Bước đầu nghiên cứu kỹ thuật đông lạnh tinh dịch ngựa và ứng dụng trong thụ tinh nhân tạo tại trung tâm nghiên cứu và phát triển chăn nuôi miền núi

Đông lạnh, bảo tồn và thụ tinh nhân tạo bằng tinh đông lạnh cho ngựa cũng là một trong những công nghệ sinh học được ứng dụng rộng rãi trong ngành chăn nuôi ở các nước phát triển.. Đặc b

Trường Đại học nông lâm

Vũ Đình Ngoan

Bước đầu nghiên cứu kỹ thuật đông lạnh tinh dịch ngựa

và ứng dụng trong thụ tinh nhân tạo tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển chăn nuôi miền núi

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa hề sử dụng cho một học vị nào Mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn Các thông tin, tài liệu trình bày trong luận văn này được ghi rừ nguồn gốc trong phần phụ lục

Tác giả

Vũ Đình Ngoan

Lời cảm ơn Sau quá trình học tập, nghiên cứu chúng tôi đã hoàn thành luận văn này Nhân dịp này chúng tôi xin trân trọng cảm ơn sự tạo điều kiện và giúp đỡ của Ban giám hiệu nhà trường, Khoa sau đại học, Phòng đào tạo khoa học và hợp tác quốc tế, các thầy giáo cô giáo Khoa chăn nuôi thú y - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc TS Đào Đức Thà, PGS TS Trần Văn Tường đã đầu tư công sức và thời gian hướng dẫn, giúp đỡ tận tình trong suốt quá trình triển khai nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám đốc, các phòng ban trạm trại, tập thể cán bộ công nhân viên thuộc Trung tâm nghiên cứu và phát triển chăn nuôi miền núi, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin trân trọng cám ơn Ban giám đốc, Phòng đào tạo thông tin, Phòng khoa học kế hoạch và hợp tác quốc tế, Bộ môn sinh sản và thụ tinh nhân tạo - Viện chăn nuôi quốc gia

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bạn bè đồng nghiệp và người thân trong gia đình với sự quan tâm động viên và tạo điều kiện về vật chất, tinh thần trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành trước những sự giúp đỡ quý báu đó Tôi xin trân trọng gửi tới các thày giáo, cô giáo và các vị trong hội đồng chấm luận văn lời cảm ơn và lời chúc tốt đẹp nhất

Thái Nguyên, ngày 10 tháng 10 năm 2007

Tác giả

Vũ Đình Ngoan

1.1.2 Một số phương thức chăn nuôi ngựa hiện nay 3

1.1.3.2 Cấu tạo bộ máy sinh dục ngựa đực 5

1.1.3.3 Tinh dịch, sự hình thành tinh dịch ở ngựa đực 9

1.1.4 Cấu tạo và kích thước âm đạo giả của ngựa 16

1.1.5 Các chỉ tiêu đánh giá số lượng, chất lượng tinh dịch ngựa 15

1.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới số lượng, chất lượng tinh dịch ngựa 20

1.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng tới sức sống tinh trùng ngựa ởngoài cơ thể 21

1.2 Cơ sở khoa học kỹ thuật đông lạnh tinh dịch ngựa 24

1.2.1 Một số nguyên lý cơ bản về đông lạnh tinh dịch ngựa 26

1.2.1.1 Hiện tượng đông băng chất lỏng 26

1.2.1.2 Ảnh hưởng của đông băng lên tế bào tinh trùng 27

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới sức sống tinh trùng trong đông lạnh 29

1.2.3 Môi trường pha loãng, bảo tồn tinh dịch ngựa 31

1.3.1 Tình hình nghiên cứu về thụ tinh nhân tạo và đông lạnh tinh

dịch ngựa trên thế giới

36

1.3.2 Tình hình nghiên cứu về thụ tinh nhân tạo và đông lạnh tinh

dịch ngựa tại Việt Nam

39

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

42

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 43

2.4.2.1 Đánh giá tinh dịch ngựa bằng phương pháp thường quy 45

2.4.2.2 Đánh giá tinh dịch bằng phần mềm Sperm Vision 3.0 49

2.4.3 Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu 50

2.4.4 Các bước tiến hành trong nghiên cứu đông lạnh tinh dịch ngựa 51

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chuẩn bị âm đạo giả và khai thác tinh dịch ngựa 52

3.2 Chuẩn bị dung dịch ly tâm và môi trường đông lạnh 54

3.3.2 Các chỉ tiêu sinh học tinh dịch ngựa 58

3.4.1 Chất lượng tinh trùng trước và sau ly tâm 63

3.4.2 Chất lượng tinh trùng trước và sau đông lạnh 66

3.5 Kết quả theo dõi vận tốc và chiều dài chuyển động tinh trùng ngựa 71

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Danh mỤC c¸c b¶ng trong luËn v¨n

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của tinh dịch ngựa 9

Bảng 1.2 Thành phần các chất có trong tinh thanh ngựa 14

Bảng 1.3 Độ tuổi ngựa ảnh hưởng đến thể tích tinh dịch và nồng độ tinh trùng 20

Bảng 1.4 Một số môi trường rửa tinh dịch ngựa đã được các tác giả sử dụng 37

Bảng 1.5 Một số môi trường đông lạnh tinh dịch ngựa đã được sử dụng 38

Bảng 2.1 Một số chỉ tiêu kỹ thuật đực giống đưa vào khai thác tinh 42

Bảng 2.2 Danh mục hoá chất dùng trong thí nghiệm 43

Bảng 2.3 Danh mục dụng cụ, thiết bị dùng trong thí nghiệm 44

Bảng 3.1 Một số chỉ tiêu kỹ thuật âm đạo giả của ngựa 52

Bảng 3.2 Thành phần và một số chỉ tiêu lý hoá của dung dịch ly tâm 55

Bảng 3.3 Thành phần môi trường đông lạnh tinh dịch ngựa 55

Bảng 3.5 Chỉ tiêu tinh dịch ngựa khai thác ở vụ xuân hè 59

Bảng 3.6 Chỉ tiêu tinh dịch ngựa khai thác ở vụ thu đông 60

Bảng 3.7 Hoạt lực tinh trùng ngựa sau khi pha với dung dịch ly tâm 64

Bảng 3.8 Một số chỉ tiêu về tinh dịch ngựa sau ly tâm ở hai phương pháp 65

Bảng 3.9 Hoạt lực tinh trùng trước và sau cân bằng ở 2 phương pháp 66

Bảng 3.10 Hoạt lực tinh trùng ngựa sau đông lạnh 68

Bảng 3.11 Hoạt lực tinh trùng ngựa ở các dung dịch giải đông và tốc độ

giải đông khác nhau

70

Bảng 3.12 Vận tốc tinh trùng ở các giai đoạn nghiên cứu 71

Bảng 3.13 Chiều dài chuyển động tinh trùng ở các giai đoạn nghiên cứu 72

Bảng 3.14 Kết quả theo dõi động dục ở ngựa cái 74

Bảng3.15 Kết quả phối giống thử nghiệm TTNT cho ngựa bằng tinh đông viên 75

Danh mục các biểu đồ trong luận văn

Biểu đồ 3.1 Thể tớch dịch ngựa ở 2 thời vụ khỏc nhau 61

Biểu đồ 3.2 Hoạt lực tinh trựng ngựa ở 2 thời vụ khỏc nhau 63

Biểu đồ 3.3 Hoạt lực tinh trựng ngựa sau khi pha với dung dịch ly tõm 64

Đồ thị 3.1 Hoạt lực tinh trựng ngựa trước và sau cõn bằng ở 2 phương phỏp 67

Đồ thị 3.2 Hoạt lực tinh trựng ngựa trước và sau đụng lạnh 69

Đồ thị 3.3 Vận tốc và chiều dài quóng đường chuyển động 73

Danh mục các chữ viết tắt trong LUẬN VĂN

TTNT : Thụ tinh nhõn tạo

DL : Mụi trường đụng lạnh

TT : Tinh trựng

TD : Tinh dịch ĐVT : Đơn vị tớnh

MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA CHO ĐỀ TÀI

Số TT Tên ảnh

1 : Đàn ngựa giống gốc Trung tâm

2 : Ngựa đực Kabadin

3 : Ngựa đực lai 25% máu Kabadin

4 : Chuẩn bị âm đạo giả

5 : Môi trường ly tâm

6 : Khai thác tinh dịch ngựa

7 : Đánh giá hoạt lực ngay sau khi khai thác

8 : Ly tâm tinh dịch

9 : Tinh dịch ngựa sau ly tâm

10 : Cân bằng tinh dịch ngựa ở 5P

0

C

11 : Đánh giá tinh trùng ngựa bằng phần mền Sperm Vision

12 : Chụp hình thái tinh trùng ngựa

13 : Nhỏ viên tinh dịch ngựa trên tấm mica ở nhiệt độ -96P

14 : Dẫn tinh cho ngựa cái tại Trung tâm

15 : Máy đo áp suất thẩm thấu

16 : Hệ thống Sperm Vision

17 : Bảo quản tinh đông viên trong bình nitơ

18 : Nhóm tác giả nghiên cứu

Më ®Çu

1 Đặt vấn đề

Thế kỷ 21 là thế kỷ của công nghệ sinh học Công nghệ sinh học đã tạo

ra những bước nhảy vọt về năng suất, chất lượng giống cây trồng, vật nuôi

Nó không những tạo ra các giống có năng suất cao, chất lượng tốt mà còn thích ứng với điều kiện môi trường sinh thái khác nhau

Trong những năm gần đây nền chăn nuôi công nghiệp trên thế giới đã

có những tiến bộ vượt bậc do áp dụng những kỹ thuật tiên tiến và công nghệ sinh học Đông lạnh, bảo tồn và thụ tinh nhân tạo bằng tinh đông lạnh cho ngựa cũng là một trong những công nghệ sinh học được ứng dụng rộng rãi trong ngành chăn nuôi ở các nước phát triển Đó là một trong những kỹ thuật

có ý nghĩa kinh tế trong việc khai thác tiềm năng di truyền con đực và bảo tồn các giống quý hiếm, đáp ứng nhu cầu thụ tinh nhân tạo trong chăn nuôi ngựa cũng như thương mại hóa các sản phẩm tinh dịch ngựa Ngoài ra, việc sử dụng tinh đông lạnh còn đảm bảo dễ dàng, thuận lợi, an toàn về dịch bệnh trong nhân giống Đông lạnh tinh dịch gia súc còn có ý nghĩa quan trọng trong thụ tinh nhân tạo vật nuôi, tăng tốc độ cải tiến di truyền và bảo tồn vật liệu di truyền dưới dạng ngân hàng gen trong thời gian dài, nhất là bảo tồn các giống gia súc quý hiếm nhằm phục vụ trong sản xuất Hiện nay nhiều nước trên thế giới như: Đức, Nhật, Mỹ, Pháp….đã rất thành công trong lĩnh vực đông lạnh tinh dịch ngựa phục vụ cho thụ tinh nhân tạo hoặc lưu giữ bảo tồn quỹ gen cũng như thương mại hoá các sản phẩm tinh dịch ngựa

Ở Việt Nam, nghiên cứu đông lạnh tinh dịch ngựa là việc làm hoàn toàn mới và độc đáo, vì từ trước tới nay chưa có tác giả nào nghiên cứu về vấn đề này Do vậy những kết quả nghiên cứu về lĩnh vực sinh sản trong chăn nuôi ngựa trong đó có lĩnh vực đông lạnh tinh dịch ngựa là một việc làm cần thiết và là một nhu cầu của thực tế sản xuất hiện nay

Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: ''Bước đầu nghiên cứu kỹ thuật đông lạnh tinh dịch ngựa và ứng dụng trong thụ tinh nhân tạo tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển chăn nuôi miền núi''

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

1.1.1 Nguồn gốc của ngựa

Ngựa có vị trí trong hệ thống phân loại động vật như sau:

Ngựa thuộc giới động vật : Animalia

Ngành : Chordata Ngành phụ có xương sống : Vertebrata

1.1.2 Một số phương thức chăn nuôi ngựa hiện nay

Ngựa được chăn nuôi rộng khắp ở các vùng địa lý, kinh tế với tập quán hướng sử dụng khác nhau đã tạo nên những phương thức chăn nuôi khác nhau Phương thức chăn nuôi bầy đàn: Ngựa được chăn nuôi với số lượng vừa phải trong các hộ gia đình hay trong các nông trang trại với mục đích kết hợp làm việc và sinh sản Phương thức này đã tồn tại từ lâu đời đối với những dân du mục ở các vùng thảo nguyên hoặc những vùng chăn nuôi chưa phát triển Với phương thức này ngựa đực và ngựa cái được nuôi chung đàn, phối giống tự do, ít có sự tác động của con người Ở nước ta phương thức chăn nuôi này đã tồn tại ở một số địa phương: Bắc Kạn, Lào Cai, Cao Bằng,

Hà Giang….Ngựa được quản lý trong hộ gia đình trong vụ trồng trọt từ tháng

11 năm trước đến tháng 4 năm sau Những ngày thả rông cũng là mùa sinh sản, ngựa đực và ngựa cái phối giống tự do Phương thức chăn nuôi này cho năng suất rất thấp gây hậu quả cận huyết, dẫn đến khả năng sinh trưởng kém

Phương thức chăn nuôi bán chăn thả: Phương thức chăn nuôi này được

áp dụng với những người chăn nuôi có định hướng, có mục đích Người chăn nuôi có chọn giống, có tác động khoa học kỹ thuật và tuyển ngựa theo mục đích riêng Theo Heriquez (1980) [30], phương thức này có hai hình thức chăn nuôi đó là:

Chăn nuôi ngựa theo từng cá thể: Những ngựa đực và ngựa cái chuyên dùng để nhân giống, hoặc chuyên dùng cho việc sản xuất gắn liền với từng chủ hộ và những yêu cầu nhất định của người chăn nuôi Ngựa được tuyển chọn theo mục đích riêng và được quản lý, chăm sóc, nuôi dưỡng riêng biệt Việc chăn thả ngựa chỉ là hình thức vận động, hoặc vận động có quy trình

kỹ thuật Phương thức chăn nuôi này đã có tổ chức phối giống, có sự theo dõi chặt chẽ ngựa đực và ngựa cái, có áp dụng kỹ thuật phối giống và theo dõi, đánh giá khả năng sinh sản của ngựa Sử dụng phương thức chăn nuôi này nếu người chăn nuôi không được trang bị đầy đủ về kỹ thuật sinh sản của ngựa thì tỷ lệ sinh sản của đàn ngựa sẽ thụ thai thấp

Chăn nuôi theo nhóm được áp dụng tại các nông hộ hoặc trong các nông trang trại, số lượng ngựa đực và ngựa cái được điều chỉnh theo tỷ lệ và được tuyển chọn nuôi kết hợp sinh sản và làm việc Phương thức chăn nuôi này có áp dụng những tiến bộ kỹ thuật nhất định trong việc chọn giống và nâng cao năng suất sinh sản

Ở Việt Nam, phương thức chăn nuôi thả rông mang tính phổ biến ở các tỉnh trung du và miền núi Do việc giao phối tự nhiên là hoàn toàn ngẫu nhiên và không có sự tác động kiểm soát của con người dẫn đến mức độ cận huyết cao Riêng ngựa cái bạch là được theo dõi và phối giống có chọn lọc với những đực bạch giống tốt Chỉ có ở các Trung tâm nghiên cứu, việc quản

lý đực giống và ghép đôi giao phối được kiểm soát chặt chẽ nên khống chế được yếu tố cận huyết

1.1.3 Sinh lý sinh sản ngựa đực

1.1.3.1 Thành thục tính dục

Thành thục tính dục là con vật có khả năng giải phóng giao tử và biểu

lộ đầy đủ các hệ quả tập tính sinh dục Về cơ bản, thành thục tính dục là kết quả của sự tăng tiết hoạt động gonadotropin và khả năng đảm đương của các tuyến sinh dục trong hoạt động sinh sản, đồng thời là sự sản sinh steroid và sản sinh giao tử Với các loài, giống gia súc khác nhau, thời gian xuất hiện tính thành thục cũng khác nhau Thành thục về tính sớm hơn thành thục về thể về thể vóc Ở ngựa đực có thời gian thành thục về tính ở khoảng 12 - 20 tháng tuổi (Nguyễn Xuân Tịnh, 1996) [15]

Thành thục về tính phụ thuộc vào: Giống gia súc, chế độ dinh dưỡng, giới tính và thời tiết khí hậu Ở con đực, thành thục về tính là khi dịch hoàn

và các tuyến sinh dục phụ đã phát triển tương đối hoàn thiện, có khả năng sản xuất tinh dịch và xuất tinh Ngựa đực thành thục về tính vào khoảng thời gian

18 - 24 tháng tuổi, khi đó khối lượng cơ thể chiếm 60 - 70% khối lượng cơ thể lúc trưởng thành (Lê Viết Ly, 1999) [8]

1.1.3.2 Cấu tạo bộ máy sinh dục ngựa đực

* Dịch hoàn (Testis): Dịch hoàn là những cơ quan đôi, sẵn có chức năng

kép: Sản sinh giao tử đực (tinh trùng) và sản sinh nội tiết tố (hormon sinh dục testosteron) Khối lượng dịch hoàn ngựa đực thường bằng 0,34% khối lượng

cơ thể Khả năng sản xuất tinh trùng/1 ngày đêm của 2 dịch hoàn ngựa là 5,3

tỷ tinh trùng (với ngựa có khối lượng 1000kg và dịch hoàn là 340g), (Nguyễn Tấn Anh, 2003) [2]

Ở ngựa, dịch hoàn trong thời kỳ bào thai nằm trong xoang bụng, đến tháng thứ 7 thì chui qua ống bẹn vào trong bao dịch hoàn Thời kỳ ngoài bào thai, dịch hoàn nằm ở giữa, 2 bên là bẹn (Phạm Thị Xuân Vân, 2001) [18]

Dịch hoàn sa xuống qua vòng bẹn, vào trong bao dịch hoàn Trước khi hình thành việc sa xuống, dây chằng mào dịch hoàn dãn ra nhiều, sau khi sa xuống xong, dây chằng mào dịch hoàn thoái hoá Cả hai quá trình được xem

là quan trọng trong cơ chế sa xuống của dịch hoàn Đôi khi dịch hoàn không

sa vào bao dịch hoàn được (dịch hoàn ẩn) không đáp ứng được nhu cầu nhiệt

độ của dịch hoàn và dịch hoàn phụ, mặc dù chức năng bài tiết của dịch hoàn là không suy chuyển Vì vậy con đực có dịch hoàn không sa vào trong bao dịch hoàn được (dịch hoàn ẩn) vẫn biểu hiện tính dục bình thường nhưng vô sinh

Cấu tạo dịch hoàn gồm: Bên ngoài là lớp giác mạc riêng (tunica vaginalis propia) bằng một lớp sợi vững chắc do phúc mạc kéo dài đến hình thành Phía trong lớp giác mạc riêng là tổ chức liên kết màng mỏng gọi là màng trắng (tunica albuginea), lớp màng trắng đi sâu vào trong chia dịch hoàn thành nhiều múi, mỗi múi đều chứa những ống sinh tinh uốn khúc (tubuli albuginea) trong đó tinh trùng được hình thành Tất cả các ống sinh tinh đều hướng về vách giữa của dịch hoàn Những ống sinh tinh đi vào vách giữa của dịch hoàn thì biến thành ống tinh thẳng (tubili recti) và đan chéo nhau tạo thành mạng tinh (Retetestis) Mạng tinh cùng với vách giữa của dịch hoàn tạo thành thể Haimo (Highmor)

* Dịch hoàn phụ (Epididimis) Gồm ba phần: Đầu dịch hoàn phụ, thân

phụ dịch hoàn, đuôi dịch hoàn phụ

Đầu dịch hoàn phụ có rất nhiều ống dẫn tinh ra (13 đến 20 ống) đính vào ống dẫn tinh của dịch hoàn phụ, tạo thành một cấu trúc dẹt, gắn vào một đầu của dịch hoàn

Thân phụ dịch hoàn, phần này hẹp nối tiếp sau đầu dịch hoàn phụ và tận cùng bên kia của dịch hoàn

Đuôi dịch hoàn phụ, phần này nối tiếp sau thân dịch hoàn phụ và rộng hơn thân dịch hoàn phụ Đường viền quanh của đuôi dịch hoàn phụ là đặc điểm có thể thấy được ở dịch hoàn phụ ở gia súc còn sống

Ở ngựa dịch hoàn phụ cũng là một ống có đường kính tăng dần từ 70

µm lên tới khoảng 500µm, chiều dài 70 - 75 cm, khối lượng 40g, (Nguyễn Tấn Anh, 2003) [2] Một lượng lớn chất dịch hàng ngày ra khỏi dịch hoàn và hầu hết nó bị hấp phụ ở đầu dịch hoàn phụ ở đoạn khỏi đầu của ống tinh của tinh hoàn phụ Sự vận chuyển tinh trùng thông qua dịch hoàn phụ 7,5 - 10

ngày, đó là dòng chảy của chất dịch màng lưới, do hoạt động của biểu mô có nhung mao của các ống dãn ra và do sự co rút của thành cơ của ống dịch hoàn phụ Sự thành thục của tinh trùng xảy ra trong quá trình đi qua dịch hoàn phụ Đặc biệt trong dịch hoàn phụ có đủ các điều kiện để tinh trùng sống, phát triển thành thục và có thể giữ được năng lực thụ tinh trong vài tuần lễ, đó là :

- pH yếu dao động 6,2 - 6,8: Kìm hãm sự vận động của tinh trùng

- Yếm khí, thiếu oxy Nhiệt độ thấp hơn thân nhiệt 3 - 4P

0

C, tinh trùng ít vận động và giảm tiêu hao năng lượng

- Dịnh hoàn phụ hấp thu một số muối khoáng giữ cho ASTT không thay đổi

- Các vách của phụ dịch hoàn có nhiều mạch quản và lâm ba quản là nguồn cung cấp năng lượng cho tinh trùng

- Đuôi tinh trùng tiết ra lipoproteit bao lấy tinh trùng làm cho tinh trùng mang điện âm Giữa các tinh trùng có lực đẩy tĩnh điện do mang điện cùng dấu làm cho tinh trùng không ngưng kết thành khối

Các ion kim loại FeP

* Các tuyến sinh dục phụ: (Tuyến cầu niệu đạo, tuyến tiền liệt, tinh nang,

tuyến niệu quản)

Tuyến cầu niệu đạo hay tuyến củ hành, tuyến Cowper Ở ngựa tuyến này

to hơn ở bò và nằm ở gốc thể hang của dương vật Dịch tiết trong suốt và trung tính, có tính sát trùng, rửa sạnh và làm trơn niệu đạo trước khi phóng tinh

Tuyến tiền liệt (Glandula Prostate) Gồm hai phần (phần phụ và phần phân tán) Ở ngựa tuyến tiền liệt rất phát triển hoàn toàn nằm ở bên ngoài và gồm hai phần nằm ở hai bên nối với nhau bằng một cái cầu Chất tiết trong suốt

có mùi hăng đặc trưng, lượng chất tiết nhiều tham gia vào thành phần tinh dịch Tác dụng tuyến tiền liệt bao gồm:

- Dịch tiết có pH kiềm để trung hoà HB 2 BCOB 3 B do tinh trùng sản sinh, có protein hấp phụ COB 2 B trong môi trường niệu đạo

- Dịch tiết có enzim chống ngưng kết tinh trùng

- Dịch tiết tuyến này còn có hormon Prostaglandin dạng PGFB 2α B (PGFB 2α

khi vào đường sinh dục gia súc cái có tác dụng làm tăng co bóp cơ trơn tử cung và sẽ làm tăng tốc độ vận động của tinh trùng tiến nhanh vào ống dẫn trứng để thụ tinh Ứng dụng trong sản xuất khi pha chế tinh dịch nếu bổ sung một lượng thích hợp Prostaglandin sẽ nâng cao được tỷ lệ thụ thai

Tuyến tiểu nang/tinh nang (Glandula vesiculares) của ngựa là những tiểu nang thực sự gồm những túi tuyến hình quả lê, tuyến có thể chứa đầy 130

- 150ml dịch (Nguyễn Tấn Anh, 2003) [2] Tuyến nằm trong xoang chậu, trên bàng quang và ống dẫn tinh Chất tiết của tuyến này không trộn với tinh trùng

mà là dịch keo phèn (mầu trắng hoặc mầu vàng) có chứa γ globulin Dịch keo phèn này gặp chất tiết của tuyến tiền liệt thì ngưng đọng lại thành nút bịt kín

âm đạo ngăn không cho tinh dịch trào ngược ra ngoài sau khi giao phối Mặt khác, do có nhiều γ globulin nên có tác dụng ngăn không cho vi khuẩn xâm nhập từ ngoài vào đường sinh dục con cái Dịch tiết này có fructoz và glucoza

là nguồn năng lượng cung cấp dinh dưỡng cho tinh trùng hoạt động, có enzim chuyển hóa glucoza thành fructoz Ngoài ra tinh nang còn có một số chất tiết khác như axit citric, axit amin, lipit, natri, kali… tăng cường dinh dưỡng và hoạt lực cho tinh trùng

Tuyến niệu quản (Littre-Urethral): Tuyến này ở ngựa được xem như một phần phân tán của tuyến tiền liệt, nằm rải rác và khó phân biệt

* Dương vật và bao dương vật

Cấu tạo gồm 3 thể hổng được tập hợp xung quanh dương vật (thể hải miên dương vật, thể hang dương vật và thể điều khiển độ dài hữu hiệu dương vật) Ở ngựa, dương vật khi cương cứng có thể dài 50 - 60cm, đường kính 10 - 11cm Quy đầu ngựa hơi loe ra, có túi thừa phía sau hõm tuyến dương vật Túi này là nơi chứa chấp tác nhân làm gây nhiễm của ngựa đực có mang bệnh viêm

tử cung truyền nhiễm (Đặng Đình Hanh, 2002) [6]

Ngựa đực khi bắt đầu xuất tinh, thì đứng yên, mắt lim dim, ghì chặt vào hông con cái, thân hơi đung đưa nhẹ nhàng Thời gian giao cấu 1 - 3 phút

1.1.3.3 Tinh dịch và sự hình thành tinh dịch ở ngựa đực

Tinh dịch là dịch lỏng mầu trắng đục, có phản ứng kiềm yếu (pH =

7,2-7,5), có mùi hăng đặc trưng, gồm tinh trùng và tinh thanh

Tinh dịch ngựa cũng như tinh dịch của một số loài gia súc khác, là dịch

tiết của cơ quan sinh dục đực khi con đực hưng phấn cao độ và thực hiện

thành công phản xạ sinh dục Tinh dịch chỉ được hình thành một cách tức thời

khi con đực phóng tinh nghĩa là lúc con đực hưng phấn cao nhất trong quá

trình thực hiện phản xạ giao phối Tinh dịch gồm tinh trùng (4 - 7%) và tinh

thanh (93 - 96%), (Trần Tiến Dũng, 2002) [4] Lượng tinh dịch và số lượng

tinh trùng thay đổi theo loài, ở ngựa lượng tinh dịch dao động 50 - 100ml/lần

xuất tinh, thành phần hóa học của tinh dịch gồm có

Bảng 1.1: Thành phần hoá học của tinh dịch ngựa

(* theo Minovanov Trích Nguyễn Xuân Tịnh, 1996) [15]

(** theo Mann, 1964; Lake, 1971; Serban, 1982….Trích Davies Morel, 1999) [28]

* Tinh trùng

Tinh trùng là loại tế bào đặc biệt, thích ứng với chức năng vận chuyển, đưa bộ gen đơn bội của con đực từ bên ngoài vào trong trứng để rồi kết hợp với bộ gen đơn bội của con cái tạo thành hợ tử

Sự hình thành: Tinh trùng là giao tử đực được hình thành từ ống sinh tinh trong dịch hoàn Tinh trùng được tạo ra từ các tế bào sinh dục nguyên thủy trong lòng các ống sinh tinh Vào một thời điểm cùng với sự thành thục

về tính, tế bào sinh dục nguyên thủy tăng lên qua hai lần phân chia, lần phân chia thứ nhất thành tinh bào sơ cấp rồi thành tinh bào thứ cấp có nhiễm sắc thể đơn bội Tinh bào thứ cấp tồn tại không lâu rồi phân chia thành hai tiền tinh trùng và hoàn thiện dần thành tinh trùng Khi đã hình thành, tinh trùng chuyển dần từ dịch hoàn đến dịch hoàn phụ Trong dịch hoàn phụ, tinh trùng tồn tại trong môi trường axit nên khả năng hoạt động bị ức chế Khi tinh trùng di chuyển trong dịch hoàn phụ, tinh trùng được bao phủ bởi một lớp lipoproteit để nâng cao khả năng ổn định cho tinh trùng, lớp này có điện tích

âm giúp cho tinh trùng không bị dính tụ nhau

Hình thái: Tinh trùng ngựa có đầu nhọn, hơn dầy Tổng chiều dài tinh trùng 55,0 - 63,6µm, trong đó dài đầu 6,0 - 8,1µm, rộng đầu 3,3 - 4,6µm, dài thân 8 - 10µm, đường kính thân 0,5µm, dài đuôi 30 - 43µm, đường kính đuôi 0,4µm, (Hiroshi Masuda, 1992) [31]

Cấu tạo: Tinh trùng gồm 3 phần cơ bản (đầu, thân và đuôi)

Phần đầu: Đầu tinh trùng gồm 2 phần chính Đó là nhân và thể chóp

acrsome Nhân tinh trùng chiếm 65% toàn bộ thể tích của đầu và là kho duy nhất chứa toàn bộ thông tin di truyền của con đực từ đời trước truyền sang đời sau Trong nhân có chứa Chromatin đậm đặc cao độ, đó là nguồn ADN liên kết với một protein đặc biệt Số lượng nhiễm sắc thể trong nhân tinh trùng là

đơn bội (Barth A D, 1989) [22]

Bản chất của nhân là nucleoprotit Nucleoprotit gồm hai thành phần cơ bản là nucleic và histin Hai thành phần này được nối với nhau bằng cầu nối hoá học NHB 2 B-P rất dễ bị đứt bởi các tác động như nhiệt độ cao, ASTT, pH,

rung động…làm tế bào tinh trùng bị chết Đây là cơ sở để xây dựng nguyên lý kiểm tra sức kháng của tinh trùng cũng như để pha loãng, bảo quản tinh trùng được trong các môi trường khác nhau Trong nguyên sinh chất phần đầu có chứa nhiều men giúp cho quá trình trao đổi chất, hoạt hoá tinh trùng Phần màng có 3 lớp (protein, lipit, protein) là màng bán thấm protein thuận lợi cho quá trình trao đổi chất, có chức năng định hình tinh trùng

Trên cùng đỉnh đầu có một lớp màng mỏng gọi là mũ chóp đỉnh Hay

mũ trước chóp Dưới mũ trước chóp có cấu tạo hình giải gọi là thể ngọn Mũ trước chóp và thể ngọn tạo thành một hệ thống xoang acrosome (thể đỉnh) Trong xoang acrosome tập trung nhiều men hyaluronidaza, men này không đặc trưng cho loài và có tác dụng phá vì màng phóng xạ của trứng trong quá trình thụ tinh Do vậy sự vẹn toàn của xoang acrsome giữ vai trũ quan trọng và được coi như là chỉ số xắc suất về khả năng thụ tinh của tinh trùng Khi bảo tồn tinh trùng, hệ thống acrosome dễ bị phồng lên, rời khỏi đầu tinh trùng và làm tinh

trùng mất khả năng thụ tinh, nhất là trong môi trường nhược trương (do đó môi trường pha loãng tinh dịch phải có ASTT tương đồng với ASTT tinh dịch) Đây

cũng là vấn đề cần quan tâm trong quá trình pha chế, bảo tồn và sử dụng tinh dịch nhằm nâng cao tỷ lệ thụ thai của tinh trùng

Người ta cho rằng acrsome là một lisosome (tiêu thể hay thể tiêu bào) đặc biệt, bên trong có chứa các enzim thuỷ phân (acrosine, hyaluronidaza, photphatase axit, esteras, các hydrolase axit) có liên quan đến quá trình xâm nhập của tinh trùng qua màng trứng vào bên trong để thụ tinh

Phần cổ: Cổ tinh trùng rất ngắn, khớp cổ lỏng lẻo dễ đứt, khi tinh trùng

lọt được vào vùng noãn hoàn của trứng thì cổ tách ra khỏi đầu Tại cổ tập trung nhiều ty thể (mitocondrias) cung cấp năng lượng cho đuôi hoạt động, ty thể có cấu tạo 50% protit, 30% lipit tích luỹ lượng lớn ATP nhằm cung cấp năng lượng cho tinh trùng hoạt động nhưng lại giảm rất nhanh khi nhiệt độ bảo tồn cao Trong nguyên sinh chất phần cổ còn chứa một lượng đáng kể là lipoit Những năm trước 1856 người ta cho rằng đó là lactine (chất "chống lạnh" cho tinh trùng ) Sau đó 1952 Bowguth đã chỉ ra rằng đã không phải là

lectine mà là plasmalogen (đây là một photpholipit chứa một phân tử axit béo, một aldehyt của axit béo và một glyxerylphotphoryl-coline khi kết hợp với một loạt các chất khác cho ra hợp chất có chứa năng lượng cung cấp cho quá trình hô hấp của tinh trùng chứ không có tác dụng chống lạnh) Do đó, trong quy trình đông lạnh tinh dịch nhất thiết phải có chất chống lạnh trong môi trường bảo tồn

Phần đuôi: Gồm 9 đôi vi ống ngoài xếp đồng tâm bao quanh 2 sợi dọc

ở trung tâm Cấu tạo này làm tinh trùng có khả năng vận động, di chuyển trong môi trường tinh dịch và trong đường sinh dục cái Đuôi có chứa nhiều

lipit (Nguyễn Tấn Anh, 1996) [1]

* Quá trình trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất của tinh trùng tạo ra năng lượng không được tinh trùng sử dụng trực tiếp mà được dự trữ dưới dạng ATP (adenozin triphotphat) Khi tinh trùng vận động tinh trùng lấy năng lượng tại chỗ từ việc cắt mạch nối cao năng của ATP cổ thân Trong protit sợi đuôi có 2 chất cơ bản là spermiozin và spartin Spermiozin có thể phân giải ATP tạo ra năng lượng và năng lượng được tạo thành chạy dọc nhờ spartin đến toàn bộ sợi đuôi làm sợi đuôi co rút và vận động

Quá trình đường phân yếm khí: Trong điều kiện không có oxy (yếm

khí), tinh trùng tiến hành đường phân yếm khí với nguyên liệu là đường

fructoz, enzim tham gia là hexokinaza và photphataza để giải phóng năng lượng dưới dạng ATP và axit lactic

Fructoz axit lactic + COB 2 B + Q (27,7 kcal) Như vậy quá trình hô hấp yếm khí của tinh trùng là quá trình đường phân Năng lượng thu được trong quá trình này cho mỗi tinh trùng là tương đối ít, sản phẩm axit lactic trong tinh dịch với nồng độ thấp thì kéo dài thời gian sống của tinh trùng, còn ở nồng độ cao gây chết tinh trùng hàng loạt Axit lactic lại phân ly rất lớn (gấp 2,8 lần axit axetic và 20 lần axit cacbonic)

0

C nên ở đó tinh trùng ở trạng thái bất động và ''sống lâu'' Khi ra ngoài cơ thể, tinh trùng nhận được đường từ chất phân tiết của tuyến tinh nang, đường nhanh chóng thấm qua màng của tinh trùng nên quá trình đường phân xảy

ra Khi thiếu fructoz tinh trùng có thể sử dụng glucoza của máu đưa tới vì trong tinh nang có enzim chuyển hoá glucoza thành fructoz Đây là cơ sở để ứng dụng bảo tồn tinh dịch trong điều kiện yếm khí và trên cơ sở đó khi pha loãng tinh dịch có thể dùng đường glucoza vào thành phần môi trường

Hô hấp hiếu khí (oxy hoá đường): Hô hấp hiếu khí xảy ra trong điều

kiện tinh trùng được phóng vào đường sinh dục con cái hoặc lấy tinh ra ngoài

để pha chế bảo tồn

CB 6 BHB 12 BOB 6 B + 6OB 2 B 6COB 2 B + 6HB 2 BO + 674 kcal Môi trường đường sinh dục con cái, đặc biệt trong giai đoạn động dục

và rụng trứng có đủ điều kiện thuận lợi cho tinh trùng hô hấp hiếu khí: Giầu oxy (do kết quả tăng sinh mà mở rộng lòng đường sinh dục), giầu glucoza (do dãn mạch máu tử cung âm đạo - máu đến nhiều)

Giai đoạn đầu của quá trình hô hấp hiếu khí xảy ra như quá trình đường phân, ở giai đoạn sau axit puryvic được hoạt hoá và đi vào chu trình

Krebs để cuối cùng cho ra COB 2 B, HB 2 BO và thu được một lượng khá lớn năng lượng dù trữ dưới dạng ATP Từ một phân tử đường đơn sau khi hoạt hoá có thể thu được 38 ATP Quá trình hô hấp tăng lên bởi nhiệt độ, cứ tăng lên 10P

0

C thì hô hấp tăng lên 2 - 2,5 lần Do đó để bảo tồn tinh dịch phải chọn được nhiệt độ phù hợp và ngăn chặn việc tinh trùng tiếp xúc với oxy để giảm đến mức thấp nhất quá trình hô hấp hiếu khí xảy ra

* Tinh thanh

Tinh thanh trong tinh dịch ngựa là một hỗn hợp những chất tiết của dịch hoàn phụ và của các tuyến sinh dục phụ (tuyến cầu niệu đạo, tuyến tiền liệt, tinh nang, tuyến niệu quản) Thành phần tinh thanh chủ yếu là nước (80 - 93%)

và vật chất khô Trong vật chất khô chủ yếu là protein, chỉ có một lượng rất nhỏ là đường mỡ, chất khoáng, men và vitamin (Trần Tiến Dũng, 2002) [4]

Tác dụng chủ yếu của tinh thanh là rửa đường niệu đạo sinh dục cho con cái, hoạt hoá tinh trùng tạo điều kiện cho tinh trùng đến gặp trứng trong quá trình thụ tinh, đồng thời là môi trường để nuôi sống tinh trùng ngoài cơ thể Như vậy tinh thanh có vai trò rất lớn trong việc ''nuôi dưỡng'' tinh trùng ngoài cơ thể và trong quá trình thụ thai

Bảng 1.2: Thành phần các chất có trong tinh thanh ngựa (theo Mann)

1.1.4 Cấu tạo và kích thước âm đạo giả ngựa

Theo Milovanov 1962: Nguyên lý cấu tạo của âm đạo giả là tập hợp tất

cả các điều kiện tự nhiên phù hợp như ở trong đường sinh dục con cái ở thời điểm giao phối và cho phép thu nhận một cách nhanh chóng toàn bộ lượng tinh mà không bị nhiễm bẩn (trích Nguyễn Tấn Anh., 1996) [1] Âm đạo giả của các loài gia súc có kích thước khác nhau Âm đạo giả của ngựa có đặc điểm cấu tạo và kích thước như sau:

- Áo bao âm đạo giả làm bằng da hoặc tôn, dài bằng thân âm đạo giả

- Âm đạo giả bao gồm:

Thân âm đạo giả: Cao su mềm trung tính Ruột âm đạo giả: Cao su mềm trung tính Bơm áp lực

Phễu hứng tinh Bình chứa tinh: Nhựa mầu trung tính Phần chứa nước ấm trong thân âm đạo

- Kích thước âm đạo giả: Chiều dài 65 cm, dài thân 50 cm, đường kính 18 cm

* Các yếu tố đảm bảo cho âm đạo giả tương đồng với âm đạo của ngựa

- Nhiệt độ: Nhiệt độ trong lòng âm đạo giả: Về mùa hè 39 - 40P

0

C, về mùa đông 41 - 42P

- Độ nhớt: Để tạo độ nhớt trong lòng âm đạo giả tương đồng với độ nhớt âm đạo của ngựa cái, người ta sử dụng vazơlin hoặc pharafin vô trùng (pH trung tính)

1.1.5 Các chỉ tiêu đánh giá số lượng, chất lượng tinh dịch

* Thể tích tinh dịch V (ml)

Thể tích tinh dịch là số ml tinh dịch sau lọc bỏ keo phèn trong một lần khai thác Thể tích tinh dịch phụ thuộc vào yếu tố: Giống, loài, độ tuổi, cá thể…đồng thời còn phụ thuộc vào kỹ thuật khai thác tinh, tần xuất lấy tinh và mùa vụ lấy tinh Lượng xuất tinh của ngựa dao động 50 - 120ml/lần, trung bình 75ml (Đặng Đình Hanh, 2002) [6] Trong tinh dịch ngựa có chứa một lượng khá lớn hạt thể selatin, chiếm tỷ lệ 20 - 30% lượng tinh dịch, chúng là sản phẩm của tuyến Cowper, dịch tiết ra của tuyến này có bản chất anbumonoit đặc quánh, trong suốt Khi xuất tinh, những hạt thể gặp men vegikinaza của tuyến tinh nang rồi đọng lại thành những tinh thể lớn hơn Sau

đó các thể này hấp phụ nước và tăng lên về thể tích, người ta gọi đó là keo phèn (Trần Tiến Dũng, 2002) [4]

Theo các tác giả: Dowett và Pattie (1982), Pickett (1988), Rickett (1993), Fayver Hosken và Caudle (1989), lượng tinh ngựa của một lần khai thác vào khoảng 100ml, trong đó tinh dịch 60 - 80ml, keo phèn 20 - 40ml Theo Pickett

1998, chỉ tiêu tinh dịch của mỗi lần khai thác phụ thuộc vào giống, độ tuổi, lao tác và thời gian gây kích dục (trích Davies Morel, 1999) [28]

Trong giao phối tự nhiên, keo phèn có tác dụng bịt lỗ tử cung, không cho tinh dịch chảy ra ngoài Trong thụ tinh nhân tạo cần phải loại bỏ keo phèn trước khi xử lý đưa vào đông lạnh Vào mùa giao phối trong tinh dịch ngựa có lượng selatin lớn hơn mùa không giao phối Do đó, khi xác định thể tích tinh dịch cần phải loại bỏ keo phèn bằng cách lọc qua nhiều lớp vải gạc

* Hoạt lực tinh trùng A (%)

Hoạt lực là sức sống, sức vận động tinh trùng trong tinh dịch Nó là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng tinh dịch, biểu thị khả năng thụ thai của tinh trùng Tuy nhiên, chỉ những tinh trùng tiến thẳng mới có khả năng thụ thai Do đó, hoạt lực tinh trùng là tỷ lệ phần trăm số tinh trùng có trong tinh dịch có khả năng vận động theo phương thức tiến thẳng

Tinh trùng vận động theo 3 phương thức:

+ Tiến thẳng: Phương vectơ vận động của tinh trùng ổn định

+ Xoay vòng: Phương vectơ vận động của tinh trùng luôn luôn thay đổi + Lắc lư (dao động): Vận động của tinh trùng hầu như không có vectơ vận động, không thay đổi vị trí tương đối của chúng Tinh trùng nằm tại vị trí

đó, chỉ có đầu hoặc đuôi cử động

Hoạt lực tinh trùng càng cao chất lượng tinh trùng càng tốt và khả năng thụ thai càng lớn Sức sống của tinh trùng có ảnh hưởng liên quan đến sức sống của đời sau Hoạt lực tinh trùng càng cao khả năng thụ thai càng cao, phát dục và chống đỡ bệnh tật của đời sau càng tốt và ngược lại (Đỗ Văn Thu, 2000) [12]

Theo Eliasson và cs 1974, hoạt lực và sức sống bền của tinh trùng phụ thuộc vào tỷ lệ thích hợp giữa các dịch tiết của tuyến tiền liệt và tiểu nang Thành phần hóa sinh của tinh thanh là rất ổn định cho mỗi lần xuất tinh và không phụ thuộc vào tần số xuất tinh Chất tiết của tuyến tiểu nang có chứa một vài nhân tố không có lợi cho hoạt lực và sức sống bền của tinh trùng Nhưng chất tiết của tuyến tiền liệt lại kích thích sức hoạt động của tinh trùng Khi tiếp xúc với chất tiết tuyến tiền liệt, tinh trùng được bảo vệ để tránh ảnh hưởng không có lợi của chất tiết tuyến tiểu nang (trích Nguyễn Tấn Anh, 1996) [1]

* Nồng độ tinh trùng C (triệu/ml)

Nồng độ tinh trùng là số tinh trùng có trong một đơn vị ml thể tích tinh dịch Nồng độ tinh trùng là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng tinh dịch, là cơ sở để tính toán số liều tinh sản xuất Nồng độ tinh trùng có thể dao động từ 100 - 200 triệu/ml (Rickett, 1993) [43] Theo Janett F, 2003 [35], nồng độ tinh trùng ngựa Warmblood thay đổi theo mùa, dao động từ 270 -

dài và ngược lại, khi pH tinh dịch kiềm tính thì tinh trùng hoạt động mạnh, thời gian sống tinh trùng bị rút ngắn Để xác định độ pH người ta sử dụng máy đo pH hoặc giấy chỉ thị mầu (giấy đo pH)

Độ pH của tinh dịch giữa các loài gia súc có sự khác nhau và đều có phạm vi giới hạn nhất định Trần Tiến Dũng (2002) [4] cho biết pH tinh dịch ngựa dao động 6,2 - 7,8, trung bình 7,3 Theo Hiroshi Masuda (1992) [31] pH tinh dịch ngựa dao động 6,9 - 7,7, trung bình 7,3

đó có dịch tiết của tuyến tinh nang chiếm tỷ lệ cao thì thường có giá trị kiềm tính Theo Nguyễn Tấn Anh, (1996) [1], pH tinh dịch ở ngựa và heo là kiềm yếu (7,2 - 7,5), pH tinh dịch ở trâu, bò, dê và cừu là hơi toan (6,7 - 6,9)

] có hại cho màng và cấu trúc P-NHB 2 B của tinh trùng và làm cho tinh trùng chết Vì thế người ta sử dụng dung dịch NaCl 1% để đo sức chống chịu của tinh trùng Sức kháng của tinh trùng là khả năng chống chịu của tinh trùng trước môi trường sống bất lợi Đó là sức đề kháng của tinh trùng trong một dung dịch không đẳng trương Để đánh giá sức kháng của tinh trùng người ta thường dùng NaCl 1% để kiểm tra lượng dung dịch cần thiết pha loãng một đơn vị tinh dịch cho đến khi toàn bộ tinh trùng ngừng hoạt động tiến thẳng Theo Nguyễn Hữu Trà (2003) [16] cho biết sức kháng của tinh trùng ngựa nuôi tại Trung tâm dao động từ 2700 - 3666

* Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình K (%)

Tinh trùng kỳ hình là tinh trùng có hình thái bất thường ở đầu, cổ, thân

và đuôi (Ví dụ: Tinh trùng hai đầu, méo đầu, đuôi gập, đuôi cụt, đuôi xoắn

lại…) Tỷ lệ kỳ hình cao sẽ làm giảm khả năng thụ tinh Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình là một trong các chỉ tiêu để đánh giá chất lượng tinh dịch

Theo Milovanov (1962) Có hai loại tinh trùng kỳ hình cùng với đó là hai thời kỳ có thể gây nên kỳ hình ở tinh trùng

- Kỳ hình ngay trong quá trình sinh tinh Tinh trùng kỳ hình sơ cấp, bắt nguồn từ nguyên nhân có liên quan đến bệnh lý ở cơ quan sinh tinh

- Sau khi tinh trùng được bài tiết ra Tinh trùng kỳ hình thứ cấp, bắt nguồn từ nguyên nhân có liên quan đến ngoại cảnh hoặc kỹ thuật không đúng trong khâu xử lý tinh dịch

Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình càng cao thì chất lượng tinh trùng càng kém

và ngược lại Chỉ những tinh trùng khoẻ mạnh, vận động tiến thẳng và hoàn hảo về hình thái thì mới tham gia vào quá trình thụ tinh (trích Nguyễn Tấn Anh, 2003) [2]

Theo Nguyễn Hữu Trà (2003) [16], tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng ngựa

dao động từ 12,96 - 20,05%

* Áp suất thẩm thấu tinh dịch (milliosmol/kg)

Áp suất thẩm thấu của một chất lỏng phụ thuộc vào nồng độ hoà tan các phân tử và các ion trong đó và được tính trên một đơn vị thể tích Đơn vị

tính: milliosmol/kg hay atm (atmosphere), 1 milliosmol/kg = 0,0224 atm

Áp suất thẩm thấu có ảnh hưởng đến quá trình hô hấp của tinh trùng trong các môi trường khác nhau Theo Salisbury G W (1978), trong môi trường có [ClP

] với 7 atm, tinh trùng đạt mức tiêu thụ Oxygen cao nhất (13 µl

OB 2 B/100 triệu tinh trùng), còn khi ở 13 atm sự tiêu hao Oxygen giảm xuống (7,8 µl OB 2 B/100 triệu tinh trùng) Nếu là môi trường có ion photphat, khi áp suất thẩm thấu là 3,9 atm, lượng OB 2 B là cao nhất (6 µl OB 2 B/100 triệu tinh trùng), nếu tăng lên 7,5 hoặc 15 atm kết quả tương ứng là 4 và 3 µl OB 2 B/100 triệu tinh trùng (trích Nguyễn Tấn Anh, 1996) [1] Áp suất thẩm thấu là chỉ tiêu cần thiết làm cơ sở cho việc nghiên cứu xây dựng môi trường pha loãng bảo tồn tinh dịch động vật

* Tổng số tinh trùng tiến thẳng V.A.C (tỷ/lần)

Tổng số tinh trùng tiến thẳng là chỉ tiêu tổng hợp của cả 3 chỉ tiêu

(V.A.C) và là tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần xuất tinh

* Mầu sắc tinh dịch

Tinh dịch gia súc, gia cầm nói chung và tinh dịch ngựa nói riêng phải có

mầu sắc ổn định Mầu tốt nhất của tinh dịch ngựa là mầu vàng kem, trắng ngà

hoặc trắng sữa Tất cả những mầu sắc bất thường đều do bệnh lý gây lên

1.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới số lượng, chất lượng tinh dịch ngựa

* Yếu tố nội tại

+ Giống, cá thể và độ tuổi

Các giống khác nhau thì số lượng, chất lượng tinh dịch cũng khác nhau

Trong cùng một giống giữa các cá thể khác nhau cũng cho số lượng và chất

lượng tinh dịch khác nhau Nói chung đực giống trẻ và có tầm vóc nhỏ thì

lượng xuất tinh ít Nếu lấy tinh hai lần liên tiếp thì lượng xuất tinh lần thứ hai

ít hơn lần đầu Theo Nguyễn Hữu Trà (2003) [16], ngựa đực Kabadin nuôi tại

Trung tâm lượng tinh dịch trong một lần xuất tinh nhiều hơn ngựa nội (ngựa

Kabadin đạt 70,82 ml, ngựa nội đạt 40,5ml) Trần Văn Thi (1985) [9], khi

nghiên cứu tinh dịch ngựa đực lai 25% máu Kabadin có số lượng tinh dịch:

59ml/lần, nồng độ tinh trùng 120 triệu, hoạt lực 62% Ngựa Tersk có lượng

tinh dịch đạt 180ml/lần, hoạt lực tinh trùng đạt 85% (Bartlett, 1973) [23]

Bảng 1.3: Độ tuổi ngựa có ảnh hưởng đến thể tích và nồng độ tinh trùng

Ghi chú: Các chữ cái a,b trong cùng một hàng có sự sai khác nhau về ý nghĩa thống kê

NS: Không có ý nghĩa thống kê

* Yếu tố ngoại cảnh

+ Chế độ chăm sóc và nuôi dưỡng

Đây là yếu tố cơ bản ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến số lượng

và chất lượng tinh dịch Chế độ dinh dưỡng phải đầy đủ và cân đối, phong phú về các chủng loại thức ăn phù hợp cho đực giống Khẩu phần ăn có năng lượng và protein quá cao hoặc quá thấp cũng đều ảnh hưởng đến chất lượng tinh dịch

+ Chế độ sử dụng và khai thác:

Không nên sử dụng đực giống đã thành thục về tính nhưng chưa thành thục về thể vóc và cũng cần loại những đực giống đã quá già Nếu sử dụng đực giống ở độ tuổi quá sớm, đực giống nhanh bị thoái hóa, chất lượng tinh trùng giảm Nếu sử dụng đực giống quá muộn thì khó thành lập phản xạ có điều kiện và hiệu quả kinh tế không cao Trong thực tế cho thấy, ngựa đực nuôi tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển chăn nuôi miền núi có thời gian khai thác sử dụng 4 - 15 năm tuổi và nếu cho giao phối trực tiếp có định hướng trong mùa phối giống ngựa đực có tần suất phối giống 2 - 3 ngày/lần

+ Các yếu tố mùa vụ, nhiệt độ

Mùa vụ và nhiệt độ có ảnh hưởng mạnh đến số lượng và chất lượng tinh dịch Ngựa Warmblood có thể tích và hoạt lực cao nhất ở mùa hạ (tương ứng 41,1ml và 75,9%), thấp nhất là mùa đông (33,9ml và 70,2%) và trung bình là mùa xuân, mùa thu (36ml và 72%) Theo Janett, 2003 [35] Ngoài ra hoạt lực và tỷ lệ tinh trùng kỳ hình cũng thay đổi theo mùa

* Các yếu tố khác

Các nhân tố như tình trạng sức khoẻ, bệnh tật…kỹ thuật khai thác (vị trí khai thác, thời gian khai thác và thậm chí thay đổi kỹ thuật viên khai thác) cũng đều ảnh hưởng đến số lượng và chất lượng tinh dịch

1.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến sức sống tinh trùng ngoài cơ thể

* Nhiệt độ môi trường bảo quản

Nhiệt độ là một trong những nhân tố đầu tiên của môi trường bên ngoài ảnh hưởng đến tinh dịch mới khai thác Nếu có sự chênh lệch lớn giữa tinh

dịch vừa mới xuất tinh với nhiệt độ môi trường bên ngoài, tinh trùng sẽ bị stress và dễ chết (nhất là về mùa đông khi nhiệt độ ngoài trời xuống <15P

* Ánh sáng

Ánh sáng tán quang không có hại cho tinh trùng Nhưng dưới tia nắng trực tiếp, hoạt động của tinh trùng được tăng cường và sau 20 - 40 phút tinh trùng sẽ chết (Nguyễn Tấn Anh, 1996) [1] Tác hại của tia nắng mặt trời được giải thích bằng tia cực tím của quang phổ đã đẩy mạnh các quá trình phản ứng hóa học và bằng ảnh hưởng nhiệt của tia cực tím Do đó trong thực tế sản xuất khi tiến hành xử lý tinh dịch hoặc TTNT không cho phép tinh trùng tiếp xúc dưới tia nắng mặt trời hoặc các đèn khử trùng

* Áp suất thẩm thấu của môi trường pha loãng bảo tồn

Áp suất thẩm thấu có ảnh hưởng sức hoạt động tinh trùng Muốn tinh trùng sống thuận lợi trong môi trường pha loãng thì ASTT của môi trường pha loãng phải tương đồng với ASTT tinh dịch Các dung dịch ưu trương hoặc nhược trương đều có hại cho tinh trùng vì sẽ làm cho tinh trùng teo lại hoặc phồng lên và chết một cách nhanh chóng Theo Revell S, Wale 1998, nhìn chung môi trường ưu trương tốt hơn môi trường nhược trương nhưng

sự chênh lệch đó chỉ cho phép trong một giới hạn nhất định Theo Pickett

1989, ASTT của môi trường nên dao động trong khoảng 290 - 310 miliosmol ASTT của môi trường <200 miliosmol hoặc >350 miliosmol đều ảnh hưởng đến hình thái cũng như chức năng của tinh trùng (trích Davies Morel, 1999) [28]

* Tác động cơ học

Cấu tạo của xoang acrosome cũng như cấu tạo giữa các bộ phận cấu tạo

cơ thể của tinh trùng đều hết sức lỏng lẻo Do vậy những tác động cơ học trong mọi thao tác đều ảnh hưởng đến sức hoạt động của tinh trùng

* Ảnh hưởng vi sinh vật có hại và vật lạ

Trong tinh dịch có chứa nhiều vi sinh vật hay vật lạ sẽ gây chết cho tinh trùng Do vậy, vấn đề vô trùng dụng cụ khai thác tinh dịch và vệ sinh bên ngoài bộ phận sinh dục ngựa đực là cần thiết Sự xuất hiện của các vật lạ trong tinh dịch sẽ làm tinh trùng bám vào đó gây lên hiện tượng tinh trùng tụ dính, mất điện tích và không còn khả năng tiến thẳng, từ đó sẽ làm giảm tỷ

lệ thụ thai

* Chất lượng nước cất

Từ lâu nay người ta chưa chú ý đầy đủ đến mối tương quan giữa chất lượng nước cất với sức sống tinh trùng khi được bảo tồn trong môi trường pha loãng Trong pha loãng và bảo tồn tinh dịch, các chỉ tiêu sau đây của nước cất được xem là quan trọng: Khả năng tích ion, tổng vật chất và tổng lượng vi khẩn Nên sử dụng nước cất có hàm lượng chất rắn < 1 ppm, tổng lượng vi khuẩn trong nước là bằng 0 (trích Nguyễn Tấn Anh, 1996) [1]

1.1.8 Giao phối và thụ thai ở ngựa

Giao phối: Có hai phương thức phóng tinh ở gia súc: Phóng tinh âm

đạo và phóng tinh tử cung Ngựa được xếp vào loại phóng tinh âm đạo, nhưng

do đầu dương vật loe to hình hoa sen, thành âm đạo của ngựa cái co bóp mạnh khi giao phối, cổ tử cung mềm không có vòng nhẫn mà chỉ có các nếp dọc do vậy khi giao phối cổ tử cung được mở rộng, tinh dịch ngựa đực phóng thẳng vào tử cung Lượng tinh dịch của ngựa xuất ra một lần từ 50 - 150 ml, nhiều nhất 600 ml, nồng độ tinh trùng trung bình 0,08 - 0,2 tỷ / ml, nhiều nhất

có tới 0,8 tỷ /ml (Nguyễn Thiện, Hoàng Kim Giao, 1996) [10] Theo Trần Văn Thi, 1985 [9] tinh dịch ngựa đực lai 25% Kabadin có lượng xuất tinh đạt

59 ml/lần, nồng độ tinh trùng: 120 triệu/ml, hoạt lực 62% Trong chăn nuôi ngựa sinh sản việc thụ tinh nhân tạo cũng được thực hiện bằng cách đưa tinh dịch vào sừng tử cung bên phía có nang trứng phát triển

Sự thụ thai ở ngựa

+ Thụ tinh: Thụ tinh là quá trình đồng hóa giữa trứng (n NST) và tinh trùng (n NST) để tạo thành hợp tử 2n NST có bản chất hoàn toàn mới và có

khả năng phân chia nguyên nhiễm liên tiếp tạo thành phôi Đó là kết quả của

sự tái tổ hợp các gen từ 2 nguồn gen khác nhau

Davises Morel (1999) [28] đó cho rằng: Tinh trùng cần phải sống trong đường sinh dục của con cái trước khi tiếp xúc với trứng được gọi là đủ năng lực do lưu lại ở vùng eo ống dẫn trứng Thành phần bề mặt của tinh trùng được cải tiến hoặc sẽ tan đi do chất tiết của đường sinh dục con cái làm cho lớp photpholipit của màng tinh trùng mất ổn định, tạo điều kiện cho acrosome được thực hiện biến đổi bao gồm sự giảm Progesteron trên bề mặt tinh trùng,

sự thay đổi glucozaa minoglycan đó có tác dụng hoạt hoá để tinh trùng có đủ năng lực thụ tinh Nhưng tuỳ thuộc vào phẩm giống và cá thể, ngựa Kabadin mỗi lần xuất tinh thu được 146 ml, nồng độ tinh trùng đạt 89 triệu/ml, (Đặng Đình Hanh 1994) [5] Ngựa Tersk có lượng xuất tinh tương ứng 180 ml/ lần, nồng độ tinh trùng đạt 85 triệu/ml (Bartlett 1973) [23]

Ngay sau khi tinh dịch được phóng vào tử cung, tinh trùng di chuyển

về phía ống dẫn trứng với vận tốc 2- 5 mm/ phút Theo Barker, (1957) [21] với tốc độ này so với chiều dài của tinh trùng đó là một vận tốc khá lớn Ngoài sự vận động của nó, còn có thêm các tác nhân khác như nhu động của

tử cung, vòi trứng, tác động của những đoạn thắt sinh lý Sự vận động với hướng vận động của mao bào sinh lý, tinh trùng di chuyển ngược dòng đến nơi thụ tinh là 1/3 phía trên của ống dẫn trứng Theo Amann 1984, Evans và Mawell 1987, Garner 1991 Tỷ lệ thụ thai của ngựa với phương thức giao phối tự nhiên là 40 - 70%, với phương thức TTNT bằng tinh tươi và tinh bảo tồn là 50 - 65%, với phương thức TTNT bằng tinh đông lạnh là 35 - 50% (trích Davies Morel, 1999) [28]

1.2 CƠ SỞ KHOA HỌC KỸ THUẬT ĐÔNG LẠNH TINH DỊCH NGỰA

Tinh trùng khi chưa ra ngoài cơ thể sống được duy trì trong môi trường phù hợp Nhưng khi ở ngoài cơ thể do bị tiêu hao năng lượng và môi trường bất lợi nên tinh trùng bị chết rất nhanh Do đó việc nghiên cứu đặc điểm sinh học của tinh dịch và tinh trùng sẽ cho phép bảo quản tinh trùng ngoài cơ thể sống và để duy trì được tinh trùng sống lâu dài phải có 2 điều kiện sau:

• Tinh trùng trong tinh dịch được bảo tồn ở trạng thái bất động

• Loại bỏ và ngăn ngừa độc tố đối với tinh trùng

Để đạt đựơc 2 điều kiện trên phải loại trừ được vi khuẩn cư trú trong tinh dịch và đông lạnh tinh trùng ở nhiệt độ lạnh sâu để chuyển tinh trùng sang trạng thái tiềm sinh

Nhiệt độ càng thấp thời gian tiềm sinh càng dài Theo dự đoán bằng phương pháp bức xạ của MaJu (1989) thì tinh trùng bảo tồn ở nhiệt độ -196P

lệ sống của tinh trùng, lúc đó tế bào chất bị kết tinh và hình thái tinh trùng bị phá vỡ Nếu đông lạnh tinh dịch đúng quy trình tế bào tinh trùng không bị đông cứng, không bị mất nước, hình thái tinh trùng không bị vỡ, vượt qua giai đoạn kết tinh hoá

Việc kết hợp các chất chống choáng cùng với các chất đệm trong môi trường cũng như cân bằng ở nhiệt độ thích hợp trong một thời gian nhất định

đã làm tăng khả năng chịu lạnh của tinh trùng Vì vậy, việc đông lạnh tinh dịch của một số gia súc đã mang tính phổ biến

Cơ sở khoa học cho kỹ thuật đông lạnh tinh dịch vật nuôi là tạo ra quá trình giảm đến mức tối thiểu quá trình trao đổi chất của tế bào sống, bằng cách tạo ra hiện tượng tinh thể hoá của tế bào do quá trình làm lạnh rất nhanh

và mạnh được tạo ra, nhưng đồng thời vẫn giữ được sự cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào sống, cũng như việc giữ nguyên hình thái của tinh trùng Đặc biệt sau khi giải đông vẫn còn số lượng tinh trùng nhất định hoạt động bình thường và có khả năng thụ thai, (Ditto, 1992) [29] Việc phát minh

ra cơ chế tác dụng của glyxeryl và lòng đỏ trứng trước đây đã thúc đẩy sự phát triển của công nghệ này Ngày nay với kỹ thuật tiên tiến người ta đã có thêm những hoá chất mới như Raffinose, Tris, BSA, Hepes, thậm chí là những dung dịch đã pha sẵn không cần đến lòng đỏ trứng (Iritani, 1989) [34]

1.2.1 Một số nguyên lý cơ bản về đông lạnh tinh dịch ngựa

1.2.1.1 Hiện tượng đông băng chất lỏng

Khi một chất lỏng được làm lạnh hiện tượng đông băng xảy ra Quá trình này xảy ra qua các giai đoạn sau:

- Tiền đông băng

- Tạo nhân tinh thể

- Dãn nở của tinh thể băng

- Kết tinh hoàn thiện tại một nhiệt độ nhất định (EP/Entectic point)

Sơ đồ quá trình làm lạnh và đông băng của một dung dịch (Ditto, 1992) [29]

EP

EP

Pha lỏng Pha lỏng Pha tinh thể Pha tinh thể

và pha tinh thể và pha lỏng Khi đông lạnh tinh dịch, sự tạo thành nhân tinh thể và dãn nở của tinh thể băng chỉ xảy ra trong điều kiện đông lạnh chậm, còn khi đông lạnh cực nhanh thì hai hiện tượng trên không xảy ra mà xảy ra hiện tượng tinh thể hoá (vitrification) tạo ra các hạt băng nhỏ li ti, loại trừ được hiện tượng dãn nở tinh thể (Iritani, 1989) [34]

Khi làm lạnh một chất lỏng, nếu tốc độ làm lạnh chậm nhiệt độ của chất lỏng hạ xuống điểm đông băng mà chất lỏng vẫn giữ nguyên trạng thái và chưa có tinh thể đông băng Quá trình này gọi là tiền đông băng Trạng thái của chất lỏng lúc này không ổn định, chỉ cần một tác động nhẹ là xảy ra hiện

tượng tạo nhân hoặc phá vỡ hiện tượng tạo nhân tinh thể thay vào đó là hiện tượng kết hạt (Ditto, 1992) [29], (Weize, 1991) [49]

+ Hiện tượng tạo tinh thể

Một chất lỏng đông băng phải có một hạt nhỏ làm nhân cho các phân tử nước lần lượt bám vào để hình thành tinh thể Hiện tượng tạo nhân tinh thể có hai hình thái:

Nước nguyên chất: Việc tạo nhân từ hạt tinh thể nước

Dung dịch: Các hạt chất tan là nhân cho các phân tử nước bao quanh tạo tinh thể Việc tạo tinh thể ở trường hợp này xảy ra ở nhiệt độ cao hơn trường hợp nước nguyên chất

+ Sự dãn vỡ của tinh thể băng

Khi đông băng các tinh thể hình thành, thể tích của chúng sẽ tăng, sự dãn nở thể tích này giải phóng năng lượng tiềm ẩn trong các phân tử nước làm cho nhiệt độ của dung dịch tăng đến điểm đông băng mặc dù quá trình làm lạnh vẫn tiếp tục (Iritani, 1989) [34] Tại thời điểm đông băng, nhiệt độ của dung dịch không đổi trong một giai đoạn nhất định và giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tốc độ đông băng Nếu tốc độ đông băng nhanh thì giai đoạn trên sẽ ngắn lại và sự dãn nở của tinh thể sẽ bị loại trừ và thay vào

đó là hiện tượng tinh thể hoá

+ Điểm đông băng hoàn chỉnh và sự kết tinh tinh thể của dung dịch Khi hiện tượng làm lạnh tiếp tục, lượng tinh thể nước tăng lên và pha lỏng giảm dần, nồng độ dung dịch tăng và dung dịch sẽ tách ra làm 2 phần: Pha tinh thể và pha lỏng Nếu hiện tượng làm lạnh tiếp tục thì pha lỏng sẽ biến mất ở một nhiệt độ nhất định Điểm đó gọi là điểm đông băng hoàn chỉnh của một dung dịch (Weize, 1991) [49]

1.2.1.2 Ảnh hưởng của đông băng lên tế bào tinh trùng

Tinh trùng là một loại tế bào đặc biệt rất mẫn cảm với các yếu tố ngoại cảnh Khi đông lạnh tinh trùng chịu ảnh hưởng bởi các hiện tượng sau:

* Hiện tượng đông băng nội bào

Tinh trùng bị chết hoặc mất năng lượng hoạt động khi cấu tạo nội bào

bị phá vỡ do việc hình thành tinh thể nước nội bào Nếu tinh trùng nằm trong dung dịch nước muối sinh lý có thể loại trừ hiện tượng này vì được các phân

tử nước ở dạng lỏng bao quanh mặc dù dung dịch ngoại bào bắt đầu đông băng ở nhiệt độ -2P

* Sự mất nước của tế bào tinh trùng

Trong quá trình làm lạnh tinh dịch, nước ngoại bào đông băng làm ASTT chênh lệch, nước nội bào thoát khỏi tinh trùng và tiếp tục đông băng ở phần ngoại bào

C, nước nội bào và ngoại bào vẫn chưa đông băng

mà ở trạng thái không bị đông lại, ổn định nên không làm ảnh hưởng đến cấu trúc tế bào tinh trùng

để tránh gây ra hiện tượng chênh lệch ASTT giữa môi trường ngoại bào và nội bào, dễ dẫn đến hiện tượng mất nước nghiêm trọng Tuy nhiên, cũng có tinh trùng không có khả năng chịu lạnh do các thay đổi lý hoá sinh xảy ra ở nhiệt độ thấp, như biến đổi cấu trúc nội bào, sự thay đổi các nguyên tử hydro trong các hợp chất hữu cơ và sự kết tủa protein (Iritani, 1989) [34]

* Hiện tượng đông băng ngoại bào

Trong quá trình đông lạnh, hiện tượng đông băng nước ngoại bào sẽ xảy ra làm nồng độ dung dịch tăng lên và ASTT ngoại bào cao hơn ASTT nội bào, pH cũng thay đổi (Iritani, 1989) [34]

* Chuyển động của nước và sự dãn nở tinh thể nước

Quá trình giải đông cũng như đông lạnh đều có tác dụng cơ học huỷ hoại tinh trùng do sự chênh lệch áp suất tinh thể, sự di chuyển của nước qua màng tế bào tinh trùng và sự dãn nở của các tinh thể nước đá hay các bọt khí giữa các phân tử nước đá gây ra hiện tượng bất thường: méo mó, vỡ màng Các tổn thương cơ học này có thể loại trừ bằng cách hạn chế việc hình thành các tinh thể với kích thước nhỏ bé nhờ kỹ thuật đông băng hoặc tan băng với tốc độ nhanh

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới sức sống tinh trùng trong đông lạnh

Khi đông lạnh và giải đông đúng quy trình thì khả năng tồn tại của tinh trùng là thực tế Các nhân tố giúp tinh trùng tồn tại khi đông lạnh và giải đông bao gồm:

* Khả năng chịu lạnh của chính bản thân tinh trùng

Khả năng chịu lạnh của tinh trùng là tỷ lệ sống sót của tinh trùng sau khi giải đông Điều này phụ thuộc vào: Giống, tuổi, mùa vụ lấy tinh và điều kiện khai thác tinh

* Thành phần môi trường pha loãng

Môi trường pha loãng bao gồm: Chất có năng lượng, chất đệm, chất chống đông và chất điện giải….Tỷ lệ tinh trùng sau đông lạnh và giải đông phụ thuộc vào các thành phần trên Nếu việc pha chế môi trường hợp lý sẽ là yếu tố quyết định cho sự tồn tại của tinh trùng trong công nghệ đông lạnh bảo tồn

* Thời gian cân bằng

Sau khi tinh dịch được pha loãng có nhiệt độ 20 - 25P

0

C và hạ dần xuống còn 5P

0

C để tinh trùng làm quen với nhiệt độ thấp

* Tốc độ hạ nhiệt trong cân bằng (cooling rate)

Tốc độ hạ nhiệt càng nhanh ảnh hưởng xấu càng lớn đến tinh trùng Các môi trường đông lạnh khác nhau có chất chống choáng lạnh khác nhau White and Wale, (1960) [50] khi hạ nhiệt độ từ 37P

0

C, nước ngoại bào ban đầu đông băng, nồng độ chất tan ngoại bào tăng lên, áp suất tinh thể chênh lệch, một phần nước nội bào thoát ra ngoài và tiếp tục biến thành tinh thể băng Ở nhiệt độ -10P

dạng tinh thể mà xảy ra hiện tượng thuỷ tinh hoá kích thước của tất cả các tinh thể nước nội bào và ngoại bào đều rất nhỏ ở dạng li ti nên không có sự dãn nở

về thể tích, giữ được áp suất thể tích đẳng trương Vì vậy tinh trùng vẫn giữ nguyên hình thái và cấu trúc nên khi giải đông hoạt lực tinh trùng cao

1.2.3 Môi trường pha loãng, bảo tồn tinh dịch ngựa

Tinh thanh là môi trường sống của tinh trùng nhưng lại là một trở ngại lớn trong công nghệ đông lạnh tinh dịch Vì trong tinh thanh không có chứa thành phần chống lạnh và có một lượng nước rất lớn trong đó (tinh dịch ngựa

và lợn là nhiều hơn cả trong các loài gia súc) sẽ gây ra hiện tượng kết tinh Do

đó phải rút được nước và loại bỏ nước thay vào đó là một môi trường đông lạnh tổng hợp có những tính chất hóa lý tương đồng ít kiềm tính hơn, bao gồm các chất điện giải, chất không điện giải và chất chống lạnh Từ đó giúp cho tinh trùng sau bảo tồn được nguyên vẹn để có khả năng thụ thai và sinh ra đời sau một cách bình thường (Nguyễn Xuân Hoàn, 1995) [7] Theo Messina (1997) [36], sử dụng tinh dịch ngựa được tách bớt tinh thanh để đạt nồng độ tinh trùng 350 x 10P

6

/ml phối giống cho ngựa đạt kết quả tốt hơn tinh nguyên

* Khả năng duy trì độ pH và năng lực đệm của một số chất trong môi trường: Quá trình trao đổi chất của tinh trùng gắn liền với sự hoạt động của

hàng loạt enzym Các enzym này xúc tiến các phản ứng hóa học trong một giới hạn pH nhất định Do đó pH của môi trường phải tương đương pH của tinh dịch hoặc toan yếu (pH = 6,8 - 6,9) để ức chế quá trình trao đổi chất của tinh trùng Trong môi trường hơi kiềm, sức hoạt động của tinh trùng được tăng cường, còn ở môi trường hơi toan sức hoạt động của tinh trùng bị ức chế và ít hoạt động hơn nhờ đó làm giảm mức tiêu hao năng lượng có lợi cho quá trình bảo tồn Nếu môi trường quá toan hoặc quá kiềm đều ảnh hưởng xấu đến tinh trùng

Để tạo nên môi trường tổng hợp có khả năng duy trì một cách ổn định

độ pH ở mức thích hợp, các nhà khoa học thường đưa vào môi trường những hóa chất có năng lực đệm Đó là những chất có khả năng làm giảm sự toan hóa hoặc kiềm hóa được phát sinh thường xuyên trong tinh dịch Các chất này thường là các muối Citrat, Bicacbonat, Tris…Hệ đệm thường được sắp xếp thành đôi Cấu trúc tạo nên một đôi đệm gồm có một axit yếu và một muối kiềm mạnh của axit yếu đó

Công thức: NaB 3 BCB 6 BHB 5 BOB 7 B 2HB 2 BO (khối lượng phân tử 249,1) hoặc

NaB 3 BCB 6 BHB 5 BOB 7 B 5HB 2 BO (khối lượng phân tử 348,0) Hai dạng công thức trên hoàn toàn giống nhau chỉ khác nhau ở độ ngậm nước Nên khi pha chế môi trường cần chú ý độ ngậm nước để điều chỉnh thích hợp với từng công thức Na-Citrate có tác dụng là một chất đệm,

có tác dụng giữ môi trường duy trì độ pH và áp lực thẩm thấu

Công thức: NaHCOB 3 B (khối lượng phân tử 84,01)B

Na-Bicacbonat tạo ra hệ đệm Bicacbonat, có tác dụng là một chất đệm,

có tác dụng giữ môi trường không quá toan hoặc quá kiềm (duy trì độ pH) và