Nghiên cứu kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ

1 Tên ñề tài “Nghiên cứu kỹ thuật ñông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ” Đào Đức Thà 1 , Đỗ Hữu Hoan 1 , Nguyễn Đình Dũng 2 V¨n lệ Hằng 3 1 Bộ môn sinh sản và Thụ tinh nhân tạo – Viện Chăn Nuôi. 2 Khoa Khoa học Tự nhiên và Xã hội – Đại học Thái Nguyên 3 Đại học sư phạm – Hà Nội * Tác giả liên hệ: Đào Đức Thà; ĐT: (04) 8.385.940; DĐ: 0903.222.229 E-mail: bacsitha@yahoo.com ABSTRACT The objective of this study was to assess the effects of centrifugation method, diluents and freezing method on progressive motility of boar sperm in straw after freezing and thawing. Semen from boar of Yorkshine and Landrace breed was used. To assess the effects of centrifugation speed, semen was diluted centrifuged with speed of 2000rpm and 2500rpm for 10 min. The supernatant was discarded after centrifugation and the precipitated spermatozoa were genlly resuspended with NSF extender. The equilibation was done in one and two step. Then the sperm suspension was transferred into 0.5 plastic straws (1x 109 spermatozoa/ml). The straws were placed in liquid nitrogen vapor for 10, 20, 30 min and stored in liquid nitrogen. After thawing, frozen semen was evaluated for motility, progressive and viability of spermatozoa by Computer Assisted Sperm Analyzer (SpermVision-Minitub, Germany). The result shown that with centrifugation speed of 2000rpm, NFS extender, two step of equilibation, 20 min of freeze and thawing in 37 oC on 50 second we can get the highest progressive motility of sperm (35.67%). Keywords: Cryopreservation, boar semen, progressive motility. ĐẶT VẤN ĐỀ Chăn nuôi lợn ở nước ta ñã và ñang là một ngành chăn nuôi chủ yếu trong cơ cấu chăn nuôi. Việc nâng cao chất lượng ñàn giống và phổ biến giống mới ñồng thời làm tươi máu những ñàn giống hiện có là một khâu vô cùng quan trọng trong chăn nuôi lợn. Đông lạnh tinh dịch lợn là một kỹ thuật có ý nghĩa kinh tế nhằm khai thác tiềm năng di truyền của con ñực, bảo ñảm an toàn về dịch bệnh, bảo tồn các giống quý hiếm và ñáp ứng nhu cầu thụ tinh nhân tạo làm tươi máu một số dòng lợn như một số cơ sở chăn nuôi hiện nay ñang làm thay cho nhập ñực giống trực tiếp từ nước ngoài. Đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ ñã ñược tiến hành ở nhiều nước trên thế giới như: Đức, Nhật Bản, Hàn Quốc.vv Tuy vậy ở Việt Nam, kỹ thuật này vẫn là một vấn ñề mới. Vì vậy, trong khuôn khổ ñề tài “ Nghiên cứu ứng dụng tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác tạo và nhân giống lợn “ thuộc chương trình công nghệ sinh học chúng tôi tiến hành ñề tài: “Nghiên cứu kỹ thuật ñông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ” với mục tiêu nhằm ñạt hoạt lực tinh trùng lợn sau giải ñông trên 30%. 2 V T LI U VÀ NG NG ỨU Vật liệu S dụng tinh dịch của hai giống lợn là Yorkshine và Landrace. Lợn ñực giống khoẻ mạnh, ñang ñược khai thác tinh dịch. Các lợn ñực này ñược chăm sóc và nuôi dưỡng theo tiêu chuẩn lợn ñực giống tại Trung tâm nghiên cứu lợn Thuỵ Phương thuộc Viện Chăn nuôi Thời gian nghiên cứu: năm 2007 Địa ñiểm nghiên cứu: Bộ môn Sinh sản và TTNT - Viện Chăn nuôi Nội dung nghiên cứu Xử lý tinh dịch lợn và ñánh giá chất lượng tinh nguyên Nghiên cứu phương pháp ly tâm Nghiên cứu phương pháp cân bằng Nghiên cứu thời gian ñông lạnh trong hơi nitơ Nghiên cứu thời gian và nhiệt ñộ giải ñông Phương pháp nghiên cứu Khai thác tinh dịch và ñánh giá chất lượng tinh nguyên Tinh dịch ñược lấy theo phương pháp dùng tay. Lọc bỏ tinh thanh ngay sau khi lấy tinh. Chất lượng tinh nguyên ñược ñánh giá bằng phần mềm Sperm Vision (Hãng Minitub, Đức) và các phương pháp thường quy trong phòng thí nghiệm thông qua các chỉ tiêu: Thể tích tinh dịch (V), nồng ñộ tinh trùng (C), hoạt lực (A), áp suất thẩm thấu (ASTT), kỳ hình (K), và pH. Chỉ những lô tinh dịch có hoạt lực trên 70% sẽ ñược ñưa vào xử lý và ñông lạnh. Dung dịch ly tâm: Tinh dịch ñược pha loãng với môi trường BTS theo tỷ lệ 1:1 về thể tích, sau ñó làm lạnh từ từ ñến 15 o C trong vòng 2 giờ. Phương pháp ly tâm: Sau khi ñược làm lạnh ñến 15 o C, tinh pha ñược ly tâm trong 10 phút ở các chế ñộ 2000 vòng/phút và 2500 vòng/phút. Bỏ phần dung dịch phía trên ống ly tâm, lấy phần ñậm ñặc lắng ở ñáy ống ly tâm. Phương pháp nghiên cứu dung dịch cân bằng Phương pháp cân bằng ñược sử dụng trong nghiên cứu này là phương pháp cân bằng hai bước. Cân bằng lần 1: Tinh dịch ñậm ñặc thu ñược sau khi ly tâm ñược pha lần thứ nhất với dung dịch NSF I ( Niwa.T ) và MT1. Tỷ lệ pha loãng là ½ thể tích cuối cùng cần ñạt ñược Tinh pha lần thứ nhất ñược hạ nhiệt ñộ từ 15 o C xuống 5 o C trong vòng 1 giờ 30 phút. Cân bằng lần thứ 2: Sau cân bằng lần thứ nhất, tinh dịch ñược bổ sung thêm dung dịch pha loãng thứ hai là NSF II và MT2 ñể ñạt ñược thể tích cuối cùng sau cho 1ml dung dịch có chứa 1 tỷ tinh trùng. Tich dịch sau khai pha loãng lần thứ hai ñược cân bằng ở 5 o C trong vòng 30 phút. 3 ươ pháp cân bằng Ph ng pháp cân bằng ñược nghiên cứu là cân bằng một bước và cân bằng hai bước. Cân bằng một bước: Tinh dịch ñậm ñặc sau ly tâm ở 15 o C ñược bổ sung NSF I ( ½ thể tích cuối cùng ) tiếp ñó pha luôn với môi trường NSF II ñể ñạt ñược thể tích cuối cùng và sau ñó hạ nhiệt ñộ từ 15 o C xuống 5 o C trong 2 giờ. Cân bằng hai bước: Được tiến hành giống phương pháp nghiên cứu dung dịch cân bằng nhưng chỉ sử dụng môi trường NSF I và NSF II. Phương pháp nghiên cứu thời gian ñông lạnh trong hơi nitơ Tinh dịch sau khi cân bằng hai bước ñược hút vào các cọng rạ và ñông lạnh trong hơi nitơ lỏng ( -80 o C) ở ba mức thời gian là 10 phút, 20 phút và 30 phút. Sau khi ñông lạnh trong hơi nitơ lỏng, cọng rạ ñược ñông lạnh sâu trong nitơ lỏng ở nhiệt ñộ -196 o C. Phương pháp giải ñông Cọng rạ sau khi ñông lạnh trong nitơ lỏng ñược giải ñông với các thời gian giải ñông là 30 giây và 50 giây và nhiệt ñộ giải ñông là 37 o C và 40 o C. Đánh giá hoạt lực tinh trùng sau giải ñông Dùng micropipet hút 0,23 µl tinh dịch sau giải ñông (ñã ñược pha loãng bằng môi trường BTS) nhỏ vào phiến kính Jeica (dùng riêng cho phần mềm Sperm Vision) có nhiệt ñộ 37 o C và ñánh giá bằng phần mềm Sperm Vision 3.0 (hãng Minitub, Đức). Phương pháp xử lý số liệu Số liệu ñược phân tích thông qua phần mềm Minitab 13. Số liệu ñược hiển thị dạng Mean ± SE, với P<0,05 có sai khác về ý nghĩa thống kê. T QU VÀ Ả LUẬN Chất lượng tinh nguyên Tinh nguyên sau khi khai thác ñược ñánh giá theo các chỉ tiêu sinh học: Thể tích tinh dịch (V, ml), hoạt lực (A, %), nồng ñộ tinh trùng (C, triệu/ml), tổng số tinh trùng tiến thẳng (VAC, tỷ/lần), pH của tinh dịch, áp suất thẩm thấu (ASTT, mosm), tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K, %), acrosome (Acr, %). Kết quả ñánh giá ñược thể hiện trên bảng 1. Bảng 1: Một số chỉ tiêu của tinh dịch lợn Chỉ tiêu Đông Xuân Hè Thu Cả hai vụ 4 Yorkshire Landrace Yorkshire Landrace Yorkshire Landrace V 321,60 ± 12,60 222,50 ± 13,25 221,71 ± 10,33 211,25 ± 12,43 271,53 ± 11,4 217,13 ± 12,84 A 0,72 ± 0,013 0,73 ± 0,010 0,72 ± 0,007 0,73 ± 0,004 0,72 ± 0,010 0,73 ± 0,007 C 304,53 ± 16,22 269,15 ± 20,72 243,51 ± 16,34 234,30 ± 9,75 274,05 ± 16,28 251,08 ± 15,24 VAC 49,63 ± 1,02 48,19 ± 1,02 45,15 ± 1,03 40,83 ± 1,25 47,43 ± 1,03 44,86 ± 1,14 pH 7,32 ± 0,18 7,33 ± 0,12 7,33 ± 0,20 7,33 ± 0,14 7,33 ± 0,19 7,33 ± 0,13 K 6,17 ± 0,09 6,23 ± 0,20 6,59 ± 0,12 6,42 ± 0,09 6,40 ± 0,11 6,37 ± 0,17 ASTT 318,80 ± 6,88 322,05 ± 5,96 Acr nguyên vẹn 93,1 93,5 Cả hai giống lợn Yorshire và Landrace có thể tích tinh dịch trong khoảng 200 – 350 ml. Có sự sai khác về thể tích tinh dịch giữa vụ Đông Xuân và vụ Hè Thu (P<0,05) ở mỗi giống lợn. Thể tích tinh dịch của một lần xuất tinh ở vụ Đông Xuân cao hơn ở vụ Hè Thu. Sự sai khác này còn thấy ở các chỉ tiêu C, VAC. Các chỉ tiêu như A, pH, K không thấy có sự sai khác giữa hai mùa vụ nêu trên. Theo TCVN (1959 – 1976) thì các chỉ tiêu chất lượng của tinh lợn khai thác ở hai giống lợn nói trên ñủ tiêu chuẩn ñể sử dụng cho sản xuất tinh ñông lạnh. Ảnh hưởng c a chế ñộ ly tâm ñến một s ch tiêu sinh lý của tinh trùng Ly tâm là một khâu rất quan trọng trong quy trình ñông lạnh tinh dịch lợn. Chế ñộ ly tâm tốt sẽ loại bỏ ñược nhiều nhất tinh thanh, thu ñược lượng tinh trùng tối ña trong tinh dịch, ñồng thời không gây những tổn thương ñến cấu trúc của tinh trùng. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chế ñộ ly tâm ñến một số chỉ tiêu sinh lý của tinh trùng ñược thể hiện ở bảng 2. Bảng 2: Ảnh hưởng của chế ñộ ly tâm ñến một số chỉ tiêu sinh lý của tinh trùng 5 n ạt l c VAP VSL Chế ñộ 1: 2500 vòng/phút 68 61,39 ± 0,92 89,36 ± 1,58 51,04 ± 0,71 30,36 ± 0,34 Chế ñộ 2: 2000 vòng/phút 80 72,03 ± 1,27 94,15 ± 1,75 52,38 ± 0,92 29,90 ± 0,59 VCL Velocity Curve Line (microns/ sec) VAP Velocity Average Path (microns/ sec) VSL Velocity Straight Line (microns/ sec) Chế ñộ ly tâm với tốc ñộ 2000 vòng/phút cho kết quả hoạt lực tinh trùng sau ly tâm ñạt 72,03 ± 1,27, có sự sai khác rõ rệt so với hoạt lực tinh trùng sau ly tâm ở chế ñộ 2500 vòng/phút (61,392 ± 0,92) (P<0,05). Theo Almlid và Hofmo (1996) thì hoạt lực tinh trùng sau ly tâm phải lớn hơn 50%. Như vậy, cả hai chế ñộ ly tâm trên ñều ñáp ứng ñược tiêu chuẩn này. Kết quả nghiên cứu cũng thống nhất với nghiên cứu của Pursel và Jonhson (1975), Westendorf và CS (1975), Paquignon và Courot (1976). Ảnh hưởng của môi trường ñông lạnh ñến hoạt lực của tinh trùng Môi trường pha loãng có tác dụng ñiều chỉnh mật ñộ tinh trùng, cung cấp năng lượng và bảo vệ tinh trùng trước sự tấn công của vi sinh vật, bảo vệ cấu trúc của tinh trùng trong quá trình ñông lạnh. Bảng 3: Ảnh hưởng của môi trường pha loãng ñến hoạt lực tinh trùng Hoạt lực Thí nghiệm n Hoạt lực của tinh trùng sau cân bằng lần thứ nhất Hoạt lực của tinh trùng sau cân bằng lần thứ hai Thí nghiệm 1 120 70,27 ± 0,903 69,523 ± 1,30 Thí nghiệm 2 104 72,03 ± 1,43 60,510 ± 0,713 + Thí nghiệm 1: Cân bằng lần thứ nhất với NSF I, lần thứ hai với NSF II + Thí nghiệm 2: Cân bằng lần thứ nhất với MT1, lần thứ hai với MT2 Hoạt lực của tinh trùng sau khi pha loãng với môi trường NSF I không có sự sai khác so với hoạt lực của tinh trùng sau khi pha loãng với môi trường MT1 (P>0,05). Điều này ñược giải thích là do thành phần của hai môi trường tương ñối giống nhau, chỉ khác ở thành phần ñường lactoza. Hoạt lực tinh trùng khi sử dụng môi trường NSF II cho kết quả cao hơn khi sử dụng môi trường MT2. Khi sử lý thống kê cho thấy các kết quả này có sự sai khác rõ rệt (P<0,05). Các nghiên cứu của các tác giả như: Graham và CS (1971), Pursel và Jonhson (1975, 1978), Westendorf và CS (1975) ñã chỉ ra rằng OEP có ảnh hưởng tích cực trong bảo vệ hình thái, cấu trúc màng, khả năng hoạt ñộng và khả năng thụ thai của tinh trùng ñông lạnh. Như vậy, sai khác giữa hoạt lực của tinh trùng 6 khi s dụng hai môi trường NSF II và MT2 có thể là do môi trường NSF II có bổ sung OEP. Ảnh hưởng của chế ñộ cân bằng ñến một số ch tiêu sinh lý của tinh trùng Việc sử dụng chế ñộ cân bằng thích hợp sẽ giúp cho tinh trùng không bị sốc khi ñông lạnh ở nhiệt ñộ thấp. Kết quả nghiên cứu về chế ñộ cân bằng cho thấy ở bảng 4. Bảng 4: Ảnh hưởng của chế ñộ cân bằng ñến một số chỉ tiêu sinh lý của tinh trùng Chế ñộ cân bằng n Hoạt lực VCL VAP VSL Cân bằng một bước 24 31,98 ± 1,24 59,01 ± 4,17 36,02 ± 1,66 25,80 ± 1,40 Cân bằng hai bước 120 35,67 ± 1,14 84,97 ± 3,11 49,56 ± 1,75 35,96 ± 1,56 Kết quả trên cho thấy hoạt lực tinh trùng sau giải ñông sử dụng phương pháp cân bằng một bước cho kết quả cao hơn so với khi sử dụng phương pháp cân bằng một bước. Có sự sai khác rõ rệt về hoạt lực tinh trùng khi sử dụng hai phưong pháp cân bằng nói trên (P<0,05). Ảnh hưởng của thời gian ñông lạnh trong hơi nitơ Giai ñoạn ñông lạnh trong hơi nitơ là một bước ñông lạnh trung gian giữa 5 o C ñến ñông lạnh sâu trong nitơ lỏng (-196 o C). Trong hơi nitơ, nhiệt ñộ khoảng - 80 o C. Kết quả nghiên cứu ñược thể hiện trong bảng 5. Bảng 5: Ảnh hưởng của thời gian ñông lạnh trong hơi nitơ ñến hoạt lực của tinh trùng Hoạt lực của tinh trùng Thời gian ñông lạnh n X ± m x C v % 10 phút 60 26,14 ± 0,812 14,09 20 phút 98 35,67 ± 1,14 11,27 30 phút 60 34,90 ± 1,86 7,040 Hoạt lực của tinh trùng sau giải ñông với thời gian ñông lạnh trong hơi nitơ là 20 phút và 30 phút cho kết quả cao hơn so với ñông lạnh trong hơi nitơ ở 10 phút. Không có sự sai khác về hoạt lực của tinh trùng sau giải ñông khi sử dụng thời gian ñông lạnh trong hơi nitơ là 20 phút và 30 phút (P>0,05). Trạm thực nghiệm Ibaragi thuộc trung tâm giống quốc gia Nhật Bản ñã thành công trong việc ñông lạnh tinh dịch của một số giống lợn ñịa phương với hoạt lực sau giải ñông ñạt 33 – 40%. Theo Westendorf và CS (1975), Johnson và Pursel (1975) thì tinh cọng rạ sau giải ñông có hoạt lực trên 30%. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi thống nhất với kết quả nghiên cứu của các tác giả này. 7 quá trình thụ tinh ñược tốt thì hoạt lực tinh trùng phải lớn hơn 30%. Như vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tôi ñáp ứng ñược yêu cầu về hoạt lực của tinh trùng cho thụ tinh nhân tạo. Thời gian khuyến cáo ñể ñông lạnh tinh dịch lợn là 20 phút. Chế ñộ gi i ñông Chế ñộ giải ñông là một khâu quan trọng làm “thức tỉnh” khả năng hoạt ñộng của tinh trùng. Chế ñộ giải ñông tốt sẽ “ñánh thức” ñược nhiều tinh trùng hoạt ñộng trở lại với khả năng hoạt ñộng chức năng cao nhất. Kết quả nghiên cứu nhiệt ñộ và thời gian giải ñông ñược thể hiện trong bảng 6. Bảng 6: Ảnh hưởng của chế ñộ giải ñông ñến hoạt lực của tinh trùng Hoạt lực tinh trùng Chế ñộ giải ñông n X ± m x C v % 37 o C trong 30 giây 98 28,12 ± 1,90 12,04 37 o C trong 50 giây 98 35,67 ± 1,14 11,27 40 o C trong 30 giây 98 32,10 ± 0,97 7,45 40 o C trong 50 giây 98 34,98 ± 1,57 9,23 Phương pháp giải ñông ở nhiệt ñộ 37 o C trong 50 giây cho kết quả cao nhất. Không có sự sai khác giữa hoạt lực của phương pháp này so với hoạt lực của phương pháp giải ñông ở nhiệt ñộ 40 o C trong 50 giây. Ngược lại, có sự sai khác về hoạt lực của tinh trùng với phương pháp giải ñông ở nhiệt ñộ 37 o C trong 30 giây và 40 o C trong 30 giây (P<0,05). So với các phương pháp giải ñông ñã ñề xuất như 50 o C trong 20 giây (Pursel và Johnson, 1975), 52°C trong 12 giây (Sellés và CS, 2003) thì nghiên cứu của chúng tôi cho kết quả tương tự. T LUẬN VÀ ĐỀ N Ị ết luận Chế ñộ ly tâm ở 2000 vòng/phút cho kết quả tốt hơn chế ñộ ly tâm 2500 vòng/phút. Sử dụng môi trường ñông lạnh NSF I và NSF II tốt hơn môi trường MT1 và MT2. Cân bằng hai bước tốt hơn cân bằng một bước. Sử dụng phương pháp cân bằng hai bước, ñông lạnh trong hơi nitơ 20 phút, giải ñông ở 37 o C trong 50 giây cho kết quả hoạt lực tinh trùng sau giải ñông ñạt 35,67%. Đề nghị Tiến hành phối giống ñể kiểm tra tỷ lệ thụ thai khi sử dụng tinh dịch lợn ñông lạnh dạng cọng rạ. 8 TÀI LI U Ả 1. Almlid T, Hofmo PO. brief review of frozen semen applications under Norwegian AI swine conditions. Reprod Domest Anim. 1996; 31:169–173. 2. Graham, E.F., A.H.J. Rajamannan, M.K.L. Schmehl. M. Maki- Laurila, and R.E. Bower. Preliminary report on procedure and rationale for freezing boar semen. A.I. Digest, 1971; 19:12. 3. Paquignon M, Courot M. Fertilizing capacity of frozen boar spermatozoa. 8 th International Congress on Animal Reproductive Artificial Insemination, Cracow, Poland. 1976; 4:1041–1044. 4. Pursel, V.G. and L.A. Johnson. Freezing of boar spermatozoa: Fertilizing capacity with concentrated semen and a new thawing procedure. J. Anim. Sci., 1975; 40: 99-102. 5. Sellés E, Gadea J, Romar R, Mat s C, Ruiz S. Analysis of in vitro fertilizing capacity to evaluate the freezing procedures of boar semen and to predict the subsequent fertility. Reprod Domest Anim, 2003;38: 66 -72. 6. Niwa T. Preparation of extender. Manual for cryopreservation of pig spermatozoa. Tokyo: Japanese artificial insemination Association 1989 ; 19-23 (in Japanese ) 7. Westendorf P, Ritcher L, Treu H. Zur Tiefgefrierung von Ebersperma. Labor-und Besamungsergebnisse mit dem Hülsenberger Paillettenverfahren. DtschTierärztl Wschr. 1975; 82: 261–267. 8. U ban Khoa học Kỹ thuật nhà nước. Tiêu chuẩn nhà nước về tinh dịch lợn, TCVN (1959 – 76) (Nhóm N). . tài: Nghiên cứu kỹ thuật ñông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ với mục tiêu nhằm ñạt hoạt lực tinh trùng lợn sau giải ñông trên 30%. 2 V T LI U VÀ NG NG ỨU Vật liệu S dụng tinh dịch của. 1 Tên ñề tài Nghiên cứu kỹ thuật ñông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ Đào Đức Thà 1 , Đỗ Hữu Hoan 1 , Nguyễn Đình Dũng 2 V¨n lệ Hằng 3 1 Bộ môn sinh sản và Thụ tinh nhân tạo – Viện. Thời gian nghiên cứu: năm 2007 Địa ñiểm nghiên cứu: Bộ môn Sinh sản và TTNT - Viện Chăn nuôi Nội dung nghiên cứu Xử lý tinh dịch lợn và ñánh giá chất lượng tinh nguyên Nghiên cứu phương