Báo cáo khoa học Viện Chăn Nuôi 2006 1 Nghiên cứu ứng dụng đông lạnh phôi bò bằng phơng pháp tạo thể thuỷ tinh (Vitrification method) Nguyễn Thị Thoa, Nguyễn Văn Lý, Lu Công Khánh, Phan Lê Sơn Bộ môn Cấy truyền Phôi Abstract This study was conducted to apply a new method for cryopreservation of bovine embryos by Vitrification solutions. In This study, total of 90 embryos were freezed by Vitrification method. After thawing and in vitro culture, the hatching rate of embryo was 74,74%. Đặt vấn đề Ngày nay công nghệ bảo quản lạnh tế bào động vật đ trở thành thông dụng. Nhiều nớc tiên tiến trên thế giới đ thành lập ngân hàng phôi, tinh, ngân hàng gen động vật và đ trở thành thơng mại hoá. Mặt khác đối với ngành y học, công nghệ bảo quản lạnh tinh, phôi đ mang lại hạnh phúc cho nhiều cặp vợ chồng sau khi chữa khỏi bệnh hiểm nghèo mà không có khả năng thụ tinh nhng vẫn có khả năng mang thai bằng cấy phôi đông lạnh. Với công nghệ sinh học hiện đại cấy phôi đông lạnh còn hạn chế đợc những bệnh về gen. Trớc đây đ có nhiều nghiên cứu về đông lạnh phôi bò, nh phơng pháp đông lạnh một bớc, đông lạnh 3 bớc. Việc bảo quản phôi bò bằng phơng pháp đông lạnh ngày càng đ- ợc cải tiến. Đông lạnh phôi bằng phơng pháp tạo Thể thuỷ Tinh (Vitrification method) đ đợc nhiều nớc nghiên cứu và áp dụng có hiệu quả. ở Việt Nam ( Bộ môn CTP) đ áp dụng thành công đông lạnh phôi bò bằng phơng pháp đông lạnh một bớc, phơng pháp 3 bớc nhng đông lạnh bằng phơng pháp Tạo Thể Thuỷ Tinh (Vitrification method) cha đợc nghiên cứu ứng dụng. u điểm của phơng pháp này so với hai phơng pháp trớc đây là quá trình đông lạnh không tạo đá nội bào, không gây thiệt hại cho phôi, đơn giản, không mất nhiều thời gian, đa phôi vào cọng rạ ở nhiệt độ phòng trực tiếp vào Nitơ lỏng, không cần máy móc đắt tiền, dễ áp dụng trong thực tế sản xuất, góp phần giảm chi phí trong công nghệ CTP. Mục đích - áp dụng đônng lạnh phôi bò bằng phơng pháp tạo Thể Thuỷ Tinh (Vitrification method) trong điều kiện Việt Nam. - Góp phần giảm chi phí trong công nghệ CTP Bò Nội dung và phơng pháp nghiên cứu 2 Phần Nghiên cứu về CNSH và các vấn đề khác Nội dung nghiên cứu - Sản xuất phôi TTON - Đánh giá phân loại phôi - Đông lạnh phôi Phơng pháp nghiên cứu Sản xuất phôi trong ống nghiệm Thu tế bào trứng,nuôi tế bào trứng chín invitro, hoạt hoá tinh trùng và TTON, theo dõi sự phát triển của phôi. Thí nghiệm đợc tiến hành tại phòng thí nghiệm Viện Chăn Nuôi Đánh giá phân loại phôi Phân loại phôi theo chất lợng và theo giai đoạn phát triển Báo cáo khoa học Viện Chăn Nuôi 2006 3 Đông lạnh phôi Thành phần của môi trờng đông lạnh Glycerol Ethylene Glycol Sucrose Xylose *PEG(w/v) V1 10% - 0,1M 0,1M 1% V2 10% 10% 0,2M 0,2M 2% V3 20% 20% 0,3M 0,3M 3% *PEG: Poly Ethylene Glycol(M.W.=8,000) MôI trờng cơ bản là D-PBS. - Chuẩn bị môi trờng đông lạnh Lấy 150àl môi trờng V1vào đĩa số1 150 àl mỗi trờng V2 vào đĩa số 2 150 àl mỗi trờng V3 vào đĩa số 3 3 ml môi trờng sucrose vào đĩa số 4 3 ml môi trờng PBS 20%CS vào đĩa số 5 - Tiến hành đông lạnh Sau khi đánh giá phân loại, những phôi tốt (những phôi đúng với giai đoạn phát triển, khối tế bào phân chia đều liên kết chặt chẽ, vòng trong suốt tròn sáng) đợc chuyển vào môi trờng V1 để cân bằng 5 phút sau đó chuyển sang môi trờng V2 để cân bằng 5 phút và vào môi trờng V3 để 1 phút, ngay lập tức hút phôi cùng với môi trờng V3 vào cọng rạ loại 0,25ml, cho vào Nitơ lỏng -196C (trong vòng 1 phút). Cho vào bình Nitơ lỏng bảo quản lâu dài. Giải đông phôi - Chuẩn bị môi trờng giải đông - Lấy150 ml môi trờng (MT) 0,5 MSucrose vào đĩa 1 - 150ml MT 0,25 M Sucrose vào đĩa 2 - 150ml MT PBS +20% CS vào đĩa số 3 Lấy cọng rạ ra khỏi Nitơ lỏng giữ trong không khí 5-6 giây, cho cọng rạ vào nứớc ấm 20C khoảng 30 giây, lấy cọng rạ ra khỏi nứớc ấm, cắt đầu cọng rạ cho phôi vào đĩa petre,tìm phôi dới kính hiển vi soi nổi, sau đó hút phôi vào đĩa 1 để 5 phút, chuyển sang đĩa 2 để 5 phút, chuyển sang đĩa 3 và chuyển vào đĩa rửa D-PBS 20%CS, rửa 2-3 lần sau đó chuyển 4 Phần Nghiên cứu về CNSH và các vấn đề khác vào giọt nuôi CRaa1 và cho vào tủ nuôi cấy CO2 5%, nhiệt độ 38,5C, ẩm độ tối đa 98%. Theo dõi khả năng sống và phát triển của phôi Kết quả Chất lợng phôi trớc khi đông lạnh Phôi đông lạnh (n) Loại A (n) % Loại B (n) % Phôi Dâu 55 38 69,09 17 30,90 Phôi Nang 44 30 68,18 14 31,81 Tổng số 99 68 68,68 31 31,31 Trong số 99 phôi đợc đông lạnh, phôi nang, phôi dâu loại A là 68 chiếm 68,68%. Phôi nang, dâu loại B là 31 chiếm 31,31%. Phôi nang, dâu loại A chiếm tỷ lệ cao hơn phôi nang, phôi dâu loại B Chất lợng phôi nuôi sống sau giải đông Phôi đông lạnh Phôi chết Phôi sống Trong đó (n) % (n) % (n) % Phôi dâu 55 55,55 18 32,72 37 67,27 Phôi nang 44 44,45 7 15,90 37 84,09 Tổng số 99 100 25 25,25 74 74,74 Sau khi giải đông và nuôi cấy in vitro, trong số 99 phôi đ có 74 phôi sống và phát triển đến thoát màng, chiếm 74,74% thấp hơn so với Nhật Bản và Hàn Quốc (74,74 so với 89% và 86%). Số phôi chết và thoái hoá là 25 (25,25%). S phôi nang sng sau giải đông v nuôi cấy in vitro cao hn so với phôi dâu (84,09% so vi 67,27%;) kết quả này này phù hợp với các kết quả nghiên cứu của các tác giả; Saito,N., K.Imai, M.Tomizawa, Shin-noh, . S. Kaidi,A. Van Langendonckt, A.Massip, F.Dessy and I.Donnay Kết luận và đề nghị Kết luận Bớc đầu nghiên cứu ứng dụng đông lạnh phôi bò bằng phơng pháp tạo Thể Thủy Tinh thành công trong điều kiện Việt Nam Tỷ lệ phôi sống sau giải đông của thí nghiệm này là 74,74%. Có thể áp dụng phơng pháp đông lạnh này vào sản xuất Đề nghị Báo cáo khoa học Viện Chăn Nuôi 2006 5 Đề nghị đựợc tiếp tục nghiên cứu đông lạnh phôi bò bằng phơng pháp tạo Thể thuỷ tinh (Vitrification method) để nâng cao tỷ lệ phôi sống sau giải đông. Tài liệu tham khảo Saito,N., K.Imai,M.Tomizawa. Effect of sugar-addition on the survival of vitrified bovine blastocysts produced in vitro. Theriogenology, 41,1053-1060,1994. Saito,N., K.Imai. The effect of addition of various monosacchorides to vitrification solutions on the survival of bovine blastocysts produced in vitro. Cryobiology and Cryotechnology, Vol. 43,No. 1, 34-39 Shin-noh, M.et al. Effect of in vitro culture of bovine embryos biopsied with a microblade on in-vitro survival after vitrivication. Theriogenology, 49,227,1998 S. Kaidi,A. Van Langendonckt,A.Massip,F.Dessy and I.Donnay. Cellular alteration after dilution of cryoprotective solution used for the vitrification of invitro-produced bovine embryos. Theriogenology,52:515-525,1999 G.Vạjta, P. Holm, M.Kwayama, P.J. Booth, H.Jacobsen, T.Greve,and H.Callesen. Open pulled straw(OPS) vitrification: A new way to reduce cryoinjuries of bovine Ova and Embryos. Molecular reproduction and development 51: 53-58(1998) . đ áp dụng thành công đông lạnh phôi bò bằng phơng pháp đông lạnh một bớc, phơng pháp 3 bớc nhng đông lạnh bằng phơng pháp Tạo Thể Thuỷ Tinh (Vitrification method) cha đợc nghiên cứu ứng dụng. . cấy phôi đông lạnh còn hạn chế đợc những bệnh về gen. Trớc đây đ có nhiều nghiên cứu về đông lạnh phôi bò, nh phơng pháp đông lạnh một bớc, đông lạnh 3 bớc. Việc bảo quản phôi bò bằng phơng pháp. 1 Nghiên cứu ứng dụng đông lạnh phôi bò bằng phơng pháp tạo thể thuỷ tinh (Vitrification method) Nguyễn Thị Thoa, Nguyễn Văn Lý, Lu Công Khánh, Phan Lê Sơn Bộ môn Cấy truyền Phôi Abstract