Liệu pháp gen trong lịch sử đã được định nghĩa là việc bổ sung các gen mới cho các tế bào của con người. Tuy nhiên, sự ra đời gần đây của công nghệ tái tạo gen đã cho phép một mô hình mới trong đó trình tự bộ gen của con người có thể được thao tác chính xác để đạt được một hiệu quả điều trị. Điều này bao gồm việc sửa đột biến gây bệnh, việc bổ sung các gen trị liệu vào trong trình tự bộ gen, và việc loại bỏ các gen bất lợi trong trình tự bộ gen. Báo cáo này trình bày cơ chế của phương pháp chỉnh sửa bộ gen khác nhau và mô tả các nền tảng nuclease phổ biến, bao gồm nucleases kẽm ngón tay, phiên mã kích hoạt giống như nucleases effector (Talens), meganucleases, và CRISPR / hệ thống Cas9. Sau đó chúng tôi tóm tắt những tiến bộ đạt được trong việc áp dụng chỉnh sửa gen tới các khu vực khác nhau của gen và liệu pháp tế bào, bao gồm cả chiến lược kháng virus, miễn dịch, và điều trị các rối loạn di truyền monogenic. Những thách thức hiện tại và triển vọng tương lai của chỉnh sửa gen và liệu pháp tế bào cũng được thảo luận.
CÔNG NGHỆ CHỈNH SỬA GEN VÀ LIỆU PHÁP TẾ BÀO Morgan L Maeder Charles A Gersbach 2,3,4 Editas Y, Cambridge, Massachusetts, USA Department of Biomedical Engineering, Đại học Duke, Durham, Bắc Carolina, Hoa Kỳ Center cho Gen Sinh Học Máy Tính, Đại học Duke, Durham, Bắc Carolina, Hoa Kỳ Department phẫu thuật chỉnh hình, Trung tâm Y tế Đại học Duke, Durham, Bắc Carolina, Hoa Kỳ Correspondence: Morgan L Maeder, Editas Y, 300 Third Street, Tầng, Cambridge, Massachusetts 02142, USA E-mail: morgan.maeder@editasmed.com; Charles A Gersbach, Cục Kỹ thuật y sinh, Phòng 1427, FCIEMAS, 101 Khoa học Drive, Box 90.281, Đại học Duke, Durham, Bắc Carolina 27.708-0.281, Hoa Kỳ E-mail: charles.gersbach@duke.edu Nhận ngày 06 Tháng 11 2015; Được chấp nhận ngày 07 tháng năm 2016 viết xem trước chấp nhận trực tuyến 12 Tháng 2016; Tạm trực tuyến công bố ngày 16 tháng năm 2016 Liệu pháp gen lịch sử định nghĩa việc bổ sung gen cho tế bào người Tuy nhiên, đời gần công nghệ tái tạo gen cho phép mô hình trình tự gen người thao tác xác để đạt hiệu điều trị Điều bao gồm việc sửa đột biến gây bệnh, việc bổ sung gen trị liệu vào trình tự gen, việc loại bỏ gen bất lợi trình tự gen Báo cáo trình bày chế phương pháp chỉnh sửa gen khác mô tả tảng nuclease phổ biến, bao gồm nucleases kẽm ngón tay, phiên mã kích hoạt giống nucleases effector (Talens), meganucleases, CRISPR / hệ thống Cas9 Sau tóm tắt tiến đạt việc áp dụng chỉnh sửa gen tới khu vực khác gen liệu pháp tế bào, bao gồm chiến lược kháng virus, miễn dịch, điều trị rối loạn di truyền monogenic Những thách thức triển vọng tương lai chỉnh sửa gen liệu pháp tế bào thảo luận Việc thực sở di truyền bệnh di truyền dẫn đến khái niệm ban đầu liệu pháp gen "ngoại sinh DNA 'tốt' sử dụng để thay DNA bị lỗi người bị khuyết tật gen" [1] Hơn 40 năm nghiên cứu chỉnh sửa gen liệu pháp gen cho thấy ý tưởng đơn giản thay gen có nhiều thách thức phức tạp mặt kỹ thuật để thực hai cách an toàn hiệu so với đánh giá ban đầu Nhiều nhà nghiên cứu thách thức tập trung vào hạn chế khả kiểm soát xác vật liệu di truyền giới thiệu đến tế bào Tuy nhiên, công nghệ bổ sung gen ngoại sinh đạt tiến đáng kể thời gian cho kết lâm sàng đầy hứa hẹn loạt chiến lược dẫn y tế [2] Tuy nhiên, số thách thức Lồng ghép gen điều trị vào gen để trì ổn định tế bào tái tạo có tác động khó lường biểu gen tác dụng ý muốn gen bên cạnh [3] Hơn nữa, số gen tác động lớn nên khó sử dụng vector chuyển gen Cuối cùng, việc bổ sung gen ngoại sinh không luôn trực tiếp giải đột biến chiếm ưu loại bỏ vật liệu di truyền không mong muốn gen virus thụ thể Để giải hạn chế phương pháp thông thường để bổ sung gen, lĩnh vực chỉnh sửa gen lên để làm cho xác, thay đổi nhắm mục tiêu vào chuỗi hệ gen Ở xem xét phát triển thú vị gần việc dễ sử dụng, đặc hiệu, công nghệ chỉnh sửa gen ứng dụng để điều trị loạt bệnh rối loạn CƠ CHẾ CHỈNH SỬA GEN Nền tảng cho lĩnh vực chỉnh sửa gen khám phá mục tiêu phá vỡ sợi đôi DNA (DSBs) sử dụng để kích thích máy điều khiển sửa chữa tế bào nội sinh Phá vỡ ADN thường sửa chữa thông qua đường : sửa chữa tương đồng (HDR) kết thúc đường không tương đồng (NHEJ) (Hình 1) HDR dựa mạch tương đồng bị hỏng phá vỡ phụ thuộc mạch [5] Báo cáo từ phòng thí nghiệm Maria Jasin chứng minh hiệu mục tiêu thông qua tái tổ hợp tương đồng tế bào động vật có vú gen kích thích số tác động cường độ cách giới thiệu DSB nơi diễn mục tiêu [6,8] Ngoài ra, chức NHEJ để sửa chữa DSBs mà mẫu trực tiếp đoạn kết thúc [9] Con đường sửa chữa dễ bị lỗi thường kết việc đặt xóa (indels) nơi diễn phá vỡ Sự kích thích NHEJ DSBs chương trình cụ thể sử dụng để phá vỡ gen mục tiêu loạt loại tế bào sinh vật cách tận dụng indels chuyển khung đọc gen[10,11,12,13,14] Với khả điều khiển sửa chữa DNA nội sinh tế bào, thiết kế loạt thay đổi gen trình tự gen cách cụ thể No donor template Donor template with point mutation STOP * * STOP Donor template with insertion NHEJ between the two cut sites produces specific, large deletions STOP STOP NHEJ produces variable length insertions and deletions (indels) These often result in frameshifts generating premature stop codons * * * * GENE LOẠI TRỰC TIẾP/ ĐỘT BIẾN Đây hình thức đơn giản chỉnh sửa gen sử dụng chất dễ bị lỗi NHEJ để giới thiệu indels nhỏ nơi diễn mục tiêu Cổ điển NHEJ trực tiếp religates chưa qua chế biến DNA đầu thay - NHEJ (còn gọi microhomology qua trung gian kết thúc tham gia, MMEJ) yêu cầu cuối cắt bỏ sau ủ vùng ngắn mạch đơn microhomology DNA cuối thắt [15] Trong tất giai đoạn chu kỳ tế bào, hai đường NHEJ sửa chữa DNA với tần số cao đột biến dẫn đến hình thành indels nơi diễn nghỉ [15,16] Khi nơi diễn mục tiêu nuclease đặt vùng mã hóa gen, indels kết thường gây frameshifts Trong bệnh bệnh teo Duchenne (DMD), nơi xóa gen dẫn đến frameshifts sau chức protein, mục tiêu indels NHEJ gây sử dụng để khôi phục lại khung đọc xác gen [17] Tuy nhiên, ứng dụng phổ biến đột biến mục tiêu liên quan đến việc gây đột biến khung đọc với mục đích loại trực tiếp gen Ngược lại với liệu pháp gen truyền thống, hạn chế việc bổ sung chuỗi ngoại sinh vào hệ gen, khả knock out gen nội sinh mở đường liệu pháp điều trị, chức gen bị phá vỡ vĩnh viễn Một ứng dụng phương pháp nhằm mục tiêu tăng chi phối đột biến chức năng, chẳng hạn người tìm thấy bệnh Huntington Căn bệnh gây mở rộng lặp lại alen gen huntingtin (HTT), dẫn đến việc sản xuất protein HTT đột biến độc Loại bỏ alen đột biến cách chỉnh sửa gen NHEJ dựa cung cấp lợi ích lâm sàng cho bệnh nhân Huntington [18,19] Trong bệnh khác, điều trị để loại bỏ chức bình thường gen Ví dụ bật việc phương pháp gien chỉnh sửa thử nghiệm lâm sàng để điều trị HIV, loại trực tiếp CCR5, đồng thụ thể HIV lớn, cấm nhiễm virus tế bào T biến đổi [20,21,22] Cuối cùng, trực tiếp nhắm vào hệ gen người, loại trực tiếp gen quan trọng việc xâm nhập vi khuẩn virus dựa DNA phục vụ điều trị chống vi khuẩn hiệu LOẠI BỎ GENE Ngoài indels tương đối nhỏ NHEJ, xóa phân đoạn lớn DNA chầu liên tục với hai DSBs Thật vậy, chứng minh giới thiệu đồng thời hai lần nghỉ nhắm mục tiêu làm phát sinh xóa gen lên đến vài megabases kích thước [25 - 29] Phương pháp hữu ích cho chiến lược điều trị mà yêu cầu loại bỏ toàn yếu tố di truyền, chẳng hạn khu vực tăng cường, đề xuất để điều trị hemoglobin việc xoá BCL11A hồng cầu khu vực cụ thể enhancer [30,31] Ngoài ra, bệnh DMD nơi xóa gen khác nội chuyển gen khỏi khung , việc xoá bỏ chủ ý hay nhiều exon sửa khung đọc khôi phục biểu cắt ngắn, phần chức protein [32 - 37] Trái ngược với đột biến khó lường NHEJ, nhắm mục tiêu DSBs gây chỉnh sửa gen xác cách kích thích HDR với mẫu nhà tài trợ ngoại sinh cung cấp Hoạt động chủ yếu S G2 giai đoạn chu kỳ tế bào, HDR tự nhiên sử dụng nhiễm sắc chị khuôn mẫu để sửa chữa DNA [15,16,38] Tuy nhiên, chuỗi nhà tài trợ ngoại sinh cung cấp sử dụng mẫu sửa chữa [39] Như codelivery nucleases nhắm mục tiêu với vector nhắm mục tiêu có chứa tương đồng ADN đến trang web nghỉ phép chỉnh sửa gen hiệu cao HDR-dựa [6,7,8] Bất kỳ khác biệt tự diện mẫu nhà tài trợ đưa vào locus nội sinh để sửa chữa bệnh gây đột biến, chứng minh nhiều chứng nghiên cứu khái niệm [40-50] Trong plasmid có truyền thống nguồn thông dụng DNA nhà tài trợ, gần nghiên cứu oligonucleotide mắc kẹt đơn (ssODNs), với 80 cặp bazơ tương đồng, phục vụ mẫu nhà tài trợ hiệu cho HDR [51,52,53] Đối với tế bào mà khó transfect, vector virus integrase lentivirus thiếu virus adeno liên quan (AAV) sử dụng nguồn tài trợ DNA [54 - 57] Trong thực tế, chất tự nhiên recombinogenic AAV, đặc biệt kết hợp với chủng lai đặc biệt hiệu AAV-DJ , làm cho vector chuyển gen đến nơi cần chuyển [54 - 62] Mặc dù liệu pháp gen truyền thống sử dụng thành công vector virus để đưa gen ngoại lai vào hệ gen, khả kiểm soát trang web hội nhập virus làm tăng mối lo ngại nghiêm trọng đột biến ghép, nhấn mạnh thử nghiệm lâm sàng đầu mà sử dụng vec tơ retrovirus chuột [63, 64,65] Việc sử dụng mẫu nhà tài trợ, chèn gen mong muốn hai bên cánh tay tương đồng bao gồm trình tự giống với trang web cắt nuclease, cho phép trang web chèn DNA cụ thể thông qua DSB-induced HDR [66] Mục tiêu đưa gen trị liệu vào trang web xác định trước gen, chẳng hạn "bến cảng an toàn" locus, làm giảm bớt nguy đột biến ghép cho phép mức độ cao biểu gen phổ biến [67,68,69] Để trì kiểm soát biểu gen yếu tố điều hòa tự nhiên, kiểu chép tự nhiên bệnh lên gen chèn vào locus nội sinh tương ứng kiểm soát promoter riêng [70,71] Một chế thay cho chèn gen chuyển mục tiêu sử dụng DSBs nuclease gây để tạo nhô tương thích DNA nhà tài trợ trang web nội sinh , dẫn đến thắt NHEJ qua trung gian chuỗi DNA chèn trực tiếp vào mục tiêu locus [72] NUCLEASES MỤC TIÊU Bởi DSB chỉnh sửa gen gây dựa chế sửa chữa nội sinh tế bào, phổ áp dụng cho loại tế bào sinh vật mà sử dụng phương pháp để sửa chữa DNA Các yếu tố quan trọng để thực phương pháp chỉnh sửa gen đời xác DSB mục tiêu Bốn tảng lớn tồn gây DSBs trang web cụ thể: nucleases ngón tay kẽm (ZFNs), phiên mã kích hoạt giống effector (Tale) - nucleases (Talens), meganucleases, gần CRISPR / hệ thống Cas (Hình 2) Fokl 3′ CCCCAACTGNNNNNNGCCGTAGAG GGGGTTGACNNNNNNCGGCATCTC CAAAAGTCGTGAAGACAGTTTC GTTTTCAGCACTTCTGTCAAAG 5′ Fokl Zinc finger domains TALE CRISPR/Cas9 TALE repeat domains Cas9 Fokl TACTAGGATCCGATTCGCNNNNNNNNNNNNTCATGCTAGACTGAGCA CTGATCCTAGGCTAAGCGNNNNNNNNNNNNAGTACGATCTGACTCGT Fokl GTCCATGATAGGTGCCATAT 3′ 5′ 3′ 5′ GTCCATGATAGGTGCCATAT CAGGTACTATCCACGGTATA GuideRNA NUCLEASES NGÓN TAY KẼM Kẽm ngón tay (ZF) protein lớp học phong phú yếu tố phiên mã miền ngón tay kẽm Cys2-His2 lĩnh vực DNA phổ biến mã hóa người genome [73] Cấu trúc tinh thể Zif268 phục vụ sở cho hiểu biết nhận DNA ngón tay kẽm [74,75,76] Trong diện nguyên tử kẽm, miền ngón tay kẽm tạo thành cấu trúc ββα nhỏ gọn với phần α-xoắn ngón tay tiếp xúc với bp rãnh ngón tay DNA [74,77,78] Tandem mảng ngón tay kẽm quấn quanh DNA để ràng buộc trình tự mục tiêu mở rộng mà protein ba ngón tay liên kết với trang web mục tiêu bp Cấu trúc mô-đun Zif268 gợi ý protein cung cấp khuôn khổ hấp dẫn cho kỹ thuật mô típ DNA [79] nỗ lực ban đầu để thiết kế ZFS với đặc trưng độc đáo dựa tập hợp đơn giản quy tắc có số thành công [80,81] Tuy nhiên, thư viện liên kết kết hợp với phương pháp lựa chọn dựa chứng tỏ cách tiếp cận mạnh mẽ để tạo ngón tay cá nhân với đặc thù gắn DNA [82 - 87] Sau thành công này, lĩnh vực phải đối mặt với thách thức kỹ thuật mảng đa ngón tay với trang web mục tiêu đủ lâu để hệ gen phức tạp Các "lắp ráp mô đun" phương pháp tiếp cận dựa sưu tập module dụng ngón tay, xác định tự nhiên protein [88] chọn để ràng buộc cụ thể ba địa điểm mục tiêu cặp base [89 - 92], sau liên kết song song để tạo protein [93 - 97] Ngoài ra, phương pháp lựa chọn trên, chẳng hạn mở, sử dụng để chọn protein từ libraries [98] Ngẫu nhiên nhiều đáng kể lao động, phương pháp đưa vào tài khoản tương tác bối cảnh phụ thuộc láng giềng ngón tay mảng đa ngón tay [76,99,100,101] Một số phương pháp, bao gồm người sử dụng Sangamo Biosciences tảng Sigma-Aldrich CompoZr, kết hợp hai cách tiếp cận để lắp ráp mảng tiểu thuyết sử dụng tài liệu lưu trữ đơn vị đa ngón tay chọn trước để làm việc tốt [13,102,103,104] Các ngón tay kẽm nuclease (ZFN) công nghệ thực khám phá phần miền DNA lĩnh phân cắt FokI chức hạn chế endonuclease độc lập 0,105 khác Bằng cách thay tên miền ràng buộc FokI DNA với miền ngón tay kẽm, tạo nucleases khảm với đặc thù ràng buộc [106,107] Bởi chức nuclease FokI dimer, hai ZFNs ràng buộc sợi đối diện DNA yêu cầu để khởi phát DSB [108] Thí nghiệm ban đầu cho thấy DSBs ZFN gây sử dụng để sửa đổi gen thông qua NHEJ HDR [10,109,110] công nghệ sau sử dụng để sửa đổi thành công gen soma nhân [40,66,98] tế bào gốc đa [42,44,111,112,113] TALENs Việc phát đơn giản mã số - mệnh lệnh đặc hiệu DNA-binding protein câu chuyện từ mầm bệnh Xanthomonas lần dấy lên khả thú vị cho thiết kế mô-đun protein gắn DNA [114,115] Bảo tồn 33-35 amino axit câu chuyện lặp lặp lại ràng buộc cặp base đơn DNA với độ đặc hiệu định hai dư hypervariable Cấu trúc tinh thể câu chuyện liên kết với DNA tiết lộ lặp lại tạo thành cấu trúc hai xoắn nối với vòng lặp trình bày cặn hypervariable vào rãnh lớn protein bọc xung quanh DNA cấu trúc superhelical [116,117] Những lặp lặp lại câu chuyện mô - đun liên kết với để xây dựng mảng dài với độ đặc hiệu DNA - ràng buộc tùy chỉnh [118,119,120,121,122] Nhiều tảng tồn mảng kỹ thuật Các phương pháp đơn giản sử dụng kỹ thuật nhân tiêu chuẩn để lắp ráp câu chuyện từ kho lưu trữ plasmid, gồm câu chuyện lặp lặp lại [123,124] Một số phương pháp vừa thông dựa hệ thống nhân Golden Gate để lắp ráp nhiều phần lúc phản ứng [120,122,125,126,127,128,129] Các phương pháp phổ biến lắp ráp [130,131,132] thắt độc lập kỹ thuật nhân [133] Xây dựng tảng đặt thập kỷ chỉnh sửa gen ZFN gây ra, việc phát câu chuyện miền DNA lập trình nhanh chóng theo sau kỹ thuật Talens Giống ZFNs, câu chuyện hợp với lĩnh vực xúc tác endonuclease FokI hiển thị với chức dimer để tách mục tiêu trang web DNA dự định họ [119,121,134,135] Cũng tương tự ZFNs, Talens chứng minh gây hiệu NHEJ HDR somatic nhân [119,132,134] tế bào gốc đa [53,136] Talens thiết kế để nhắm mục tiêu trình tự cho kiềm chế nhắm mục tiêu họ yêu cầu cho 'T, theo quy định miền N-terminal không đổi, cho mảng Phạm vi nhắm mục tiêu không giới hạn này, dễ dàng kỹ thuật protein mới, làm cho Talens tảng hấp dẫn để chỉnh sửa gen mục tiêu Ngược lại, kích thước lớn tính chất lặp lặp lại mảng Tale trình bày trở ngại cho giao hàng thể protein Trái ngược với 30 amino axit ngón tay kẽm, mà liên kết với ba sở DNA, Talens yêu cầu 34 axit amin để xác định cặp sở khác biệt kích thước ngăn cấm giao hai monome Talen vector virus với dung lượng bao bì hạn chế Ngoài ra, chất không ổn định lặp song song, chẳng hạn người có mặt Talens, làm cho khó khăn để đóng gói trình tự lặp lặp lại hệ thống virus Thật vậy, Talens giao lentivirus chứng minh dễ bị xếp lại, [137] tượng giảm nhẹ cách đa dạng hóa codon lặp [138] hệ thống adenovirus sử dụng để cung cấp thành công Talens [139] MEGANUCLEASES Công nghệ Meganuclease liên quan đến việc tái kỹ thuật đặc trưng gắn DNA tự nhiên endonuclease homing Các lớp lớn endonuclease homing gia đình LAGLIDADG, bao gồm đặc trưng thường sử dụng I-CreI I-SCEI enzyme [140] Thông qua kết hợp thiết kế hợp lý lựa chọn, endonuclease homing tái thiết kế để nhắm mục tiêu trình tự [141 – 148] Trong nhiều nghiên cứu cho thấy hứa hẹn cho việc sử dụng chỉnh sửa meganucleases gen [149 – 152], lĩnh vực DNA phân tách endonuclease homing khó để tách biệt, khó khăn tương đối protein đặc trưng kỹ thuật với tiểu thuyết có truyền thống giới hạn việc sử dụng tảng Để giải hạn chế này, protein khảm bao gồm hợp meganucleases, ZFS, câu chuyện thiết kế để tạo enzyme monomeric tiểu thuyết mà tận dụng mối quan hệ ràng buộc ZFS câu chuyện đặc phân cắt meganucleases [153- 156] Một lợi tiềm liên quan đến công nghệ meganuclease DSB-hình thành enzym kết 3' nhô ra, recombinogenic cho HDR 5' nhô tạo FokI phân cắt Ngoài ra, meganucleases lớp học nhỏ nucleases thiết kế, làm cho chúng có khả tuân theo tất phương pháp chuyển gen tiêu chuẩn Trong thực tế, nhiều monome meganuclease dễ dàng đóng gói thành vector virus đơn đồng thời tạo nhiều DSBs CRISPR / nucleases Cas CRISPR-Cas nucleases RNA-hướng dẫn bắt nguồn từ hệ thống miễn dịch thích nghi tiến hóa vi khuẩn để bảo vệ chống lại plasmid xâm lược virus Nhiều thập kỷ công việc điều tra hệ thống CRISPR loài vi sinh vật khác làm sáng tỏ chế mà chuỗi ngắn xâm nhập axit nucleic đưa vào CRISPR loci [157] Sau đó, họ phiên mã chế biến thành CRISPR RNA (crRNAs), với crRNAs xuyên kích hoạt (tracrRNAs), phức tạp với (Cas) protein CRISPR liên quan lệnh đặc hiệu phân cắt DNA Cas nucleases qua Watson-Crick sở ghép nối axit nucleic [158,159,160,161] Xây dựng tắt hai nghiên cứu cho thấy ba thành phần cần thiết cho loại hình II CRISPR nuclease hệ thống protein Cas9, crRNA trưởng thành tracrRNA [162, 163] Doudna, Charpentier cộng cho thấy thông qua thí nghiệm in vitro tách DNA hệ thống giảm xuống hai thành phần hợp crRNA tracrRNA thành đơn hướng dẫn RNA (gRNA) Hơn nữa, họ cho thấy lại nhắm mục tiêu phức Cas9 / gRNA đến trang web thực cách thay đổi trình tự phần ngắn gRNA [164] Sau đó, loạt ấn phẩm chứng minh CRISPR / hệ thống Cas9 thiết kế cho sửa đổi di truyền có hiệu tế bào động vật có vú [165 - 168] Nói chung nghiên cứu đẩy CRISPR / công nghệ Cas9 thành tâm điểm ý lĩnh vực gen chỉnh sửa Giới hạn chuỗi hệ thống CRISPR / Cas xuất phát từ cần thiết motif protospacer liền kề (PAM) nằm 'để trang web mục tiêu Trình tự PAM đặc trưng cho loài Cas9 Ví dụ, trình tự PAM 5'-NGG-3 'là cần thiết để ràng buộc phân tách DNA Cas9 thường sử dụng từ Streptococcus pyogenes [169,170,171] Tuy nhiên, Cas9 biến thể với PAMS tiểu thuyết thiết kế phát triển đạo, mở rộng đáng kể số lượng mục tiêu tiềm chuỗi 172,173 Cas9 phức với crRNA tracrRNA trải qua thay đổi hình dạng, liên kết với họa tiết PAM toàn gen xét hỏi chuỗi trực tiếp ngược dòng để xác định bổ sung liên tục với gRNA [171,174,175,176,177] Sự hình thành DNA-RNA heteroduplex lần xuất trang web mục tiêu cho phép phân tách DNA mục tiêu Cas9-RNA phức tạp [171] Không giống ba hệ thống nuclease thảo luận trên, CRISPR / Cas nucleases không yêu cầu kỹ thuật protein cho trang web mục tiêu DNA Sự dễ dàng so với trang web nhắm mục tiêu, đơn giản cách thay đổi khu vực ngắn gRNA mệnh lệnh đặc hiệu, làm cho hệ thống phương pháp hấp dẫn cho giới thiệu DSBs trang web cụ thể Ngoài ra, protein Cas9 không kết nối trực tiếp đến gRNA, hệ thống cao tuân theo để ghép thông qua việc sử dụng đồng thời nhiều gRNAs để gây DSBs nhiều locus Bởi đa dạng phong phú hệ thống CRISPR tự nhiên understudied phần lớn, hợp lý để mong đợi nhiều công nghệ gen chỉnh sửa CRISPR dựa xuất hiện, bao gồm không Cas9 dựa loại hệ thống II mô tả gần RNA-hướng dẫn endonuclease Cpf1 người khác [178,179] ĐẶC TRƯNG CỦA NUCLEASES MỤC TIÊU Hiệu việc chỉnh sửa gen mục tiêu dựa bóc DNA cách cụ thể giảm thiểu, lý tưởng ngăn chặn, thiệt hại tài sản chấp để phần lại gen Vì lý này, đặc trưng nucleases nhắm mục tiêu trọng tâm lĩnh vực gen chỉnh sửa Sửa đổi miền dimerization FokI tăng mạnh đặc trưng ZFNs Talens cách yêu cầu hai heterodimers bắt buộc để ràng buộc DNA mục tiêu Những nghiên cứu tập thể cách hạn chế thời gian hoạt động nuclease với ngắn ngủi mRNA protein, tác dụng off-mục tiêu giảm thiểu so với giao plasmid dựa nỗ lực tương lai tận dụng lợi công thức hạt nano cho hiệu không cung cấp riêng lẽ [213] Đối với nhiều ứng dụng, vector virus phương tiện tối ưu để tối đa hóa hiệu giao hàng giảm thiểu khả gây độc [214] Trong đó, vector lentivirus tối ưu hóa cho truyền cao hiệu tế bào T bào gốc tạo máu; Tuy nhiên vectơ tích hợp vào hệ gen ổn định thể hàng hóa gen chuyển họ Để tận dụng lợi tính hiệu truyền lentivirus hạn chế thời gian biểu nuclease tế bào mục tiêu, vector lentivirus integrase thiếu sử dụng để cung cấp công cụ thoáng qua gen chỉnh sửa để nhắm mục tiêu tế bào [57,111] Tương tự vậy, hệ thống adenovirus đạt cao mức độ dẫn truyền loạt loại tế bào ex vivo cung cấp thoáng qua biểu nuclease [20,137,139] Cả lentivirus vec tơ adenovirus có lợi khả đóng gói đầy đủ để thực nhiều nucleases cassette biểu gRNA để chỉnh sửa multiplex nhiều loci [215] Trong gen in vivo chỉnh sửa lại thách thức bổ sung mục tiêu mô cụ thể, phân bố vector, miễn dịch biocompatibility người vận chuyển Mặc dù số ví dụ giao plasmid đến gan cho thấy chứng nguyên tắc quan trọng việc biên tập gen in vivo mô hình động vật [216, 217, 218], dịch chiến lược để điều trị người chưa khả thi Tuy nhiên, thể chuyển gen với AAV đến gan, mắt, hệ thần kinh xương tim cho thấy hiệu ấn tượng hai mô hình tiền lâm sàng thử nghiệm lâm sàng [219] Do đó, AAV hệ thống đầy hứa hẹn cho giao nucleases gen chỉnh sửa để nhắm mục tiêu tissues [220] Hơn nữa, đặc tính recombinogenic tự nhiên AAV làm cho vector mong muốn giao mẫu sửa chữa DNA [56,61,62,221,222,223,224] Mặc dù số nghiên cứu tái tổ hợp nhắm mục tiêu locus gen với vec tơ AAV vắng mặt nucleases [58 , 71], hiệu thấp so với báo cáo có nucleases đáng kể Thêm nghiên cứu cần thiết để hiểu dấu hiệu bệnh mạnh mẽ giải hiệu thấp biên tập gen Mặc dù AAV thể lời hứa đáng kể cho chuyển gen thể, khả đóng gói giới hạn ~ 4,8 kb DNA Điều đặt thách thức việc cung cấp nucleases lớn Talens, đòi hỏi hai monome mã hóa cDNA lớn bốn kb, thường sử dụng S pyogenes Cas9 nuclease mã hóa ~ 4,2 kb cDNA vectơ Trans-nối thiết kế để kết hợp lại tế bào để mở rộng kích thước gen chuyển giao AAV [225], hiệu biểu thức thấp so với gen cung cấp đơn AAV đáng kể Một số orthologs Cas9 nhỏ tồn tại, ~ 3.1 kb Cas9 từ S aureus có đặc điểm kỹ lưỡng thể để làm trung gian chỉnh sửa gen hiệu cao thể sau sinh AAV [35,36,226,227] Bước tiến quan trọng quan trọng để tạo điều kiện dễ dãi mạnh mẽ chỉnh sửa gen in vivo với CRISPR hệ thống / Cas9 Nó đặc biệt thuận lợi cho việc phát triển sản phẩm liệu pháp gen thể dịch đóng gói vector đơn ỨNG DỤNG GENE THERAPY Khả thao tác chuỗi gen cách chỉnh sửa gene tạo hội đa dạng để điều trị nhiều bệnh khác rối loạn (Hình 4) Ở đây, thảo luận loại dấu hiệu bệnh theo đuổi mô hình tiền lâm sàng (Bảng 1), làm bật thử nghiệm lâm sàng liên tục có kế hoạch sử dụng chiến lược gen chỉnh sửa (Bảng 2) Eyes Leber’s congenital amaurosis Glaucoma Retinitis pigmentosa Skeletal muscle and heart Muscular dystrophy Lungs Cystic fibrosis Gastrointestinal system Liver Bacterial infections Hemophilia Tyrosinemia type Glycogen and lysosomal storage disorders α-1-antitrypsin deficiency Cholestero l levels Viral infections Blood Skin Epidermolysis bullosa Bacterial infections Cancer Immuno therapy Viral and bacterial infections Immunodeficiency Sickle cell disease Thalassem ias CHIẾN LƯỢC KHÁNG VIRUS Các ứng dụng đơn giản chỉnh sửa gen sử dụng chế tương đối hiệu NHEJ để knockout gen liệu pháp tế bào tự thân ex vivo, nơi tế bào soma cô lập, sửa đổi, giao lại cho bệnh nhân Hơn nữa, ứng dụng hấp dẫn chỉnh sửa gen công tác phòng chống nhiễm virus nhân rộng Do đó, chiến lược gen chỉnh sửa tiên tiến thay đổi ex vivo tế bào T để loại bỏ đồng thụ thể CCR5 sử dụng cho HIV infection [20] Nghiên cứu chứng minh giảm tải lượng virus tăng lượng tế bào CD4 + T-cell chuột bị nhiễm HIV engrafted với tế bào T gen CCR5 bị đánh gục ngón tay kẽm nucleases [20] Sau theo sau biểu tình kết tương tự sau chỉnh sửa gen, ghép CD34 + HSCs vào chuột chiếu xạ, cho phép bảo vệ tất dòng tế bào máu từ CCR5 nhiễm HIV -tropic [21,228] Những nghiên cứu dẫn đến loạt thử nghiệm lâm sàng (Bảng 2) đánh giá phương pháp bệnh nhân HIV dương tính Như đến nghiên cứu cho thấy việc ghép an toàn tồn tế bào T CCR5 sửa đổi kiểm soát tải lượng virus số bệnh nhân, cung cấp đầy hứa hẹn chứng nguyên tắc phương pháp gen chỉnh sửa người [22] Điều thú vị là, liệu từ nghiên cứu cho thấy lớn hiệu lâm sàng bệnh nhân dị hợp tử tự nhiên ▵32 đột biến, cho thấy hiệu gen chỉnh sửa yếu tố quan trọng cho thành công Xây dựng nghiên cứu đầy hứa hẹn với ZFNs, nhiều nỗ lực khác phát triển chiến lược gen chỉnh sửa tương tự knockout CCR5 với Talens [134,229] CRISPR / Cas9 (refs 229, 230) meganucleases [231], công việc khác mở rộng vượt mục tiêu CCR5 để tăng sức đề kháng nhiễm HIV Điều bao gồm nhắm mục tiêu đồng thụ thể CXCR4 [232] gen PSIP1 mã hóa / protein P75 LEDGF cần thiết cho hội nhập HIV [233,234] Một số nghiên cứu sử dụng nhắm mục tiêu hội nhập gen vào gen CCR5 HDR lúc loại trực tiếp CCR5 giới thiệu chống HIV tố [235] Cuối cùng, hoàn chỉnh cắt bỏ gen HIV từ tế bào bị nhiễm độc nucleases nhắm chuỗi lặp tận dài (LTRs) chầu gen virus báo cáo [236] Do đó, loạt hệ chiến lược gen chỉnh sửa để ngăn ngừa nhiễm trùng nhân lên HIV đường chân trời Ngoài việc giải nhiễm HIV, tất tảng gen biên tập áp dụng khác pathogens 23 virus khác virus viêm gan B [217, 218, 237, 238, 239, 240, 241, 242] herpes simplex virus [243.244.245] virus papilloma [246] Những chiến lược thường liên quan đến việc loại bỏ gen virus suy thoái sau tách nuclease cách nhắm mục tiêu gen cần thiết cho ổn định hệ gen, bảo trì nhân rộng Trong nhiều nghiên cứu ban đầu tập trung vào chứng nguyên tắc giảm tải lượng virus nuôi cấy tế bào sau giao DNA plasmid thủy động lực cho chuột, nghiên cứu gần sử dụng giao AAV công cụ gen chỉnh sửa trực tiếp đến gan chuột cung cấp đường đáng cho khả mở rộng lâm sàng [238] Một thách thức chung liệu pháp kháng virus đột biến cao mục tiêu virus Đây luận thuyết phục ủng hộ mục tiêu gen chủ, chẳng hạn CCR5, giải cách nhắm mục tiêu đồng thời nhiều trang web quan trọng hệ gen virus LIỆU PHÁP MIỄN DỊCH UNG THƯ Liệu pháp miễn dịch ung thư công nhận rộng rãi tiến vĩ đại nghiên cứu y sinh học năm gần [247] Trong đó, nuôi miễn dịch tế bào T, tế bào T tự thân thiết kế để công kháng nguyên ung thư ex vivo chuyển trở lại cho bệnh nhân, có ấn tượng thành công điều trị số trường hợp ung thư hạch, ung thư máu, u ác tính [248] Mặc dù có thành công thử nghiệm lâm sàng liên tục hứa hẹn, có số lĩnh vực, tế bào T miễn dịch có khả cải thiện cách chỉnh sửa gen Tại đây, hai hiệu chống lại loại khối u khác khả sản xuất sản phẩm di động áp dụng cho số bệnh nhân rộng tăng cường thông qua kỹ thuật gen-chỉnh sửa Ví dụ, chiến lược đầy hứa hẹn cho liệu pháp miễn dịch bao gồm tế bào T kỹ thuật để thụ thể tổng hợp gọi thụ thể khảm kháng nguyên, CAR, mà nhận epitope tế bào ung thư tế bào T CAR đặc biệt thành công điều trị u lympho tế bào B cách công tế bào CD19 bề mặt kháng nguyên [247,248] Tuy nhiên, hạn chế phương pháp tế bào T sửa đổi thể hai thụ thể tế bào T nội sinh CAR kế Bởi thụ thể hoạt động chất nhị trùng, thụ thể tự nhiên thiết kế dimerize tương tác, kết đặc epitope đoán trước có khả làm giảm hiệu lực điều trị Để giải hạn chế này, số nghiên cứu tập trung vào cách gõ thụ thể tế bào T với nội sinh nucleases kế [154,249,250,251] Một thách thức lớn phát triển liệu pháp miễn dịch T-cell immunotherapy cần thiết phải sử dụng tế bào để tránh loại bỏ miễn dịch Đến lúc này, gene chỉnh sửa sử dụng để loại trực tiếp kháng nguyên bạch cầu người (HLA) mà hệ thống tự miễn dịch tế bào Quan trọng cách tiếp cận hữu ích cho liệu pháp tế bào Ví dụ cách tiếp cận tương tự áp dụng người tế bào pluripoten poten – tially có đa dạng sử dụng y học tái tạo sử dụng cho allogeneic mạch ghép [252] Một trở ngại lớn để thành công T-cell immunotherapy ức chế chức effector T - cell biểu điểm kiểm tra thuốc ức chế bề mặt tế bào khối u Ví dụ, ràng buộc thuốc ức chế để thụ thể PD-1 vào Tcell doc-umented tốt để ngăn chặn T-cell effector chức gây chết rụng kiệt sức Ức chế thụ thể PD-1 cung cấp chế mà bệnh ung thư tế bào thành công tránh hệ thống miễn dịch Như chiến lược để khắc phục điều này, gene chỉnh sửa sử dụng cho loại trực tiếp PD-1 T-cell, [254] dẫn đến tăng T- cell effector function [209,254] Sự thành công chiến lược gen chỉnh sửa có khả mở rộng để trạm kiểm soát chất ức chế đường ung thư tế bào khai thác để vent mục immunosurveillance, công nghệ quan trọng cho rộng rãi cho phép immunotherapy cho loại ung thư khác Cuối cùng, cho dấu hiệu glioblastoma, apop-tosis T-cell thiết kế phát sinh từ điều trị steroid glucocorticoid chống viêm sau phẫu thuật bị giới hạn hiệu T-cell immunotherapy Để tạo nguồn T-cell kháng glucocorticoid, gene chỉnh sửa sử dụng để loại trực tiếp nội sinh T-cell receptor [255] điều dẫn đến thành công liệu pháp T - cell chống glioma chuột models [255] sở thử nghiệm lâm sàng (bảng 2) Rối loạn máu Việc gene trị liệu thử nghiệm lâm sàng liên quan đến ex vivo retroviral phân phối điều trị adenosine deaminase (ADA) transgene T tế bào để điều trị trẻ em bị nặng kết hợp immunodefi-ciency (ADA-SCID), [256] sau điều trị liên kết với X SCID (X-SCID) retroviral gen giao CD34 + tạo máu tế bào gốc (hội)[257] tập trung đầu vào nguyên liệu pháp gen vivo cho suy giảm miễn dịch dựa tuyệt vọng cần phải phát triển điều trị cho rối loạn không gây tử vong khả avail phương pháp cho việc phân phối hiệu retroviral gen vào tế bào văn hóa Các quan sát tiếp thể dẫn đến insertional mutagenesis chất theo giao xúc thức ban đầu có tác cho gen-chỉnh sửa trường chứng minh cần thiết cho điều chỉnh đột biến gen cáctế bào này, trái ngược với transgene delivery [63] Trong thực tế, ví dụ điều chỉnh nội sinh gen tế bào người, tập trung vào IL2 thụ thể phổ biến gamma chuỗi đột biến X-SCID[40] tiếp cận nhiều mở rộng đến gen điều chỉnh công cụ chỉnh sửa CD34 + HSCs [57] Gen phát triển để sửa chữa đột biến gen liên quan đến ADASCID258 radiosensitive SCID, gây suy yếu phụ thuộc vào ADN protein kinase (DNA-PK) activity [259] Vì vậy, khả hiệu làm thay đổi trình tự gen T - cell, CD34 + hội, tế bào người plu-ripotent cung cấp trị liệu gen chỉnh sửa chiến lược cho loạt khác người suy giảm miễn dịch Tương tự vậy, việc thành lập gen chỉnh CD34 + hội người pluripotent tế bào có khả phân biệt thành ery-throid thâp cung cấp tùy chọn cho việc điều trị rối loạn máu, bao gồm bệnh tế bào liềm, gây đột biến điểm E6V cụ thể gen β-globin, β-thalassemia, gây loại đột biến để β-globin.Những đột biến globin sửa chữa gen chỉnh sửa iPSCs người phân biệtthành chức eryth-rocytes [42, 48, 260] trực tiếp CD34 + HSCs [261] Tương tự phương pháp tiếp cận phát triển nhằm mục tiêu hội nhập trans-gen trị liệu vào cảng an toàn chương trình người iPSCs α-thalassemia [69] Fanconi anemia [262] Bệnh hồng cầu lưỡi liềm β-thalassemia defi-ciencies chức β-globin biểu bồi thường cho inducing upregulation γglobin,mà thể trình phát triển bào thai im lặng sau sinh BCL11A điều transcrip - tế ngăn chặn biểu γ-globin, vòng đấu loại trực BCL11A đề xuất cách tiếp cận để điều trị bệnh tế bào liềm β-thalassemia Tuy dòng dõi tạo nhiên, vắng máu quan sát mặt BCL11A tất thấy bất lợi tế bào nonerythroid Điều thú vị, yếu tố enhancer mà đặc biệt phối hợp BCL11A tế bào erythroid ngừng hoạt động enhancer gen biên chế BCL11A upregulation γ-globin tế tập dẫn đếnức bào erythroid lineage [30,31,263] Vì vậy, cách tiếp cận cung cấp chế liệu pháp gen chỉnh sửa cho bệnh tế bào liềm β-thalassemia, rộng cho thấy chiến lược chung điều chế trị liệu gen biểu thông qua việc chỉnh sửa nhắm mục tiêu di động dành riêng cho loại enhancers Nhắm mục tiêu theo dõi gen chỉnh sửa Ngoài ex vivo gen chỉnh dội gen chỉnh sửa máu miễn dịch tế bào, quan sửa vivo cho gene correction gen nhắm mục tâm tiêu bổ sung cho mô tế bào mà transplantation khó khăn hay không thực tế Điều đòi hỏi việc phân phối hiệu chỉnh sửa gene nucleases nhà tài trợ vectơ để mô mục tiêu Các biểu tình gene với hiệu suất cao, nuclease trung gian chỉnh sửa vivo dùng AAV vectơ để cung có promoter, gan mô hình chuột hemo-Philia B tiên yếu tố yếu tố IX cDNA vào quỹ hình hemophilic Nghiên cấp ZFNs yếu người đột cứu đầu tố IX cDNA, mà [70] Cleavage intron đầu biến gen IX ZFNs xúc tích, dẫn đến tiên không điều thực tác hội nhập hiệu chỉnh kiểu trẻ sơ sinh mà hepatocytes tích cực phân chia đạo diễn homology sửa chữa đường hoạt động Đáng ý, mộthiệu ác quỷ-strated nghiên cứu chuột dành cho người lớn mà hepatocytes có sumably trước thoát khỏi chu kỳ tế bào, tích hợp kết từ kết hợp HDR mediated NHEJ events [264] Nghiên cứu thêm cần thiết để xác định vai trò chu kỳ tế bào gen chỉnh sửa với AAV cácvectơ giao hàng loại mô khác Gen nhắm mục tiêu chỉnh gan có tiềm để điều trị nhiều bệnh khác nhau, bao gồm rối loạn đông máu dể băng huyết A, hemophilia B, rối loạn lysosomal stor-tuổi bao gồm Fabry bệnh, bệnh Gaucher, bệnh Pompe, von Gierke bệnh hội chứng Hurler thợ săn Tuy nhiên, người số quần thể bệnh nhân tương đối nhỏ loại đột biến để gen liên quan đến bệnh đa dạng Do đó, chi phí lâm sàng phê duyệt regula tory vàphát triển để phát triển an toàn hiệu công cụ chỉnh sửa gene cho người số bệnh có thểprohibitive Hơn nữa, không rõ ràng cho dù đủ cấp nhắm mục tiêu transgene tích hợp chỉnh sửa gen đạt để đạt hiệu điều trị lái xe promoter nội sinh tự nhiên tương ứng cho gen Một cách tiếp cận thông minh đến địa thách thức hội nhập nhắm mục tiêu trị liệu gen vào albumin locus hạ nguồn promoter [71,265] Nội sinh albumin albumin cấp độ cao bày tỏ, chí thấp tar - geted gene tích hợp vào trang web có khả dẫn đến mức độ điều trị biểu gen Hơn nữa, gen "cảng an toàn" sử dụng cho bệnh khác nhau, bao gồm người liệt kê trên, mà đơn xác nhận chỉnh sửa gen hoá sử dụng cho sig-nificantly lớn bệnh nhân dân Cách tiếp cận sử dụng có hiệu mô hình chuột với AAV dựa tài trợ tương đồng mẫu để điều trị dể băng huyết mà nucleases71 ZFNs có khả đáng kể nâng cao nhắm mục tiêu efficiency.265 Sự đời hệ thống CRISPR/Cas9 thực vivo gen-chỉnh sửa công cụ có sẵn rộng rãi com-munitykhoa học có nhiều nghiên cứu gần sử dụng cách tiếp cận cho nước phát triển mô hình bệnh tật chiến lược cho gen có apy Ví dụ vivo gen chỉnh sửa với CRISPR/Cas9 tham gia sửa chữa mô hình chuột loại tyrosin-emia di truyền sau tiêm tĩnh mạch thủy đuôi plasmid DNA thành mice [216], tổng thể gen chỉnh sửa hiệu tương đối thấp (~ 0.4%), mô hình cho phép lựa chọn sửa chữa tế bào để repopulate gắn thể quỷ-strate chỉnh kiểu hình bệnh Mặc dù phương pháp nakedDNA giao hàng đến gan có khả dịch với người, nghiên cứu bước ngoặt việc chứng minh vivo gen chỉnh sửa với CRISPR/Cas9 mô dành cho người lớn Ngoài gen correction, gián đoạn gen đặc biệt gan có tác dụng mang lại lợi ích Ví dụ, PCSK9 gen mã hóa proteinase gây suy thoái thấp den - sity lipoprotein thụ thể (LDLR) Giảm LDLR mức dẫn đến trao đổi chất thấp LDL cholesterol(LDL-C), tăng mức độ LDL-C, tăng nguy bị bệnh tim mạch Các khám phá tự nhiên biến thể di truyền dẫn đến cao hay thấp PCSK9 activity tương ứng với mức cholesterol dẫn đến căng thẳng inter-est PCSK9 ngăn chặn loại thuốc để làm giảm cholesterol [266,267] Tương phản với Cục quản lý dược liên tục, hai nghiên cứu khác cho thấy điều trị Cas9 gRNA PCSK9 nhắm mục tiêu giao cho gan dẫn đến hiệu gen đập giảm cholesterol levels [226 , 268] Cuối cùng, gen chỉnh sửa gan, phương pháp cho văn hóa khác biệt ngườipluripotent tế bào thành func-tế hepatocytes cung cấp tùy chọn cho ex vivo di động sửa antitrypsin muta-tions liên chữa engraftment vào gan Ví dụ: α-1- tụcđược sửa chữa gen chỉnh sửa người iPSCs sau phân biệt vào tế bào gan thể gene [45] khôi phục lại loại sản phẩm dựa di động phức tạp đáng kể so với loại thuốc vi rút, chiến lược mô tả nghiên cứunày cho phép toàn diện gen analy-sis tế bào sửa đổi Rối loạn thần kinh Tiến gene tế bào phân phối ghép hệ thần kinh trung ương xương tim tạo hội mớicho gen tế bào điều DMD, dystrophies muscular nịt trị cho rối lưng chân loạn thần kinh cơ, bao tay, teo xương Friedreich ataxia, Huntington gồm sống, của dis-dễ dàng amyotrophic lateral sclerosis (ALS) Trong lớp bệnh, gen chỉnh sửa vậy, đến tiến hầu hết promi-nently cho DMD, chiến lược áp dụng gen chỉnh sửa cho điều kiện khác hình dung DMD gây đột biến dystrophin gene, phổ biến lớn dele-tions chuyển gen hạ lưu đoạn khỏi khung hình đưa sản phẩm protein nonfunctional Bởi trình tự mã hóa gen dystrophin đặc biệt lớn (14 kb), đóng gói vào kích thước giới hạn giao hàng viral vectơ Dù cắt ngắn minigenes phát triển phù hợp với vectơ virus, họ phần chức so với gen dàivà khả họ để đảo ngược bệnh nhân xác định Vì lý do, không liệu pháp chấp thuận có sẵn cho DMD, gen chỉnh sửa để sửa chữa gen nội sinh đặc biệt hấp dẫn Sớm báo cáo đề xuất chế sửa chữa dystrophin genvới gen chỉnh sửa, [269] sau chứng nguyên tắc experi-ments nuôi cấy tế bào từ bệnh nhân DMD chứng tỏ dys-trophin gen sửa chữa cáchnhắm mục tiêu hội nhập exons [270] bị xóa khôi phục lại biểu protein dystrophin nhắm mục tiêu theo shift-ing khung đọc trung gian NHEJ indels [17] Tuy nhiên, chiến lược hai bị giới hạn dân kiên nhẫn với chiến lược cụ thể gen chỉnh sửa địa thiếu dự đoán đáng tin cậy kết quảchỉnh sửa phụ thuộc vào ngẫu nhiên trung gian NHEJ DNA repair, tương ứng Do đó, nghiên cứu gần tập trung vào việc xoá nhiều exon với kết hợp nucleases để tạo protein xácphục hồi sản phẩm địa phân số lớn DMD bệnh nhân population [32–34], điều bao 300 kb gen ADN gồm exon 45-55 có gồm thể áp chiến lược dụng để khôi xóa phục > lại biểu dystrophin 62% DMD patients [33] Để phát triển điều vào cách tiếp cận có khả áp dụng lâm sàng cho bệnh nhân DMD , làm việc gần đãtích hợp hệ thống CRISPR/Cas9 vào AAV vectơ với tropism cho skel-muscle [35– 37] etal tim áp dụng lar tiêm quan qua tiêm tĩnh sửa CRISPR/Cas9 khôi địa phương thông mạch cho mô qua intramuscu- hình chuột DMD, gene chỉnh phục expres-sion dystrophin protein bệnh lý cải thiện bắp sức mạnh Đáng ý, nghiên cứu cho thấy tương đối hiệu vivo gen chỉnh sửa tế bào tổ tiên tích cực Pax7 hành động nguồn tái pháp tịnh xây tạo tế bào gen dystrophin repaired.36 phương dựng sửa xương với adenoviral delivery quỷ-stration gen tạivivo chỉnh [271] chỉnh sửa dystrophin đột biến đơn bào chuộtembryos [41] để đảo ngược triệu chứng bệnh Trong tương lai, nỗ lực mở rộng với liệu pháp tế bào cách sử dụng loại có nguồn gốc bệnh nhân tế bào, chẳng hạn tế bào iPS, mà chỉnh sửa gen củ-tion nhắm mục tiêu dystrophin transgene insertion [272] mở rộng cho số lượng lớn hiệu engrafted vào tissue [34,273] Rối loạn da Sự phát triển thiết kế da ghép từ tế bào tự thân allogeneic, bao gồm tế bào iPS, tạo quan hệ opportuni cho việc điều trị bệnh di truyền ảnh hưởng đến da Ví dụ, Lặn dystrophic epidermolysis bullosa bệnh gây đột biến gen mã hoá loại VII collagen Này phá vỡ loại VII collagen biểu kết mở rộng da xỉn-ing Điều chữa cách chỉnh tế bào bệnh nhân với gen chỉnh [274] Trong nghiên sửa sử cứu kỹ sư, đột dụng tế bào da tự biến để loại VII collagen genđã thân grafts chỉnh sửa bệnh nhân fibroblasts sau repro - grammed vào tế bào iPScó thể sử dụng để tạo cấu trúc da vivo[275] Một nghiên cứu khác sửa chữa bệnh gây muta-tion tế bào bệnh nhân IP , sử dụng tế bào để tạo biểu mô keratinocyte tấm, dẫn đến phân tầng biểu bì ống nghiệm văn hóa organotypic vivo mice [276] Rối loạn mắt Các thành công gần trị Amaurosis bẩm hàng vào spotlight lĩnh thử nghiệm lâm sinh Leber loại (LCA2) đẩy võng vực trị liệu gen Sử cận augmentationgene, tiêm subretinal AAV mã sàng mạc dis-đơn dụng cách hóa gen RPE65 đầy điều đủ đặt tiếp tìm thấy để an toàn hiệu Các tạp chí thức Hiệp hội người Mỹ liệu pháp gen & tế bào, nhiều đồng thời trials.277–280 LCA nguyên nhân hàng đầu trẻ em-khói mù gây [281] LCA10, hình đột thức biến phổ 18 ent khác với genes biến LCA, đột biến gen CEP290kb khoảng 7.5, không amenable để phương pháp trị liệu gen tiêu chuẩn làm việc cho LCA2 kích thước lớn gen gây bệnh Trong nghiên cứu ống nghiệm chứng khái niệm sử dụng lentivirus để cung cấp đầy đủ transgene cho tế bào có nguồn gốc iPSC photoreceptor precur-sor, [282] an toàn chứng minh subretinal AAV giao hàng làm cho gen chỉnh sửa chiến lược, thành phần nuclease phân phối qua AAV, đặc biệt hấp dẫn Như chứng nguyên tắc gene chỉnh sửa cho bệnh này, S aureus Cas9 sử dụng để xóa vùng intronic CEP290 gen có chứa đột biến thường xuyên tạo trang web bất thường splice phá vỡ gen mã hóa sequence[283] xóa khu vực intronic khôi phục CEP290 biểu Gene chỉnh sửa positioned để rối loạn chi phối NST thường địa hình thức bệnh tăng nhãn áp góc mở retinitis pigmentosa, mà có khả điều trị loại nhắm mục tiêu trực tiếp gen MYOC RHO, tương ứng Rối loạn hô hấp Xơ nang gây đột kênh clorua kết biến để CFTR clorua chan-nel.Mất chức dysregula-tion biểu mô vận chuyển chất lỏng sốcơ quan Đặc biệt, mát thích hợp vận chuyển chất lỏng phổi kết dày lên chất nhầy thường xuyên bị nhiễm trùng biến chứng thở-ing Gene chỉnh sửa sử dụng để sửa chữa đột biến CFTR văn hóa bệnh đường ruột cells50 IP tế bào gốc mà sau phân biệt thành biểu mô cells [284,285] thách thức lâu dài cho cácliệu pháp gen gen chỉnh sửa cho cys-tic xơ đạt hiệu gen giao cho biểu mô phổi, nghiên cứugần chứng tỏ chức chỉnh sửa chuột bị xơ nang sau mũi giao nanoparticles chở peptidetriplex tạo thành phân tử axit nucleic tiến hứa hẹn regard [286] Antimicrobials Ngoài cách thay đổi gen gen người, córất nhiều cách mà gen chỉnh sửa sử dụng đến địa người bệnh cải thiện sức khỏe người cách nhắm mục tiêu gen sinh vật khác Chính ví dụ phiên applica-tion gen chỉnh sửa để công gây bệnh vi khuẩn infections [24] Ví dụ, chỉnh sửa gen nucleases thiết kế để gen mục tiêu trao virulence kháng sinh kháng Ngoài ra, nhắm mục tiêu theo trình tự gen cụ thể cho chủnggây bệnh tạo điều kiện cho họ loại bỏ chọn lọc từdân hỗn hợp Hai nghiên cứu gần chứng minh chứng thống CRISPR/Cas9 để loại [287] mô nguyên bỏ vi hình bướmnhiễm ấu tắc phương pháp sử khuẩn chuột da thực trùng, [288], chọn dụng hệ dân model lọc loại bỏ plasmid vi khuẩn popula-tions Là chiến lược thay thếhấp dẫn để cung cấp đầy đủ hệ thống CRISPR để biến hệ thống CRISPR địa chống lại họ - thân cách cung cấp nhắm mục tiêu tự crRNAs, gần thực để chọn lọc loại bỏ vi khuẩn giống với loại I CRISPR systems[289 Lựa chọn loại đáng ý hệ thống cho Cas3 enzyme loại hệ thống hoạt động exonuclease tạo điều kiện cho DNA gián đoạn loại bỏ, [290] trái ngược với loại hình hệ thống II CRISPR/Cas9 mà cắt DNA Hơn nữa, phần lớn thống CRISPR loại I, với mộtphần nhỏ thuộc loại II category địa hệ [291] Với tất liệu pháp gen, thách thức việc di chuyển tảng tiếp phát triển xe phù hợp giao dịch lâm sàng, có triển vọng làm việc lĩnh vực kỹ thuật bacteriophage cho purpose [292] Các nghiên cứu đề nghị phương pháp tiếp cận đến địa tăng tỷ lệ kháng kháng sinh KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Sự tiến to lớn thực địa thách thức liệu pháp gen thông thường cách phát triển công nghệ cho thay đổi xác củabộ gen người Điều ngại cản lĩnh nhiên, nhiều thách giúp khắc vực liệu phục pháp gen nhiều thức để hoàn toàn nhận số trở thập tiềm niên Tuy gen chỉnh sửa cho liệu pháp gen tế bào Trung tâm củanhững thách thức vấn đề liên tục an toàn giao hàng Về vấn đề này, tiến nhanh chóng thực hai để tăng đặc trưng công cụ chỉnh sửa gen tăng độ nhạy phương pháp để đánh giá đặc trưng gen-wide [189,190,195,203– 206] Tuy nhiên, chưa rõ ràng cho dù tất tắt mục tiêu hiệu ứng chiếm điều trịmột trang web mục tiêu hàng tỷ cặp sở DNA, liên quan đến modifica-tion hàng triệu tế bào , chuẩn bị tùy chỉnh cho bệnh nhân Hơn nữa, nhiều câu hỏi cách hệ thốngmiễn dịch người phản ứng với biến đổi tế bào quyền vivo gen chỉnh sửa công cụ Các tiến đáng kể công nghệ phân phối tạo nhiều opportuni-mối quan hệ để chỉnh sửa gen, bao gồm ex vivo phân phối đến tế bào với DNA-Việt components [207-210,212] giao hàng tận nơi vivo với hiệu cụ thể cứu preclinical xem mô vectors xét [220] Những thành đây, tiến công trình nhiều nghiên gen chỉnh sửa thử nghiệm lâm sàng, nguồn lạc quan đáng kể cho tương lai lĩnh vực Những tiến nhanh chóng lĩnh vực có khả để tiếp tục dẫn đầu công nghệ mở rộng phạm vi gen edit-ing Thay gen chỉnh sửa công nghệ lý recombinases [293] trang không dựa vào việc tạo sợi đôi breaks, thay hệ thống CRISPRvới đặc dẫn nuclease systems tính độc [294] tiếp đáo, tục thay [178, đổi 179] DNA-hướng vớinhững công cụ Epigenome chỉnh sửa, DNA nhắm mục tiêu theo tảng sử dụng để đặc biệt thay đổi cấu trúc gen quy định bị, tạo cách thức để thao tác gen cho gen tế bào therapy [295–297] Inducible tự quy định hệ thống cho phép điều khiển expres-sion, hoạt động ổn định công cụ chỉnh sửa gen đóng vai trò quan trọng việc đảm bảo độ xác an toàn họ Tóm lại, chỉnh sửa gen thay đổi định nghĩa liệu pháp gen tế bào yếu tố quan trọng trỗi dậy lĩnh vực này, đólà quan trọng Tịnh làm việc để thực đủ công nghệ để điều trị người bệnh tiếng Anh lời hứa đầy [...]... dõi gen chỉnh sửa Ngoài ex vivo gen chỉnh dội trong gen chỉnh sửa của máu và miễn dịch tế bào, đó là quan sửa tại vivo cho gene correction và gen được nhắm mục tâm dữ tiêu bổ sung cho các mô tế bào mà transplantation là khó khăn hay không thực tế Điều này đòi hỏi việc phân phối hiệu quả chỉnh sửa gene nucleases và nhà tài trợ vectơ để các mô mục tiêu Các cuộc biểu tình đầu tiên của gene với hiệu suất... ra những cách thức mới để thao tác gen cho gen và tế bào therapy [295–297] Inducible hoặc tự quy định hệ thống cho phép điều khiển các expres-sion, hoạt động và sự ổn định của các công cụ chỉnh sửa bộ gen có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc đảm bảo độ chính xác và an toàn của họ Tóm lại, chỉnh sửa bộ gen đã thay đổi định nghĩa của liệu pháp gen và tế bào và đã là một yếu tố quan trọng trong... với vectơ virus, họ chỉ một phần chức năng so với gen dàivà khả năng của họ để đảo ngược bệnh nhân vẫn còn được xác định Vì những lý do, và vì không hiện không có liệu pháp được chấp thuận có sẵn cho DMD, gen chỉnh sửa để sửa chữa các gen nội sinh là đặc biệt hấp dẫn Sớm báo cáo đề xuất một cơ chế sửa chữa dystrophin genvới các gen chỉnh sửa, [269] và sau đó là bằng chứng của nguyên tắc experi-ments... đến gen điều chỉnh trong các công cụ chỉnh sửa CD34 + HSCs [57] Gen cũng đã được phát triển để sửa chữa những đột biến gen liên quan đến ADASCID258 và radiosensitive SCID, gây ra do suy yếu phụ thuộc vào ADN protein kinase (DNA-PK) activity [259] Vì vậy, khả năng hiệu quả làm thay đổi trình tự gen ở T - cell, CD34 + hội, và các tế bào của con người plu-ripotent có thể cung cấp trị liệu gen chỉnh sửa. .. quả trong dày lên của chất nhầy và do đó thường xuyên bị nhiễm trùng và biến chứng hơi thở-ing Gene chỉnh sửa đã được sử dụng để sửa chữa đột biến CFTR trong văn hóa bệnh đường ruột cells50 và IP tế bào gốc mà có thể được sau đó phân biệt thành biểu mô cells [284,285] mặc dù một thách thức lâu dài cho cácliệu pháp gen và gen chỉnh sửa cho cys-tic xơ đã đạt được hiệu quả gen giao cho biểu mô phổi, một... trong những trở thập ra tiềm niên Tuy năng của gen chỉnh sửa cho các liệu pháp gen và tế bào Trung tâm củanhững thách thức này là những vấn đề liên tục an toàn và giao hàng Về vấn đề này, tiến bộ nhanh chóng đang được thực hiện cả hai để tăng các đặc trưng của các công cụ chỉnh sửa bộ gen và tăng độ nhạy của phương pháp để đánh giá các đặc trưng này bộ gen- wide [189,190,195,203– 206] Tuy nhiên, nó vẫn... VIRUS Các ứng dụng đơn giản nhất của chỉnh sửa gen là sử dụng cơ chế tương đối hiệu quả NHEJ để knockout gen trong một liệu pháp tế bào tự thân ex vivo, nơi các tế bào soma có thể được cô lập, sửa đổi, và giao lại cho bệnh nhân Hơn nữa, một trong những ứng dụng hấp dẫn nhất của chỉnh sửa gen là công tác phòng chống nhiễm virus hoặc nhân rộng Do đó, chiến lược gen chỉnh sửa tiên tiến nhất cho đến nay là... những đột biến gen mã hoá loại VII collagen Này phá vỡ các loại VII collagen biểu hiện kết quả mở rộng làn da xỉn-ing Điều này có thể chữa bằng cách chỉnh các tế bào bệnh nhân với bộ gen chỉnh [274] Trong một nghiên sửa và sử cứu kỹ sư, đột dụng những tế bào da tự biến để loại VII collagen gen ã thân grafts được chỉnh sửa trong chính bệnh nhân fibroblasts rằng đã được sau đó repro - grammed vào các tế... bào , và được chuẩn bị tùy chỉnh cho mỗi bệnh nhân Hơn nữa, vẫn còn nhiều câu hỏi về cách hệ thốngmiễn dịch của con người sẽ phản ứng với biến đổi tế bào hoặc các chính quyền tại vivo gen chỉnh sửa công cụ Các tiến bộ đáng kể trong công nghệ phân phối cũng đang tạo ra nhiều hơn opportuni-mối quan hệ để chỉnh sửa bộ gen, bao gồm ex vivo phân phối đến các tế bào với DNA-Việt components [207-210,212] và. .. và upregulation của γ-globin chỉ trong các tế tập dẫn đếnức bào erythroid lineage [30,31,263] Vì vậy, cách tiếp cận này cung cấp cả một cơ chế của liệu pháp gen chỉnh sửa cho bệnh tế bào liềm và β-thalassemia, nhưng rộng hơn cho thấy một chiến lược chung của các điều chế trị liệu gen biểu hiện thông qua việc chỉnh sửa nhắm mục tiêu di động dành riêng cho loại enhancers Nhắm mục tiêu theo dõi gen chỉnh