Ứng dụng tế bào gốc trong ghép da

Nguyên bào sợiIV Cơ chế biệt hóa tế bào gốc thành biểu bì da V/ Ứng dụng của tế bào gốc trung mô dây rốn trong ghép da 1.. Giai đoạn nuôi cấy sơ cấp tế bào của máu cuống rốn 3.. khái ni

Chủ đề 8: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC TRONG GHÉP DA

4 Nguyên bào sợi

IV Cơ chế biệt hóa tế bào gốc thành biểu bì

da

V/ Ứng dụng của tế bào gốc trung mô dây rốn trong ghép da

1 Thu nhận máu cuống rốn

2 Giai đoạn nuôi cấy sơ cấp tế bào của máu cuống rốn

3 Giai đoạn nuôi cấy thứ cấp

4 Biệt hoá MSC thành tế bào dạng nguyên bào sợi

5 Giai đoạn nuôi cấy nguyên sợi bào

6 Ghép nguyên sợi bào và kiểm tra thải loại VI/ Kết luận

I Đặt vấn đề:

Cháu bé được cấy nguyên bào sợi do bị bỏng nước sôi (Ảnh: VTV)

II Giới thiệu

1 khái niệm

Tế bào gốc là những tế bào có khả năng biệt hóa trong quá trình phát triển để trở thành bất kì một loại tế bào trung ương nào và là phần không thể thiếu của cơ thể.

II Giới thiệu

2 Phân loại tế bào gốc

III Nguyên bào sợi và cấu trúc da

 Nguyên bào sợi: Nguyên bào sợi là tế bào quan trọng nhất trong giai đoạn liền vết thương Được nuôi cấy nhằm mục đích thu nhận chủ động nguồn tế bào, ứng dụng trong trị bỏng

 Cấu trúc da: 3 lớp

- Lớp biểu bì

- Lớp trung bì

- Lớp hạ bì

IV Cơ chế biệt hóa tế bào gốc thành biểu bì da

V ỨNG DỤNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÁU CUỐNG RỐN

Quy trình

1.Thu nhận máu cuống rốn

2.Giai đoạn nuôi cấy sơ cấp

3.Giai đoạn nuôi cấy thứ cấp

5 Giai đoạn nuôi cấy nguyên sợi bào

4 Biệt hoá MSC

6 Ghép nguyên sợi bào và kiểm tra và thải loại

IV ỨNG DỤNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÁU CUỐNG RỐN

- Máu cuống rốn được thu nhận từ các sản phụ

đã được xét nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV…

• Tế bào máu trưởng thành

• Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cell – MSC)

1 Thu nhận máu cuốn rốn

2 Nuôi cấy sơ cấp tế bào của máu cuống rốn: Chọn lọc MSC

- Ly tâm trên gradient nồng độ Ficoll-paque (Sigma) ở

tốc độ 2.500 vòng/phút, trong 5 phút

- Thu nhận phân đoạn chứa các tế bào đơn nhân nằm

giữa lớp Ficoll-paque và lớp huyết tương bên trên

- Tế bào đơn nhân sau khi thu nhận được huyền phù

trong môi trường nuôi cấy IMDM, 10% FBS

3 Nuôi cấy thứ cấp: cấy chuyền tăng sinh MSC

- Sau 15s, đổ bỏ dung dịch Enzyme

- Giữ lại 1ml, tiếp tục ủ trong tủ ấm 370C, từ

4 Biệt hóa tế bào:

Môi trường cảm ứng biệt hóa Môi trường cơ bản: DMEM được bổ sung 5% FBS và 1% kháng sinh

 Các bước biệt hóa

Cấy tế bào trong đĩa nuôi ở mật độ 5000tb/cm2

Thay môi trường sau môi 2-3 ngày

Khi tế bào bám ổn định vào bề mặt đĩa nhựa nuôi cấy thì hút bỏ môi trường tăng trưởng Tráng rửa tế bào trong đĩa nuôi bằng PBS Duy trì tế bào trong

đĩa nuôi bằng môi trường nuôi cấy cảm ứng nguyên bào sợi

Duy trì tế bào gốc trung mô trong môi trường nuôi

cấy tế bào gốc

Hàng ngày thay thế ½ môi trường trong đĩa bằng môi trường mới Theo dõi sự phát triển cũng như biến đổi hình thái tế bào trên kính hiển vi

Kiểm tra biểu hiện 1 số gen đặc trưng cho tế bào biểu mô bằng RT-PCR :

Thu nhận RNA tổng số của tế bào biệt hóa bằng Trizol

Phản ứng RT-PCR thực hiện bằng bộ kít AccessQuickTM RT-PCR ( Promega , Hoa Kỳ )

Phản ứng phiên mã ngược : 45 phút ở 45oC, kết thúc ở 95 OC trong 2 phút

Chu trình nhiệt PCR ( 35 chu kì ):

Ủ 10 phút ở 72OC

Sản phẩm PCR được điện di trên gel Agarose 2% và quan sát bằng hệ thống chup gel tự động GelDoc It ( UVP, Hoa Kỳ)

94 0C trong 45 giây 55-60 OC trong 45 giây

72 0C trong 1 phút

35X

Hình : Kết quả phân tích RT_PCR biểu hiện gen CK18 (149bp), β1-integrin (640bp) , CK19 (460bp) và p63 (611bp)

1: Tế bào đối chứng ; 2: tế bào biệt hóa sau 1 tuần ; 3: tế bào biệt hóa sau 3 tuần

CK18(149bp) F :TGGTACTCTCCTCAATCTGCTG R: CTCTGGATTGACTGTGGAAGT CK19(460bp) F:AGGTGGATTCCGCTCCGGGC R: ATCTTCCTGTCCCTCGAGCA P63 (611bp) F:CAGACTCAATTTAGTGAG R: AGCTCATGGTTGGGGCAC β1-Integrin (640bp) F: AATGTTTCAGTGCAGAGCC R: TTGGGATGATGTCGGGA

Trình Tự primer :

5 Nuôi cấy nguyên bào sợi

Chuẩn bị giá đỡ tế bào

Cấy tế bào lên giá đỡ

Theo dõi và đánh giá tế bào nuôi cấy

NUÔI CẤY THƯỜNG DIẾN RA TRONG VÒNG 14 NGÀY

Hình ảnh nguyên bào sợi được hình thành

6 Ghép nguyên sợi bào và kiểm tra thải loại

KI M TRA TH I LO I Ể Ả Ạ

Kết quả phân tích bằng western blot

phát hiện sự có mặt của các kháng

nguyên HLA-G và HLA-E trong dịch

nghiền tế bào gốc trung mô màng dây

rốn cho thấy tất cả các mẫu tế bào

đều biểu lộ cả kháng nguyên HLA-G

 Mức độ biểu hiện HLA-DR chiếm 1,9 ±

1,53%

 Mức độ biểu hiện dấu ấn CD90 đặc

thù của tế bào gốc trung mô đạt tới 92,65 ± 6,3%.

Như vậy, tế bào gốc trung mô dây rốn có biểu hiện cao về dấu ấn CD90 đặc thù và các kháng nguyên hòa hợp tổ chức HLA -DR, HLA-E, HLA-G

Tế bào gốc trung mô dây rốn có tính sinh miễn dịch thấp

Trên 98% số tế bào thuộc quần thể TBGTM

màng dây rốn nằm trong vùng M1

Trong khi đó, trên 92% số tế bào này nằm

trong vùng M2 khi phân tích với kháng thể

kháng CD90

Điều này cũng tái khẳng định tế bào được phân

tích là TBGTM Kết quả phân tích 15 mẫu TBGTM

màng dây rốn cho mức độ biểu hiện của HLA chỉ

ở mức 1,95 ± 1,53%

VI Kết luận

Thu nhận và nuôi cấy thành công tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người.

Tế bào gốc trung mô dây rốn có đặc tính sinh miễn dịch thấp.

Tế bào gốc trung mô dây rốn có thể cảm ứng để biệt hóa thành nguyên bào sợi trong môi trường định hướng in vitro.

Ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn trên mô hình vết thương bỏng là an toàn và có tác dụng tích cực trong điều trị vết thương.

KIẾN NGHỊ

Tiếp tục nghiên cứu việc đáp ứng miễn dịch đối với người để nhanh chóng ứng dụng trên lâm sàng

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Công nghệ sinh học trên người và động vật – Phan Kim Ngọc

Công nghệ tế bào gốc – Phan Kim Ngọc

Đề tài “Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người để điều trị vết thương bỏng nhiệt thực nghiệm” (Bác sĩ Phan Minh Hoàng – Học viện Quân Y Hà Nội)

Tạp chí sinh học 2014, 36(1) – Biệt hóa tế bào gốc trung mô dây rốn thành tế bào giống tế bào biểu mô da.

Cảm ơn cô và các bạn đã chú ý lắng nghe và theo dõi bài thuyết trình của nhóm !!!