Nghiên cứu đặc điểm sinh học và công nghệ nuôi vi tảo biển nannochloropsis oculata (DROOP) HIBBERD sử dụng làm thực phẩm chức năng

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT PHẠM ĐỨC THUẬN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NUÔI VI TẢO BIỂN Nannochloropsis oculata (DROOP) HIBBERD SỬ DỤNG LÀM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG Chuyên ngành : Thực vật học Mã số : 62.42.01.11 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2016 Cơng trình hồn thành Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Đặng Diễm Hồng Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: PGS TS Vương Trọng Hào Phản biện 2: PGS TS Nguyễn Đình San Phản biện 3: PS TS Nguyễn Trung Thành Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sỹ cấp nhà nước Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Số 18 Hồng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi phút, ngày tháng Có thể tìm thấy luận án tại: - Thư viện Cơng nghệ sinh học - Thư viện Quốc Gia năm 2016 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Theo xu thị trường việc sử dụng thảo dược nguyên liệu có nguồn gốc thiên nhiên để chăm sóc sức khỏe người quan trọng mang lại nhiều lợi ích to lớn Trong vi tảo nguồn dinh dưỡng quan trọng cho động vật nuôi, nuôi trồng thủy sản, nguồn nguyên liệu cho phân bón, sản xuất nhiên liệu sinh học, bảo vệ môi trường đặc biệt dùng làm thực phẩm chức tăng cường dinh dưỡng cho người đánh giá ứng dụng quan trọng có triển vọng lớn Hàng năm giới sản suất khoảng 6000 vi tảo khô cho doanh thu 1,25 tỷ USD (Gross Pulz, 2004) Các sản phẩm thương mại dạng nguyên liệu dạng thành phẩm sản phẩm hãng Green Sun (Mỹ) Thành phần dinh dưỡng thương phẩm vi tảo công ty Green Growth (Mỹ) bào chế ứng dụng hỗ trợ điều trị bệnh mãn tính, đặc biệt ung thư (www.greengrowthnutri.com) Trong số loài vi tảo biển (VTB) tập trung nghiên cứu khai thác nay, sinh khối VTB Nannochloropsis oculata giàu axit béo eicosapentaenoic (C20:5 ω-3) - axit béo khơng bão hịa đa nối đơi thiết yếu cho người động vật nuôi, sử dụng rộng rãi làm thức ăn sống cho đối tượng nuôi trồng thủy sản giai đoạn ấu trùng khác nhau, làm thực phẩm chức năng, làm nhiên liệu sinh học…và đạt nhiều thành tựu khả quan Tuy nhiên Việt Nam, có nhiều cơng trình nghiên cứu VTB N oculata ứng dụng nhiều lĩnh vực khác kết nghiên cứu nhìn chung chưa mang tính hệ thống chủng giống chủ yếu nhập ngoại; chưa nuôi trồng qui mô lớn Việc làm sáng tỏ tính an tồn sinh khối tảo ni được; sử dụng sinh khối tảo giàu dịnh dưỡng làm viên thực phẩm chức bổ sung cho sức khỏe người; nghiên cứu tác dụng sinh học dược học sinh khối tảo Việt Nam hoàn toàn chưa có Vì vậy, nhằm nâng cao chất lượng giá trị sản phẩm thực phẩm chức từ VTB nói chung từ vi tảo N oculata phân lập từ vùng biển Việt Nam, tối ưu hóa điều kiện nuôi tảo hệ thống nuôi hở (HTNH) hệ thống ni kín (HTNK) tự thiết kế để đủ sinh khối để sản xuất viên nang thực phẩm chức có tác dụng bảo vệ sức khỏe, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học công nghệ nuôi vi tảo biển Nannochloropsis oculata (Droop) Hibberd sử dụng làm thực phẩm chức năng” Mục tiêu đề tài Tuyển chọn, sàng lọc, định tên khoa học nghiên cứu đặc điểm sinh học loài VTB thuộc chi Nannochloropsis; Chọn chủng/loài VTB thuộc chi Nannochloropsis có khả nhân nhanh sinh khối, nuôi trồng HTNK 20, 50, 100 L đủ tiêu chuẩn làm nguyên liệu cho sản xuất viên thực phẩm chức Nội dung nghiên cứu Tuyển chọn, sàng lọc nghiên cứu đặc điểm sinh học, thành phần dinh dưỡng chủng VTB N oculata điều kiện nhân nuôi HTNH Nghiên cứu sinh trưởng chủng N oculata QN1 HTNK kín 20, 50 100 L xây dựng quy trình thu hoạch, chế biến, bảo quản sinh khối chủng tảo Đánh giá tác động sinh học – dược lý, xây dựng tiêu chuẩn sở sinh khối tảo N oculata QN1 bào chế, xây dựng tiêu chuẩn sở viên thực phẩm chức thành phẩm Những đóng góp luận án Sàng lọc thành công dựa đặc điểm hình thái giải mã đoạn gen 18S rRNA xác định tên chủng N oculata QN1; Xây dựng thành cơng quy trình ni sinh khối chủng N oculata QN1 hệ thống ni kín dạng ống tự thiết kế (với điều kiện không sử dụng bơm dùng máy nén khí nâng bình chứa lên cao) có dung tích 50, 100 L đạt mật độ tế bào 245,13 ±3,96 246,31 ±4,21 x 106 TB/mL sau 15 ngày nuôi cấy Đã nghiên cứu độc tính cấp bán trường diễn, dược lý sinh khối VTB N oculata QN1 đạt tiêu chuẩn sản xuất thực phẩm chức Đã xây dựng tiêu chuấn sở cho nguyên liệu tảo dạng lỏng, nguyên liệu tảo dạng bột khô chủng QN1, tiêu chuẩn sở viên nang thực phẩm chức có chứa sinh khối chủng QN1 Cục An tồn Thực phẩm – Bộ Y tế cấp phép Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án Kết nghiên cứu thu Luận án sở khoa học để nghiên cứu sâu đặc điểm sinh học chủng N oculata QN1 phân lập từ vùng biển Quảng Ninh bổ sung sở liệu cho tập đồn giống VTB có nguồn gốc Việt Nam; cung cấp số liệu khoa học cho phép làm chủ quy trình nhân ni chủng QN1 điều kiện phịng thí nghiệm, khả sử dụng hệ thống ni kín tự thiết kế 20, 50 100 L để cung cấp sinh khối làm nguyên liệu sản xuất viên thực phẩm chức đạt tiêu chuẩn sở, có tác dụng dược lý - sinh học tốt Các kết Luận án có ý nghĩa thực tiễn sở sản xuất sinh khối tảo làm chủ quy trình ni, thu sinh khối bảo quản sinh khối tảo đạt chất lượng làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức Bố cục luận án Luận án gồm 147 trang, phần mở đầu trang, tổng quan tài liệu 27 trang, vật liệu phương pháp nghiên cứu 24 trang, kết thảo luận 90 trang, kết luận kiến nghị trang, danh mục cơng trình cơng bố trang, tài liệu tham khảo 12 trang với 130 tài liệu tham khảo Trong luận án có 43 Bảng 74 Hình CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU Trong tự nhiên, vi tảo thành phần chuỗi thức ăn thủy vực Chúng coi nguồn thực phẩm quan trọng cho người động vật, cung cấp protein, lipit, axit béo khơng bão hịa đa nối đôi (PUFAs - Polyunsaturated fatty acids) EPA (axit eicosapentaenoic, C20:5 ω-3), DHA (axit docosahexaenoic, C22:6 ω − 3); nguyên liệu cho sản xuất nhiên liệu sinh học, cung cấp chất có hoạt tính sinh học dùng làm thuốc, mỹ phẩm dược phẩm, nguồn phân bón sinh học Gần đây, sinh khối tảo sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức VTB N oculata có kích thước nhỏ, dao động từ 2-4 μm, khơng có roi, màu xanh, phân bố rộng nước ngọt, lợ mặn (Hu Gao, 2003) N oculata giàu axit béo bão hịa khơng bão hịa đa nối đơi, chủ yếu EPA với hàm lượng dao động khoảng 20-29,9 % so với axit béo tổng số, tùy theo điều kiện nuôi cấy pha sinh trưởng tế bào (Pal cs., 2011; Chen cs., 2013) EPA chứng minh có vai trị quan trọng việc tăng cường sức đề kháng phòng tránh bệnh cho người động vật EPA giúp chống suy nhược thể (Babcock cs., 2000), ngăn chặn tình trạng máu nhiễm mỡ, chống bệnh tim mạch, xơ vữa động mạch, làm giảm viêm nhiễm (Nordoy, 1991; Gill Valivety, 1997) EPA thành phần quan trọng nhiều loại thực phẩm thuốc hỗ trợ phát triển trí não trẻ em chống bệnh suy giảm trí nhớ người già Theo Senzaki cs., (1998); Bonaa cs., (1992), EPA giúp kháng ung bướu xem yếu tố hỗ trợ phịng ngừa điều trị ung thư Chính vậy, nhu cầu sử dụng sinh khối VTB N oculata sạch, đạt tiêu chuẩn làm nguyên liệu sử dụng lĩnh vực dược phẩm mỹ phẩm ngày tăng Hiện nay, nhu cầu sử dụng sinh khối tảo N oculata sạch, đáp ứng tiêu chuẩn làm nguyên liệu cho sản xuất thuốc thực phẩm chức ngày cao Vì vậy, giải pháp ni tảo hệ thống ni kín triển khai, nhằm mục đích nâng cao hiệu ni trồng chất lượng sinh khối tảo Trên giới, nuôi tảo N oculata hệ thống ni kín tiến hành phổ biến (Briassoulis cs., 2010; Feng cs., 2011) Tuy nhiên, Việt Nam việc nuôi tảo N oculata hệ thống ni kín triển khai với mục đích chủ yếu cung cấp giống nhân nuôi ban đầu cho hệ thống nuôi hở, làm thức ăn sống cho đối tượng nuôi trồng thủy sản (Đặng Tố Vân Cầm cs., 2013; Ngơ Thị Hồi Thu, 2015) Các nghiên cứu sử dụng hệ thống ni kín để ni VTB cung cấp ngun liệu cho sản xuất thực phẩm chức khơng có chưa có tính hệ thống Chính vậy, nhằm nâng cao chất lượng giá trị sản phẩm chức từ VTB nói chung từ vi tảo N oculata để phục vụ cho sức khỏe cộng động hướng nghiên cứu phân lập N oculata từ vùng biển Việt Nam, tìm điều kiện nhân ni tảo hệ thống ni hở kín tự thiết kế để sản xuất viên nang thực phẩm chức cần thiết Ngoài ra, sinh khối tảo cần phải kiểm tra theo quy định an toàn thực phẩm kiểm nghiệm tiêu quan trọng ảnh hưởng đến sức khỏe người; cần phải tiến hành nghiên cứu tác dụng dược lý- sinh học sinh khối tảo nêu đến sức khỏe người thông qua đánh giá tác động sinh khối tảo lên hành vi động vật thực nghiệm đánh giá chất lượng viên nang tảo thành phẩm dùng làm thực phẩm chức CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Các chủng giống Nannochloropsis spp QN1, NT1, NT2, NT3, NT4 NT5 phân lập Quảng Ninh, Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa năm 2009 thuộc sưu tập VTB Phịng Cơng nghệ Tảo, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH CN Việt Nam cung cấp Các mẫu lưu giữ nuôi cấy ổn định điều kiện phịng thí nghiệm, lưu giữ môi trường lỏng, thạch cung cấp giống để thực nội dung nghiên cứu luận án; Chuột nhắt trắng giống Swiss 18 – 20 g/con Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương cung cấp Hai giống thỏ trắng (đực cái) cân nặng từ 2,0 đến 2,5 kg/con Bộ phận chăn nuôi G1 Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương cung cấp để nghiên cứu, đánh giá độc tính sinh khối tảo mơ hình động vật thực nghiệm Chuột nhắt trắng, giống đực, khỏe mạnh 10 – 12 tuần tuổi, trọng lượng 20 – 30 g/con, Ban chăn nuôi động vật Học viện Quân y cung cấp để tiến hành thử nghiệm đánh giá tính an tồn dược lý sinh khối vi tảo Trình tự cặp mồi nhân đoạn gen 18S rRNA với kích thước khoảng 1100 bp Phịng Cơng nghệ Tảo, Viện CNSH thiết kế sử dụng với Primer F: 5’TACCACATCTAAGGAAGGCAGCAG-3’ (24nu) Primer R: 5’GGCATCACAGACCTGTTATTGC-3’ (22 nu) 2.2 Hóa chất Các hóa chất sử dụng nghiên cứu thơng dụng phịng thí nghiệm, đạt độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu Việt Nam, Trung Quốc Mỹ cung cấp 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Chụp ảnh hình thái tế bào kính hiển vi quang học (Light Microcope) kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscope –SEM); cố định mẫu glutaradehyde trước chụp ảnh kính JEOL, JSM-6400 (Nhật Bản) 2.3.2 Các phương pháp sinh học phân tử: đọc so sánh trình tự nucleotide đoạn gen 18S rRNA chủng Nannochloropsis sp QN1 tiềm tiến hành theo Sambrook Rusell, (2001) Các chương trình phần mềm chuyên dụng DNA Club, ClustalX 1.83, DNASTAR, MEGA4 BLAST sử dụng cho phân tích, so sánh xây dựng phát sinh chủng loại chủng Nannochloropsis sp QN1 nghiên cứu 2.3.3 Khảo sát điều kiện nhân nuôi N oculata QN1 quy mơ phịng thí nghiệm: nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng (với ba môi trường Walne, F/2 Erd), nồng độ muối (dao động từ – 60 ‰), nhiệt độ (15 – 40 C), ánh sáng (60 - 800 mol/m2/s), pH (3 - 11), mật độ tế bào (MĐTB) ban đầu (7, 11, 13 15 triệu TB/mL), tỉ lệ CO2 (với nồng độ 1, 2, 5, 10 15 % v/v) lên sinh trưởng phát triển chủng QN1 2.3.4 Khảo sát điều kiện nhân nuôi chủng QN1 HTNK 20, 50 100 L: nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng (F/2, Erd Walne), nồng độ muối (từ 20- 40 ‰), nhiệt độ (25-28 0C 35 0C), ánh sáng trắng với CĐAS 100 mol/m2s, pH (từ đến 9), tỉ lệ CO2 (2 % v/v) với MĐTB ban đầu (1025 triệu TB/mL) lên sinh trưởng chủng QN1 HTNK nói 2.3.5 Xác định sinh trưởng chủng QN1: đo mật độ quang bước sóng 680nm, đếm mật độ tế bào (MĐTB) sử dụng buồng đếm Burker-Turk (Đức), xác định tốc độ sinh trưởng đặc trưng (Guillard Sieracki, 2005) sinh khối khô (sấy 105 C), hàm lượng chlorophyll a carotenoit, xác định kích thước tế bào phần mềm MapInfo Professional 7.5 2.3.6 Phân tích thành phần hàm lượng dinh dưỡng, kim loại nặng, lipit tổng số axít béo sinh khối chủng QN1 - Xác định hàm lượng lipit sinh khối tảo: theo phương pháp Bligh Dyer, (1959) có số cải tiến cho phù hợp với điều kiện Việt Nam - Thành phần hàm lượng axít béo sinh khối QN1: xác định máy sắc kí khí HP-6890 theo mơ tả Đặng Diễm Hồng cs., (2007) - Phân tích thành phần dinh dưỡng kim loại nặng chủng QN1: tiến hành theo Horwitz, (2000) 2.3.7 Nghiên cứu quy trình thu hoạch sinh khối chủng QN1: sử dụng kỹ thuật làm lắng (sử dụng chất trợ lắng Al2 (SO4)3.18H2O; phèn nhôm kali sulfate dạng muối kép: KAl (SO4)2.12H2O FeCl3; kỹ thuật ly tâm sinh khối tảo sau thu hoạch kiểm tra đánh giá đánh giá hàm lượng lipit EPA, protein, cacbohydrate, chlorophyll a, carotenoit kim loại nặng 2.3.8 Nghiên cứu quy trình chế biến bảo quản sinh khối chủng QN1: sinh khối tảo sau thu hoạch chất tạo kết sấy khô theo phương pháp khác (sấy phun, sấy đông khô, sấy tủ sấy nhiệt, phơi khô) Đánh giá ảnh hưởng phương pháp sấy qua độ ẩm biến đổi thành phần dinh dưỡng tảo trình chế biến bảo quản Sinh khối tảo khơ có mức hàm ẩm khác bảo quản túi nilon dán kín điều kiện bảo quản khác Đánh giá độ ổn định vi tảo q trình bảo quản thơng qua theo dõi biến đổi thành phần dinh dưỡng tảo lipit, protein, cacbohydrat, hàm lượng EPA… 2.3.9 Nghiên cứu độc tính cấp độc tính bán trường diễn sinh khối vi tảo N oculata QN1: tiến hành thử độc tính sinh khối tảo khơ N oculata QN1 theo Quy chế đánh giá tính an tồn hiệu lực thuốc cổ truyền Bộ Y tế (Bộ Y tế, 1996) Các thử nghiệm tiến hành gồm thử độc tính cấp chuột nhắt trắng độc tính bán trường diễn thỏ theo hướng dẫn hành (Đỗ Trung Đàm, 1996; WHO, 2000; OECD, 2001; OEDC, 2008) 2.3.10 Nghiên cứu tác động dược lý sinh khối tảo N oculata QN1 lên động vật thực nghiệm: thông qua tập môi trường mở; tập mê lộ chữ Y; tập nhận thức đồ vật 2.3.11 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn sở sinh khối tảo QN1 làm nguyên liệu cho sản xuất viên thực phẩm chức năng: + Với tiêu có phương pháp kiểm tra quy định tiêu chuẩn ngành, dược điển nước: áp dụng kiểm tra mẫu thử + Với tiêu chưa có sẵn phương pháp: dựa tính chất hoạt chất cần kiểm tra phương tiện phân tích sẵn có để đề xuất phương pháp kiểm tra Phương pháp đề xuất hiệu lực hóa phép thử độ đặc hiệu (định tính) độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ xác (định lượng) 2.3.12 Nghiên cứu công thức bào chế, xây dựng tiêu chuẩn thành phẩm sản xuất thử nghiệm viên nang chứa thành phẩm vi tảo N oculata QN1: + Dựa công dụng, tác dụng dược liệu để đưa công thức viên dạng bào chế + Dựa tính chất hóa lý thành phần hoạt chất tá dược để lựa chọn phương pháp bào chế công thức bào chế phù hợp Đánh giá phù hợp lựa chọn thông qua khả tạo hạt, làm viên độ ổn định chế phẩm trình bào chế + Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng hiệu lực hóa phương pháp kiểm tra chất lượng mơ tả mục “Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn sở”, áp dụng với thành phẩm viên nang vi tảo 2.3.12 Xử lý số liệu Số liệu thu thập xử lý phần mềm Excel So sánh thống kê thực qua phân tích one-way ANOVA với giá trị P0,05) Kết nghiên cứu thu cho thấy sinh khối vi tảo N oculata QN1 không ảnh hưởng đặc biệt lên mức tăng KLCT giống chuột (đực/cái) Bảng 3.5 Ảnh hƣởng sinh khối N oculata QN1 đến mức tăng KLCT chuột thử nghiệm theo giống (đực/cái) Liều (gam/kg KLCT Tỷ lệ tăng (%) Pnhóm Nhóm chuột) Chuột đực Chuột 0,0 32,0±0,8 29,7±1,0 0,41 (>0,05) 15,0 31,8±0,7 32,5±0,8 0,47 (>0,05) 20,0 30,7±0,8 33,1±0,7 0,45 (>0,05) 25,0 29,6±0,7 28,9±0,8 0,27 (>0,05) 30,0 31,3±1.1 32,4±1,1 0,66 (>0,05) 31,1±0,9 31,3±1,7 TB Ptổng 0,81 (> 0,05) Kết nghiên cứu trình bày Bảng 3.4 3.5 cho thấy chuột nhắt trắng uống với mức liều từ 15,0 – 30,0 g sinh khối vi tảo N oculata QN1/kg khối lượng thể chuột không ảnh hưởng đến thể trạng, hoạt động chuột Chuột thử nghiệm khỏe mạnh, tăng cân Như vậy, kiện thí nghiệm không phát thấy giá trị LD50 sinh khối vi tảo N oculata cho chuột uống đến liều 30 g/kg KLCT chuột hồn tồn an tồn, khơng gây chết động vật thí nghiệm thử nghiệm gây độc cấp tính Theo phân loại độc tính Hệ thống phân loại hóa chất hợp chất toàn cầu GHS (Globally Harmonised System for Classification of Chemical substances and Mixtures), chất có LD50 >5g/kg khối lượng thể coi chất không độc Điều cho thấy bột tảo khô N oculata QN1 với liều uống đến 30g/kg khối lượng thể chuột sản phẩm không độc 3.3.1.2 Kết đánh giá độc tính bán trƣờng diễn *Ảnh hưởng sinh khối vi tảo N oculata QN1 đến tình trạng chung khối lượng thể thỏ Kết nghiên cứu trình bày Bảng 3.6 cho thấy sinh khối chủng QN1 mức liều nghiên cứu 1,2 3,0 g/kg KLCT thỏ/ngày không gây ảnh hưởng tới thể trạng thỏ thí nghiệm sau uống liên tục 28 ngày Bảng 3.6 Kết theo dõi khối lƣợng thể thỏ trƣớc sau uống sinh khối N oculata QN1 Kết cân nặng (kg) Nhóm (n=7) P Trƣớc Sau Sau Sau Sau TN (m0) tuần (m1) tuần (m2) tuần(m3) tuần (m4) Đối chứng (C) 2,09±0,11 2,13±0,16 2,16±0,16 2,16±0,14 2,24±0,15 % so với trước thử nghiệm Thử nghiệm – Ptrước-sau=0,044 1,91% 3,34% 3,34% 7,18% 2,10±0,13 2,16±0,14 2,19±0,15 2,23±0,14 2,27±0,15 Ptrước-sau=0,026 1,2 g/kg thỏ (T1) % so với trước thử nghiệm Thử nghiệm – Ptrước (T1-C)=0,408 2,86% 4,29% 6,19% 8,09% 2,12±0,12 2,13±0,10 2,18±0,13 2,20±0,13 2,28±0,13 Ptrước-sau=0,045 3,0 g/kg thỏ (T2) % so với trước thử nghiệm Psau (T1-C)=0,606 Ptrước (T2-C)=0,644 0,47% 2,83% 3,77% 7,55% Psau (T2-C)=0,501 Ghi chú: Ptrước-sau: So sánh KLCT thỏ thời điểm trước sau uống 28 ngày nhóm Ptrước (C-T): Khi so sánh KLCT thỏ nhóm chứng nhóm thử thời điểm trước uống Psau (C-T): Khi so sánh KLCT thỏ nhóm đối chứng nhóm thử nghiệm thời điểm sau uống 28 ngày *Ảnh hưởng sinh khối vi tảo N oculata QN1 đến chức tạo máu thỏ Kết phân tích số huyết học thỏ thử nghiệm thời điểm sau uống sinh khối vi tảo N oculata QN1 nhóm đối chứng nhóm thử T1 T2 trình bày Bảng 3.7 Kết nghiên cứu thu cho thấy khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê sinh học thông số huyết học trước (t0) sau 14 (t1) 28 (t2) ngày thử nghiệm nhóm uống chế phẩm T1 T2 Nếu so sánh thời điểm xét nghiệm (t1 t2) nhóm đối chứng nhóm thử nghiệm, kết thu cho thấy khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê sinh học số huyết học thỏ (PC-T1, PC-T2 thời điểm t1, t2 > 0,05) Bảng 3.7 Kết phân tích số huyết học thỏ thử nghiệm thời điểm t0, t1, t2 Chỉ tiêu n Hồng cầu (x 1012/ Lit) Bạch cầu (x 109/ Lit) Thời điểm Nhóm đối chứng Nhóm thử T1 t0 6,1 ± 0,3 6,0 ± 0,6 5,9± 0,4 t1 5,9 ± 0,6 6,2 ± 0,3 6,0± 0,8 t2 5,8 ± 0,5 5,9± 0,7 6,1 ± 0,7 Ptrước-sau >0,05 > 0,05 > 0,05 t0 9,1 ± 1,3 8,6 ± 1,4 9,0 ± 0,9 t1 8.7 ± 1,4 9,0 ± 1,5 9,4 ± 1,1 t2 9,2 ± 1,4 9,1 ± 2,3 9,5 ± 1,1 Ptrước-sau >0,05 > 0,05 > 0,05 PCT1 Nhóm thử T2 t0 391,7 ± 76,9 439,4 ± 88,7 444,9 ± 73,9 >0,05 >0,05 Tiểu cầu (x 109/ Lit) t1 430,1± 68,6 427,0 ± 54,3 468 ± 78,1 t2 426,1± 55,2 432,4± 63,2 453,5 ± 77,5 Ptrước-sau >0,05 > 0,05 > 0,05 t0 36,3 ± 2,5 37,7 ± 1,5 37,3 ± 2,1 t1 34,9± 2,4 35,3 ± 3,5 35,6 ± 3,7 t2 35,1± 2,8 36,5 ± 2,7 34,6± 3,1 Ptrước-sau >0,05 > 0,05 > 0,05 t0 11,3 ± 0,9 10,6 ± 1,4 11,2 ± 0,4 t1 10,9 ± 0,8 11,0 ± 0,3 10,3± 0,8 Hematocrit (%) Hemoglobi n PC-T2 (g/dL) t2 10,4 ± 0,8 10,0 ± 1,1 10,7 ± 0,6 Ptrước-sau >0,05 > 0,05 > 0,05 Ghi chú: - t0: Thời điểm trước thử nghiệm; t1: Thời điểm sau 14 ngày uống sinh khối vi tảo; t2: Thời điểm sau 28 ngày uống sinh khối vi tảo; P C-T: So sánh nhóm chứng nhóm thử thời điểm; Ptrước-sau: So sánh trưóc sau thử nghiệm nhóm; T1: nhóm thỏ uống 1,2 g/kg KLCT; T2: nhóm thỏ uống 3,0 g/kg KLCT Kết thực nghiệm thu Bảng 3.7 cho thấy mức liều cao 3,0 g sinh khối vi tảo N oculata QN1/kg khối lượng thể thỏ không gây ảnh hưởng đến chức tạo máu thỏ *Ảnh hưởng sinh khối vi tảo N oculata QN1 đến chức gan thỏ thí nghiệm Ảnh hưởng sinh khối vi tảo N oculata QN1 lên chức gan thỏ trình bày Bảng 3.8 Kết trước thí nghiệm thu cho thấy, số sinh hóa thỏ nhóm thử (T1 T2) nhóm đối chứng khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê sinh học (PC-T1, PC-T2, thời điểm t0 > 0,05) Sau 14 28 ngày thí nghiệm khơng nhận thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê sinh học nhóm đối chứng nhóm thử T1 T2 số sinh hóa (PC-T1, PC-T2 , thời điểm t1, t2 > 0,05) Ngồi ra, chúng tơi khơng thấy có khác biệt có ý nghĩa thống kê sinh học so sánh thơng số nhóm thử thời điểm xét nghiệm so với trước uống (P > 0,05) Bảng 3.8 Kết phân tích số số sinh hóa liên quan đến chức gan thỏ thời điểm t0, t1, t2 Chỉ tiêu SGOT n (U/ Lit) SGPT (IU/ Lit) Bilirubin tồn phần Thời điểm Nhóm đối chứng Nhóm T1 t0 20,9 ± 3,4 22,1 ± 3,1 20,3 ± 2,0 t1 22,7 ± 5,6 20,9 ± 4,2 19,4 ± 6,5 t2 22,0 ± 4,6 23,7 ± 2,8 21,6 ± 1,7 Ptrước-sau > 0,05 > 0,05 > 0,05 t0 38,3 ± 4,8 40,0 ± 4,3 t1 40,4 ± 4,0 42,6 ± 3,6 43,7 ± 5,1 t2 39,9 ± 2,4 41,1 ± 3,9 40,1 ± 4,4 Ptrước-sau > 0,05 > 0,05 > 0,05 t0 16,9 ± 1,3 17,2 ± 1,6 17,9 ± 0,8 t1 17,6 ± 1,9 18,4 ± 1,7 19,2 ± 1,2 PC-T1 Nhóm T2 PC-T2 40,7 ± 2,0 > 0,05 > 0,05 (μmol/Lit) Protein toàn t2 18,6 ± 1,8 17,9 ± 1,6 19,1 ± 0,9 Ptrước-sau > 0,05 > 0,05 > 0,05 t0 60,7 ± 3,1 59,7 ± 4,3 60,7 ± 2,2 t1 59,0 ± 2,0 61,3 ± 3,8 62,7 ± 4,4 t2 60,4 ± 2,1 60,1 ± 1,6 59,9 ± 1,2 Ptrước-sau > 0,05 > 0,05 > 0,05 phần (g/L) Ghi chú: - t0: Thời điểm trước thử nghiệm; t1: Thời điểm sau 14 ngày uống sinh khối vi tảo; t2: Thời điểm sau 28 ngày uống sinh khối vi tảo; P C-T: So sánh nhóm chứng nhóm thử thời điểm; Ptrước-sau: So sánh trưóc sau thử nghiệm nhóm; T1: nhóm thỏ uống 1,2 g/kg khối lượng thể; T2: nhóm thỏ uống 3,0 g/kg khối lượng thể Như vậy, khẳng định mức liều 3,0 g sinh khối vi tảo N oculata QN1/kg khối lượng thể thỏ/ngày nghiên cứu không ảnh hưởng đến chức gan thỏ thử nghiệm Ảnh hưởng sinh khối vi tảo N oculata QN1 đến chức thận thỏ thử nghiệm Ảnh hưởng sinh khối vi tảo N oculata đến chức thận thỏ thử nghiệm trình bày Bảng 3.9 Kết trình bày Bảng 3.9 cho thấy khơng có khác có ý nghĩa thống kê số creatinin urea huyết nhóm đối chứng nhóm uống sinh khối tảo nhóm thử T1 T2 tất thời điểm nghiên cứu nhóm thử (P> 0,05) Bảng 3.9 Kết phân tích số số sinh hóa liên quan đến chức thận thỏ thời điểm t0, t1 t2 Chỉ tiêu Creatinin (μmol/Lit) Urea (mmol/Lit) Nhóm đối chứng Nhóm T1 t0 102,4 ± 9,9 95,6 ± 7,3 96,4 ± 11,7 t1 98,1 ± 8,9 97,3 ± 8,6 100,7 ± 11,3 t2 97,1 ± 10,5 94,9 ± 8,2 97,7 ± 13,6 Ptrước-sau > 0,05 > 0,05 > 0,05 t0 6,2 ± 0,9 5,9 ± 0,7 6,1 ± 0,5 t1 6,0 ± 1,1 6,1 ± 0,6 t2 6,4 ± 1,4 6,0 ± 1,0 6,1 ± 0,8 Ptrước-sau > 0,05 > 0,05 > 0,05 n 7 PC-T1 > 0,05 Nhóm T2 6,2± 1,3 PC-T2 > 0,05 Ghi chú: T1: nhóm thỏ uống 1,2 g/kg khối lượng thể; T2: nhóm thỏ uống 3,0 g/kg khối lượng thể; t0: Thời điểm trước thử nghiệm; t1: Thời điểm sau 14 ngày uống sinh khối vi tảo; t2: Thời điểm sau 28 ngày uống sinh khối vi tảo; P C-T: So sánh nhóm chứng nhóm thử thời điểm; Ptrước-sau: So sánh trưóc sau thử nghiệm nhóm Như vậy, với mức liều uống 3,0 g sinh khối tảo/kg khối lượng thể thỏ/ngày không gây ảnh hưởng đến chức thận thỏ sử dụng thí nghiệm chúng tơi Ảnh hưởng sinh khối vi tảo N oculata QN1 tới thay đổi mô bệnh học gan, thận thỏ thí nghiệm Ảnh hưởng sinh khối vi tảo N oculata QN1 lên thay đổi mô bệnh học gan, thận thỏ thí nghiệm xác định nhờ giải phẫu mô bệnh quan sát tổng quát đại thể vi thể tổ chức mơ kính hiển vi Sau kết thúc thời gian cho thỏ uống sinh khối vi tảo với mức liều 1,2 3,0 g/kg KLCT thỏ/ngày (kéo dài liên tục 28 ngày), lấy ngẫu nhiên mẫu gan thận thỏ nhóm để làm tiêu bản, quan sát đại vi thể Bộ môn Giải phẫu sinh lý bệnhTrường Đại học Y Hà Nội Kết nghiên cứu trình bày Hình 3.6 Như vậy, sinh khối vi tảo biển N oculata QN1 h ng g độc tính cấp d thử mức liều cao tối đa so với thể tích dà chuột g g hối lượng thể chuột) chuột thực nghiệm Chúng không phát thấy giá trị LD50 tất liều 15, 20, 25 30 g/kg khối lượng thể chuột nghiên cứu Điều cho thấy bột tảo khô N oculata QN1 với liều uống đến 30 g/kg khối lượng thể chuột sản phẩm h ng độc Kết nghiên cứu độc tính bán trường diễn sinh khối vi tảo N oculata QN1 mức liều uống 1,2 3,0 g/kg khối lượng thể thỏ/ngày 28 ngày liên tục cho thấy sinh khối tảo h ng ảnh hưởng đến thể trạng; hoạt động thỏ thử nghiệm; không ảnh hưởng đến chức tạo máu; chức mô học gan thận thỏ thử nghiệm so với l đối chứng Sinh khối vi tảo N oculata QN1 hoàn toàn an toàn sử dụng cho động vật Lô đối chứng (C1) Lơ thí nghiệm (T1) Gan thỏ C1.1: Nhu mơ gan Gan thỏ T1.1: Các tế bào xung huyết nhẹ Nhuộm HE gan thối hóa nhẹ HE x 400 x 100 Thận thỏ C1.1: Nhu mô thận xung huyết nhẹ Nhuộm HE x 100 Thận thỏ T1.1: Cầu thận sung huyết nhẹ HE x 100 Lơ thí nghiệm (T2) Gan thỏ T2.1: Tế bào gan thối hóa nhẹ Nhuộm HE x 400 Thận thỏ T2.1: Các ống thận sung huyết nhẹ HE x 100 Ghi : Lô thử nghiệm T1: nhóm thỏ uống 1,2 g/kg khối lượng thể; T2: nhóm thỏ uống 3,0g/kg khối lượng thể Hình 3.6 Ảnh sinh thiết tế bào gan, thận lơ thỏ đối chứng lơ thỏ thí nghiệm 3.3.1.3 Nghiên cứu đánh giá hành vi chuột thực nghiệm sử dụng sinh khối tảo N oculata QN1 Kết nghiên cứu môi trường mở Kết số chuột tập môi trường mở thể Hình 3.7, 3.8 3.9 Hình 3.7: Qng đƣờng chuột vận động mơi trƣờng mở Hình 3.8: Tốc độ trung bình chuột vận động mơi trƣờng mở Hình 3.9: Qng đƣờng chuột vận động môi trƣờng mở Chúng nhận thấy số quãng đường vận động, tốc độ vận động trung bình thời gian vùng trung tâm chuột nhóm khơng có khác biệt Điều chứng tỏ uống dung dịch vi tảo N oculata QN1 (liều 4,8 g 12 g/kg KLCT chuột) không ảnh hưởng đến chức vận động khả khám phá chuột Nghiên cứu tập nhận thức đồ vật Kết thời gian tần suất chuột khám phá hai đồ vật giống ngày thứ tập thể Hình 3.10 3.11 (giây ) (lần) Hình 3.10: Thời gian chuột phám phá hai đồ vật giống Hình 3.11 Tần suất chuột phám phá hai đồ vật giống Kết nghiên cứu trình bày Hình 3.10 3.11 cho thấy thời gian tần suất chuột khám phá hai đồ vật giống hệt ngày tập thứ hai tập khơng có khác biệt vật A vật B nhóm Đồng thời so sánh thời gian tần suất khám phá hai đồ vật nhóm (nhóm chứng, nhóm 4,8 g/kg 12 g/kg) khơng thấy có khác biệt Kết cho thấy chuột uống dung dịch NaCl 0,9% vi tảo hai liều khác (4,8 g/kg 12 g/kg) có kết tương tự ngày tập thứ tập Hình 3.12 Thời gian chuột phám phá đồ vật cũ (vật A) đồ vật (vật B) Hình 3.13 Tần suất chuột phám phá đồ vật cũ (vật A) đồ vật (vật B) Kết thời gian tần suất chuột khám phá đồ vật cũ (vật A) vật (vật B) ngày thứ tập thể Hình 3.12 3.13 Kết cho thấy thời gian tần suất chuột khám phá vật cũ (vật A) vật (vật B) có khác biệt hai đồ vật nhóm Ở nhóm chuột thí nghiệm có xu hướng sử dụng nhiều thời gian tần suất khám phá vật khám phá vật quen thuộc (vật cũ) Đồng thời so sánh thời gian tần suất khám phá hai đồ vật nhóm (nhóm chứng, nhóm 4,8 12 g/kg) cho thấy hai nhóm chứng nhóm 4,8 g/kg khơng thấy có khác biệt Tuy nhiên chuột nhóm 12 g/kg có xu hướng khám phá vật nhiều (cả thời gian tần suất) so với nhóm cịn lại Kết cho thấy chuột uống dung dịch NaCl 0,9 % tảo liều 4,8 g/kg có kết tương tự nhau, chuột uống tảo liều 12 g/kg có xu hướng khám phá vật nhiều so với nhóm cịn lại ngày tập thứ tập Các kết nghiên cứu thu cho thấy giai đoạn luyện tập, khơng có khác biệt đáng kể tổng thời gian dành khám phá hai đồ vật giống hệt tất nhóm, vậy, khả nhận thức đối tượng thuộc nhóm khác tương đương Trong giai đoạn kiểm tra, chuột nhóm giành nhiều thời gian khám phá đồ vật so với vật cũ, chuột thuộc nhóm 12 g/kg có thời gian dài so với hai nhóm cịn lại Kết cho thấy uống dung dịch tảo (liều 12 g/kg) tuần làm tăng cường trí nhớ chuột, liều uống g/kg khơng thấy khác biệt so với nhóm chứng Hiện nay, số nhóm nghiên sử dụng phương pháp nghiên cứu tương tự để đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ số dược liệu Ptychopetalum olacoides (Götz Ittner, 2008), Acanthopanax (Bartolini cs., 2006) Trifoliatus, Lycium barbarum (Chang So, 2008) Kết nghiên cứu mê lộ chữ Y Kết nghiên cứu số chuột tập mê lộ chữ Y thể Hình 3.14 3.15 Kết cho thấy phần trăm luân phiên chuột vào cánh liên tiếp mê lộ có tổng số lần chuột vào cánh mê lộ chữ Y tương đương nhóm chuột thí nghiệm (lần) Hình 3.14 Tổng số lần chuột vào cánh mê lộ (%) Hình 3.15 Phần trăm luân phiên chuột vào cánh liên tiếp mê lộ Các kết nghiên cứu vận động, khả nhận thức trí nhớ chuột sử dụng dung dịch vi tảo N oculata QN1 cho thấy liều uống 4,8 12g/kg khối lượng thể không ảnh hưởng đến chức vận động tăng khả khám phá giúp tăng cường trí nhớ chuột uống với liều 12 g sinh khối vi tảo/kg khối lượng thể chuột sau tuần 3.3.2 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho sản phẩm vi tảo N oculata đảm bảo tiêu chuẩn thực phẩm chức 3.3.2.1 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho sản phẩm vi tảo N oculata QN1 dạng lỏng đảm bảo tiêu chuẩn thực phẩm chức Các phương pháp đề xuất để phân tích tiêu mẫu sinh khối vi tảo tươi N oculata QN1 đạt yêu cầu phân tích theo AOAC sử dụng để kiểm tra/kiểm sốt chất lượng mẫu sinh khối vi tảo tươi N oculata QN1 Các kết phân tích cho thấy mẫu vi tảo tươi dùng thử nghiệm đạt yêu cầu tiêu lý hóa, tiêu hàm lượng kim loại nặng, tiêu vi sinh theo yêu cầu tiêu chất lượng dự kiến Nguyên liệu Cục An toàn Thực phẩm – Bộ Y tế cấp phép lưu hành theo chứng nhận tiêu chuẩn cho tảo tươi số 13781/2013/ATTP – XNCB, ngày có hiệu lực 18/7/2013 3.3.2.2 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho sản phẩm vi tảo N oculata QN1 dạng h đảm bảo tiêu chuẩn thực phẩm chức Các phương pháp đề xuất đạt u cầu phân tích sử dụng để kiểm tra/kiểm soát chất lượng sản phẩm sinh khối tảo khô N oculata QN1 Các kết phân tích mẫu vi tảo khơ N oculata QN1 cho thấy mẫu vi tảo khô đạt yêu cầu tiêu lý hóa, tiêu hàm lượng kim loại nặng, tiêu vi sinh theo yêu cầu theo dự kiến Nguyên liệu Cục An toàn Thực phẩm – Bộ Y tế cấp phép lưu hành theo chứng nhận tiêu chuẩn cho bột tảo khô 12553/2013/ATTP – XNCB, ngày có hiệu lực 05/7/2013 3.3.2.3 Nghiên cứu bào chế sản xuất viên nang thực phẩm chức chứa vi tảo N oculata QN1 Nghiên cứu công thức bào chế viên nén viên nang chứa thành phẩm vi tảo khô N oculata QN1 đạt tiêu chuẩn thực phẩm chức Để tăng cường chức tác dụng hiệu sử dụng vi tảo N oculata QN1, nghiên cứu bổ sung thêm số thành phần hoạt chất vi chất dinh dưỡng phù hợp hỗ trợ cho tác dụng tảo N oculata QN1 bao gồm: Nhàu, Hoàng kỳ, Taurin, Immune gamma, Vitamin B1, Vitamin B5, Vitamin B6, vitamin B3, Axit Folic Dựa công dụng dược liệu vitamin trên, đề xuất công thức sản phẩm viên tảo N oculata QN1 (Bảng 3.10) sau: Bảng 3.10: Công thức sản phẩm viên tảo N oculata QN1 Hàm lƣợng Thành phần Vi tảo Nannochloropsis oculata QN1 50mg Cao Hoàng kỳ (Radix Astragali) 50mg Cao nhàu (Fructus Morindae citrifoliae) 50mg Taurine 50mg ImmuneGamma 50mg Vitamin PP 5,0mg Vitamin B5 2,0mg Vitamin B1 0,5mg Vitamin B6 0,5mg Axít Folic 0,15mg 3.3.2.4 X dựng tiêu chuẩn chất lượng viên nang thành phẩm Các kết phân tích mẫu viên nang tảo cho thấy mẫu viên tảo đạt yêu cầu tiêu lý hóa, tiêu hàm lượng kim loại nặng, tiêu định tính, định lương tiêu vi sinh theo yêu cầu tiêu chuẩn sở công bố (Bảng 3.11) Bảng 3.11 Kết phân tích tiêu chuẩn sở viên nang thành phẩm STT Tên tiêu Kết đánh giá Mức độ đạt yêu cầu Đạt Hình thức Viên nang cứng, màu xanh tảo Cốm nang màu nâu vàng, có mùi đặc trưng Độ đồng khối lượng 613mg – 693mg/viên Đạt Độ rã 12 – 15 phút, đạt Đạt Vi tảo dạng đơn bào, màu Định tính N.oculata QN1 xanh lục, tế bào dạng hình cầu hình trứng đặc trưng Đạt Định tính Nhàu Dương tính Đạt Định tính Hồng kỳ Dương tính Đạt Định tính Immune Gamma Đặc hiệu Immune Gamma Đạt Định lượng vitamin B1 0,46 ± 0,005mg/viên Đạt Định lượng vitamin B6 0,46 ± 0,008mg/viên Đạt 10 Định lượng vitamin PP 4,57 ± 0,058mg/viên Đạt 11 Định lượng vitamin B5 1,93 ± 0.014mg/viên Đạt 12 Định lượng axit Folic 0,145 ± 0,003mg/viên Đạt 13 Định lượng Taurin 47 ± 0,382mg/viên Đạt 14 Tổng số VKHK 3,0 x 102CFU/g Đạt 15 Coliforms < MPN/g Đạt 16 E coli KPH/g Đạt 17 C perfringens < 3MPN/g Đạt 18 B cereus < 10CFU/g Đạt 19 S aureus KPH/g Đạt 20 Salmonella KPH/25g Đạt 21 Tổng số nấm men, nấm mốc