oculata

QN1 ở HTNK 20 L đạt 201,1 x triệu TB/mL, tăng 21,2 % so với HTNH 197,00 x triệu TB/mL Còn ở các HTNK 50 và 100 L, MĐTB đạt giá trị trung bình cao nhất

là 245,13 ±3,96 và 246,31 ±4,21 triệu TB/mL sau 15 ngày nuôi cấy, tương ứng

Sinh khối tảo trong HTNK huyền phù, không bị tạp nhiễm, thời gian vận hành được kéo dài giúp làm giảm chi phí nuôi cấy, năng suất sinh khối luôn ổn định, tiết kiệm diện tích cũng như công sức nuôi cấy

Đã đưa ra được sơ đồ quy trình nuôi trồng loài N oculata QN1 làm nguyên

liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng

3.2.3 Nghiên cứu quy trình thu hoạch chế biến và bảo quản sinh khối tảo N

oculata QN1

3.2.3.1 Quy trình thu hoạch

Điều kiện thu hoạch sinh khối tảo từ các hệ thống nuôi khác nhau: chế độ ly tâm 6000 v/p trong 10 phút với hiệu quả lắng đạt 95 % và 3000 v/p trong 10 phút với hiệu quả lắng đạt 100 % với dịch nuôi tảo không được và được xử lý chất kết bông (KAl (SO4)2.12H2O 0,4 g/L) Hàm lượng, thành phần lipit và axit béo trong sinh khối tảo thu hoạch được từ hai phương pháp ly tâm là tương đương nhau, trong đó hàm lượng lipit tổng số đạt 16,21±1,88 đến 16,72±0,88 % sinh khối khô,

hàm lượng EPA đạt 24,73±2,17 đến 26,03±2,12 % so với tổng số axit béo

Đã xây dựng được quy trình thu hoạch sinh khối tảo N oculata QN1, cung

cấp nguyên liệu cho sản xuất viên thực phẩm chức năng (Hình 3.5)

Tính ổn định của vi tảo N oculata QN1 trong quá trình thu hoạch đã được

xác định Hàm lượng lipit, EPA, protein, cacbohydrate, chlorophyll a, carotenoit trong sinh khối tảo thu hoạch được bằng phương pháp ly tâm và sử dụng chất kết bông (có rửa sinh khối bằng 2 lần HCl 0,1N và 3 lần bằng nước cất) đạt lần lượt là 15,62±1,23 % và 15,15±1,36 % SKK; 2,3±0,1 và 2,28±0,1 % SKK; 18,21±1,21 và 18,12±1,32 % SKK; 34,7±2,13 và 30,2±2,45% SKK; 1,65±0,05 và 1,61±0,04%

SKK; 0,29±0,04 và 0,27±0,03 % SKK Sinh khối tảo N oculata QN1 cũng rất

giàu các khoáng đa và vi lượng, hàm lượng các kim loại nặng như Cd, Pd, As và

Hg đều nằm dưới ngưỡng cho phép đối với các mẫu thực phẩm theo tiêu chuẩn Việt Nam, (2002) Ngoài ra, các quan sát cảm quan cũng cho thấy màu sắc của sinh khối tảo thu hoạch được theo hai phương pháp ly tâm trực tiếp dịch nuôi tảo hoặc kết bông và ly tâm sau khi rửa 2 lần bằng HCl 0,1 N và 3 lần rửa bằng nước cất đều có màu xanh đặc trưng và không có sự khác biệt

3.2.3.2 Nghiên cứu quy trình chế biến và bảo quản vi tảo N oculata QN1

Hình 3.5 Sơ đồ quy trình thu hoạch vi tảo biển N oculata QN1

Sinh khối tảo N oculata QN1 có thể sấy bằng sấy phun là phương pháp có

thể thu sinh khối chủng QN1 có chất lượng tốt, chi phí phù hợp và có thể áp dụng

cho việc sản xuất sinh khối tảo ở quy mô bán công nghiệp và công nghiệp Ngoài

ra, có thể sử dụng sấy phun với điều kiện thích hợp là hàm lượng chất khô trong

dịch tảo trước sấy khoảng 20 %, nhiệt độ không khí đầu vào là 200 °C, áp lực khí

nén là 4,00 bar và tốc độ bơm nhập liệu là 20 mL/phút với hiệu suất thu hồi đạt

trên 65 %, độ ẩm sản phẩm dao động khoảng 3,5 %

Nghiên cứu điều kiện bảo quản sinh khối tảo N oculata QN1 thu hoạch

được ở các điều kiện khác nhau bao gồm nhiệt độ phòng, 4 – 10 °C và -20 °C

trong thời gian từ 1 tuần đến 1 năm đã được tiến hành Kết quả về điều kiện bảo

quản được đánh giá thông qua sự thay đổi về hàm lượng lipit, protein,

cacbohydrate, chlorophyll a trong sinh khối tảo tươi của chủng QN1

Điều kiện bảo quản sinh khối tảo tươi N oculata QN1 phù hợp nhất ở -20

°C với thời gian bảo quản lên tới 1 năm Sự thay đổi về thành phần và hàm lượng

axit béo của N oculata QN1 sau thời gian bảo quản 1 năm được trình bày ở Bảng

Tảo khô

Ly tâm loại nước và rửa lại bằng HCl 0,1N và nước cất 3-5 lần (tỷ lệ 1:5, w/v)

Nước, KAl (SO 4 ) 2 12H 2 O

Bảng 3.1: Sự thay đổi hàm lƣợng, thành phần axit béo của N oculata QN1

sau thời gian bảo quản 1 năm ở -20 0 C

SK có

độ ẩm 100%

SK có

độ ẩm 60- 80%

SK có

độ ẩm 20- 40%

SK có

độ ẩm 0-5%

C14:0 Tetradecanoic acid 0,62 0,58 0,53 0,60 0,61 C16:0 Hexadecanoic acid 20,15 20,10 20,19 20,12 20,16 C16:1n-7 9- Hexadecanoic acid 3,52 3,30 3,57 3,24 3,46 C18:1n-9 9- Octadecenoic acid 8,46 8,00 6,71 7,21 7,12

C18:2n-6

9,12- Octadecenoic acid

9,18 8,30 9,03 9,25 9,13

C18:3n-3

9,12,15- Octadecatrienoic acid

17,82 17,70 17,01 16,35 17,21

C20:0 Eicosanoic acid 5,26 5,90 5,98 5,68 6,08

C20:4n-6

5, 8, 11, 4- Eicosatetraenoic acid

0,83 0,60 0,74 0,85 0,79

C20:5n-3

(EPA)

5, 8, 11, 14, Eicosapentaenoic acid

Hàm lượng, thành phần các axit béo trong sinh khối tảo N oculata QN1 với

độ ẩm khác nhau sau thời gian bảo quản 1 năm ở -20 0C là không thay đổi nhiều

so với thời điểm ban đầu Các axit béo chính chứa trong sinh khối tảo bao gồm EPA, axit  -linolenic, axit palmitic, axit oleic, axit linoleic Trong đó, hàm lượng EPA trong sinh khối tảo có độ ẩm khác nhau dao động từ 23,21 – 26,03 % SKK sau 1 năm bảo quản ở -20 0

C

Nghiên cứu xác định tính ổn định của vi tảo trong quá trình chế biến

Tính ổn định của sinh khối tảo N oculata QN1 sau quá trình sấy khô theo

các phương pháp khác nhau (phơi nắng, sấy khô bằng tủ sấy nhiệt, sấy phun và sấy đông khô) đã được nghiên cứu Kết quả cho thấy hàm lượng, thành phần các

axit béo trong sinh khối tảo N oculata QN1 khi được sấy đông khô là không thay

đổi nhiều so với thời điểm ban đầu Hàm lượng EPA giữ ổn định ở mức 35,03 – 35,08 % so với tổng số axit béo (TFA) Hàm lượng EPA trong sinh khối tảo được sấy khô trong lò sấy và sấy phun giảm xuống còn 26,98 % và 28,68 % so với TFA,

tương ứng Trong khi đó, quá trình sấy khô sinh khối tảo bằng cách phơi nắng làm giảm đáng kể hàm lượng EPA (giảm từ 35,03 xuống 19,9 % so với TFA) (Bảng 3.2)

Bảng 3.2: Sự thay đổi hàm lƣợng, thành phần axit béo trong sinh khối

N oculata QN1 sau quá trình sấy khô khác nhau

Sấy trong tủ sấy

Sấy phun

Sấy đông khô

C12:0 Dodecanoic acid 0,61 6,58 0,96 2,60 0,61 C14:0 Tetradecanoic acid 5,31 15,10 8,19 10,12 5,16 C16:0 Hexadecanoic acid 13,56 13,98 13,17 14,24 13,46 C16:1(n-7) 9- Hexadecanoic acid 20,16 23,00 16,71 18,21 18,12 C18:1(n-9) 9- Octadecenoic acid 4,54 2,30 3,03 3,25 4,13

có chất lượng tốt với chi phí hợp lý và có thể áp dụng để sấy một lượng lớn sinh khối tảo

Nghiên cứu xác định tính ổn định của vi tảo trong quá trình bảo quản

Nghiên cứu xác định tính ổn định của sinh khối vi tảo thu được (bằng cách sấy nhiệt, sấy phun và sấy đông khô) sau thời gian bảo quản ở -20°C từ 0 ngày đến

1 năm đã được tiến hành Hàm lượng lipit, EPA, protein, carbonhydrate, và chlorophyll a trong sinh khối tảo được bảo quản ở -20°C thì chất lượng sinh khối tảo khô vẫn được đảm bảo sau thời gian 1 năm Ngoài ra, ở tất cả các điều kiện bảo quản, mức độ giảm hàm lượng lipit, EPA, protein, cacbohydrate và

chlorophyll a trong sinh khối tảo được sấy đông khô cũng thấp hơn so với sinh khối tảo được sấy nhiệt và sấy phun

3.3 Đánh giá tác động sinh học của sinh khối tảo N oculata QN1 sử

Bảng 3.3: Kết quả theo dõi các biểu hiện bất thường sau khi uống của chuột

Nhóm

Liều (g/kg KLCT

chuột)

Các biểu hiện ngộ độc (hoảng loạn, thở gấp, mệt mỏi, tím tái… chết)

Số chuột chết

Tình trạng tiêu thụ thức ăn, nước uống, bài tiết

Ghi chú: KLCT – khối lượng cơ thể

Kết quả nghiên cứu thu được trên Bảng 3.3 đã cho thấy chuột ở nhóm chứng

và bốn nhóm thử đều không có bất kỳ biểu hiện bất thường nào Tất cả các chuột đều khỏe mạnh, hoạt động bình thường Không có chuột bị chết trong thời gian theo dõi 7 ngày

Kết quả nghiên cứu về độc tính cấp đã cho thấy chuột uống sinh khối vi tảo

N oculata QN1 ở các liều nghiên cứu là 15; 20; 25 và 30 g/kg KLCT không có

con nào bị chết, chuột vẫn di chuyển và ăn uống bình thường Như vậy, sinh khối

vi tảo N oculata QN1 không gây độc tính cấp do không xác định được giá trị

LD50 Hay nói cách khác, sinh khối vi tảo an toàn và không gây chết động vật thí nghiệm trong thử nghiệm gây độc cấp tính

Theo phân loại độc tính của Hệ thống phân loại hóa chất và hợp chất toàn