Nghiên cứu hoạt tính và cơ chế kháng khuẩn của tinh dầu màng tang (litsea cubeba) đối với vi khuẩn gây bệnh và khả năng ứng dụng trong nuôi trồng thuỷ sản (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN HẢI VÂN NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH VÀ CƠ CHẾ KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU MÀNG TANG (LITSEA CUBEBA) ĐỐI VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG NI TRỒNG THUỶ SẢN Ngành: Cơng nghệ Thực phẩm Mã số: 9540101 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Hà Nội - 2018 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Chu Kỳ Sơn TS Samira Sarter Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi …… giờ, ngày … tháng … năm ……… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Khai thác nuôi trồng thuỷ sản ngành phát triển nhanh nguồn cung cấp protein quan trọng cho người Việt Nam đứng top nước nuôi trồng thuỷ sản giới Tuy nhiên, bùng phát Aeromonas hydrophila Vibrio parahaemolyticus gây nên tổn hại to lớn mặt kinh tế Kháng sinh thường sử dụng thủy sản với mục đích ngăn ngừa nhiễm trùng vi khuẩn Tuy nhiên, việc lạm dụng sử dụng không cách thuốc kháng sinh nguyên nhân dẫn đến phát triển vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh Thêm vào đó, gen kháng kháng sinh thể lây truyền ngang vi sinh vật – động vật – người (Witte, 2000) Ngày có nhiều nghiên cứu liên quan đến việc sử dụng hợp chất kháng sinh tự nhiên ví dụ sản phẩm từ thực vật Tinh dầu (TD) sản phẩm trao đổi chất bậc hai lồi thực vât, chiết xuất từ nhiều phận khác thực vật, ví dụ hoa (nhài, oải hương…), (màng tang, húng quế…), thân (quế…), (màng tang, hồi…) TD chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt hoạt tính kháng khuẩn Khả kháng khuẩn TD phụ thuộc vào thành phần hố học có mặt TD vi sinh vật Cơ chế kháng khuẩn TD chứng minh qua nghiên cứu Tính chất kỵ nước TD giúp cho chúng dễ dàng xâm nhập vào tế bào thông qua tương tác TD với màng tế bào TD gây số tác động như: làm hư hại thành tế bào tế bào chất, đông tụ tế bào chất, rối loạn chức protein màng tế bào, tăng tính thấm màng tế bào dẫn đến tổn thất chất nội bào, làm giảm lực proton, giảm hàm lượng ADN, giảm hàm lượng ATP tế bào thông qua việc giảm trình tổng hợp ATP làm giảm điện màng tế bào tăng tính thấm màng tế bào (Li, 2016; Zengin, 2014; Cui, 2015; Li, 2014) Nhiều nghiên cứu tiềm ứng dụng TD chất chiết từ thực vật thuỷ sản Trên thực tế, hợp chất thiên nhiên có tác dụng làm tăng tiêu tăng trưởng, tiêu miễn dịch khả phòng chống tác nhân gây bệnh cho động vật thuỷ sản Việt Nam có tiềm khai thác nguồn TD lớn, nghiên cứu khả kháng khuẩn TD Việt Nam ngày quan tâm Tuy nhiên, số lượng nghiên cứu chế kháng khuẩn ứng dụng chất chiết thực vật thuỷ sản hạn chế Vì lý trên, chúng tơi chọn đề tài “Nghiên cứu hoạt tính chế kháng khuẩn tinh dầu màng tang (Litsea cubeba) vi khuẩn gây bệnh khả ứng dụng nuôi trồng thuỷ sản” cho luận án tiến sỹ Mục tiêu nghiên cứu • Sàng lọc TD để chọn TD có hoạt tính kháng khuẩn tốt Việt Nam vi khuẩn gây bệnh thực phẩm thủy sản • Chứng minh chế kháng khuẩn TD vi khuẩn • Ứng dụng kết nghiên cứu thuỷ sản Nội dung nghiên cứu ND 1: Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn số loại TD từ Việt Nam chủng vi khuẩn kiểm định vi sinh vật phân lập từ thủy sản Escherichia coli, Aeromonas spp., Vibrio spp., … ND 2: Nghiên cứu đa dạng thành phần hóa học khả kháng khuẩn TD (chọn lọc từ Nội dung 1) Việt Nam ND 3: Nghiên cứu chế kháng khuẩn TD bao gồm đánh giá tồn vẹn màng tế bào, kiểm tra tính thấm màng tế bào, tỉ lệ vi khuẩn sống chết, hình thái kích thước vi khuẩn, tổn thương ADN ND 4: Ứng dụng vào thủy sản tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) cá chép (Cyprinus carpio) Việt Nam Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án 4.1 Ý nghĩa khoa học - Đã chứng minh hoạt tính kháng khuẩn loại TD Việt Nam vi khuẩn gây bệnh thường gặp thực phẩm thủy sản - Đã thành phần hóa học hoạt tính 25 TD màng tang Litsea cubeba Việt Nam số vi khuẩn gây bệnh thường gặp - Đã chứng minh chế kháng khuẩn TD màng tang L cubeba chứa thành phần hóa học khác (1,8-cineole linalool) E coli 4.2 Giá trị thực tiễn - Việc áp dụng thành công kết nghiên cứu quy mơ phòng thí nghiệm đối tượng tơm thẻ chân trắng cá chép phòng trị bệnh giúp giảm thiểu tình trạng lạm dụng kháng sinh thủy sản - Việc thay kháng sinh sản phẩm có nguồn gốc thực vật giúp giảm thiểu tình trạng kháng kháng sinh động vật ngày tăng cao Việt Nam giới, đồng thời khắc phục hậu kinh tế đề kháng kháng sinh - Các kết đề tài sử dụng làm tài liệu tham khảo cho giảng dạy, nghiên cứu khoa học ứng dụng thực tế sản xuất, đồng thời mở nhiều hướng nghiên cứu tương lai Những điểm luận án - Kết nghiên cứu kết đóng góp vào sở liệu thành phần hoá học khả kháng khuẩn màng tang Việt Nam - Là cơng trình (ở Việt Nam) nghiên cứu chế kháng khuẩn TD màng tang L cubeba vi khuẩn Escherichia coli - Là cơng trình đánh giá hiệu bước đầu bột màng tang L cubeba cá chép TD màng tang L cubeba tôm thẻ chân trắng Bố cục luận án Luận án trình bày 134 trang: mở đầu (3 trang), tổng quan tài liệu (36 trang), vật liệu phương pháp nghiên cứu (16 trang), kết thảo luận (59 trang, 12 bảng, 21 hình), kết luận kiến nghị (2 trang), danh mục cơng trình cơng bố (1 trang) tài liệu tham khảo (21 trang với tài liệu tiếng Việt 199 tài liệu tiếng Anh) CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tinh dầu-sản phầm nguồn gốc thực vật thay kháng sinh bao gồm 05 tiểu mục 1.1.1 Định nghĩa hoạt tính sinh học TD 1.1.2 Thành phần hóa học TD: bao gồm nhóm terpene, phenylpropanoid, số thành phần hố học chứa nitơ lưu huỳnh 1.1.3 Khả kháng khuẩn TD: giới thiệu chung khả kháng khuẩn TD đối tượng nghiên cứu TD màng tang L cubeba 1.1.4 Tăng cường hoạt tính kháng khuẩn TD sử dụng kết hợp với chất kháng khuẩn khác 1.1.5 Cơ chế kháng khuẩn TD: giới thiệu chế TD nghiên cứu 1.2 Thuỷ sản Việt Nam bao gồm 04 tiểu mục 1.2.1 Tổng quan tình hình thuỷ sản Việt Nam 1.2.2 Các động vật thuỷ sản: giới thiệu cá chép C carpio tôm thẻ chân trắng L vannamei 1.2.3 Vi khuẩn gây bệnh thuỷ sản: giới thiệu A hydrophila V parahaemolyticus 1.2.4 Sử dụng kháng sinh thuỷ sản: tình hình sử dụng kháng sinh thuỷ sản hậu việc lạm dụng kháng sinh thuỷ sản Chính vậy, cần tìm nguồn kháng khuẩn để thay việc sử dụng kháng sinh 1.3 Tiềm việc sử dụng chất chiết thực vật thuỷ sản bao gồm 03 tiểu mục 1.3.1 Chất chiết thực vật đóng vai trò tác nhân tăng trưởng 1.3.2 Chất chiết thực vật đóng vai trò tăng cường hệ miễn dịch 1.3.3 Chất chiết thực vật đóng vai trò chất kháng khuẩn CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu - Tinh dầu + 09 TD thương mại bao gồm hương nhu (Ocimum gratissimum), tràm dài (Meulaleuca leucadendron), quế (Cinnamomum loureiri), sẻn hôi (Zanthoxylum rhetsa), hao hoa vàng (Artemisia annua), màng tang (Litsea cubeba), húng quế (Ocimum basilicum), dầu giun (Chenepodium ambrosioides) bạc hà Á (Mentha arvensis) - mua từ công ty AROMA ASIA có nguồn gốc từ tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam + Lá màng tang L cubeba tươi thu tỉnh phía Bắc Việt Nam, mẫu gửi đến định danh lưu Bảo tàng Thực vật học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam (VNUA) 25 TD màng tang L cubeba tách chiết phương pháp chưng cất lôi theo nước - Kháng sinh: khoanh giấy kháng sinh amikacin 30 g/đĩa (AK30) cefoxitin 30 g/đĩa (FOX30) (Lifochem), kháng sinh dạng bột oxytetracycline (OTC) nalidixic axit (Sigma Aldrich) - Vi khuẩn: + 10 chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm vi khuẩn Gram (-): Salmonella enterica subsp enterica serovar Typhimurium ATCC 14028, E coli ATCC 25922, A hydrophila ATCC 35654, Vibrio furnissii ATTC 35016, V parahaemolyticus ATCC 17802 vi khuẩn Gram (+): Bacillus subtilis ATCC 11774, Listeria innocua ATCC 33090, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Bacillus cereus ATCC 13061 Nghiên cứu đồng thời sử dụng chủng vi sinh vật phân lập từ thủy sản lấy từ vài nguồn sau: + Edwarsiella tarda AR436, Streptococcus garvieae AR759 Phòng thí nghiệm thú ý quốc gia, Montpellier, Pháp cung cấp + V parahaemolyticus ND201 V parahaemolyticus TB81 cảm nhiễm tơm thẻ chân trắng Trung tâm chẩn đốn thú y Trung ương – Hà Nội cung cấp + Vi khuẩn cảm nhiễm cá chép A hydrophila Phòng thí nghiệm Bệnh học (Khoa Thuỷ sản – Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh) cung cấp - Tơm thẻ chân trắng (Littopenaeus vannamei) khỏe mạnh, khối lượng trung bình 5,0 g mua từ Phòng thí nghiệm tư nhân Tiến sĩ Bùi Quang Tề - Cá chép (Cyprinus carpio) giống khoẻ mạnh, khối lượng trung bình 30,0 g, mua từ trại cá giống Viện Thuỷ sản I 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Tách chiết tính hiệu suất thu hồi TD màng tang L cubeba 25 mẫu màng tang L cubeba tách chiết phương pháp chưng cất lôi theo nước (Randrianarivelo, 2009) Hiệu suất thu hồi TD tính theo cơng thức Y = V/Bm, V: thể tích TD tách chiết (mL), Bm: khối lượng tươi ban đầu (g) (Costa, 2014) 2.2.2 Phân tích thành phần hóa học TD Thành phần hố học 09 TD thương mại 25 TD màng tang L cubeba tách chiết phân tích phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) 2.2.3 Phương pháp khoanh giấy khuếch tán dùng để xác định đường kính vòng kháng khuẩn TD vi sinh vật (Wilkinson, 2003) 2.2.4 Phương pháp pha loãng liên tục dùng để xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu MIC nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC (Celiktas, 2007) Sàng lọc tuyển chọn 01 TD có hoạt tính kháng khuẩn tốt dựa đường kính vòng kháng khuẩn giá trị MIC, MBC TD vi sinh vật gây bệnh thường gặp thực phẩm thủy sản Do có khả kháng khuẩn tốt, tiềm khai thác chưa nghiên cứu nhiều Việt Nam, màng tang L cubeba lựa chọn cho nghiên cứu 2.2.5 Tương tác kháng khuẩn TD màng tang L cubeba với chất kháng khuẩn khác (TD kháng sinh) xác định phương pháp bàn cờ, tính tốn giá trị nồng độ ức chế riêng phần (FIC) Tác dụng tương tác bao gồm hiệp đồng (FIC≤0,5), cộng hợp (0,5