Giới thiệu chung về họ cóc và độc tố cócBufadienolid là nhóm các hợp chất steroids 24C chứa vòng pyron tại C17, có nguồn gốc từ một số loài động vật và họ thực vật. Trong động vật, bufadienolid được tìm thấy chủ yếu ở cóc (Bufo), đom đóm (Photinus) và rắn (Rhabdophis), trong đó số lượng cao nhất và đa dạng của các chất đã được chứng minh trong một số loài cóc 8, 17. Cóc là động vật lưỡng cư, thuộc họ Bufonidae có 529 loài khác nhau, cư trú ở khắp mọi nơi trên thế giới. Trong số 529 loài có 16 loài có chất độc bufotoxin, trong đó có loài cóc nhà Việt Nam Bufo melanostictus Schneider. Độc tố cóc (bufotoxin) chỉ có ở một số bộ phận cơ thể: nhựa cóc (ở tuyến sau tai, tuyến trên mắt và các tuyến trên da cóc), trong gan và buồng trứng. Bufotoxin gồm hơn 40 hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau: bufalin, cinobufagin, resibufogenin, bufagin, bufogenin, bufothionin, epinephrine, norepinephrin, serotonin…Trong đó có những chất được xếp vào nhóm không gây độc bao gồm cholesterol, provitamin D, ergosterol và gamma sitosteral. Những chất gây độc được xếp thành 3 nhóm: Nhóm 1: Các glycosis có tác dụng lên tim (hay bufadienolid) chủ yếu gồm bufalin, cinobufagin và resibufogenin có tác động trên hệ tim mạch của động vật và con người.Nhóm 2: Phenethylamines và dẫn xuất. Bao gồm các catecholamines như: dopamin, norepinephrin và epinephrin.Nhóm 3: Tryptamines và dẫn xuất: serotonin, bufotenin, 5methoxyN,Ndimethyltryptamin (5MeODMT) chúng có tác dụng tăng huyết áp và gây ảo giác và hưng thần (psychoactive) 13.
MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1: Một số loài cóc có độc giới Hình 1.2: Một số sản phẩm có nguồn gốc từ cóc 10 Hình 1.3: Mô hình hệ thống LC - MS/MS .…25 Hình 1.4: Kỹ thuật APCI với chế độ bắn phá ion dương 27 Hình 1.5: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI .28 Hình 1.6: Cấu tạo phân tích khối tứ cực chập ba 31 Hình 1.7: Các bước trình chiết pha rắn 33 Hình 2.1: Hệ thống máy LC - MS/MS .44 Hình 3.1: Cơ chế phân mảnh bufalin 49 Hình 3.2: Sắc đồ tổng ion mẫu chất chuẩn ba bufadienolid 500 ng/ ml hai ion bufalin .51 Hình 3.3: Sắc đồ ba bufadienolid dùng dung môi pha động acid HCOOH 0,1% 54 Hình 3.4: Sắc đồ bufadienolid chế độ gradient 56 Hình 3.5: Sắc đồ rửa giải bufadienolid với tốc độ dòng ml/ phút 58 Hình 3.6: Quy trình xử lý mẫu dự kiến 61 Hình 3.7: Ảnh hưởng dung môi chiết đến hiệu suất thu hồi bufadienolid mẫu bột cóc 63 Hình 3.8: Ảnh hưởng dung môi chiết đến hiệu suất thu hồi bufadienolid mẫu xương cóc 64 Hình 3.9: Ảnh hưởng thể tích dung môi chiết đến hiệu suất chiết bufadienolid mẫu bột cóc 65 Hình 3.10: : Ảnh hưởng thể tích dung môi chiết đến hiệu suất chiết bufadienolid mẫu xương cóc 66 Hình 3.11: Ảnh hưởng dung môi rửa giải đến hiệu suất thu hồi bufadienolid mẫu bột cóc 69 Hình 3.12: Ảnh hưởng dung môi rửa giải đến hiệu suất thu hồi bufadienolid mẫu xương cóc 70 Hình 3.13: Ảnh hưởng thể tích dung môi rửa giải đến suất thu hồi bufadienolid mẫu bột cóc 71 Hình 3.14: Ảnh hưởng thể tích dung môi rửa giải đến suất thu hồi bufadienolid mẫu xương cóc 72 Hình3.15: Quy trình xử lý mẫu tối ưu .73 Hình 3.16: Sắc đồ mẫu trắng bột cóc 75 Hình 3.17: Sắc đồ mẫu trắng bột có thêm chuẩn .75 Hình 3.18: Sắc đồ mẫu chuẩn hỗn hợp ba bufadienolid 500 ng /ml 75 Hình 3.19: Đường chuẩn bufalin mẫu bột cóc 76 Hình 3.20: Đường chuẩn cinobufagin mẫu bột cóc 77 Hình 3.21: Đường chuẩn resibufogenin mẫu bột cóc .77 Hình 3.22: Đường chuẩn bufalin mẫu xương cóc .78 Hình 3.23: Đường chuẩn cinobufagin mẫu xương cóc .78 Hình 3.24: Đường chuẩn resibufogenin mẫu xương cóc 78 Hình 3.25: Sắc đồ bufalin giới hạn phát LOD 1,25 µg/kg 25 Hình 3.26: Sắc đồ resibufogenin giới hạn phát LOD 2,5 µg/kg 80 Hình 3.27: Sắc đồ cinobufagin giới hạn định lượng LOQ 5,0 µg/kg 80 Hình 3.28: Sắc đồ resibufogenin giới hạn định lượng LOD 10,0 µg/kg 80 Hình 3.29: Sắc đồ mẫu bột cóc thêm chuẩn bufadienolid mức nồng độ 500 µg/kg 82 Hình 3.30: Sắc đồ mẫu xương cóc thêm chuẩn bufadienolid mức nồng độ 500 µg/kg 83 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Cấu tạo tính chất bufalin, cinobufagin, resibufogenin Bảng 1.2: Thống kê vụ ngộ độc ăn cóc sản phẩm chế biến từ cóc Bảng 1.3: Các phương pháp xác định nhóm độc tố bufadienolid 12 Bảng 1.4: Đánh giá độ lặp lại phương pháp theo hội đồng Châu Âu 2002/657/EC .37 Bảng 1.5: Đánh giá độ phương pháp theo hội đồng Châu Âu 2002/657/EC .38 Bảng 2.1: Thông tin mẫu nghiên cứu 41 Bảng 3.1: Các thông số tối ưu hóa điều kiện phân mảnh 48 Bảng 3.2: Các thông số tối ưu MS/MS 51 Bảng 3.3: Chương trình chạy gradient .53 Bảng 3.4:Ảnh hưởng dung môi pha động đến thời gian lưu diện tích pic 53 Bảng 3.5: Khảo sát chương trình chạy gradient 55 Bảng 3.6: Kết khảo sát gradient 56 Bảng 3.7: Khảo sát tốc độ dòng pha động 57 Bảng 3.8: Chương trình gradient tối ưu .58 Bảng 3.9: Khảo sát quy trình xử lý mẫu 60 Bảng 3.10: Khảo sát dung môi chiết với mẫu bột cóc .62 Bảng 3.11: Khảo sát dung môi chiết với mẫu xương cóc 63 Bảng 3.12: Khảo sát thể tích dung môi chiết với mẫu bột cóc 65 Bảng 3.13: Khảo sát thể tích dung môi chiết với mẫu xương cóc .66 Bảng 3.14: Khảo sát cột chiết pha rắn .67 Bảng 3.15: Khảo sát dung môi rửa giải với mẫu bột cóc 68 Bảng 3.16: Khảo sát dung môi rửa giải với mẫu xương cóc .69 Bảng 3.17: Khảo sát thể tích dung môi rửa giải với mẫu bột cóc .71 Bảng 3.18: Khảo sát thể tích dung môi rửa giải với mẫu xương cóc .72 Bảng 3.19: Ion mẹ ion bufadienolid .74 Bảng 3.20: Phương trình đường chuẩn bufadienolid mẫu bột cóc 76 Bảng 3.21: Phương trình đường chuẩn bufadienolid mẫu xương cóc77 Bảng 3.22: Giới hạn phát giới hạn định lượng bufadienolid 79 Bảng 3.23: Độ lặp lại hiệu suất thu hồi bufadienolid mẫu bột cóc .81 Bảng 3.24: Độ lặp lại hiệu suất thu hồi bufadienolid mẫu xương cóc 82 Bảng 3.25: Kết phân tích bufadienolid mẫu phẩm làm từ cóc 84 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT Kí hiệu ACN AOAC APCI EI ESI GC-MS HPLC NP-HPLC RP-HPLC HSCCC LC-MS/MS LD50 LOD LOQ MeOH MS Tiếng Anh Acetonitrile Association of Official Analytical Tiếng Việt Acetonitril Hiệp hội cộng đồng phân Community Atmospheric pressure chemical tích thức Chế độ ion hóa áp suất ionization Electron Impact Electrospray ionization Gas chromatography mass khí Va chạm electron Ion hóa phun điện tử spectrometry High performance liquid chromatography Normal phase high performance Sắc ký khí khối phổ Sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký lỏng hiệu cao liquid chromatography Reversed phase high performance pha thuận Sắc ký lỏng hiệu cao liquid chromatography High speed countercurrent pha đảo Sắc kí ngược dòng tốc độ chromatography Liquid chromatography tandem cao Sắc ký lỏng ghép khối phổ mass spectrometry Lethal Dose Limit of detection Limit of quantification Methanol Mass spectrometry hai lần Liều gây chết trung bình Giới hạn phát Giới hạn định lượng Methanol Khối phổ PDA TLC TOF RSD SD SDS SPE LLE R(%) UFLC UPLC Photodiode array Thin layer chromatography Time of flight analyser Relative standard devition Standard deviation Sodium dodecyl sulfate Solid phase extraction Liquid liquid extraction Recovery Ultra fast liquid chromatography Ultra performance liquid chromatography Dãy diod quang Sắc ký mỏng Bộ phân tích thời gian bay Độ lệch chuẩn tương đối Độ lệch chuẩn Natri dodecyl sulfat Chiết pha rắn Chiết lỏng lỏng Hiệu suất thu hồi Sắc ký lỏng siêu nhanh Sắc ký lỏng siêu hiệu MỞ ĐẦU Hiện nay, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm nhận quan tâm lớn toàn xã hội Các vụ ngộ độc thực phẩm ngày gia tăng, có ngộ độc ăn sản phẩm từ cóc nhiễm độc tố cóc dẫn đến nhiều trường hợp tử vong bùng lên nỗi lo âu cho người tiêu dùng Bufadienolid nhóm hợp chất steroids 24C chứa vòng pyron C-17 số lượng cao đa dạng chất chứng minh số loài cóc Cóc động vật lưỡng cư, thuộc họ Bufonidae có 529 loài khác nhau, cư trú khắp nơi giới [17] Thịt cóc giàu dinh dưỡng (53,37% protit, 12,66% lipit), có nhiều acid amin cần thiết (asparagin, histidin, tyrosin, methionin, leucin), hàm lượng số nguyên tố vi lượng kẽm, mangan cao nhiều so với loài động vật khác Thịt cóc hỗ trợ tăng cường dinh dưỡng cho người sau ốm dậy, thực phẩm bổ dưỡng cho người già, trẻ em suy dinh dưỡng, chán ăn, chậm lớn, còi xương Trong Đông y dân gian, nhựa cóc, gan cóc sử dụng để chống sưng, tiêu viêm dạng cao, dùng da điều trị nhọt độc, đầu đinh, sưng tấy [2] Tuy nhiên, số 529 loài cóc có 16 loài chứa chất độc bufotoxin, có loài cóc nhà Việt Nam Bufo melanostictus Schneider Độc tố bufotoxin thường gặp phận da, trứng, gan, ruột nhựa cóc (ở tuyến sau tai, tuyến mắt tuyến da cóc) Các bufadienolid thường gặp độc tố cóc bufalin, cinobufagin resibufogenin, bufotalin, 19-hydroxy bufalin số hợp chất khác Các bufotoxin nguyên nhân phần lớn vụ ngộ độc ăn sản phẩm làm từ cóc [7, 8] Trên giới có nhiều phương pháp xác định đồng thời bufadienolid đối tượng khác phương pháp sắc ký mỏng, sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao, sắc ký khí ghép khối phổ sắc ký lỏng hiệu cao (ghép nối với detector UV, PDA, MS, MS/MS) Phương pháp sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần có nhiều ưu điểm chọn lọc, độ nhạy độ xác cao, đặc biệt phân tích đồng thời chất mẫu sinh học phức tạp Hiện nay, Việt Nam chưa có nghiên cứu xác định đồng thời bufadienolid mẫu phẩm từ cóc Vì vậy, để góp phần kiểm soát nguy tiềm ẩn ngộ độc độc tố cóc chọn đề tài: “Xác định đồng thời ba bufadienolid số mẫu phẩm từ cóc phương pháp sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần (LC - MS/MS)” 10 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu bufadienolid 1.1.1 Giới thiệu chung họ cóc độc tố cóc Bufadienolid nhóm hợp chất steroids 24C chứa vòng pyron C-17, có nguồn gốc từ số loài động vật họ thực vật Trong động vật, bufadienolid tìm thấy chủ yếu cóc (Bufo), đom đóm (Photinus) rắn (Rhabdophis), số lượng cao đa dạng chất chứng minh số loài cóc [8, 17] Cóc động vật lưỡng cư, thuộc họ Bufonidae có 529 loài khác nhau, cư trú khắp nơi giới Trong số 529 loài có 16 loài có chất độc bufotoxin, có loài cóc nhà Việt Nam Bufo melanostictus Schneider Độc tố cóc (bufotoxin) chỉ có số phận thể: nhựa cóc (ở tuyến sau tai, tuyến mắt tuyến da cóc), gan buồng trứng Bufotoxin gồm 40 hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau: bufalin, cinobufagin, resibufogenin, bufagin, bufogenin, bufothionin, epinephrine, norepinephrin, serotonin…Trong có chất xếp vào nhóm không gây độc bao gồm cholesterol, provitamin D, ergosterol gamma sitosteral Những chất gây độc xếp thành nhóm: - Nhóm 1: Các glycosis có tác dụng lên tim (hay bufadienolid) chủ yếu gồm bufalin, cinobufagin resibufogenin có tác động hệ tim mạch động - vật người Nhóm 2: Phenethylamines dẫn xuất Bao gồm catecholamines như: dopamin, norepinephrin epinephrin 1.3.187 1.3.188 1.3.189 Hình P4.2: Dung môi: acetonitril - mẫu bột cóc xương cóc 1.3.190 1.3.191 1.3.192 Hình P4.3: Dung môi: ethyl acetat - mẫu bột cóc xương cóc 1.3.193 1.3.194 1.3.195 1.3.196 Hình P4.4: Dung môi: chloroform - mẫu bột cóc xương cóc 1.3.197 Phụ lục 5: Sắc đồ khảo sát thể tích dung môi chiết 1.3.198 1.3.199 1.3.200 Hình P5.1: Chiết lần - 5ml MeOH mẫu bột cóc xương cóc 1.3.201 1.3.202 1.3.203 Hình P5.2: Chiết lần - 5ml MeOH mẫu bột cóc xương cóc 1.3.204 1.3.205 1.3.206 Hình P5.3: Chiết lần - 10ml MeOH mẫu bột cóc xương cóc 1.3.207 1.3.208 1.3.209 Hình P5.4: Chiết lần - 10ml MeOH mẫu bột cóc xương cóc 1.3.210 Phụ lục 6: Sắc đồ khảo sát dung môi rửa giải 1.3.211 1.3.212 1.3.213 Hình P6.1: 0,1% CH3COOH methanol mẫu bột cóc xương cóc 1.3.214 1.3.215 1.3.216 Hình P6.2: 0,5% CH3COOH methanol mẫu bột cóc xương cóc 1.3.217 1.3.218 1.3.219 1.3.220 Hình P6.3: 1% CH3COOH methanol mẫu bột cóc xương cóc 1.3.221 1.3.222 1.3.223 1.3.224 1.3.225 1.3.226 1.3.227 1.3.228 1.3.229 1.3.230 1.3.231 1.3.232 Phụ lục 7:Sắc đồ khảo sát thể tích dung môi rửa giải 1.3.233 1.3.234 1.3.235 Hình P7.1: ml dung dịch acid acetic 0,1% methanol mẫu bột cóc xương cóc 1.3.236 1.3.237 1.3.238 Hình P7.2: ml dung dịch acid acetic 0,1% methanol mẫu bột cóc xương cóc 1.3.239 1.3.240 1.3.241 Hình P7.3: ml dung dịch acid acetic 0,1% methanol mẫu bột cóc xương cóc 1.3.242 1.3.243 1.3.244 1.3.245 1.3.246 1.3.247 1.3.248 1.3.249 1.3.250 1.3.251 1.3.252 Phụ lục 8: Sắc đồ số điểm chuẩn 1.3.253 1.3.254 1.3.255 Hình P8.1: Điểm chuẩn 50ppb bột cóc xương cóc 1.3.256 1.3.257 1.3.258 Hình P8.2: Điểm chuẩn 100ppb bột cóc xương cóc 1.3.259 1.3.260 1.3.261 Hình P8.3: Điểm chuẩn 200ppb bột cóc xương cóc 1.3.262 1.3.263 1.3.264 1.3.265 Hình P8.4: Điểm chuẩn 500ppb bột cóc xương cóc 1.3.266 Phụ lục 9: Sắc đồ số mẫu thực tế 1.3.267 1.3.268 Hình P9.1: Bột cóc royal Baby 1.3.269 1.3.270 Hình P9.2: Xương cóc 1.3.271 1.3.272 Hình P9.3: Thuốc đen 1.3.273 1.3.274 Hình P9.4: Thiềm ô châu 1.3.275 1.3.276 Hình P9.5: Gan cóc 1.3.277 1.3.278 Hình P9.6: Trứng cóc pha loãng 10 lần 1.3.279 1.3.280 Hình P9.7: Da cóc pha loãng 40 lần 1.3.281 1.3.282 Hình P9.8: Nhựa cóc 0,1779g pha loãng 50 lần [...]... rất nhiều các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu nhóm độc tố bufadienolid bằng nhiều phương pháp như sắc ký bản mỏng (TLC), sắc ký ngược dòng tốc độ cao (HSCCC), sắc ký khí ghép khối phổ ( GC – MS/MS), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – UV, PDA), đặc biệt là sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC - MS, LC – MS/MS) trên các đối tượng khác nhau như: thuốc cổ truyền Chansu, dung dịch sinh học (huyết tương... số nghiên cứu khác như cơ chế tiết nhựa, tính độc của nhựa cóc trên động vật… Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào về thành thành phần hóa học trong nhựa cóc 19 1.1.51 Năm 1973, nhóm nghiên cứu do tác giả Phan Quốc Kinh làm chủ đề tài đã nghiên cứu về thành phần hóa học trong nhựa cóc Việt Nam – Bufo melanostictus, các tác giả chỉ ra rằng chủ yếu chứa các chất có cấu trúc nhân sterol Trong báo cáo về... – UV, PDA), đặc biệt là sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC - MS, LC – MS/MS) trên các đối tượng khác nhau như: thuốc cổ truyền Chansu, dung dịch sinh học (huyết tương chó, huyết tương chuột), mẫu sinh học (gan người) Bảng 1.3 tóm tắt một số phương pháp đã được sử dụng để tiến hành xác định nhóm độc tố bufadienolid 20 1.1.56 Bảng 1.3: Các phương pháp xác định nhóm độc tố bufadienolid 1.1.57 P 1.1.58... nhạy thấp - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC kết hợp với các detector UV, PDA cho độ nhạy, độ chọn lọc và độ chính xác thấp, đặc biệt khi phân tích đồng thời các bufadienolid trong nền mẫu sinh học phức tạp - Phương pháp LC - MS/MS có nhiều ưu điểm như độ nhạy cao, rất chọn lọc và độ chính xác cao Trong các nghiên cứu này các tác giả chủ yếu sử dụng nguồn ion hóa là chế độ ion hóa phun điện tử... pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau 1.1.157 Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa, Các ion... máy trực tiếp tác động vào pha lỏng hoặc rắn để tạo thành ion ở thể hơi Có nhiều kỹ thuật ion hóa khác nhau nhưng hai kỹ thuật hay được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ bao gồm: Chế độ ion hóa hóa học áp suất khí quyển (Atmospheric Presure Chemical Ionization-APCI) 1.1.172 Dòng mẫu ở dạng lỏng thoát ra từ cột HPLC được đi qua một nguồn nhiệt cao để nhanh chóng hóa hơi Sau đó, dòng khí này được ion... thành nên ion [M-H]-, [M-nH]n1.1.185 ESI là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao, ESI - MS thích hợp cho cả phân tử có phân tử khối nhỏ (khoảng 100-150 amu) cũng như phân tử khối lớn của các phân tử sinh học, các hợp chất khó bay hơi, không bền nhiệt, phân cực và không phân cực 1.1.186 Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật ion hoá phun điện tử (ESI) bắn phá với chế độ ion dương b Bộ phân tích