Nghiên cứu kỹ thuật đông lạnh tinh dịch trâu dạng cọng rạ tại bá vân

Nghiên cứu kỹ thuật đông lạnh tinh dịch trâu dạng cọng rạ tại bá vân

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT ĐÔNG LẠNH TINH DỊCH TRÂU DẠNG CỌNG RẠ TẠI BÁ VÂN – THÁI NGUYÊN Vũ Đình Ngoan, 1 Đào Đức Thà, Đặng Đình Hanh, Nguyễn Hữu Trà, Nguyễn Đức Chuyên, Tạ Văn Cần, Hàn Quốc Vương, 1 Nguyễn Thị Hương, 1 Nguyễn Thị Tuyết Nhung Trung tâm Nghiên cứu và PTCN miền Núi 1 Bộ môn Sinh lý Sinh hoá và Tập tính Vật nuôi Tóm tắt Hiện nay, Việt Nam có khoảng 3 triệu con trâu. Việc nâng cao tầm vóc và chất lượng đàn giống là việc làm cần thiết trong đó phải có ứng dụng thụ tinh nhân tạo. Vì vậy trong khuôn khổ đề tài trên với mục tiêu sản xuất tinh đông lạnh cọng rạ trâu có hoạt lực tinh trùng (A) sau giải đông ≥35%. Tinh trâu có hoạt lực >70% được đưa vào sử dụng trong nghiên cứu. Trong thí nghiệm chúng tôi nghiên cứu môi trường đông lạnh, phương pháp cân bằng, chế độ cân bằng và thời gian đông lạnh trong hơi nitơ, chế độ giải đông để đánh giá hoạt lực tinh trùng sau giải đông. Tinh trâu được cân bằng 2 bước: Tinh dịch được pha lần thứ nhất với môi trường A theo tỷ lệ pha loãng là ½ thể tích cuối cùng cần đạt được (cân bằng lần 1), tinh dịch được hạ nhiệt độ từ 150C xuống đến 50C trong thời gian 1.5 giờ. Tiếp theo tinh dịch được bổ sung thêm môi trường đông lạnh B vào 3 thời điểm là 1.5h; 2h và 2.5h. Sau đó cân bằng trong 1.5 giờ tiếp theo. Tinh dịch sau cân bằng được tiến hành nạp tinh vào cọng rạ. Tinh dịch sau cân bằng có mật độ tinh trùng khoảng 200 triệu/ml sau đó được nạp tinh vào cọng rạ (0.25ml/cọng) để tiến hành đông lạnh. Đông lạnh ở 20 phút trong hơi nitơ sau đó đông lạnh sâu trong nitơ lỏng. Giải đông ở 420C trong 5 giây, sau đó chuyển sang 370C trong 30 giây cho kết quả hoạt lực tinh trùng sau giải đông tốt nhất (A 41.04%). Hoạt lực tinh trùng sau giải đông được đánh giá bằng phần mềm Sperm Vision 3.0. 1. Đặt vấn đề Tại Việt Nam, các cơ sở chăn nuôi tập trung, cơ sở nuôi giữ giống gốc quốc gia, việc áp dụng TTNT trên vật nuôi đại gia súc đặc biệt là TTNT cho trâu chưa được áp dụng nhiều mặc dù nước ta có đến 3 triệu con. Việc nâng cao tầm vóc cũng như chất lượng đàn giống và tăng đàn là một việc làm cần thiết. Vì vậy TTNT trâu nói chung và đông lạnh tinh trâu là vô cùng cần thiết. Đông lạnh tinh trâu là một kỹ thuật có ý nghĩa kinh tế, nhằm khai thác tiềm năng di truyền của con đực, bảo đảm an toàn về dịch bệnh, bảo tồn các giống quý hiếm, đáp ứng nhu cầu TTNT trong chăn nuôi, giúp cho thương mại giống được dễ dàng, tránh cận huyết và dịch bệnh, tránh được sự chênh lệch về khối lượng cơ thể, đem lại hiệu quả kinh tế cao trong chăn nuôi. Đông lạnh tinh trâu ở Bá Vân - Thái Nguyên kỹ thuật này vẫn là một vấn đề hoàn toàn mới. Vì vậy trong khuôn khổ đề tài: Nghiên cứu kỹ thuật đông lạnh tinh trâu murrah dạng cọng rạ tại Bá Vân - Thái Nguyên với mục tiêu nhằm đạt được: Sản xuất tinh đông lạnh cọng rạ trâu có hoạt lực tinh trùng (A) sau giải đông>35%, Bảo tồn và nhân nhanh nguồn gen quý của trâu giống tốt vào sản xuất. 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu Sử dụng tinh dịch của giống giống trâu Murah. Trâu đực giống khỏe mạnh được chăm sóc nuôi dưỡng theo quy trình của Trung tâm nghiên cứu và phát triển chăn nuôi miền núi - thuộc Viện chăn nuôi. Thời gian nghiên cứu: Tháng 1-12 năm 2009 Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Nghiên cứu và PTCN miền Núi Bộ môn Sinh lý Sinh hoá và Tập tính Vật nuôi 2.2. Phương pháp nghiên cứu Khai thác tinh dịch và đánh giá chất lượng tinh nguyên Tinh trâu được khai thác bằng âm đạo giả, có sử dụng trâu cái làm giá. Một số chỉ tiêu chất lượng tinh nguyên được đánh giá bằng phần mềm Sperm Vision và các phương pháp thường quy trong phòng thí nghiệm thông qua các chỉ tiêu: Thể tích tinh dịch (V), Mầu sắc tinh dịch, Hoạt lực tinh trùng (A), Nồng độ tinh trùng (C), Áp suất thẩm thấu (ASTT), tỷ lệ kỳ hình (K), độ pH . Những lô tinh dịch có hoạt lực ≥70% sẽ được đưa vào xử lý và đông lạnh trong thí nghiệm. Tinh dịch sau khai thác, đánh giá hoạt lực sau đó được pha môi trường đông lạnh A, B sao cho đạt mật độ tinh trùng có 50 triệu tinh trùng/cọng rạ sau đó tiến hành đông lạnh. Khi pha loãng tinh dịch môi trường A và môi trường B phải bằng nhau về thể tích khi cân bằng. Trong 1 một môi trường đông lạnh chúng tôi chia làm 2 loại môi trường: Môi trường A không có thành phần glyceryl. Môi trường B có thêm thành phần glyceryl. Cân bằng 1 bước: Tinh dịch thu được sau khai thác pha ngay với môi trường đông lạnh A,B hạ nhiệt độ từ 15 0 C xuống 5 0 C trong 1.5giờ và để cân bằng trong 2.5 giờ ở 5 0 C. Cân bằng 2 bước: (bổ sung MT đông lạnh B vào 1 lần) Tinh dịch thu được sau khai thác được pha lần thứ nhất với môi trường A theo tỷ lệ pha loãng là ½ thể tích cuối cùng cần đạt được (cân bằng lần 1) được hạ nhiệt độ từ 15 0 C xuống đến 5 0 C trong thời gian 1.5 giờ. Tiếp theo tinh dịch được bổ sung thêm môi trường B vào 1 lần. Tinh dịch sau khi pha loãng lần thứ 2 được cân bằng ở 5 0 C trong 2.5 giờ. Cân bằng 2 bước: (bổ sung MT đông lạnh B vào 3 lần) Tinh dịch thu được sau khai thác được pha lần thứ nhất với môi trường A theo tỷ lệ pha loãng là ½ thể tích cuối cùng cần đạt được (cân bằng lần 1), tinh dịch được hạ nhiệt độ từ 15 0 C xuống đến 5 0 C trong thời gian 1.5 giờ. Tiếp theo tinh dịch được bổ sung thêm môi trường đông lạnh B vào 3 thời điểm là 1.5h; 2h và 2.5h. Sau đó cân bằng trong 1.5 giờ tiếp theo. Tinh dịch sau cân bằng được tiến hành nạp tinh vào cọng rạ Phương pháp đông lạnh trong hơi nito: tinh dịch sau khi cân bằng được nạp vào các cọng rạ và đông lạnh trong hơi nito lỏng (-80 0 C) ở 3 mức thời gian là 10 phút, 20 phút, 30 phút. Sau đó tinh dịch được đông lạnh sâu ở nito lỏng (-196 0 C). Phương pháp giải đông: cọng rạ được giải đông ở nhiệt độ là 37 0 C, 39 0 C với các thời gian là 30 giây, 50 giây và 42 0 C trong 5 giây sau đó 37 0 C trong 30 giây. Đánh giá hoạt lực tinh trùng sau giải đông: dùng micropipet hút 0.23l tinh dịch sau giải đông (đã được pha loãng bằng môi trường MTS) nhỏ lên phiến kính chuyên dụng (dùng riêng cho phần mềm Sperm Vision) có nhiệt độ ổn định 37 0 C và đánh giá bằng phần mềm Sperm Vision 3.0 (hãng Minitub , Đức). Phương pháp xử lý số liệu: một số chỉ tiêu tinh dịch được đánh giá bằng phương pháp thường quy và phần mền Sperm Vision 3.0. Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê miêu tả (Display Descriptive Statistics) qua phương pháp kiểm tra ANOVA của phần mềm Minitab 13. Số liệu được hiển thị dạng MeanSE, với P<0.05 có sai khác về ý nghĩa thống kê. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Chất lượng tinh nguyên Tinh nguyên sau khi khai thác được đánh giá các chỉ tiêu sinh học: Thể tích tinh dịch (V, ml), mầu sắc tinh dịch, hoạt lực tinh trùng (A, %), nồng độ tinh trùng (C, triệu/ml), tổng số tinh trùng tiến thẳng (VAC, tỷ/lần), pH tinh dịch, áp suất thẩm thấu (ASTT), tỷ lệ tinh trùng kỳ hình. Kết quả được đánh giá ở bảng 1. Bảng 1. Một số chỉ tiêu tinh dịch trâu ở vụ thu đông Chỉ tiêu ĐVT Trâu Murrah n X  SE V ml 10 3,02  0.114 A % 10 73,667  0,59 C triệu/ml 10 946,7  19,2 VAC tỷ/lần 10 2,364  105 K % 10 9,733  0,182 R 10 19533  236 pH 10 6,57  0,095 ASTT mOsm/kg 15 320,67  5,48 Mầu tinh nguyên Trắng, trắng ngà (n là số mẫu tinh nguyên khai thác ở các lần trên cùng một cá thể trâu) Qua bảng 1 cho thấy: Tinh dịch trâu có thể tích tinh dịch 3ml/lần khai thác, hoạt lực tinh trùng 73%, nồng độ tinh trùng 946 triệu/ml. Như vậy hoạt lực tinh trùng >70% đủ điều kiện để tiến hành nghiên cứu đông lạnh các bước tiếp theo. Một số nghiên cứu về tinh dịch trâu của các tác giả như sau: Tạ Văn Cần (2006), tinh trâu: 2,35-3,5ml/lần. A=72-73%. C=0.81-830 triệu/ml. Trâu đực Murrah nuôi tại Trung tâm nghiên cứu trâu sữa và đồng cỏ Sông Bé cho kết quả: V=3-5ml/lần, A=60-70%. (Sharma, 1990). Koonjaenak và cs (2006), tinh trâu có A =73,4; C = 995tr/ml ở mùa hè. Tinh trâu để làm đông lạnh thì hoạt lực tinh nguyên ngay sau khi khai thác A >70%. Trâu đực murrah nuôi tại Trung tâm nghiên cứu trâu sữa và đồng cỏ Sông Bé cho kết quả: V=3-5ml/lần, A=60-70%. (Sharma, Đỗ Kim Tuyên 2006). Như vậy, kết quả nghiên một số chỉ tiêu về phẩm chất tinh dịch trên tương tự với một số kết quả của tác giả khác đã công bố. 3.2. Ảnh hưởng của môi trường đông lạnh tới hoạt lực của tinh trùng Môi trường đông lạnh có tác dụng điều chỉnh mật độ tinh trùng, cung cấp năng lượng và bảo vệ tinh trùng trước sự tấn công của vi sinh vật, bảo vệ cấu trúc của tinh trùng trong suốt quá trình đông lạnh. Bảng 2. Ảnh hưởng của môi trường đông lạnh tới hoạt lục của tinh trùng MT đông lạnh tinh trâu n Hoạt lực A (%) Kỳ hình K (%) Môi trường 1 10 68,61  0,94 13,21  0,25 Môi trường 2 10 70,33  0,21 12,33  0,63 Môi trường 3 10 68,25  0,78 12,96  0,52 Qua bảng 3 cho thấy: Hoạt lực tinh trùng của tinh dịch trâu ở các môi trường đông lạnh sau cân bằng 68% đến 70%. Nhưng hoạt lực tinh trùng ở môi trường đông lạnh 2 cho kết quả cao nhất 70,33%. Theo Koonjaenak (2006), tinh trâu có nồng độ pha loãng trong thời gian cân bằng trước khi nạp tinh vào cọng là ≥120 triệu/ml, 0.25ml/cọng. 3.3. Ảnh hưởng của chế độ cân bằng đến hoạt lực của tinh trùng trước và sau giải đông Sử dụng môi trường đông lạnh 2 để nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ cân bằng đến hoạt lực tinh trùng. Kết quả thể hiện bảng 3. Bảng 3. Hoạt lực tinh trùng trước và sau giải đông. Chế độ cân bằng n Hoạt lực tinh trùng, A (%) Trước đông lạnh (sau CB) Sau giải đông Cân bằng 1 bước 10 70,05  0,20 33,88  0,16 CB 2 bước: bổ sung MT đông lạnh B vào 1 lần 10 70,17  0,19 38,11  0,18 CB 2 bước: bổ sung MT đông lạnh B vào 3 lần 10 70,20  0,12 41,34  0,18 Ghi chú: Hoạt lực tinh trùng giai đoạn trước đông lạnh (sau cân bằng 4h) Kết quả cho thấy: Hoạt lực tinh trùng sau giải đông sử dụng phương pháp cân bằng 2 bước có bổ sung môi trường B làm 3 lần cho kết quả cao nhất (41,34%). Có sự sai khác rõ rệt về hoạt lực tinh trùng sau giải đông ở 3 phương pháp cân bằng nói trên. Theo Dhamil (1995), tinh dịch trâu được cân bằng 2h tại 5 0 C so với 0h cải thiện đáng kể tới hoạt lực sau giải đông 48% so với 39%. Koonjaenak (2006), tinh trâu có hoạt lực tinh trùng sau giải đông là 42.1%. Kết quả nghiên cứu trong thí nghiệm này cho thấy hoạt lực tinh trùng sau giải đông thống nhất với một số kết quả của một số tác giả đã nghiên cứu. 3.4. Ảnh hưởng của thời gian đông lạnh trong hơi nitơ đến hoạt lực tinh trùng và tỷ lệ kỳ hình sau giải đông Giai đoạn đông lạnh trong hơi nito là bước đông lạnh trung gian giữa 5 0 C với đông lạnh sâu (-196 0 C). Trong hơi nito nhiệt độ khoảng -80 0 C. Sử dụng môi trường đông lạnh 2, CB 2 bước bổ sung môi trường B làm 3 lần để nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đông lạnh trong hơi nitơ đến hoạt lực tinh trùng. Kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng 4 như sau: Bảng 4. Ảnh hưởng của thời gian đông lạnh trong hơi nitơ đến hoạt lực tinh trùng và tỷ lệ kỳ hình sau giải đông Thời gian đông lạnh n Hoạt lực A(%) Kỳ hình K(%) 10 phút 10 38,47  0,21 17,20  0,29 20 phút 10 41,04  0,18 17,30  0,45 30 phút 15 40,23  0,39 17,55  0,54 (Hoạt lực tinh trùng sau giải đông ở cùng một chế độ giải đông) Kết quả nghiên cứu bảng 4 cho thấy: Hoạt lực của tinh trùng sau giải đông với thời gian đông lạnh trong hơi nito 20 phút cho kết quả cao nhất, cao hơn so với đông lạnh trong hơi nito 10 phút và 30 phút. Không có sự sai khác về hoạt lực của tinh trùng sau giải đông khi sử dụng thời gian đông lạnh trong hơi nito 20 phút và 30 phút (P>0.05). Có sự sai khác rõ rệt về hoạt lực tinh trùng sau giải đông khi đông lạnh trong hơi nito ở 20 phút, 30 phút so với đông lạnh trong hơi nito ở 10 phút (P<0.05). Theo Rasul (2001), trước đông lạnh hoạt lực tinh trùng trâu là 77,3 % đã giảm sau khi giải đông còn 53,0%. Theo Koonjaenak (2006), Tốc độ đông lanh: 4 đến -40 0 C (18 0 C/phút), từ -40 0 C đến -140 0 C (8 0 C/phút), sau đó đông lạnh trong nito lỏng. Hoạt lực tinh trùng trâu sau giải đông 40% đến 43%. 3.5. Ảnh hưởng của chế độ giải đông đến hoạt lực tinh trùng Sử dụng môi trường đông lạnh 2, cân bằng 2 bước bổ sung môi trường B làm 3 lần và đông lạnh trong hơi nito 20 phút để nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ giải đông đến hoạt lực tinh trùng. Kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng 5. Bảng 5. Ảnh hưởng của chế độ giải đông đến hoạt lực tinh trùng Chế độ giải dông n Hoạt lực A(%) 37 0 C trong 30 giây 10 35,37  0,20 37 0 C trong 50 giây 10 38,21  0,33 39 0 C trong 30 giây 10 37,25  0,27 39 0 C trong 50 giây 10 37,50  0,30 42 0 C ở 5 giây, tiếp 37 0 C trong 30 giây 10 41,54  0,68 Với cọng rạ 0.25ml/cong. Phương pháp giải đông 42 0 C trong 5 giây, tiếp 37 0 C trong 30 giây cho kết quả cao nhất. Không có sự sai khác về hoạt lực tinh trùng sau giải đông ở nhiệt độ 37 0 C trong 50 giây, 39 0 C trong 30 giây và 50 giây. Ngược lại có sự sai khác về hoạt lực của tinh trùng ở chế độ giải đông 37 0 C trong 30 giây so với các phương pháp khác trên. Bhavsa và cs (1989), hoạt lực tinh trùng trâu trước và sau khi tan băng trung bình 69,9% và 54,2%. Zahid và cộng sự (2001) cho kết quả tưng ứng là 77,3% và 53,0%. Theo Kuisma và cs (2006), nên giải đông cọng rạ 0.5ml/cọng nhiệt độ giải đông 37 0 C ít nhất 30 giây, cọng rạ 2,5ml/cọng ứng với 50 0 C cho 30 giây. Tốc độ giải đông phải đạt ≥35 0 C/giây. 4. Kết luận và đề nghị 4.1. Kết luận - Sử dụng môi trường đông lạnh 2. Cân bằng 2 bước bổ sung MT B có Glyceryl làm 3 lần ở 3 thời điểm cho hoạt lực tinh trùng sau giải đông cao nhất. - Đông lạnh trong hơi nitơ 20 phút và giải đông ở 42 0 C ở 5 giây, tiếp 37 0 C trong 30 giây cho kết quả hoạt lực tinh trùng sau giải đông là 41,04% 4.2. Đề nghị Đề nghị công nhận kết quả nghiên cứu đông lạnh tinh trâu dạng cọng rạ. Đề nghị tiến hành TTNT bằng tinh đông lạnh trâu để đánh giá tỷ lệ thụ thai. Tài liệu tham khảo 1. Tạ Văn Cần, Nguyễn Hữu Trà, Vũ Văn Tý, Nguyễn Đức Chuyên, Mai Văn Sánh, 2006. Nghiên cứu lai tạo giữa trâu đực Murrah với trâu cái địa phương và đánh giá khả năng sinh trưởng của con lai F1 nuôi trong nông hộ. Báo cáo khoa học Viện chăn nuôi 2006. 2. Bhavsa, D.K., Dhamin, A.J., Kadagali, S.B, 1989. Monthly variation in freezability and fertility of Mehsana buffalo semen. Indian J Dairy Scri 42. 3. Dhami1, A.J., Sahni, K.L., Mohan, G., Jani, V.R, 1995. Effects of different variables on the freezability, post-thaw longevity and fertility of buffalo spermatozoa in the tropics. Received 24 March 1994; Accepted 10 October 1995. 4. Koonjaenak, S., Kunawongkrit, A., Chanatinart, V., Sirivaidyapong, S., Pinyopuminintr & Rodriguez, H., Martinez, 2006. Semen quality of Thai Swamp buffalo artificial insemination bulls: Comparison of production date from 1988-1993, 2001-2004 and 2004-2005. Swedish University of Agricultural Science, Box 7054, SE 75 007, Uppsala, Swedish 2006. 5. Kuisma, P., Andersson, M., Koskinen, E and Katila, T, 2006. Fertility of frozen-thawed stallion semen cannot be predicted by the currently used laboratory methods. Acta Veterinaria Scandinavica. 6. Rasul, Z., Ahmad, N., and Anzar, M, 2001. Changes in Motion Characteristics, Plasma Membrane Integrity, and Acrosome Morphology During Cryopreservation of Buffalo Spermatozoa. Journal of Andrology. Animal Sciences Institute, National Agricultural Research Centre, Islamabad, Pakistan 7. Sharma, P.A., Đỗ Kim Tuyên, 2006. Khả năng sinh sản của trâu đực giống Murrah nuôi tại Sông Bé. Tạp chí Khoa học nông nghiệp số 292. Hà Nội tháng 10 năm 2006. Phụ lục. Các loại môi trường đông lạnh tinh trâu trong thí nghiệm Bảng 1. Thành phần các loại môi trường thí nghiệm TT Tên hóa chất ĐVT Môi trường đông lạnh MT 1 MT 2 MT 3 1 Tris g 2.42 1.82 0.60 2 Citric acid g 1.34 1.00 0.34 3 Sodium Citrate g 0.52 1.04 2.08 4 Fructos g 0.25 0.25 0.25 5 Glucose g 0.25 0.25 0.25 6 Lactose g 1.00 1.00 1.00 7 Streptomycin mg/ml 1 1 1 8 Penicillin UI/ml 1000 1000 1000 9 Glycerol ml 7 7 7 10 Distilled Water upto ml 100 100 100 11 Egg Yolk ml 20 20 20 . tài: Nghiên cứu kỹ thuật đông lạnh tinh trâu murrah dạng cọng rạ tại Bá Vân - Thái Nguyên với mục tiêu nhằm đạt được: Sản xuất tinh đông lạnh cọng rạ trâu có hoạt lực tinh trùng (A) sau giải đông& gt;35%,. NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT ĐÔNG LẠNH TINH DỊCH TRÂU DẠNG CỌNG RẠ TẠI BÁ VÂN – THÁI NGUYÊN Vũ Đình Ngoan, 1 Đào Đức Thà, Đặng Đình Hanh,. quả hoạt lực tinh trùng sau giải đông là 41,04% 4.2. Đề nghị Đề nghị công nhận kết quả nghiên cứu đông lạnh tinh trâu dạng cọng rạ. Đề nghị tiến hành TTNT bằng tinh đông lạnh trâu để đánh