ỨNG DỤNG MÁU CUỐNG RỐN TRONG GHÉP T Ế BÀO GỐC TẠO MÁU Nguyễn Hữu Toàn 1. Các nguồn tế bào gốc tạo máu sử dụng cho ghép Ghép tế bào gốc tạo máu (thường gọi là ghép tủy xương) ñã ñược áp dụng khoảng 30 năm gần ñây ñể ñiều trị bệnh nhân bị tổn thương tạo máu tại tủy xương. Tổn thương này có thể là nguyên phát, hoặc thứ phát sau hóa trị hoặc xạ trị các bệnh máu và ung thư ñặc. Hàng năm, có hàng trăm nghìn bệnh nhân bệnh máu và ung thư ñặc có nhu cầu ghép tế bào gốc tạo máu. Tế bào gốc tạo máu ñược truyền vào ñường tĩnh mạch bệnh nhân sẽ ñến cư trú tại tủy xương và phục hồi khả năng tạo máu của tổ chức này. - Trước kia, tế bào gốc tạo máu thường ñược thu hoạch từ tủy xương người cho bằng phương pháp chọc hút tại các gai chậu. Thủ thuật này khá nặng nề ñối với người cho tủy và phức tạp trong sử lý dịch ghép. Trước khi truyền vào bệnh nhân, dịch ghép ñược loại bỏ bớt thành phần mỡ và dịch tế bào không cần thiết. - Từ ñầu những năm 1980, người ta thấy rằng tại máu ngoại vi cũng tồn tại một lượng nhỏ tế bào gốc tạo máu CD34. Một số thuốc như cyclophosphamide, cytarabin, hoặc yếu tố kích thích tạo máu như G-CSF có thể có tác dụng huy ñộng tế bào gốc tạo máu từ tủy xương và phóng thích ra máu ngoại vi. Sử dụng các hệ thống máy tách tế bào tự ñộng như CS-3000 Plus, COPE, Hemonetics có thể thu hoạch ñược một lượng lớn tế bào gốc này, ñủ ñể thực hiện kỹ thuật ghép tế bào gốc tạo máu mà không cần ñến dịch tủy xương. Phương pháp thu hoạch tế bào gốc từ máu ngoại vi là một tiến bộ lớn của kỹ thuật ghép tủy xương, làm cho kỹ thuật ghép tủy xương ñồng loại trở lên thuận tiện và phổ biến hơn. - Tuy nhiên trong thực tiễn, một khó khăn kinh ñiển của kỹ thuật ghép tủy xương là làm sao lựa chọn ñược người cho tương ñồng HLA với bệnh nhân. Mặc dù nhiều trung tâm ghép tủy xương lớn trên thế giới ñã xây dựng ngân hàng tế bào gốc xác ñịnh sẵn kháng nguyên HLA ñể cung cấp cho các trung tâm ghép khác, nhưng cơ hội ñể bệnh nhân tìm ñược người cho tương ñồng HLA vẫn rất thấp. - Khoảng 15 năm gần ñây, máu cuống rốn bắt ñầu ñược sử dụng như một nguồn tế bào gốc tạo máu. Tỷ lệ tế bào gốc tạo máu CD34 chiếm 0,2- 0,4% tế bào có nhân, cao hơn hàng chục lần so với máu ngoại vi người trưởng thành. Tế bào gốc máu cuống rốn có khả năng tăng sinh cao, có thể tạo ra một số dòng tế bào khác như tế bào gốc trung mô, tế bào ñơn nhân và fibroblast trong nuôi cấy tế bào. Máu cuống rốn có một số ưu ñiểm ñể vận dụng vào kỹ thuật ghép tế bào gốc tạo máu: + Lượng tế bào gốc trong máu cuống rốn rất phong phú, ñặc biệt là tế bào tạo cụm hỗn hợp (CFU- Mix), có khả năng biệt hóa thành các dòng tế bào máu khác nhau. + Các tế bào miễn dịch của máu cuống rốn phần lớn ñang ở trạng thái "trinh nguyên", hiệu quả ñáp ứng miễn dịch thấp, ít nguy cơ gây ra bệnh lý mảnh ghép chống túc chủ (GVHD). + Nguồn máu cuống rốn rất sẵn có ñể xây dựng ngân hàng máu cuống rốn lớn từ ñó dễ dàng chọn lựa mẫu máu cuống rốn phù hợp HLA giữa người cho và người nhận. Việc thu thập tế bào gốc máu cuống rốn hoàn toàn không ảnh hưởng ñến người cho. So sánh giữa các nguồn tế bào gốc khác nhau, chúng ta thấy mặc dù lượng tế bào tạo máu và thể tích máu cuống rốn khá thấp nhưng các thông số về hiệu lực tạo máu lại thường cao hơn so với dịch tủy xương (bảng 1). Bảng 1. So sánh tế bào gốc tủy xương, máu ngoại vi và máu cuống rốn Thông số Tủy xương Máu ngoại vi Máu cuống rốn CD34/ BCðN 5,4 ± 4,5% 1,8 ± 2,5% 1,1 ± 1,7% Tiền thân dòng tủy/ CD34 26,7 ± 16,6% 57,5 ± 17,9% 70,4 ± 16,1% Tế bào có nhân (108/kg) 3,1 7,0 0,2 TB gốc CD34 (106/kg) 1,4 4,2 0,1 Hiệu lực tạo cụm Thấp Cao Cao Khả năng tái tạo Chậm Nhanh Nhanh CD34 cần cho ñậu ghép Nhiều Ít hơn Ít hơn 2. Vấn ñề thể tích máu cuống rốn Thể tích mẫu máu cuống rốn là một thông số rất quan trọng. Thể tích càng lớn thì tổng lượng tế bào gốc thu ñược càng lớn, do ñó khả năng ñậu ghép càng cao. 100 78.31 31.32 13.25 69.13 28.39 9.87 4.93 2.46 6.02 2.41 1.23 0 20 40 60 80 100 10 20 30 40 50 60 TBCN CD34 ðồ thị 1. Tỷ lệ túi máu cuống rốn sau thu hoạch ñủ lượng tế bào có nhân hoặc tế bào gốc CD34 ñể ghép cho bệnh nhân theo cân nặng (nguồn: Ng. H. Toàn- 2005, Cð) - Các nghiên cứu ở nước ngoài cho thấy thể tích máu cuống rốn thu ñược trung bình là 80ml (từ 60- 120ml). Ở Việt Nam, Trần Văn Bé (2000), Trần Quốc Dũng (2004) và Nguyễn Hữu Toàn (2005) thông báo thể tích trung bình mẫu máu cuống rốn thu ñược trong khoảng 70ml (từ 40- 120ml), thấp hơn so với nghiên cứu của các tác giả Âu Mỹ. Kg bệnh nhân % - Một số yếu tố như tuổi thai, trọng lượng thai, con so hay con rạ ñược cho là có liên quan ñến thể tích máu cuống rốn. Tuổi thai càng lớn thì số lượng tế bào có nhân càng tăng nhưng số lượng tế bào CD34 và CFU- GM lại giảm. Cân nặng của trẻ càng lớn thì lượng tế bào có nhân, tế bào gốc CD34 và CFU- GM càng nhiều. Mẹ càng ít lần sinh trước ñó thì máu cuống rốn càng có nhiều tế bào tạo máu. Ngược lại, số lần sinh trước ñây càng nhiều thì lượng tế bào gốc CD34 càng giảm, nhất là khi người mẹ ñã lớn tuổi. 3. Gia công và bảo quản máu cuống rốn - Quy trình gia công và bảo quản ñông lạnh máu cuống rốn tiến hành qua 2 bước. Túi máu cuống rốn ñược ly tâm lạnh trong hệ thống túi kín ñể tách ñược khối huyết tương giàu bạch cầu. Sau ñó, khối tế bào này sẽ ñược bổ sung DMSO và ñặt vào hệ thống ñông lạnh tự ñộng ñể hạ nhiệt ñộ xuống -1960C trong nitơ lỏng. - Máu cuống rốn có thể ñược bảo quản trong ngân hàng rất lâu. Khả năng tăng sinh của tế bào gốc trước và sau bảo quản không thay ñổi nếu trong môi trường nuôi cấy có ñủ các yếu tố kích thích tạo máu. Tỷ lệ tế bào gốc còn sống sót sau khi ñông lạnh ñạt khoảng 50%. Như vậy trên thực tế, số lượng các tế bào liên quan ñến ghép tế bào gốc tạo máu từ máu cuống rốn cần phải lớn hơn nhiều ñể có thể hy vọng ñậu ghép hiệu quả. Bởi vì trong quá trình gia công và bảo quản ñông lạnh, tỷ lệ tế bào gốc còn sống sót thấp hơn nhiều so với số lượng tế bào thu ñược ban ñầu. - Một túi máu cuống rốn truyền cho bệnh nhân thường có lượng tế bào có nhân trung bình từ 6- 10 x 108, lượng tế bào gốc CD34 từ 1- 3 x 106 và lượng CFU- GM từ 2- 10 x 105. - Trong suốt quá trình thu thập, gia công và bảo quản túi máu cuống rốn, chỉ còn khoảng 60% túi máu cuống rốn có thể sử dụng cho ghép; trong ñó chỉ khoảng 30- 40% ñủ lượng tế bào gốc ñể ghép cho bệnh nhi nặng 20 kg (khoảng 5- 8 tuổi). 4. Kết quả ghép máu cuống rốn - Số lượng tế bào gốc CD34 và ñơn vị tạo cụm CFU là những thông số có giá trị ñể ñánh giá khả năng ñậu ghép. Số lượng tế bào gốc CD34 tối thiểu nên ( 1 x 105/ kg bệnh nhân. Số lượng tế bào có nhân cũng có giá trị nhất ñịnh, cần tối thiểu >2 x 107/ kg ñể có thể hồi phục tốt BCHTT. - Tại Việt Nam, năm 2002 bệnh viện Truyền máu- Huyết học thành phố Hồ Chí Minh ñã bắt ñầu tiến hành ghép tế bào gốc tạo máu bằng máu cuống rốn. Bệnh viện cũng ñã chuẩn bị khá kỹ lưỡng từ khâu thu thập mẫu máu cuống rốn, sinh học máu cuống rốn, triển khai quy trình gia công, bảo quản và nuôi cấy tế bào gốc tạo máu in vitro ñể xây dựng ngân hàng máu cuống rốn chính quy trong nước, phục vụ cho ghép tế bào gốc. Số lượng bạch cầu hạt trung tính hồi phục sau khoảng 5- 6 tuần; tiểu cầu hồi phục sau khoảng 2 tháng. Nếu là ghép cùng huyết thống thì thời gian hồi phục ngắn hơn so với ghép không cùng huyết thống. ðối với những trường hợp không tương ñồng hoàn toàn về HLA, các yếu tố tiên lượng cho thành công của ghép máu cuống rốn là lượng tế bào có nhân, mức ñộ phù hợp HLA và lượng yếu tố kích thích tạo máu G-CSF. - Kết quả ghép máu cuống rốn trên thế giới cho thấy, 70- 90% bệnh nhân sẽ phục hồi BCHTT và tiểu cầu sau 60 ngày; thời gian sống không bệnh (FDS) trên 3 năm ñạt 30- 60% bệnh nhân tùy mức ñộ tiên lượng. - Tình trạng ñậu ghép, phục hồi BCHTT và tiểu cầu chậm sau ghép máu cuống rốn có lẽ do trở ngại trong quá trình biệt hóa tế bào gốc. Bệnh nhân ñược ghép tủy xương sẽ phục hồi số lượng bạch cầu hạt trung tính và tiểu cầu nhanh hơn. Tuy nhiên bệnh nhân ñược ghép máu cuống rốn lại ñạt ñược lượng tế bào ñịnh hướng và tế bào tiền thân giai ñoạn sớm tại tủy xương cao hơn. Như vậy thực ra ghép máu cuống rốn sẽ phục hồi kho tế bào tiền thân tạo máu tốt hơn so với ghép tủy xương. 5. Năng lực miễn dịch của máu cuống rốn - Nhìn chung tại máu cuống rốn, số lượng lymphocyte cao hơn so với người trưởng thành và phân bố các dưới nhóm lymphocyte biến ñộng rất lớn giữa các cá thể. Mặc dù số lượng lympho Th và lympho Ts/c máu cuống rốn khá cao, nhưng phần lớn các tế bào này ñang ở trạng thái trinh nguyên, chưa ñược hoạt hóa và chưa sẵn sàng ñáp ứng miễn dịch, ñặc biệt ở trẻ sơ sinh non tháng. Bảng 2. Phân bố lymphocyte máu cuống rốn Tác giả Lympho (G/L) TCD4 % TCD8 % CD4/CD8 Tr V Bé- 2000 4,6 ± 1,5 57 ± 7,6 16 ± 6 3,6 D’Arena- 1998 3,2 ± 1,8 1,7 ± 0,5 Pranke- 2001 44 ± 16 13 ± 8 Ng H Toàn- 2005 5,2 ± 1,8 32 ± 9 24 ± 7 1,5 ± 0,7 - Tỷ lệ lympho T hoạt hóa (CD3+Ia+) rất thấp (dưới 1%) so với người trưởng thành (3,7%). CD38 (dấu ấn non) có trên toàn bộ lympho T máu cuống rốn, trong khi chỉ có trên 50% lympho T máu ngoại vi người trưởng thành. - Tỷ lệ lympho TCD8 thấp hơn so với người trưởng thành, làm cho tỷ lệ CD4/CD8 máu cuống rốn khá cao (1,5- 2,0). Tỷ lệ lympho T ñộc tế bào không giới hạn HLA và tế bào NK ñều rất thấp so với người trưởng thành. - Do phần lớn lympho T máu cuống rốn ñang ở trạng thái trinh nguyên, chưa sẵn sàng cho ñáp ứng miễn dịch, nên các phản ứng miễn dịch ghép biểu hiện nhẹ nhàng hơn so với ghép từ các nguồn tế bào khác. Nguy cơ xuất hiện GVHD trong ghép máu cuống rốn thấp, ngay cả khi ghép không phù hợp 1- 2 kháng nguyên HLA. - Trong nuôi cấy lympho hỗn hợp, nếu không ñược kích thích, lympho T máu cuống rốn sản xuất ít IFN-( hơn. Phần lớn lympho T máu cuống rốn ñang ở trạng thái trinh nguyên nên còn non nớt về năng lực miễn dịch. Tuy nhiên, nếu ñược kích thích bằng IL-18 và IL-12, lympho T máu cuống rốn cũng sản xuất IFN-( như lympho T người trưởng thành. - Lympho T máu cuống rốn giảm khả năng tăng sinh, giảm khả năng ñộc tế bào và chỉ ñáp ứng 1 phần với kích thích kháng nguyên HLA. Tần xuất tế bào tạo IL-2 thấp, ít tế bào tiền thân T ñộc và ít lympho sản xuất IL-4. Ở máu cuống rốn, IL-2 kích thích tăng sinh lympho Ts/c mạnh hơn so với lympho Th. Lympho Th máu cuống rốn khi ñược kích thích sẽ tạo ra ít IFN-( và tạo ra nhiều IL-10 hơn so với lympho Th của người trưởng thành.Việc sản xuất ít IFN-( và nhiều IL-10 góp phần làm giảm mức ñộ GVHD sau ghép. - Ngược lại với lympho T, tế bào NK của máu cuống rốn sản xuất nhiều IFN-( hơn. Hoạt tính ñộc tế bào khi ñược kích thích bằng IL-18 và IL-12 máu cuống rốn tương ñương máu người trưởng thành. Máu cuống rốn giàu tế bào NK CD56+CD16-, ñáp ứng tốt với IL-12 hoặc IL-15 và có tính ñộc tế bào cao. Hoạt tính chức năng của tế bào NK và tế bào LAK ñã tương ñối thành thục. Tế bào NK và tế bào LAK nhanh chóng cảm ứng và bộc lộ hoạt tính tiêu tế bào nếu ñược kích thích bởi các cytokin. Vì vậy ghép máu cuống rốn cũng tạo ñược hiệu ứng GVL khá mạnh, như máu người trưởng thành. 6. Phục hồi miễn dịch sau ghép - So với ghép tế bào gốc từ tủy xương, ghép máu cuống rốn phục hồi miễn dịch chậm hơn, ñáp ứng miễn dịch kém hơn với kích thích IL-2 do phần lớn tế bào miễn dịch chưa trưởng thành hoàn toàn. - Tuy nhiên, số lượng và chức năng lymphocyte bắt ñầu phục hồi sau khoảng 60 ngày, kho dự trữ lympho T của bệnh nhân hồi phục gần hoàn toàn sau 2- 3 năm, trước tiên là do lympho T của máu cuống rốn nhân lên, tạo thành kho dự trữ lympho T mới. Có ñáp ứng miễn dịch sau tiêm chủng vaccin (thương hàn, bạch hầu, uốn ván, sởi, BCG ). - Trẻ em hồi phục miễn dịch sớm hơn người lớn do chức năng tuyến ức của trẻ em hoạt ñộng mạnh hơn. 7. Hạn chế của máu cuống rốn trong ghép tế bào gốc tạo máu Hạn chế chính của máu cuống rốn là lượng máu thu thập ñược từ mỗi mẫu máu cuống rốn thường tương ñối thấp, nhiều khi không ñủ lượng tế bào gốc ñể ñậu ghép khi truyền vào bệnh nhân. ðể ñảm bảo chất lượng của cuộc ghép, cần lựa chọn cẩn thận mẫu máu cuống rốn trước khi gia công và bảo quản. Không nên thu thập mẫu máu cuống rốn nếu ối vỡ sớm trước 24 giờ, tuổi thai thấp dưới 37 tuần, cân nặng trẻ sơ sinh thấp dưới 2600 gam hoặc thể tích máu cuống rốn thu ñược quá thấp dưới 50 ml. Hiện tại, máu cuống rốn thường chỉ ñược chỉ ñịnh rộng rãi trong ghép tế bào gốc máu cho bệnh nhi có cân nặng thấp, khoảng 20kg. Một số giải pháp khắc phục hạn chế về thể tích và ít tế bào tạo máu: - Khuếch ñại khối tế bào gốc ex vivo dưới tác ñộng của các yếu tố tăng trưởng ñể nhân khối tế bào gốc trước ghép lên hàng trăm lần (Kogler G 1996, Shpall E. J 2002). - Truyền ñồng thời tế bào gốc máu cuống rốn với tế bào trung mô ñể phát triển vi môi trường tạo máu và hỗ trợ tế bào gốc phát triển (Cohen Y 2004, Solves P 2004). - Sử dụng nhiều mẫu máu cuống rốn tương ñồng một phần HLA ñể ghép cho một bệnh nhân, nhằm tăng cao lượng tế bào gốc tạo máu cho mỗi cân nặng (Barker J. N 2005). Hy vọng trong tương lai, những giải pháp này sẽ chứng minh ñược hiệu quả và ghép tế bào gốc từ nguồn máu cuống rốn sẽ ñược ứng dụng rộng rãi hơn trong ñiều trị nhiều bệnh lý cần ñến phương pháp này. * Tài liệu tham khảo 1. Trần Văn Bé (2004): ðánh giá ghép tế bào gốc máu cuống rốn tại bệnh viện Truyền máu- Huyết học thành phố Hồ Chí Minh. Y học Việt Nam; 5/2004, 1- 5. 2. Trần Quốc Dũng (2004): Số lượng tế bào gốc (CD34+) trong túi máu cuống rốn bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy. Y học Việt Nam; 5/2004, 12- 24. 3. Huỳnh Nghĩa, Trần Quốc Dũng, Lê Thị Diệu Hiền (2004): Bước ñầu ñánh giá chất lượng sản phẩm tế bào gốc từ máu cuống rốn bằng các kỹ thuật ñếm tế bào CD34 và nuôi cấy khúm tế bào gốc. Y học Việt Nam; 6/2004, 36- 40. 4. Nguyễn Hữu Toàn (2005): Nghiên cứu ñặc ñiểm huyết học máu cuống rốn một số bệnh viện tại Huế; tài liệu chưa công bố. 5. Azuma E, Hirayama M, Bonno M et al (2001): Successful immunization following cord blood transplantation in a child with Diamond-Blackfan anemia. Pediatr Hematol Oncol. 2001 Apr- May; 18 (3): 193- 7. 6. Barker JN, Weisdorf DJ, DeFor TE et al (2005): Transplantation of 2 partially HLA-matched umbilical cord blood units to enhance engraftment in adults with hematologic malignancy. Blood. 2005 Feb 1;105(3):1343-7. Epub 2004 Oct 5. 7. Barret J. A. (1999): Hematopoietic Stem cell transplantation. 8. Fritsch G, Stimpfl M, Kurz M et al (1996): The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood. Bone Marrow Transplant. 1996 Feb;17(2):169-78. 9. Harris DT. (1995): In vitro and in vivo assessment of the graft-versus-leukemia activity of cord blood. Bone Marrow Transplant. 1995 Jan;15(1):17-23. 10. Hassan J, Reen DJ. (1997): Cord blood CD4+ CD45RA+ T cells achieve a lower magnitude of activation when compared with their adult counterparts. Immunology. 1997 Mar; 90(3):397-401. . ỨNG DỤNG MÁU CUỐNG RỐN TRONG GHÉP T Ế BÀO GỐC TẠO MÁU Nguyễn Hữu Toàn 1. Các nguồn tế bào gốc tạo máu sử dụng cho ghép Ghép tế bào gốc tạo máu (thường gọi là ghép tủy xương). vận dụng vào kỹ thuật ghép tế bào gốc tạo máu: + Lượng tế bào gốc trong máu cuống rốn rất phong phú, ñặc biệt là tế bào tạo cụm hỗn hợp (CFU- Mix), có khả năng biệt hóa thành các dòng tế bào máu. thành. Tế bào gốc máu cuống rốn có khả năng tăng sinh cao, có thể tạo ra một số dòng tế bào khác như tế bào gốc trung mô, tế bào ñơn nhân và fibroblast trong nuôi cấy tế bào. Máu cuống rốn có một