—
HUTECH ) GIAO DUC VA DAO TAO
—— TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM
ĐỎ ÁN TÓT NGHIỆP
KHẢO SÁT TUYẾN CHỌN CÔNG THỨC
CHÁT MANG DẠNG LỎNG CHO HAI DÒNG VI KHUAN BURKHOLDERIA TROPICA VA
ENTEROBACTER CLOACAE
Ngành Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Giảng viên hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Ngọc Trúc
Sinh viên thực hiện _: Nguyễn Thị Kim Ngọc
MSSV: 107111104 Lớp: 07DSH02
Trang 2“THU VEN Số Roàu [7 4 bait j MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv
DANH MUC CAC BANG Vv
DANH MỤC CÁC HÌNH vi
LOI MO DAU 1
1 Tính cấp thiết của đề tài 1
2 Tình hình nghiên cứu 1
3 Mục đích nghiên cứu
4 Nhiệm vụ nghiên cứu
5 Phương pháp nghiên cứu
6 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
7 Kết quả đạt được
§ Kết cấu của luận văn
CHƯƠNG 1: TONG QUAN TAI LIEU
1.1 Sơ lược về phân bón vi sinh
1.1.1 Khải niệm phân bón vi sinh vật
1.1.2 Lịch sử phát triển phân bón vi sinh
1.2.3 Các loại phân bón vi sinh vật
1.2 Sơ lược về chất mang và chất mang dạng lỏng
{ 1.2.1 Dinh nghia chat mang
+t 1.2.2 Chat mang dang long ou
OO DHA HH S&F HB BH WwW WwW W
j 1.2.3 Ưu điểm đang được nghiên cứu của chất mang dạng lỏng
| so với các loại chat mang khác 10
1.2.4 Phân bón vi sinh dạng lỏng 11
Trang 3mang dạng lỏng
1.2.6 Quy trình sản xuất phân lân vi sinh trên nền chất mang dạng lỏng,
1.3 Sơ lược các chủng vi sinh vật sống nội sinh có ích trong đất
1.3.1 Các chủng vi sinh vật có khả năng có định đạm
1.3.2 Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp kích thích tố Auxin
1.3.3 Các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải lân
1.3.4 Enterobacter cloacae 1.3.5 Burkholderia tropica
CHUONG 2: VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU
2.1 Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Chủng giống
2.1.2 Hóa chất sử dụng
2.1.3 Dụng cụ và thiết bị
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.1.2 Phương pháp thu mẫu và đo pH
2.1.3 Phương pháp tính mật số VSV bằng cách đếm khuẩn lạc
2.3Phương pháp thông kê và sử lí số liệu bằng phần mềm Excel và phần
mem SAS
CHƯƠNG 3: KET QUA VA THAO LUAN
3.1 Ảnh hưởng của các thành phần dung dịch chất mang dạng lỏng đối với
sự phát triển của hai chủng vi sinh vật Burkholderia tropica va Enterobacter cloacae
3.1.1 Sự thay đổi màu sắc của các dung dịch chất mang chứa BTEC
3.1.2 Ảnh hưởng của các chất mang đối với sự phát triển và nhân sinh khối ctia hai dong vi khuan Burkholderia tropica va Enterobacter cloacae
3ã 33
33 33 39
Trang 4iii
pH của môi trường 4I
3.2 Ảnh hưởng của việc bỗ sung glyeerol ở các nồng độ khác nhau lên sự
phát triển của hai chủng vi khuẩn Burkholderia tropica va Enterobacter
cloacae 43
3.2.1 Sự thay đổi màu sắc của các dung dich VSV bé sung glycerol 4 3.2.2 Ảnh hưởng của việ bồ sung glycerol đến sự phát triển của BTEC 49
3.2.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glycerol đến độ pH của môi
trường dung dịch vi khuẩn 50
CHƯƠNG 4: KÉT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ 53
4.1 Kết luận 53
4.2 Đề nghị 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO 54
Trang 5DANH MỤC CAC TU VIET TAT
BT: Burkholderia tropica EC: Enterobacter cloacae
BTEC: hén hợp hai dòng vi khuẩn Burkholderia tropica va Enterobacter cloacae
Ctv: cộng tác viên
TNVN: tiêu chuẩn Việt Nam
VSV: vi sinh vat
Trang 6DANH MỤC BẢNG
Trang
Bang 1.1 Một số sản phẩm của phân bon vi sinh 13
Bảng 1.2 Một số môi trường tổng hợp trong sản xuất phân VSV từ
vi khuẩn 17
Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm 1 29
Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm 2 30
Bảng 3.1 Đặt điểm màu sắc và độ nhiễm của các công thức chất mang 33
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của các công thức chất mang đến mật số VSV BTEC 40
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thành phần chất mang đến pH môi trường 42
Bảng 3.4 Đặc điểm màu sắc của các dung dịch VSV ở các nồng độ glycerol
khác nhau 4
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ glycerol đối với mật số VSV 50
Trang 7vi
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1 Sơ đồ chu trình Nitơ ở tế bào vi khuẩn 18
Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của IAA 20
Hình 1.3 So dé 16 trinh sinh tong hop ctia Enterobacter cloacae 21
Hình 3.1 Nghiém thire DC sau 3 ngày chung VSV 36
Hình 3.2 Các nghiệm thức sau 3 ngày sau khi chủng BTEC on Hình 3.3 Sự thay đổi màu sắc ở nghiệm thức CT3 sau 3 ngày 38
Hình 3.4 CT1 chuyển màu sau 12 ngày 38
Hình 3.5 Sự chuyên màu ở nghiệm thức CT1, CT2, CT3, CT4 sau 25 ngày 39 Hình 3.6 Biểu hiện nhiễm của NT5, NT6 41
Hình 3.7 Các nghiệm thức thí nghiệm 2sau 3 ngày được chủng BTEC 46
Hình 3.8 Nghiệm thức ĐC (thí nghiệm 2) sau 3 ngày được churnh BTEC 46
Hình 3.9 Nghiệm thức NT4 bị nhiễm sau 12 ngày 47
Hình 3.10 Nghiệm thức NT5, NT6 nhiễm 48
Hình 3.11 Các nghiệm thức sau 25 ngày quan sát 49
Trang 8LỜI CAM ĐOAN
Luận văn tốt nghiệp này được em thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của
Thạc sĩ Nguyễn Thị Ngoc Trúc, phó giám đốc Trung tâm chuyền giao tiến bộ
kỹ thuật, Viện cây ăn quả Miền Nam Em xin cam đoan các kết quả thí nghiệm trong luận văn là trung thực, hoàn toàn mới và chưa được ai công bố trước đó
Người hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện
Trang 9LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này em đã nhận được sự hướng dẫn, truyền
đạt kiến thức, động viên giúp đỡ của Quý Thầy, Cô, gia đình và bạn bè trong
suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này Em xin trân trọng cảm ơn:
- Th.s Nguyễn Thị Ngọc Trúc, phó giám đốc Trung tâm chuyền giao tiền
bộ kỹ thuật, Viện cây ăn quả Miền Nam đã tận tâm hướng dẫn em thực
hiện thí nghiệm và viết bài luận văn này
- —T.s Nguyễn Thị Hai giảng viên trường ĐH KTCN TPHCM đã hướng
dẫn em định hướng đề tài thực hiện
- _ Quý Thầy, Cô bộ môn khoa MT và CNSH, trường ĐH KTCN TPHCM
đã tận tâm truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian em học tập
và rèn luyện tại trường
Các cán bộ, nhân viên tại phịng thí nghiệm Vi sinh và phịng thí nghiệm bộ mơn Hoa tại Trung tâm chuyển giao tiến bộ kỹ thuật, Viện
cây ăn quả Miền Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ trang thiết bị thí
nghiệm tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đề tài
-_ Đặt biệt em xin cảm ơn Ba, mẹ, gia đình và người thân đã quan tâm,
chăm sóc, động viên và tạo điều kiện thuân lợi nhất cho em học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này
- Cảm ơn các bạn đã cùng chia sẽ và giúp đỡ em trong quá trình học tập
và làm luận văn
Trang 10LỜI MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay, việc sử dụng nguồn giống mới, phân bón và thuốc bảo vệ thực vật
đã làm tăng năng suất và chất lượng sản phẩm, góp phần làm tăng thu nhập và
nâng cao đời sống của người nông dân Do đó nhu cầu về phân bón hóa học
ngày càng tăng Nhưng bên cạnh đó việc sử dụng quá mức cần thiết các loại
phân hóa học đã làm đất bị thối hóa, bạc màu, mặt khác lượng phân bón hóa
học dư cây không sử dụng được bị tích tụ trong đất, không được phân hủy
góp phần làm hại cây trồng và ô nhiễm môi trường đất Hiện nay, các loại
phân bón hóa học thường được sử dụng là phân đạm (N), lân (P) và kali (K)
Nhưng thực tế cây trồng chỉ sử dụng được khoảng 30% lượng phân bón bổ sung vào đất và lượng phân còn lại trở thành những dạng khó tiêu trong dat
Vì thế, cần thiết phải đây mạnh nghiên cứu nhằm tìm ra các loại chê phẩm vi
sinh vật có khả năng thay thế các loại phân bón hóa học, cung cấp nguồn dinh
dưỡng cho cây trồng và không gây ô nhiễm môi trường đất Do vậy, ngoài
việc tuyển chọn và phân lập các lồi vi khn có khả năng phân giải lân, có
định đạm và sinh tổng hợp IAA trong đất, thì việc tìm hiểu, chọn lọc và sử
dụng công thức chất mang hợp lí cũng là một vấn đề cần được chú ý Vì vậy,
trong phạm vi thực hiện đề tài tốt nghiệp, em chọn đề tài: “Khảo sát, tuyển
chọn công thức chất mang dạng lỏng cho hai dòng vi khuan Burkholderica
tropica và Enterobacter cloacae” với mục tiêu xác định các công thức chất mang đạng lỏng thích hợp làm cơ sở cho việc nghiên cứu sản xuất phân bón
Trang 112 Tình hình nghiên cứu
Trên thế giới từ cuối thế kỷ thứ XIX, việc ứng dụng trộn hạt giống với vi khuẩn có ích đã được khuyến cáo rộng rãi ở Mỹ (Smith, 1992) Sau đó 10
năm, sản phẩm Nitragin duge ra doi, lam tir Rhizobium spp (Nobbe va Hiltner, 1896) Ở Brazil, việc sử dụng vi khuẩn vùng ré Azotobacter trên
diện rộng đã thực hiện từ những năm 1939-1940 Những năm gần đây thì
hiệu quả của việc sử dụng Azotobacter moi dat duge một số thành tựu mới
Ở Thụy Điển, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy ở vùng rẻ của các loài ngũ cốc và cỏ chăn nuôi các vi khuẩn Ezerobacter và Bacillus (Lindberg và
Granhall, 1984) Ở Nhật, các nhà nghiên cứu đã xác định được các vi
khuẩn nội sinh #ferbaspirillưm có khả năng cố định đạm ở các loài lúa
hoang (Elbeltagy et al., 2001) Người ta cũng đã tiến hành thi nghiệm
chủng vi khuẩn Herbaspirillum seropedicae và giông Burkholderia yao cây
lúa, kết quả các vi khuẩn có thể cố định đạm khoảng 19% tong số đạm cần
thiết cho cây (Verma et al., 2001)
Ø Việt Nam, nhận thức được vai trò của phân bón vi sinh vật, từ những
năm đầu của thập kỷ 80, nhà nước đã triển khai hàng loạt các đề tài nghiên cứu thuộc chương trình cơng nghệ sinh học phục vụ nông nghiệp giai đoạn
1986- 1990 và chương trình cơng nghệ sinh học 1991-2005 Việc nghiên
cứu các vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp
kích thích tố IAA ở các cây nông nghiệp đã được tiến hành khá nhiều trong những năm gần đây Tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh
học, trường đại học Cần Thơ, Cao Ngọc Điệp (2007) đã phân lập và nhận diện các dòng Azospirillum bang kỹ thuật PCR từ rễ và thân lúa trồng
Từ năm 2007, Nguyễn Thị Ngọc Trúc và Lê Thị Thu Hồng đã có nhiều
nghiên cứu phân lập, định danh các vi sinh vật vùng rễ có ích, và có khả
Trang 12năng cải tạo đất ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Kết quả đã phân lập được
một số chủng vi sinh vật có khả năng cố định đạm, phân giải lân tiêu biểu
la hai dong vi khuan Burkholderia tropica va Enterobacter cloacae Dén năm 2009, Nguyễn Thị Ngọc Trúc và ctv bước đầu nghiên cứu cơng thức
chất mang thích hợp cho các dòng vi sinh vật có ích làm tiền đề sản xuất
phân bón vi sinh
3 Mục đích nghiên cứu
Khảo sát và chọn ra công thức chất mang dạng lỏng thích hợp cho hai dòng vi
khuan Burkholderia tropica và Enterobacter cloacae (gọi tắt là BTEC), nhằm
tạo ra chế phẩm phân bón vi sinh có chức năng bổ sung các vi sinh vật có khả
năng phân giải lân, đồng thời có khả năng cố định đạm và sinh tong hop IAA
trong đất, phục vụ cho ngành nông nghiệp 4 Nhiệm vụ nghiên cứu
Nhiệm vụ nghiên cứu là tìm ra được một cơng thức chất mang tối ưu nhất
trong việc bảo quản và đảm bảo mật số vi sinh vat Burkholderia tropica va Enterobacter cloacae cao nhất Công việc được thực hiện qua các bước:
e« Bồ trí thí nghiệm, lập các công thức chất mang dang long
© Theo déi su thay đổi màu sắc, pH của môi trường nhân nuôi s_ Khảo sát mật số vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 5 Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp bố trí thí nghiệm
Phương pháp thu mẫu và đo pH
Phương pháp tính mật số vi sinh vật bằng cách đếm khuẩn lạc
Trang 13Phương pháp thống kê xử lí số liệu bằng phần mềm Excel và phần
mem SAS
6 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm: tại phịng thí nghiệm Vi Sinh Vật, Viện cây ăn quả Miền Nam Thời gian: từ ngày 1/4/2011 đến ngày 30/6/2011
7 Kết quả đạt được
e Tim được công thức chất mang thích hợp cho hai dòng vi khuẩn Burkholderia tropica va Enterobacter cloacae, độ nhiễm thap
© Loai bé céng thức chất mang có bổ sung đạm vô cơ và lân vơ cơ (có độ
nhiễm cao)
s Đánh giá mật số vi sinh và độ pH của dung địch vi khuẩn BTEC trong các công thức chất mang chứa ølycerol ở các nồng độ 5%, 10%, 25%
8 Kết cấu của luận văn
Bao gồm các nội dung sau:
Lời mở đầu
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Vật liệu và Phương pháp
Chương 3: Kết quả và Thảo luận
Chương 4: Kết luận và Đề nghị
Trang 14CHUONG 1: TONG QUAN TAI LIEU
1.1 Sơ lược về phân bón vi sinh
1.1.1 Khái niệm phân bón vi sinh vật
Phân bón vi sinh vật (VSV) là các sản phẩm mang VSV nhiễm cho đất và cây
trồng Theo Tiêu chuẩn Việt Nam năm 1996 (TCVN 6168-1996), phân bón
VSV được định nghĩa: "Phân vi sinh vật (phân vi sinh) là sản phẩm chứa các
vi sinh vật sống, đã được tuyển chọn có mật độ phù hợp với tiêu chuẩn ban
hành, thông qua các hoạt động sống của chúng tạo nên các chất dinh dưỡng mà cây trồng có thể sử dụng được (N, P, K, S, Fe ) hay các hoạt chất sinh học, góp phần nâng cao năng suất và (hoặc) chất lượng nông sản Phân vi sinh vật phải bảo đảm không gây ảnh hưởng xấu đến ngư, động, thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản"(Nguyễn Minh Hưng và ctv)
Theo định nghĩa nêu trên, phân bón VSV được hiểu như sau:
Phân bón VSV phải là sản phẩm chứa các VSV sống tồn tại dưới dạng tế
bào sinh dưỡng hoặc bào tử
- Vi sinh vat chứa trong phân bón VSV phải là các VSV đã được tuyển chọn
đánh giá có hoạt tính sinh học, có khả năng sinh trưởng, phát triển và thích
nghỉ với điều kiện môi trường sống mà ở đó chúng được sử dụng 1.12 Lịch sử phái triển phân bón vi sinh
Phân bón vi sinh đo Noble Hiltner sản xuất đầu tiên tại Đức năm 1896 và
được đặt tên là Nitragin Sau đó phát triển sản xuất tại một số nước khác như
ở Mỹ(1896), Canada (1905), Nga (1907), Anh (1910) và Thụy Điển (1914)
Nitragin là loại phân được chế tạo bởi vi khuan Rhizolium do Beijerink phan
lap nam 1888 va duge Fred đặt tên vào năm 1889 dùng để bón cho các loại
Trang 15cây thích hợp họ đậu Từ đó cho đến nay đã có rất nhiều cơng trình nghiên
cứu nhằm ứng dụng và mở rộng việc sản xuất các loại phân bón vi sinh cố định nitơ mà thành phần còn được phối hợp thêm một số vi sinh vật có ích
khác như một số xạ khuẩn cố định nitơ sống tự do Frankia spp, Azotobacter
spp, cac vi khuan cé dinh nito séng ty do Clostridium, Pasterium,
Beijerinkiaindica, các xạ khuẩn có khả năng giải cellulose, hoặc một số chủng
vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các nguồn dự trữ phospho và kali ở dạng
khó hoà tan với số lượng lớn có trong đất mùn, than bùn, trong các quặng
apatit, phosphoric v.v chuyển chúng thành dạng dễ hoà tan, cây trồng có thê
hấp thụ được
Ở Việt Nam, phân VSV cố định đạm cây họ đậu và phân VSV phân giải lân
đã được nghiên cứu từ năm 1960 Đến năm 1987, phân Nitragin trên nền
chất mang than bùn mới được hoàn thiện Năm 1991 đã có hơn 10 đơn vị
trong cả nước tập trung nghiên cứu phân vi sinh vật Các nhà khoa học đã
phân lập được nhiều chủng vi sinh vật có định đạm và một số VSV phân giải
lân ( Lê Văn Vĩnh, 2007)
1.1.3 Cúc loại phân bón vi sinh vật
Phân bón vi sinh vật (VSV) được chia thành nhiều dạng khác nhau tùy theo
cơng nghệ sản xuất, tính năng tác dụng của vi sinh vật chứa trong phân bón
hoặc thành phần các chất tạo nên sản phẩm phân bón
1.1.3.1 Phân loại theo công nghệ sản xuất phân bón
Tùy theo cơng nghệ sản xuất, người ta có thể chia phân vi sinh vật thành hai
loại như sau:
- Phân vi sinh vật trên nền chất mang khử trùng có mật độ vỉ sinh vật
Trang 161/1000 so với vi sinh vật hữu ích Phân bón dạng này được tạo thành bằng
cách tầm nhiễm sinh khối vi sinh vật sống đã qua tuyển chọn vào cơ chất đã
được xử lý vô trùng bằng các phương pháp khác nhau Phân bón vi sinh vật
trên nền chất chất mang đã khử trùng được sử dụng dưới dạng nhiễm hạt, hồ
rễ hoặc tưới phủ với liều lượng 1-1.5 kg (li0/ha canh tác
- Phan vi sinh vật trên nền chất mang không khử trùng được sản xuất
bằng cách tâm nhiễm trực tiếp sinh khối vi sinh vật sống đã qua tuyển chọn,
vào cơ chất không cần thông qua công đoạn khử trùng cơ chất Phan bon dang
này có mật độ vi sinh vật hữu ích 10° vi sinh vat/g (ml) va duge str dung véi
số lượng từ vài trăm đến hàng nghin kg (lit)/ha
Đối với phân bón vi sinh vật trên nền chất mang không khử trùng, tùy theo thành phần các chất chứa trong chất mang mà phân bón VSV dạng này được
phân biệt thành các loại:
- Phân hữu cơ VSV là sản phẩm phân hữu cơ có chứa các VSV sống đã được tuyên chọn có mật độ phù hợp với tiêu chuẩn ban hành, thông qua các hoạt động sống của chúng tạo nên các chất dinh dưỡng mà cây trồng có thể sử dụng
hay các hoạt chát sinh học góp phần nâng cao năng suất, chất lượng nông sản
- Phân hữu cơ khoáng VSV là một dạng của phân hữu cơ VSV, trong đó
có chứa một lượng nhất định các đinh dưỡng khoáng
1.1.3.2 Phân loại theo chức năng, tác dụng của các nhóm VSV:
Trên cơ sở tính năng tác dụng của các VSV chứa trong phân bón, phân VSV
còn được gọi đưới các tên:
- Phân VSV có định nitơ (phân đạm vi sinh) là sản phẩm chứa các VSV
Trang 17sinh trong vùng rễ cây trồng cạn hay tự do trong đất, nước có khả năng sử
dụng nitơ từ khơng khí, tổng hợp thành đạm cung cấp cho đất và cây trồng
- Phân VSV phân giải hợp chất phospho khó tan (phân lân vi sinh) sản
xuất từ các VSV có khả năng chuyển hóa các hợp chất photpho khó tan thành
dễ tiêu cho cây trồng sử dụng
- Phân VSV kích thích, điều hòa sinh trưởng thực vật chứa các VSV có
khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học có tác dụng điều hịa hoặc kích
thích q trình trao đổi chất của cây
- Phân VSV chức năng là một dạng của phân bón VSV ngồi khả năng
tạo nên các chất dinh dưỡng cho đất, cây trồng, cịn có thê ức chế, kìm hãm sự phát sinh, phát triển của một số bệnh vùng rễ cây trồng do vi khuẩn và vi nắm
gây nên
1.1.3.3 Phân loại theo trang thai vat lý của phân bón:
Căn cứ vào trạng thải vật lý của phân bón, có thể chia phân bón VSV thành
các loại sau:
- Phân VSV dạng bột là dạng phân bón vi sinh, trong đó sinh khối VSV sơng đã được tuyển chọn và chất mang được xử lý thành dạng bột mịn
- Phan VSV đạng lỏng là một loại phân bón vi sinh, trong đó sinh khối
VSV từ các vi sinh vật tuyên chọn được chế biến tạo nên dung dịch có chứa các tế bào sống của chúng
- Phân VSV dạng viên được tạo thành khi sinh khối VSV được phối trộn
và xử lý cùng chất mang tạo thành các hạt phân bón có chứa các VSV sống đã
được tuyển chọn
Lưu ý: Phân bón VSV không được gây ảnh hưởng xâu đến người, động thực
vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản
Trang 181.2 Sơ lược về chất mang và chất mang dạng lỏng 1.2.1 Định nghĩa chất mang
Chất mang là chất đẻ vi sinh vật được cấy tồn tại và phát triển, tạo điều kiện
thuận lợi cho vận chuyển, bảo quản và sử dụng phân vi sinh Chất mang
không được chứa chất có hại cho người, động thực vật, môi trường sinh thái
và chất lượng nông sản (TCVN 6169: 1996)
Chất mang của phân bón vi sinh thường là than hoạt tính, tro, trấu, than bùn
Nhưng sử dụng phân vi sinh dạng cơ chất vẫn còn những bất lợi nhất
định liên quan đến chất mangnhư hạn sử dụng ngắn (3-4 tháng), điều kiện lưu trữ chưa cao (phải được lưu giữ trong nhiệt độ mát) vì nó nhạy cảm
với nhiệt độ, cồng kềnh khi vận chuyển, chỉ phí vận chuyển cao, khơng có
khả năng xuất khẩu, dễ bị nhiễm, vấn đề bao bì, khả năng bảo vệ tế bảo song
kém, duy trì độ âm kém
Ưu tiên sử dụng các vật liệu dễ tìm, có số lượng lớn, chỉ phí thắp 1.2.2 Chất mang dạng lỏng
Chat mang lỏng thường sử dụng là nước được bổ sung các chất đinh dưỡng,
chất bề mặt và chất nhũ hóa nước dạng giọt làm kích thước hơn so với kích
thước của giọt nước bình thường, như thế khi phun sẽ có thể kiểm sốt tốt hơn Thẻ tích dung dịch được giảm đi, dễ dàng khi vận chuyên (Làm tăng thé
tích nhằm làm ướt hoàn toàn một bề mặt mục tiêu Giảm thể tích làm
tăng kích thước giot téi ưu khi phun để bao phủ vùng rộng hơn) Các yếu tố
ảnh hưởng đến dung dich chất mang dạng lỏng là độ nhớt, độ bám dính và
thời gian lưu trữ (Krishan, 2009)
Chất mang lỏng cần thỏa các yêu cầu sau: -_ Ôn định khi được thêm các phụ gia
Trang 19Duy trì pH đệm khi thêm các chất phụ gia
Đảm bảo khơng bị vón cục và đóng cặn khi trữ thời gian dài
Thêm vào chất bề mặt hoặc dầu để nhũ tương nước hoặc sử dụng dầu
tỉnh khiết
Tác động của chất lỏng là như nhau với bắt kỳ môi trường nào
Chất chống ánh nắng được thêm vào đề bảo quản vi khuân khỏi tia UV
Chất mang lỏng có chứa chất giữ ẩm dé tao điều kiện thuận lợi cho vi
khuẩn phát triển
Chất mang dạng lỏng cơ bản cần đạt tính Ơn định
Tổn tại bền vững
Khuếch tán tốt
Tăng cường hoạt động của vi sinh vật khi sử dụng
(Hasarin Ngampimol, 2008)
1.2.3 Ưu điểm đang được nghiên cứu của chất mang dạng lỏng so
với các loại chất mang khác
Ngồi những đặc tính ưu việt của phân bón vi sinh như thân thiện với môi trường, không ảnh hưởng đến sức khỏe con người, cải tạo đất hiệu quả, hạn
chế xói mịn, v.v Phân bón vi sinh dạng lỏng cịn có những thuận lợi so với
các đạng phân vi sinh khác như:
Hạn sử dụng dài từ 12 đến 24 tháng
Không bị nhiễm
Khơng biến tính khi dự trữ ở nhiệt độ lên đến 45°C
Có khả năng tồn tại với hệ vi sinh vật tự nhiên Dễ sử dụng
Hoạt tính enzyme cao
Mật số cao, có thẻ duy trì 10” tế bào/ml từ 12 tháng đến 24 tháng
Trang 20-_ Dễ đàng nhận biết nhờ vào mùi lên men điển hình
- Tiết kiệm được lượng chất mang, chi phí nghiền, khử trùng, đóng gói
và vận chuyền
- _ Quá trình kiểm tra chất lượng đễ dàng và nhanh chóng
- _ Tổn tại tốt hơn trên hạt giống và đất
- Liéu ding it hon 10 lan so véi dang bột
- Doanh thu thuong mai cao
- C6 tiém nang xuất khâu (Krishan, 2009)
1.2.4 Phân bón vi sinh dạng long
Phân vi sinh dang lỏng chứa vi sinh vật ở dạng tiềm sinh và chất dinh dưỡng kèm với cơ chất để giúp vi sinh vật hình thành dạng bào tử nghỉ hoặc bào xác để kéo dài thời gian sử dụng và chịu được điều kiện khắc nghiệt
Thông thường, dung địch phân bón vi sinh đạng lỏng gồm có:
- Visinh vat co ich: 10 - 40%
Thanh phan dich huyền phù: 1 — 3%
Chat phân tan: 1-5 %
Chất bề mặt: 3 — § %
Chất mang lỏng (thường là nước): 35 — 65 % (Krishan, 2009)
Dung dich huyền phù được sử dụng để ức chế sự phát triển và nhiễm của các
chất như là: Sodium benzoate, Butanol, Acetone, thuốc trừ nấm, thuốc trừ
sau Lam cho VSV có khả năng tồn tại lâu dài Trường hợp
Azospirillum, Azotobacter, PSM, được quan sat thay rằng những vi khuẩn nay
vượt qua giai đoạn tiềm sinh, vì vậy khi sử dụng chúng có thời gian kích hoạt
kéo đài nên không phù hợp cho cây trồng ngắn ngày (Krishan, 2009)
Vi sinh vật có thể được treo trong giọt dầu ở nồng độ cao ở các mức độ khác
nhau mà VSV ton tại trong tình trạng mất nước VSV được cung cấp trong
trạng thái không hoạt động sinh lý, hạn chế sự lây nhiễm trong thời gian lưu
Trang 21trữ Các vi khuẩn, nắm đã được sấy khô bằng sục khí liên tục như hệ thông
treo trong dầu để kéo dài hạn sử dụng đến vài năm
Dịch huyền phù dầu (dầu dừa, dầu thực vật) thường rất giới hạn trong việc
kích hoạt vi khuẩn Nó thường mắt 10 - 20 ngày để tái sinh cho nên đòi hỏi
ban đầu của cây là không được đáp ứng Để khắc phục vấn đề này, người ta
kết hợp bổ sung vào dung dịch các chất như Nitơ, Phospho, Kali đã đem lại
năng suất tốt và lợi ích tối đa khoảng 15 - 30% so với thông thường Mặt hạn
chế của việc sản xuất và sử dụng môi trường này là các vi khuẩn đều có đặc
điểm khác nhau, tiết ra các enzyme khác nhau và các axit hữu cơ khác
nhau Sự tương thích của các vi khuẩn là vấn đề chính trong quá trình sản
xuất các chế phẩm vi sinh
Chất lượng phân bón vi sinh vật được thẻ hiện thông qua các chỉ tiêu:
Số lượng vi sinh vật sống có trong 1 gam hay 1 mililit phân
-_ Hoạt tính sinh học của các vi sinh vật sử dụng
Thời gian tồn tại của vi sinh vật chứa trong phân bón
Sơ lượng hay tỷ lệ vi sinh vật tạp so với ví sinh vật sử dụng làm phân bón
Các chỉ tiêu khác liên quan đến tính chất vật lý, hóa học hay thành phần
chất dinh dưỡng của phân bón (Nguyễn Văn Hưng, 2007)
Ở các nước có truyền thống sử dụng phân bón vi sinh vật như Úc, Mỹ, Án
Độ, mật độ vi khuẩn trong một gam hay 1 ml phân là 10” - 10” đối với chế
phẩm vi sinh vat va 10°- 10” đối với phân hữu cơ vi sinh vat
Theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) 6166-2002, 6167- 1996 về phan vi sinh
vật cố định nitơ và chế phẩm vi sinh vật phân giải hợp chất phospho khó tan
được coi là bảo đảm chất lượng khi mật độ vi khuẩn đã được tuyên chọn trong 1g bay 1 ml chế phẩm (phân bón) đạt 10°- 10” và số lượng vi khuẩn tạp trong
đó phải thấp hơn 1,0 triệu vi sinh vat/g hay ml chế phẩm (phân bón) trên nền chất mang vô trùng Phân hữu cơ vi sinh vật yêu cầu phải có mật độ vi khuẩn
Trang 22sống đã được tuyển chọn thấp nhát là 10” tế bào/g hay ml phân bón Thời gian
sử dụng đối với phân bón vi sinh vật được đặt ra ít nhất là 6 tháng kể từ ngày
sản xuất Trước đây người ta còn đưa ra chỉ tiêu về độ âm đối với phân bón vi sinh vật, song đến nay chỉ tiêu này khơng cịn ý nghĩa vì có nhiều sản phẩm phân bón vi sinh vật được sản xuất theo phương pháp đông khô, hoặc được
tạo ra từ sinh khối các bào tử vi sinh vật Các sản phẩm dạng này có độ 4m
dưới 10%
Tùy theo công nghệ sản xuất và tính năng của sản phẩm phân bón vi sinh vật
mà các nhà sản xuất có thể đưa thêm các chỉ tiêu về hàm lượng các chất dinh
dưỡng đạm, lân, kali, chất hữu cơ và các yêu tơ khống trung và vi lượng
khác có trong phân bón vi sinh vật
1.2.5 Một số sản phẩm thương mại của phân bón vi sinh với chất
mang dạng lỏng
Các sản phẩm phân hữu cơ sinh học hiện có trên thị trường phía Nam với chất
lượng tốt và có uy tín như nhóm sản phẩm của Công Ty Anh Việt, Công ty Viễn Khang, Công ty SA CAI, Công ty Thanh Lan, Công ty Việt Thắng (Tran Thai Ha, 2011)
Bảng 1.1 Một số sản phâm phân bón vi sinh (Nguyễn Minh Hưng, 2007)
STT Tên sản Đơn vị Chủng vi khuẩn Cơng
phẩm tính ty
(Bacillus, Clostridium, Streptomyces, Cong
Achoromobacter, Aerobacter, ty
Power
ite Gal CFU/ml Nitrobacter, Nitrosomonas TNHH
nt
Pseudomonas, Aspergillus, Fusarium SA
Polyporus, Rhizopus): 1x10? CAI
2 SPNol CFU/ml (Bacillus, Clostridium, Streptomyces, Cong
Trang 23
Achoromobacter, Aerobacter, ty
Nitrobacter, Nitrosomonas TNHH
Pseudomonas, Aspergillus, Fusarium TM &
Trang 241.2.6 Quy trình sản xuất phân lân vỉ sinh trên nền chất mang dạng lỏng > Phan lap tuyển chọn chủng vi sinh vật phân giải lân (VSVPGL):
Người ta thường phân lập tuyển chọn chủng VSVPGL từ đất hoặc từ vùng rễ cây trồng nên các loại đất hay cơ chất giàu hữu cơ theo phương pháp ni cây pha lỗng trên môi trường đặc Pikovskaya Khi đó các chủng vi sinh vật phân giải lân sẽ tạo vòng phân giải, tức là vòng tròn trong suốt bào quang khuẩn lạc Vòng phân giải được hình thành nhờ khả năng hòa tan hợp chất phospho không tan được bổ sung vào môi trường nuôi cấy Căn cứ vào đường kính vịng phân giải, thời gian hình thành và độ trong của vòng phân giải người ta
có thể đánh giá chính xác mức độ phân giải các hợp chất của chúng bằng cách
phân tích hàm lượng lân dễ tan trong môi trường muôi cấy có chứa loại phosphat khơng tan Tỷ lệ (%) giữa hàm lượng lân tan và lân tổng số trong
môi trường được gọi là hiệu quả phân giải Thông thường dé sản xuất phân
lân vi sinh vật người ta cố gắng tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy nhiều loại hợp chất phospho và vô cơ khác nhau Chủng vi sinh vật có khả năng phân giải hợp chất phospho cao chưa hẳn là có ảnh hưởng tốt đến cây trồng Vì ngồi hoạt tính phân giải lân, nhiều chủng vi sinh vật cịn có các hoạt tính sinh học khác gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng, phát triển và
năng suất cây trồng Do vậy sau khi đánh giá khả năng phân giải lân, các
chủng vi sinh vật dùng để sản xuất phân lân vi sinh cần được đánh giá ảnh
hưởng đến đối tượng cây trồng sử dụng Chỉ sử dụng chủng vi sinh vật vừa có hoạt tính phân giải lân cao vừa không gây ảnh hưởng xấu đến cây trồng và
môi trường sinh thái
Ngoài những chỉ tiêu quan trọng trên, còn phải đánh giá đặc tính sinh học như
khi chọn chủng VSVCĐN đó là: thời gian mọc; kích thước tế bào, khuẩn lạc;
khả năng thích ứng ở pH; khả năng cạnh tranh
Trang 25> Nhân sinh khối, xử lí sinh khối, tạo sản phẩm
Từ các chủng vi sinh vật được lựa chọn tiến hành nhân sinh khối vi sinh vật,
xử lý sinh khối vi sinh vật và tạo sản phẩm phân vi sinh Người ta thường tiến
hành nhân sinh khối vi sinh vật theo phương pháp lên men chìm hoặc lên men
xốp Sinh khối vi sinh vật được nhân lên trong các điều kiện phù hợp với từng
chủng vi sinh vật và mục đích sản xuất Sau khi các giống gốc đã đạt được
mật số tế bào theo yêu cầu sẽ được cấy vào nguyên liệu các chủng vi sinh vật
thuần khiết trong điều kiện nhất định để đạt được hiệu suất cao Mặc dù vi
sinh vật nhỏ bé nhưng trong điều kiện thuận lợi, đủ chất đinh dưỡng, có độ
pH thích hợp, CO; và nhiệt độ môi trường tối ưu chúng sẽ phát triển cực kỳ nhanh chóng (hệ số nhân đôi chỉ 2-3giờ) Ngược lại, trong điều kiện bất lợi
VSV sé không phát triển hoặc bị tiêu diệt, dẫn đến hiệu quả của phân bị giảm sút, Để cho phân vi sinh được sử dụng rộng rãi, người ta thường chọn các
chủng vi sinh có khả năng thích nghi rộng hoặc dùng nhiều chủng trong cùng
một loại phân
> Xử lí sinh khối, tạo sản phẩm
Sinh khối yi sinh vật được phối trộn với các chất mang vô trùng (hoặc không
vô trùng) theo tỉ lệ đã biết để tạo ra chế phẩm trên nền chất mang vô trùng (hoặc không vô trùng), và được bổ sung các chất phụ gia, chất dinh dưỡng,
bao quan dé tao ra ché pham đạng lỏng hoặc cô đặc, làm khô để tạo ra chế
phẩm đông khô hoặc khô Một số môi trường tổng hợp trong sản xuất phân
VSV từ vi khuẩn được thể hiện ở bảng 1.2 > Kiểm tra chất lượng sản phẩm
Phân vi sinh được coi là có chất lượng tốt khi có một hoặc một vài loài vi sinh
vật có hoạt tính mong muốn cao, có ảnh hưởng tốt đến cây trồng có mật độ vi sinh vật cao Tùy theo điều kiện của từng vùng địa lý, mật độ vsinh vật chuyên tính trong 1 gam hoặc mililit chế phẩm dao động 10” +10” đối với chế
Trang 26phẩm trên nền chất mang khử trùng và 10”-10/ đối với chế phẩm trên nền chất
mang không khử trùng Đề phân bón vi sinh vật có chất lượng cao cần kiểm
tra chất lượng sản phẩm tạo ra sau mỗi công đoạn sản xuất
Bảng 1.2 Một số môi trường tổng hợp trong sản xuất phân VSV từ vi khuẩn
Loại vi khuẩn Thành phần môi trường Tác giả
Pseudomonas Nước thủy phân đậu,thịt Bashan (1986)
Azospirillum 10g/1 glycerol
50g/1 nước thủy phân tinh bột Atkinson and Mavitune
Bacilius subtilis 20g/1 Casein (1993)
3.3 g/1 Na;HPO¿
Rhiobium 20g/1 nước chiếc men Somasegara (1985)
10g/1 Manital
1.3 Sơ lược các chủng vi sinh vật sống nội sinh có ích trong đất
Nhiều dong vi khuẩn sống trong đất có khả năng tổng hợp nên các chất tăng trưởng của thực vật và giúp cho cây trồng phát triển Trong đó có nhiều vi sinh vật sông trong vùng rễ (rhzophere) có khả năng tổng hợp chất kích thích sự tăng trưởng của thực vật gọi là nhóm Plant growth-promoting rhizobacteria
(PGPR) (Nguyễn Thị Ngọc Trúc, 2007)
Trong đất tổn tại các nhóm vi khuẩn vùng rễ sống nội sinh có khả năng cố
định đạm, sinh tổng hợp auxin (IAA) hay phân giải các hợp chất lân khó tiêu
trong đất Các vi khuẩn này có khả năng sống quanh vùng rễ và bám vào hạt giống, sau đó giúp tăng trưởng sự phát triển của cây trồng
Trang 271.3.1 Các chúng vi sinh vật có khả năng cỗ định đạm
Đạm là yếu tố quan trọng cho sự phát triển của các sinh vật, vì N là thành
phần dinh dưỡng cần thiết cấu tạo nên protein, acid nucleic va cac thanh phan
quan trọng khác của tế bào Đối với thực vật, đạm gây ảnh hưởng trực tiếp
đến năng suất và sản lương thu hoạch của cây trồng Do vậy, để tăng năng
suất và sản lượng người ta cung cấp đạm cho cây trồng chủ yêu là bón phân đạm vô cơ, phương pháp này vừa đắt tiền, vừa không mang lại hiệu quả kinh tế, mà còn gây ảnh hưởng đến môi trường
Do đó vai trị của các vi sinh vật có khả năng cố định đạm được ưu tiên
nghiên cứu và phát triển Nhóm vi sinh vật này có khả năng sống dị dưỡng, chúng sử dụng carbohydrate làm nguồn năng lượng đề có định đạm, khử liên
kết của N; thành NH; nhờ vào nguồn năng lượng ATP, sự hoạt động của phức hợp enzyme nitrogenase va enzyme hydrogenase (hinh 1.1)
>
Nitrate
Nitric oxide
}
Km Lên ‘ogen 0: Nitrite
Chú thích: ==là lớp màng đôi của tế bào; REE8và Đà các protéin xuyén mang
Hình 1.1 Sơ đồ chu trình Nitơ ở tế bảo vỉ khuẩn
(Yan et al (2008))
Trang 28Phức hợp enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase biến đổi N; thành NHạ theo công thức sau:
N; + §H” + §e + I6ATP + 16H;O —>2NH; + H; + I6ADP + 16Pi
Ammonia (NH3) dugc tao ra trong chu trinh tiép tuc két hop voi chuỗi carbon đề đồng hóa thành những acid amin đầu tiên cung cấp trực tiếp cho cây trồng Năm 1901, nhà bác học người Hà Lan Beijerinck đã phân lập được từ đất một
loại vi sinh vật có khả năng có định nitơ phân tử cao, ông đã đặt tên cho loài
vi sinh vat nay 1a Azotobacter Azotobacter đồng hóa tốt các loại đường đơn
và đường kép, cứ tiêu tốn 1 g đường glucose nó có khả năng đồng hóa được tir 8 — 18 mg N Ngoai ra Azotobacter cé kha năng tiết ra một số vitamin
thuộc nhóm B như BI, B6 một số acid hữu cơ như: nicotinic, acid
pantotenic, biotin, auxin Một số chủng VSV có khả năng có định nitơ tự đo
đã được sử dụng trong sản xuất phân bón VSV như 4cefobacfer, Achromobacter, Agrobacterium, Azospirillum, Azotobacter, Azotomonas,
Bacillus, Clostridium, Frankia, Klebsiella, Pseudomonas (Nguyén Minh Hung va ctv)
1.3.2 Các vị sinh vật có khả năng tổng hợp kích thích tơ Auxin
IAA (Indole-3-acetie acid) hay còn gọi là auxin là kích thích tố tăng trưởng
đầu tiên được xác định và giữ vai trò trung tâm trong sự tăng trưởng thực vật và nó được dùng như một chất điều hòa quá trình sinh học từ sự phân chia tế
bào, kéo đài, phân hóa sinh mơ, phát triển trái và hạt (Lưu Hồng Mẫn, 2004)
IAA có cấu tạo 2 vòng carbon (5, 6) IAA có tính tích điện âm do gốc -
COOH linh động: -COOH —› -COO' + H” Chính vì điều này làm cho IAA tập trung nhiều ở phía điện dương (Nguyễn Đình Dậu, 2000) Trong tự nhiên
IAA có 2 dạng: IAA liên kết (R-CHCOO-R) và IAA tự do (R-CH;COOH)
Trang 29CH2COOH
Indole-3-acetic acid (IAA)
Hình1.2 Cấu trúc hóa học của IAA
IAA tự do điều khiển quá trình hoạt động sinh lý của thực vật, còn IAA liên
kết thì khơng hoạt động IAA có tác dụng trực tiếp đến cây trồng, kích thích
sinh trưởng tạo rễ, kích thích sự phân chia tế bào, hình thành quả
Theo Loper & Schroth (1986) thì có đến 80% các dòng vi khuẩnđược phân
lập từ vùng rễ của nhiều loại cây trồng là có khả năng tổng hợp auxins Các đòng vi khuẩn thuộc các giống như 4zospiilium, Pseudomonas, Rhizobium, Xanthomonas, Bradyrhizobium japonicum, Gluconobacter diazotrophicus da được xác định là có khả năng tổng hợp IAA giúp kích thích sự sinh trưởng
của cây trong (Patten & Glick, 1996) Gan day 1a Ahmad (2005) da phan lap
được 10 ching Azorobacter va 11 ching Pseudomonas tir đất vùng rễ cây lúa
mì, mù tạt, cây cải, đều cho thấy chúng có khả năng téng hop IAA rat cao
trong méi truéng cé b6 sung Tryptophan va khéng cé bé sung Tryptophan Mot s6 vi sinh vat nhu: Pseudomonas, Azotobacter, Enterobacter cloacae có khả năng sinh tơng hợp IAA, được xem như là các VSV có khả năng kích thích sinh trưởng
Có 3 lộ trình tiêu biểu nhất cho sự biến đổi của L-tryptophan thành IAA đã
duge Koga ef al (1991) mé ta chi tiết như sau:
s_ Lộ trình Indole-3-pyruvic acid
Tryptophan indole-3-pyruvic acid indole-3-acetaldehyde IAA
Trang 30e_ Lộ trinh Tryptamine
Tryptophan tryptamine indole-3-acetaldehyde IAA
e_ Lộ trình indole-3-acetamic
Tryptophan indole-3-acetamide IAA
CH,CHCOOK ` H NH, we Tryptophan 2⁄7 (Trp) a | É Ls CONH Ñ 2 › Ề rr COC00H —*~ € TT 0605000 s ‘ bu H H H
Indole-3-acetamide Iadole-3-pyruvic acid Indole-3-lactic acid
( IAAm) \ (IPyA) (ILA)
\ | ` \ (hoe — Ty UP % , _— I H N H 1 ‘\ Indole-3-acetaldehyde Tryptophol N (IAAtd) (Tol) ` vã th H Indole-3-acetic acid (IAA)
Hình 1.3 Sơ đồ lộ trình sinh tong hgp IAA 6 Enterobacter cloacae
Koga et al (1991)
Từ kết quả nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp IAA từ tiền chất tryptophan ở
vi khuẩn Ez/erobacter cloacae cia Koga et al (1991) cho thay trong các điều
kiện có oxy phan lớn (50 - 90% ) lượng IAA được tạo ra chủ yêu bằng lộ
trình indole-3-pyruvic acid Đồng thời ở các điều kiện có chất khử thì indole-
3-pyruvic acid và indole-3-acetaldehyde (các chất trung gian của lộ trình) lần lượt bị khử thành indole-3-lactic acid và tryptophol nên hàm lượng IAA được
Trang 31tổng hợp bị giảm, do d6 indole-3-lactic acid và tryptophol có thể là các sản
phẩm tích ly quan trọng liên quan đến sự điều hòa sinh tổng hợp IAA 1.3.3 Các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải lân
Lân đóng vai trò là nguồn đinh dưỡng thiết yếu, cần thiết cho cây trồng và các
vi sinh vật sống trong đất Lân dễ tiêu trong đất giúp cho hệ rễ phát triển tốt,
tác động trực tiếp đến quá trình trao đổi chất của cây trồng và là thành phần
không thể thiếu tổng hợp ATP, ADP, AMP Phospho có tác dụng thúc đây sự
phát triển và tăng khả năng chống chịu của cây trồng
Hàm lượng lân trong đất (ở hầu hết các loại đất Việt Nam) đều rất thắp (từ
0,02 — 0,15% ở lớp đất trồng 0 — 30 em) không đủ cho nhu cầu của các loại
cây trồng Mà lân trong đất thường ở dạng khó tiêu nên cây hấp thu được rất ít
(Cao Ngọc Điệp, Bùi Thị Kiều Oanh, 2006)
Do vậy, người ta không ngừng bón vào đất các hợp chất lân hóa học làm tích tụ một lượng lân khó tiêu trong đất gây ảnh hưởng đến năng suất của cây trông và gây ô nhiêm mơi trường dat
Lân khó tiêu là các dạng lân tồn tại trong đất dưới dạng các phức chất khó
tiêu mà cây trồng không thể trực tiếp hấp thu được Phân lân hóa học (DAP,
Super lân, lân nung chảy) hay phân lân tự nhiên (apatit, phosphorit) là những dạng lân khó tiêu trong dung dịch đất Số dễ tan như DAP, Super lân thì sau một thời gian bón vào đất, cũng bị đất kết tủa thành không tan (Nguyễn Xuân
Thành và ctv, 2003)
Nhiều nghiên cứu đều cho rằng sự phân giải Ca;(PO¿); và các hợp chất lân
khó tiêu khác có liên quan mật thiết đến sự sản sinh acid trong quá trình sống
của vi sinh vật Các vi sinh vật có khả năng hịa tan lân khó tiêu bằng cách
tổng hợp dinh dưỡng và tiết ra ngoài những acid hữu cơ như acid lactic, acid
Trang 32glycolic, acid citric, acid 2-keto-glunonic, acid malic, acid oxalic Nhimg acid hữu cơ này thay thé acid sunphuric để cắt đứt các ion orthophosphat
(PO) để tao ra các lân ở thể hòa tan mà cây trồng có thể hấp thu dé dang
Trong đó acid carbonic rat quan trọng Chính H;CO; làm cho Ca;(PO¿); phân giải
Quá trình phân giải lân được biểu diễn bằng phương trình sau:
Ca;(PO¿)› +4H:O + 4CO; —> 2Ca(HCO;); + Ca(H;PO¿);
Trong đất, vi khuẩn nitrat hóa và vi khuẩn chuyên hóa S cũng có tác dụng quan trọng trong việc phân giải Ca(H;PO¿); (Lưu Hồng Mẫn, 2004)
Các VSV hòa tan phosphate làm cho phosphate khó tan có thể thành dạng hịa
tan bằng q trình acid hóa và làm giảm pH do các acid hữu cơ do vi khuẩn
tiết ra nhiều ion H* (Lin et al, 2006)
Q trình hịa tan các hợp chất khó tiêu có thể theo cơ chế : Lân khó tiêu được tạm thời đồng hóa bởi vỉ sinh vật, sau đó lân được giải phóng khỏi vi sinh vật dưới dạng dé tiêu mà cây trồng có thể đồng hóa được
Người ta thường phân lập tuyển chọn chủng VSV phân giải lân từ đất hoặc từ
vùng rễ cây trồng nên các loại đất hay cơ chất giàu hữu cơ theo phương pháp
ni cấy pha lỗng trên môi trường đặc Pikovskaya Khi đó các chủng vi sinh
vật phân giải lân sẽ tạo vòng phân giải, tức là vòng tròn trong suốt bào quang
khuẩn lạc Vòng phân giải được hình thành nhờ khả năng hòa tan hợp chất
phospho không tan được bổ sung vào môi trường nuôi cấy Căn cứ vào đường kính vịng phân giải, thời gian hình thành và độ trong của vòng phân giải người ta có thể đánh giá chính xác mức độ phân giải các hợp chất của chúng
bằng cách phân tích hàm lượng lân dễ tan trong môi trường nuôi cây có chứa
Trang 33loại phosphate không tan Tỷ lệ (%) giữa hàm lượng lân tan và lân tổng số
trong môi trường được gọi là hiệu quả phân giải
Vi sinh vat phân giải lân, vi sinh vật chuyền hóa lân (Phosphate Solubilizing Microorganisms - PSM) là các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa hợp chất
phosphate khó tan thành dạng dễ tiêu cho cây trồng sử dụng Vi sinh vật phân
hủy lân hữu cơ chủ yếu thuộc 2 chi Bacillus va Pseudomonas Cac lồi có
khả năng phân giải mạnh 1a: B.megaterium, Serratia, B.subtilis, Serratia,
Proteus, Arthrobster
Vi khuan: Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Agrobacterium, Aerobacter, Brevibacterium, Micrococcus, Flavobacterium, Alcaligenes, Achromobacter, Flavobacterium, Flavobacterium.Xa khuan: Streptomyces Nam: Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Sclerotium
Nhưng thông thường để sản xuất phân lân vi sinh vật người ta có gắng tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy nhiều loại hợp chất phospho và vô cơ khác nhau Chủng vi sinh vật có kha năng phân giải hợp chất phospho cao chưa hẳn là có ảnh hưởng tốt đến cây trồng Ngồi hoạt tính
phân giải lân, nhiều chủng vi sinh vật cịn có các hoạt tính sinh học khác gây
ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng, phát triển và năng suất cây trồng Do vậy sau
khi đánh giá khả năng phân giải lân, các chủng vi sinh vật dùng để sản xuất phân lân vi sinh cần được đánh giá ảnh hưởng đến đối tượng cây trồng sử
dụng Chỉ sử dụng chủng vi sinh vật vừa có hoạt tính phân giải lân cao vừa
không gây ảnh hưởng xấu đến cây trồng và môi trường sinh thái Năm 2009,
Nguyễn Thành Dũng đã đưa ra kết quả hai dòng vi khuan Burkhoderia
tropica va Enterobacter cloacae cé kha nang phan giải lân, cố định đạm và sản
sinh ra IAA cao trong số các loài VSV phân lập được ở huyện Vĩnh Thuận tỉnh
Kiên Giang
Trang 341.3.4 Enterobacter cloacae Giới : Bacferia Nganh: Proteobacteria Lớp : GammaProteobacteria Bo _ : Enterobacteriales Họ : Emferobacteriaceae Chi: Enterobacter
Loai_: Enterobacteria cloacae
(http://ijs.sgmjournals.org/content/54/6/2155 full)
E.cloacae là vi khuẩn Gram âm, hình que, có tiên mao, kích thước từ 0.3-0.6 x 0.8-2.0 im, oxidase-âm tính, catalase-dương tính, phát triển tối ưu ở nhiệt
độ 37°C, đi chuyên nhờ các tiên mao E.cloacae 1a vi khuẩn ky khí tùy nghỉ
Tế bào vi khuẩn có thẻ tạo ra ATP trong điều kiện hơ hấp hiếu khí, khi có mặt
oxy và chuyển sang lên men nếu khơng có oxy Vi khuẩn này cho kết quả
dương tỉnh với Beta-galactosidase, arginine dihydrolase, ornithine decarboxylase, sit dung citrate, phan gidi nitrate va phan tng với Voges- Proskauer, E.cloacae sử dụng một số nguồn cacbon và sinh ra acid Theo
Koga (1991) thì Z.eloaeae có khả năng tổng hợp IAA trong điều kiện có oxy
(50-90%)
E.cloacae phát triển tốt trong môi trường, làm môi trường từ màu đỏ tía (tím)
chuyển Sang màu vàng Khuẩn lạc hình trịn, mịn, bóng, có màu vàng nhạt trên môi trường carbonate agar yeast extract-dextrose-calcium, và tạo vòng
phân giải màu nâu nhạt
Trang 351.3.5 Burkhoderia tropica Giới : Bacferia Ngành: Proteobacteria Lớp : BefaProteobacteria Bộ: Burkholderiales Họ : Burkholderiaceae Chi: Burkholderiaceae
Loai_ : Burkholderia tropica
(http://ijs.sgmjournals.org/content/54/6/2 155, full)
Vi khudn Burkholderia séng ở vùng rễ của nhiều loại cây khác nhau Các vi
khuan thuée giéng Burkholderia duge phan lập từ vùng rễ của các loại cây như bắp, mia, ca phê, lúa cỏ Burkholderia thuéc nhém vi khuẩn Gram âm, có thể di chuyển nhờ tiên mao Chúng sinh trưởng và phát triển trong điều
kiện hiếu khí hoặc kị khí, nhưng khi thiếu oxy thì phát triển mạnh nhất
B.tropica té bao dạng cầu, chiều dai khoảng 1.5-1.6 pm và chiều rộng là 0.7—
0.8 um Chúng xuất hiện dạng đơn và tạo vỏ Chúng có từ 1 đến 4 roi Gram
âm, oxidase và catalase dương tính Trên môi trường bán đặc LGI-P những
khuẩn lạc nhỏ có màu vàng hay trắng đục
Trang 36CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Chủng giống
Ching VSV Burkholderia tropica va Enterobacter cloacae duge cung cap tir
phịng thí nghiệm Vi Sinh, Viện Cây ăn quả miền Nam
2.1.2 Hóa chất sử dụng
Hóa chất dùng để chuẩn bị các nghiệm thức thí nghiệm: Succrose, dầu thực vật, glycerol, chất bám dính, phân lân (P;Os), đạm (N), nước may
Hóa chất chuẩn bị môi trường Pikovskaya:
Trang 372.1.3 Dụng cụ và thiết bị
Dụng cụ: Bình nhựa có nắp
Đĩa petri, đũa khuấy, que cấy
Erlen 1000ml, cốc thủy tỉnh, eppendo£ Micropipette
Thiét bi: Can phan tich
Nồi hấp khử trùng Autocalve pH kế Tủ cấy vi sinh Tủ ủ nhiệt, tủ lạnh Buông đếm khuẩn lạc Máy ảnh kỹ thuật số
2.2 Phương pháp nghiên cứu
Dựa theo kết quả “nghiên cứu phát triển chế phẩm vi sinh cải tạo đất nông
nghiệp Đồng bằng sông Cửu Long” của Nguyễn Thị Ngọc Trúc với nồng độ
đường thích hợp cho sự phát triển sinh khối của hai dòng vi khuẩn BTEC là 3g/ tiến hành thí nghiệm bổ sung các chất có khả năng hạn chế sự lây nhiễm
của các VSV khác, hoặc tăng nguồn cơ chất thích hợp cho sự gia tăng sinh
khối của BTEC
Trang 382.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.2.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của việc bồ sung các chất nhũ hóa trong thành phân của dung dich chất mang đối với sự phát triển của hai
chủng vi sinh vật Burkholderia tropica va Enterobacter cloacae
Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm 1
Nghiệm Dung dich chất mang
thức
ĐC Nước
Cut Nước + 3% succrose
CT2 Nước + 3% sueerose + 1% dầu ăn CT3 Nước + 3% succrose + 1% glycerol
CT4 Nước + 3% succrose +1% chất bám dính
CT5 Nước + 3% succrose+ 1% P20; + 1.8 % N
CT6 Nude + 3% succrose + 1% P2305 + 1.8% N+ 1% chat bam dinh
Tién hanh thi nghiém bé sung cac chất có khả năng nhũ hóa nước, hoạt động bề mặt như glycerol, chất bám đính, dầu thực vật vào dung dịch chứa 3%
sucrose làm chất mang cho hai dong vi khuan Burkholderia tropica va Enterobacteria cloacae Thí nghiệm được bố trí theo kiêu ngẫu nhiên I yếu tố
Trang 39với 6 nghiệm thức và l nghiệm thức đối chứng (ĐC) Mỗi nghiệm thức có 5
lần lặp lại (bảng 2.1)
Các công thức chất mang được bố trí vào các bình nhựa có nắp đậy khoảng 5
lit/binh, sau đó tiến hành chủng giống VSV BTEC 25ml/I dung dịch chất mang vào các nghiệm thức thí nghiệm
Các chỉ tiêu theo đõi: mật số VSV, pH, độ nhiễm, màu sắc môi trường dung
dịch chất mang ở các nghiệm thức
2.2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của việc bồ sung glycerol ở các nông độ khác nhau trong trong dung dịch chất mang đối với sự phát triển của hai
dong vi sinh vat Burkholderia tropica va Enterobacter cloacae
Báng 2.2 Bồ trí thí nghiệm 2
Nghiệm thức Dung dịch chất mang
ĐC Nước
NTI Nude + 3% Succrose + 1% glycerol
NT2 Nude + 3% Succrose + 5% glycerol NT3 Nước + 3% Succrose + 10% glycerol
NT4 Nude + 3% Succrose + 1% P30; + 1.8 % N+ 1% glycerol NT5 Nước + 3% Succrose + 1% PO; + 1.8 % N + 5% glycerol
NT6 Nước + 3% Succrose + 1% P20; + 1.8 % N + 10% glycerol
Trang 40
Tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của glycerol ở các nồng độ 1%, 5%,
10% khi bổ sung vào các dung dịch chất mang đối với sự phát triển và nhân
sinh khối của hỗn hợp VSV BTEC Thí nghiệm gồm có 6 nghiệm thức và 1
nghiệm thức đối chứng, được bồ trí vào các bình nhựa có nap (5 lit/binh), méi nghiệm thức có 5 lần lặp lại (bảng 2.2)
Sau đó tiến hành chủng giống VSV BTEC 25 ml/I dung dich chat mang vao
các nghiệm thức thí nghiệm
Các chỉ tiêu theo déi: mật số vi sinh, pH, độ nhiễm, màu sắc của môi trường
dung địch chất mang ở các nghiệm thức
2.1.2 Phương pháp thu mẫu và đo pH
Ba ngày sau khi chủng BT EC, ta tiến hành thu mẫu VSV, dùng micropipette
hút 1ml dung dịch mẫu từ các nghiệm thức cho vào eppendof và trữ lạnh ở
nhiệt độ dưới 20°C Đồng thời đo pH của các nghiệm thức bằng pH kế Dùng
đũa khuấy, khuấy đều dung dịch VSV trước khi thu mẫu và đo pH Chu kỳ thu mẫu và đo pH 3 hoặc 4 ngày/ lần
Theo dõi và ghi nhận sự thay đổi màu sắc, độ nhiễm của các nghiệm thức
2.1.3 Phương pháp tính mật số V'SV bằng cách đắm khuẩn lạc
Đối với vsv đơn bào, ta có thể xem mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển
từ một tế bào ban đầu ( Lê Minh Tâm, 2007) Do vay, dé tinh mật số VSV ta
lay 0.1ml dung dịch chứa sinh khối VSV pha lỗng trong eppendof có chứa 0.9ml dung dich nước muối sinh lí Sau đó tiếp tục pha loãng nồng độ xuống 102, 103, 10', 10° hút 0.1 ml dung dịch đã pha loãng trãi đều lên đĩa petri
chứa môi trường Pikovskaya đã được chuẩn bị