NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LÀM SÁNG DA CỦA CHIẾT XUẤT TỪ CỦ BÁCH BỘ Stemona cochinchinensis VÀ LÕI GỖ MÍT Artocarpus heterophyllus

1. Lí do chọn đề tài Ánh sáng mặt trời không thể thiếu đối với sự sống: thực vật cần ánh sáng để quang hợp tổng hợp các chất hữu cơ, con người cần ánh sáng để tổng hợp vitamin D3. Tuy nhiên, ngoài những tác dụng hữu ích đó thì các bức xạ từ mặt trời cũng là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây nên những vấn đề về thẩm mỹ và bệnh học đối với da. Bức xạ mặt trời có các tia cực tím có bước sóng ngắn có thể xuyên sâu vào da gây tổn thương cho các tế bào da. Tuy nhiên, việc tia cực tím chiếu vào da sẽ kích thích sự sản sinh sắc tố da melanin từ các tế bào sinh melanin (melanocyte) – tế bào nằm ở lớp màng đáy của biểu bì, và các bào quan sinh melanin (melanosome) trong các tế bào sừng (keratinocyte) để bảo vê da. Sự tăng sinh và tích lũy melanin trong da gây nên sạm da, nám, tàn nhang, làm mất đi vẻ thẩm mĩ của làn da. Hơn nữa, việc nám da lâu dài cũng có thể dẫn đến ung thư da. Vì vậy, việc nghiên cứu để tìm ra các chất ức chế sinh tổng hợp melanin có ý nghĩa quan trọng. Nhiều nghiên cứu đã tìm ra một số chất có tác dụng ức chế sinh tổng hợp melanin, sử dụng làm thành phần mỹ phẩm làm sáng da như hydroquinone, acid kojic, arbutin, acid azelaic... Tuy nhiên, chúng có thể gây ra một số tác dụng phụ ảnh hưởng đến sức khỏe. Do đó, việc tìm kiếm những chiết xuất và chất có tác dụng làm sáng da có nguồn gốc từ thiên nhiên đã và đang được các nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu và bước đầu đem lại những kết quả khả quan. Với điều kiện khí hậu nhiệt đới, Việt Nam có đa dạng các loài thực vật trong đó có nhiều loài dược liệu quí có hoạt tính sinh học phong phú. Những loài thực vật đó đã và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu. Tuy nhiên, ở Việt Nam cho đến nay có rất ít công trình công bố về khả năng làm sáng da của thực vật ở Việt Nam. Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng làm sáng da của chiết xuất từ củ bách bộ Stemona cochinchinensis và lõi gỗ mít Artocarpus heterophyllus”.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

- -HÀ THỊ MINH TÂM

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LÀM SÁNG DA CỦA

CHIẾT XUẤT TỪ CỦ BÁCH BỘ Stemona cochinchinensis

VÀ LÕI GỖ MÍT Artocarpus heterophyllus

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm (Sinh lý học người và động vật)

Mã số: 60.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Thị Phương Hoa

Hà Nội – 2014

LỜI CẢM ƠN

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn cô giáo – TS.Lê Thị Phương Hoa đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và thực hiện đề tài.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Hóa Sinh và Tế bào học, Bộ môn Sinh lý Người và Động vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học

Sư phạm Hà Nội đã chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong thời gian tôi làm đề tài.

Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ tận tình từ TS Đặng Ngọc Quang – Phòng Hóa hợp chất thiên nhiên, Khoa Hoá học Đồng thời tôi cũng chân thành cảm

ơn sự giúp đỡ từ cô Phạm Thùy Linh, Phòng Thử hoạt tính sinh học, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam cùng các bạn sinh viên, học viên cao học Bộ môn Hoá sinh và Tế bào học, Khoa Sinh học.

Tôi xin cảm ơn Phòng Sau Đại học, Trung tâm Thông tin Thư viện Đại học Sư phạm Hà Nội đã giúp đỡ và cung cấp cho tôi những tư liệu quý giá.

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh – KTNN, Tổ Động vật – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành việc nghiên cứu, học tập.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè

và những người thân đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Hà Nội, tháng 10 năm 2014

Học viên

Hà Thị Minh Tâm

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DMSO : Dimethyl sulfoxide

DPPH : 2,2-diphenyl1-picrylhydrazyl

DQ : DOPA – quinone

EtoAc : Cao phân đoạn Ethyl acetate

FBS : Huyết thanh thai bò (Fetus bovine serum)

GAE : Đương lượng acid gallic (Gallic acid equivalent)

H2O : Cao phân đoạn nước

n –Hex : Cao phân đoạn n – Hexane

IC50 : Nồng độ ức chế 50% (Half maximal inhibitory

concentration) L-DOPA : Dihydroxyphenylalanine

MIC : Nồng độ ức chế tối thiểu (minimal inhibitory

concentration) MTT : 3-( 4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-

diphenylterazolium bromide

QE : Đương lượng quercetin (Quercetin equivalent)

SDB : Môi trường lỏng Sabouraud2% dextrose (Sabouraud

2% dextrose broth) TSB : Môi trường lỏng có đậu nành (Tryptic Soy Broth)

UV : Tia cực tím (Ultra violet)

PHẦN MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Ánh sáng mặt trời không thể thiếu đối với sự sống: thực vật cần ánhsáng để quang hợp tổng hợp các chất hữu cơ, con người cần ánh sáng đểtổng hợp vitamin D3 Tuy nhiên, ngoài những tác dụng hữu ích đó thì cácbức xạ từ mặt trời cũng là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây nênnhững vấn đề về thẩm mỹ và bệnh học đối với da

Bức xạ mặt trời có các tia cực tím có bước sóng ngắn có thể xuyên sâuvào da gây tổn thương cho các tế bào da Tuy nhiên, việc tia cực tím chiếuvào da sẽ kích thích sự sản sinh sắc tố da melanin từ các tế bào sinh melanin(melanocyte) – tế bào nằm ở lớp màng đáy của biểu bì, và các bào quan sinhmelanin (melanosome) trong các tế bào sừng (keratinocyte) để bảo vê da Sựtăng sinh và tích lũy melanin trong da gây nên sạm da, nám, tàn nhang, làmmất đi vẻ thẩm mĩ của làn da Hơn nữa, việc nám da lâu dài cũng có thể dẫnđến ung thư da

Vì vậy, việc nghiên cứu để tìm ra các chất ức chế sinh tổng hợpmelanin có ý nghĩa quan trọng Nhiều nghiên cứu đã tìm ra một số chất có tácdụng ức chế sinh tổng hợp melanin, sử dụng làm thành phần mỹ phẩm làmsáng da như hydroquinone, acid kojic, arbutin, acid azelaic Tuy nhiên,chúng có thể gây ra một số tác dụng phụ ảnh hưởng đến sức khỏe Do đó, việctìm kiếm những chiết xuất và chất có tác dụng làm sáng da có nguồn gốc từthiên nhiên đã và đang được các nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu và bướcđầu đem lại những kết quả khả quan

Với điều kiện khí hậu nhiệt đới, Việt Nam có đa dạng các loài thực vậttrong đó có nhiều loài dược liệu quí có hoạt tính sinh học phong phú Nhữngloài thực vật đó đã và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước quantâm nghiên cứu Tuy nhiên, ở Việt Nam cho đến nay có rất ít công trình công

bố về khả năng làm sáng da của thực vật ở Việt Nam Vì vậy chúng tôi tiếnhành đề tài: “Nghiên cứu khả năng làm sáng da của chiết xuất từ củ bách bộ

Stemona cochinchinensis và lõi gỗ mít Artocarpus heterophyllus”.

Năm 1987, A Yagi và cộng sự ở Nhật Bản đã chứng minh được dịchchiết cây lô hội có khả năng ức chế tyrosinase của nấm Theo nghiên cứu, hợpchất 2-O-feruloylaloesin và aloesin ở nồng độ 0,4mM – 0,8mM ức chế tốt quátrình oxi hóa L-DOPA thành DOPAquinone thông qua sự ức chế tyrosinase[47] Từ đó đến nay, có rất nhiều các nghiên cứu về khả năng làm sáng da ởthực vật được công bố

Năm 1992, H Matsuda đã nghiên cứu tác dụng dược lý của dịch chiết lá

thường xuân Arctostaphylos uva ursi L Kết quả cho thấy dịch chiết

methanol 80% và arbutin phân lập từ lá thường xuân có tác dụng ức chếhoạt động của tyrosinase Hơn nữa, dịch chiết ức chế sự oxi hóa tự độngcủa dopachrome [33]

Năm 1997, nhà khoa học Hàn Quốc K.T Lee và cộng sự đã nghiên cứu

100 dịch chiết thực vật về khả năng ức chế in vitro tyrosinase và quá trình oxi

hóa DOPA tự động Trong đó, một số dịch chiết thực vật như mộc hoa

Chaenomeles speciosa, dương liễu Dryopteris crassirhizoma, cây thiên ma Gastrodia ellata, cam thảo Glycyrrhiza glabra, dâu tằm Morus alba, nhục

đậu khấu Myristica fragrans, cây đại hoàng Rheum palmatum và cây hòe

Sophora japonica có tác dụng ức chế hoạt động của tyrosinase Còn các dịch

chiết của cây sài hồ bắc Bupleurum falcatum, dâu tằm, cúc dại Tussilago

farfara có tác dụng ức chế quá trình oxi hóa tự động DOPA [25].

Năm 1998, T.Yokota và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của dịchchiết từ rễ cây cam thảo trong việc ức chế quá trình hình thành melanin trên tếbào khối u ác tính B16 của chuột lang Kết quả nghiên cứu cho thấy thànhphần glabridin chiết xuất từ cam thảo có tác dụng ức chế quá trình sinh tổnghợp melanin thông qua ức chế hoạt động của tyrosinase ở nồng độ 0,1-1,0µg/ml Thí nghiệm còn cho thấy tình trạng ban đỏ ở da của những con chuộtthí nghiệm do tiếp xúc với tia UVA, UVB giảm đi khi bôi tại chỗ kem chứa0,5% glabridin Bên cạnh đó nghiên cứu còn chứng minh được glabridinkhông chỉ ức chế hình thành melanin mà còn có tác dụng chống viêm da [50]

Năm 2003, K.T Lee và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng ức chế

tyrosinase và quá trình hình thành melanin trên tế bào khối u B16 của dịch chiết từ cành dâu Ramulus mori Kết quả cho thấy hợp chất 2,3',4,5'

-tetrahydroxystilbene(2-oxyresveratrol) tinh sạch từ dịch chiết cành dâutằm có khả năng ức chế tyrosinase với IC50, nồng độ ức chế 50%, = 0.23µg/ml Đồng thời khi nghiên cứu trên chuột lang, các nhà khoa học cònthấy rằng dịch chiết từ cành dâu có tác dụng làm giảm hàm lượng melanin

ở chuột lang Ngoài ra, thử nghiệm chiết xuất từ cành dâu trên da khônggây dị ứng, thậm chí chiết xuất này còn không gây kích ứng khi tiếp xúcvới mắt, không gây độc qua đường tiêu hóa [26]

Cũng trong năm này, SJ Kim và cộng sự đã tìm ra được các ba

flavonoid từ dịch chiết ethanol của cây khổ sâm (dã hòe) Sophora

flavescens Đó là sophoraflavanone G, kuraridin, và kurarinone Các hợp

chất này có tác dụng ức chế tyrosinase mạnh hơn acid kojic Cụ thể đốivới acid kojic thì giá trị IC50 = 20,5 µM, còn đối với ba hợp chất

sophoraflavanone G, kuraridin, và kurarinone thì giá trị IC50 lần lượt là6,6; 0,6 và 6,2 µM [22].

Năm 2007, O¨ O¨zer và cộng sự đã tách chiết và chứng minh đượcmột hợp chất polyphenol, acid ellagic từ các dịch chiết methanol của một số

thực vật như lá cây hạch đào (Juglans regia L), vỏ cây dẻ (Castanea sativa)

và lá cây bạch đàn (Eucalyptus camaldulensis) có khả năng ức chế tốt quá

trình sinh tổng hợp melanin thông qua việc ức chế hoạt động của tyrosinase

và ức chế quá trình chuyển từ dopachrome thành melanin [37]

Năm 2009, M Matsuda và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng ức chế

tyrosinase của các thành phần của hạt cây nhàu Morinda citrifolia thuộc họ

Cà phê Các nhà khoa học đã phân lập được một số hợp chất từ hạt cây nàynhư bisdemethylpinoresinol, americanin A, và quercetin có tác dụng ức chếtốt tyrosinase [34]

Năm 2010, M.Y Lee và cộng sự đã phân lập được các hợp chất từ dịch

chiết ethyl acetate của cây Lespedeza cyrtobotrya – một loài thực vật có

hoa trong họ Đậu Có 4 hợp chất được phân lập ,trong đó, hợp chất Dihydroxyphenyl)-6-hydroxybenzofuran có hoạt tính ức chế tyrosinasemạnh nhất với giá trị IC50 = 5,2 µM Đặc biệt, ở nồng độ 37,3 µM hợpchất này có tác dụng làm giảm 50% hàm lượng melanin trên các tế bàokhối u ở người [27]

Năm 2012, H.C Huang và cộng sự đã nghiên cứu thành công hoạt tính

ức chế sự sinh tổng hợp melanin và hoạt tính chống oxi hóa từ chiết xuất hoa

mộc lan Magnolia grandiflora L trên nấm và tế bào B6F10 Kết quả cho thấy

dịch chiết hoa mộc lan hoa ức chế hoạt động của tyrosinase nấm (IC50 =11,1%, v/v) Đồng thời chiết xuất này cũng có hiệu quả ức chế hoạt động củatyrosinase trong tế bào B6F10 (IC = 13,6%, v/v) Ngoài ra, các nhà khoa học

còn chứng minh dược dịch chiết này có hàm lượng phenol tổng số cao, do đó

nó có khả năng chống oxi hóa mạnh [18]

Gần đây, năm 2014, ở Nhật Bản, K Murata và cộng sự đã nghiên cứu

và tìm ra tác dụng làm sáng da của các chiết xuất từ hoa của cây đào (Prunus

persica) Dịch chiết này có khả năng ức chế tyrosinase và qua đó ức chế quá

trình hình thành melanin trong melanocyte B16 Các hoạt tính của dịch chiếtđược cho là do một số thành phần có trong dịch chiết như afzelin vànaringenin – một loại flavanone [35]

Cũng trong năm nay, nhóm các nhà nghiên cứu ở Nhật Bản gồm Y.Yamashita – Higuchi và cộng sự đã tìm ra được dẫn xuất của arbutin mới từ

dịch chiết trong methanol của lá cây ngân hoa (Grevillea robusta) Các dẫn

xuất này tên gọi là grevilloside J – Q có khả năng làm sáng da và ức chế tốt

đã được GS Đỗ Tất Lợi chỉ ra trong cuốn Những cây thuốc và vị thuốc Việt

Nam, ví dụ như bạch chỉ, đỗ xanh, bí đao…[1] Tuy nhiên, gần đây, cũng có

một số công trình về khả năng ức chế tyrosinase của chiết xuất thực vật vàchất tinh sạch

Năm 2012, các nhà khoa học thuộc khoa Hóa học, trường Đại họcKhoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh đã công bố hoạt tính ứcchế quá trình sinh tổng hợp melanin của chất tinh sạch từ dịch chiết methanol

của lá cây mít Artocarpus heterophyllus [3].

Năm 2013, Hà Mạnh Tuấn và cộng sự đã nghiên cứu và chứng minhđược hoạt tính ức chế tyrosinase của acid vanillic phân lập từ củ mài [2] Năm 2013, công ty Dược Saman cho sản phẩm Trắng bền Saman có tácdụng làm trắng/sáng da, gồm hỗn hợp các chiết xuất từ một số thảo dược như:

Đỏ ngọn Cratoxylon prunifolium, cam thảo Radix glycyrrhizae, dâu tằm Folium

Mori, lô hội Aloe sp [54].

3 Mục đích nghiên cứu

- Đánh giá được một số hoạt tính sinh học in vitro của chiết xuất củ

bách bộ đặc biệt là hoạt tính ức chế sinh tổng hợp melanin (thông qua ức chếtyrosinase) và khả năng hấp thụ tia UVB, UVA

- Đánh giá được khả năng ức chế sinh tổng hợp melanin của chiết xuất

từ củ bách bộ và lõi gỗ mít trên dòng tế bào SK-MEL-2 melanoma và chuộtthí nghiệm

- Đánh giá được hoạt tính ức chế sinh tổng hợp melanin và khả nănghấp thụ tia UVB, UVA của một số chất tinh sạch từ lõi gỗ mít

Từ đó, góp phần làm cơ sở cho các nghiên cứu và sản xuất dược mỹphẩm làm sáng da

4 Đối tượng nghiên cứu

- Thực vật: Lõi gỗ của cây mít Artocarpus heterophyllus và củ bách bộ

Stemona cochinchinensis Gagnet.

- Các chủng vi sinh vật và nấm kiểm định

- Dòng tế bào SK-MEL-2 melanoma của người

- Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss

- Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học như hoạt tính chống oxy hóathông qua hoạt tính quét gốc tự do DPPH, hoạt tính kháng vi sinh vật và hoạttính ức chế tyrosinase, khả năng hấp thụ tia UVB, UVA của các cao tổng vàcao phân đoạn củ bách bộ.

- Xác định khả năng ức chế sinh trưởng dòng tế bào

SK-MEL-2 melanoma của chiết xuất củ bách bộ và lõi gỗ mít

- Xác định khả năng ức chế tyrosinase và hấp thụ tia UVB, UVA củacác chất tinh sạch từ lõi gỗ mít

- Phân tích khả năng ức chế sinh tổng hợp melanin trên chuột thí nghiệm

6 Đóng góp mới của đề tài

Đưa ra dẫn liệu đầu tiên về hoạt tính ức chế sinh tyrosinase, khả năng

hấp thụ tia UVB, UVA của các chiết xuất từ củ bách bộ Stemona

cochinchinensis, khả năng ức chế dòng tế bào SK-MEL-2 melanoma của chiết

xuất củ bách bộ và lõi gỗ mít Artocarpus heterophyllus, tác dụng làm sáng da

của chiết xuất lõi gỗ mít trên chuột thí nghiệm

7 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp thử một số hoạt tính sinh học

+ Hoạt tính chống oxy hóa

+ Khả năng ức chế dòng tế bào SK – MEL- 2 melanoma

+ Khả năng làm sáng da trên mô hình chuột thí nghiệm

7.2 Phương pháp xử lý thống kê số liệu

Phân tích số liệu bằng các giá trị thống kê sinh học sử dụng phần mềmMicrosoft Excell

PHẦN NỘI DUNGCHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sự hình thành sắc tố da

1.1.1 Sơ lược cấu tạo của da

Da là lớp bao phủ bề mặt của cơ thể, là cơ quan thực hiện nhiều chứcnăng khác nhau như: bảo vệ cơ thể chống lại những tác động có hại, chứcnăng cảm giác, bài tiết, điều hòa thân nhiệt và trao đổi khí Da được cấu tạogồm ba lớp: lớp biểu bì, lớp bì hay còn gọi là hạ bì và lớp mỡ dưới da [5]

+ Lớp biểu bì (epidermis)

Đó là lớp ngoài cùng của da, cấu tạo bởi nhiều tầng tế bào của môthượng bì Trên cùng là lớp sừng gồm các tế bào biểu mô đã chết, thườngđược bóc ra khỏi da cùng lớp bụi và vi khuẩn bám vào nó

Bên dưới lớp sừng là các tế bào sống Tầng sâu nhất của biểu bì có khảnăng sinh sản ra tế bào mới gọi là tầng sinh trưởng (tầng Malpighi) hay gọi làtầng đáy Ở tầng này có khoảng 10% các tế bào sắc tố - melanocyte có dạng

Hình 1.1 Cấu tạo da và melanocyte [56, 57]

hình sao có thể sản sinh ra các sắc tố melanin khi có tác động của tia cực tím.Bên trong melanocyte có nhân, thể golgi, màng lưới nội chất tham gia tổnghợp nên tyrosinase, enzyme xúc tác quá trình tổng hợp melanin Xung quanhmelanocyte là các keratinocyte [5, 38].

Melanin được hình thành đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ các

tế bào da ở người khỏi ảnh hưởng có hại của tia cực tím Đồng thời melanincũng qui định màu da khác nhau [12, 38] Số lượng các tế bào sắc tố ở nhữngngười thuộc các chủng tộc khác nhau thì gần như nhau, nhưng các tế bào nàyhoạt động mạnh hơn ở những người da đen và da màu Ngoài ra, lượngmelanin cũng được tăng lên bởi sự kích thích của hormon kích hắc tố ở thuỳgiữa tuyến yên (MSH) [5]

+ Lớp hạ bì (dermis)

Đây là lớp mô liên kết, trong lớp này có mạch máu, đầu mút dây thầnkinh cảm giác xúc giác, nang lông, tuyến mồ hôi [5]

+ Lớp dưới da

Lớp này nằm sâu và phủ lên các cơ quan trong cơ thể, được cấu tạo từ

mô liên kết sợi xốp có xen kẽ các tế bào mỡ, tạo thành lớp mỡ dưới da Lớp

mỡ chính là kho dự trữ chất dinh dưỡng của cơ thể [5]

1.1.2 Cơ chế sinh tổng hợp melanin của melanocyte

Khi có tia UV chiếu vào da thì quá trình sinh tổng hợp melanin củamelanocyte bắt đầu với sự tham gia của tyrosinase [12, 38] Tyrosinase đượctổng hợp bởi ribosome trên màng lưới nội chất có hạt Sau khi được tổng hợp,tyrosinase được đóng gói trong thể golgi rồi được chuyển tới melanosome ởdạng bất hoạt [38]

Có hai loại tế bào melanin được tạo ra là eumelanin có màu nâu hoặcđen và pheomelanin có màu đỏ hoặc màu vàng [38]

Con đường sinh hóa tổng hợp melanin lần đầu tiên được chứng minhbởi Raper (1928), Mason (1948) và gần đây đã được bổ xung bởi Cookse và

cộng sự và Schallreuter và cộng sự [24] Con đường này trải qua nhiều bước

gồm một loạt các phản ứng oxi hóa khử [12, 38]

Bước đầu tiên của quá trình hình thành sắc tố là tyrosinase oxi hóaacidacid amin tyrosine có sẵn trong da thành dopaquinone Đây là bước quantrọng trong sinh tổng hợp melanin vì các bước còn lại của chuỗi phản ứng cóthể được tiếp tục diễn ra một cách tự động trong điều kiện pH của cơ thể[12,38]

Bước tiếp theo: dopaquinone được tự động oxi hóa chuyển thànhDOPA (dihydroxyphenylalanine) DOPA là cơ chất của tyrosinase và lại đượcoxi hóa ngược lại thành dopaquinone dưới tác dụng của tyrosinase [12]

Dopaquinone cũng được oxi hóa chuyển thành leukodopachrome rồi tựđộng chuyển thành dopachrome là một chất trung gian có màu da cam Sau đódopachrome tự động mất nhóm CO2 để thành DHI (5,6-dihydroxyindole).Đồng thời dưới tác dụng của enzyme gắn protein TRP (tyrosinase-relatedprotein) thì dopachrome được chuyển thành DHICA ( 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid) Cuối cùng, eumelanin được tạo thành qua một chuỗi cácphản ứng oxi hóa khử từ DHI và DHICA [12]

Trong điều kiện với sự có mặt của cysteine, acid amin chứa lưu huỳnhhoặc glutathione, một tripeptide được tổng hợp từ 3 acid amin là L –glutamate, L-glycine, L– cysteine thì dopaquinone được tự động chuyểnthành cysteinyldopa hoặc glutathioyldopa rồi tạo thành pheomelanin [12]

Ngoài eumelanin và pheomelain, có một loại melanin khác gọi làallomelanin được tạo thành dựa trên sự trùng hợp các monophenolic khác từtyrosinase [12]

Sự khác nhau chính giữa allomelanin và eumelanin, pheomelanin ở chỗ

là trong cấu trúc allomelanin không chứa dopaquinone mà lại chứa hợp chấtdạng quinone [12]

Mặc dù melanin là yếu tố chính để bảo vệ da ở người nhưng sự tích tụ

số lượng các tế bào melanin một cách dị thường trong da dẫn đến kết quả làxuất hiện những mảng sắc tố gây mất thẩm mĩ cho da Cơ chế để làm sáng da

là phải ức chế được hoạt động tyrosinase để ức chế sự hình thành sắc tốmelanin [12]

Melanocyte sản sinh hạt melanosome có chứa melanin trong đó, sau đómelanosome được chuyển vào các tế bào sừng (keratinocyte) rồi di chuyểnđến lớp thượng bì tạo ra màu của làn da Như vậy sự phân bố melanosome vàmật độ melanocyte là yếu tố quan trọng quyết định màu da [38,40]

Sau đây là sơ đồ về con đường hình thành các loại melanin [12]:

Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp melanin [12].

TYR: Tyrosinase; TRP: Tyrosinase-related protein; IQ: Indole – 5,6 –quinone; HBTA: 5 – hydroxyl – 1,4 – benzothiazinylalanine

HBTA

EUMELANINS

IQ DHI

Tia tử ngoại (UV) là các tia không nhìn thấy của năng lượng từ mặttrời, có bước sóng từ 200 ~ 400nm Có ba loại tia tử ngoại với các bước sóngkhác nhau: UVA (320 – 400nm), UVB (280 – 320nm) và UVC (200 –280nm) [43].

Trong số ba loại tia UV thì tia UVC là tia bức xạ rất nguy hiểm đối với

cơ thể, kể cả khi tiếp xúc trong thời gian ngắn Nó cực kì có hại đối với làn

da Tuy nhiên, các tia UVC được hấp thụ gần như hoàn toàn bởi tầng ozonetrong khí quyển của trái đất và không có tia bức xạ nào có bước sóng dưới

290 nm có thể xâm phạm được vào không gian của trái đất [19]

Tia UVA chiếm 95% trong số các loại tia UV chiếu xuống trái đất Đây

là tia bức xạ có bước sóng dài, còn gọi là tia lão hóa Nó có thể xuyên sâu vàolớp biểu bì và hạ bì của da làm giảm tính đàn hồi của làn da và dẫn đến tìnhtrạng da bị chảy sệ và hình thành nếp nhăn Đồng thời, khi tiếp xúc lâu dài,UVA cũng có thể gây tổn thương ADN của tế bào và làm suy giảm hệ miễndịch [18, 43] UVA làm melanin đậm hơn ở biểu bì do UVA tác động đếnthành phần khung tế bào làm tăng sự phân bố melanosome vào bề mặt da Do

đó, có thể nói UVA là một tác nhân gây tăng sắc tố da [52]

Tia UVB được xem như là tia bức xạ gây nám da, sạm da và nó chỉchiếm khoảng 5% trong các tia bức xạ từ mặt trời Tuy vậy, hoạt động của nólại có ảnh hưởng mạnh mẽ đến cơ thể Khả năng làm da bị cháy nắng của UVBmạnh gấp 1000 lần so với UVA đồng thời nó cũng gây đột biến gen mạnh hơnUVA Hoạt động của UVB chủ yếu là ở các tế bào đáy của lớp biểu bì da [43]

Nó kích thích hoạt động của hệ thống sinh tổng hợp melanin trong melanocyte

để hình thành sắc tố da mạnh hơn UVA Vì vậy, khi da chúng ta tiếp xúc với ánhnắng mặt trời trong thời gian dài sẽ thúc đẩy sự tổng hợp các melanin, làm cho

da bị nám, tàn nhang [42]

Tác động của UVB còn làm chậm sự phát triển của tế bào, gây lão hóa

da Ngoài ra, nó cũng làm giảm đáng kể khả năng chống oxi hóa của da vàkhả năng bảo vệ của da chống lại ảnh hưởng có hại của các tia tử ngoại dẫnđến nguy cơ bị ung thư da như ung thư tế bào biểu mô, tế bào đáy của biểu bì.UVB cũng có thể làm giảm hệ thống miễn dịch của cơ thể [43] UVB có khảnăng gây đột biến và ung thư cao hơn so với tia UVA [19]

Các nhà khoa học cũng khuyến cáo, để ngăn chặn tác hại gây ung thư

da của các tia UV, cách tốt nhất là chúng ta nên ăn những thực phẩm hoặcdùng thuốc bôi có chứa nhiều chất chống oxi hóa như vitamin C, vitamin E,polyphenol [19]

1.2 Một số hoạt chất có tác dụng làm sáng da

Các hoạt chất được dùng trong mỹ phẩm làm sáng da có tác dụng làm

ức chế quá trình sinh tổng hợp melanin thông qua ức chế hoạt tính tyrosinase.Trên thế giới đã có một số hợp chất được sử dụng rộng rãi trong công nghệlàm đẹp da như hydroquinone, arbutin, acid kojic, acid azelaic [12,20,37,30].Bên cạnh đó, với nền khoa học tiên tiến hiện nay, các nhà khoa học cũng đãtìm ra một số lượng lớn các hợp chất mới có tác dụng ức chế tyrosinase nhưpolyphenol, các dẫn xuất benzaldehyde và benzoate, một số steroid và lipidmạch dài [12, 30]

1.2.1 Các hợp chất phổ biến làm sáng da

1.2.1.1.Hydroquinone

Là một hợp chất hydroxyphenolic được dùng rộng rãi để điều chế mỹphẩm làm sáng da, và điều trị các bệnh liên quan đến rối loạn tăng sắc tố danhư nám, tàn nhang Hydroquinone có tác dụng gây độc đối với tế bàomelanocyte thông qua ức chế hoạt động trao đổi chất của tế bào melanocyte

Cụ thể, nó ức chế quá trình tổng hợp ADN và ARN Từ đó gây ảnh hưởngđến quá trình sinh tổng hợp tyrosinase làm giảm hoạt tính của tyrosinase Tácdụng này dẫn đến sự ức chế quá trình chuyển từ DOPA thành melanin Kết

quả là số lượng tế bào melanin và melanosome giảm đi làm da trở nên sánghơn, giảm nám, tàn nhang [21, 38].

Các nghiên cứu còn cho thấy hydroquinone có thể phá hủy cấu trúcmàng tế bào melanocyte, thậm chí phá hủy cả tế bào melanocyte làm giảm sốlượng tế bào sinh melanin trong da Điều này là tiềm năng cho việc chữa trịbệnh nám, tàn nhang và giảm nguy cơ tái phát [16]

Bên cạnh những hydroquinone tổng hợp, các nhà khoa học còn tìmthấy các hidroquinone tự nhiên trong nhiều thực vật như: cà phê, chè [38]

Tuy nhiên, việc sử dụng hydroquinone tổng hợp cũng có thể gây nênmột số tác dụng phụ không mong muốn như: dị ứng, viêm da, ban đỏ, đổi màucủa móng, thậm chí ở một số ít trường hợp còn gặp hiện tượng tăng sắc tố đen ởvùng da điều trị [12, 21, 38] Hiện nay hydroquinone tổng hợp bị hạn chế sửdụng trong sản xuất mỹ phẩm trắng da ở nhiều nước trên thế giới [21, 12]

1.2.1.2 Acid azelaic

Là một acid no không có gốc phenol được chiết xuất từ một loài vi nấm

(Pitysporum ovale), có tác dụng ức chế rất tốt tyrosinase, được dùng để điều

trị tình trạng tăng sắc tố da như nám da [16, 38]

Cơ chế tác động của acid azelaic là gây ức chế hoạt động sinh tổng hợpADN, ức chế hoạt tính của các enzym oxi hóa khử của ti thể Do đó nó gâyđộc trực tiếp cho tế bào melanocyte [12] Đặc biệt là acid azelaic có ảnhhưởng mạnh mẽ đến hoạt động của melanoma hơn là đối với các tế bào sắc tố

da bình thường [21]

Acid azelaic thường được dùng trong việc điều trị bệnh nám da kéo dài,mặc dù vậy, nó vẫn có một số tác dụng phụ như ban đỏ, viêm da, bong vảy,ngứa, bỏng rát, tuy nhiên những tác dụng phụ này sẽ mất đi sau 2 – 4 tuầnđiều trị [21]

1.2.1.3 Acid kojic

Là một chất ức chế tyrosinase được chiết xuất từ các loại nấm khác

nhau như Aspergilius, Penicillium [22, 30] Acid kojic ức chế hoạt động của

tyrosinase bằng việc tạo phức càng cua với phân tử đồng trong enzyme đó

Đồng thời, nó cũng ngăn cản quá trình chuyển từ DOPA thành dopaquinone

Do đó quá trình sinh tổng hợp melanin sẽ bị ức chế, làm giảm số lượng tế bàomelanin [20, 30, 38] Mặt khác, các tế bào melanocyte khi được điều trị bởiacid kojic thì mất hình dạng phân nhánh, điều này cũng dẫn đến thu hẹp phạm

vi chứa tế bào melanin [38]

Việc sử dụng acid kojic có khả năng gây kích ứng da kèm theo viêm

da Tuy nhiên, khi dùng kết hợp với corticosteroid thì sẽ làm giảm đáng kểkích ứng da [38]

1.2.2 Một số hợp chất làm sáng da khác

1.2.2.1 Polyphenol

Polyphenol là một nhóm gồm các hợp chất đa chức năng chứa phenolđược phân bố rộng rãi trong tự nhiên Chúng có khả năng ức chế tyrosinase

hiệu quả Trong số lượng lớn các polyphenol thì nhóm flavonoid được xem làtốt nhất Flavonoid thường có mặt ở lá, hạt, vỏ, và hoa của thực vật Đồngthời chúng cũng có nhiều ở trong rượu vang, trong những loại quả có màu đỏnhư cà chua, và trong các loại rau xanh Sự có mặt của các flavonoid trongthực vật có ý nghĩa quan trọng đó là bảo vệ cây chống lại tác động của tia

UV, các mầm bệnh và động vật ăn cỏ [12]

Nhóm các hợp chất flavonoid gồm một số hợp chất chính như:flavonol, flavone, flavanone, flavanol isoflavonoid, chalcone, coumarin [12].Trong số các hợp chất này thì khả năng ức chế enzym tyrosinase của flavonol

là rất yếu, thấp hơn tác dụng ức chế của acid kojic đến 20 lần Do đó, hợpchất flavonol ít có hiệu quả trong việc làm sáng da [12]

Đối với ba hợp chất flavone, flavanone, flavanol được chiết xuất từ vỏcủa cam quýt, mặc dù hiệu quả ức chế tyrosinase của chúng là thấp nhưngcác nghiên cứu cho thấy chiết xuất trong ethanol của chúng có hiệu quả đốivới quá trình tổng hợp melanin trên da lưng của lợn đen Tác dụng này chính

là do hoạt tính chống oxi hóa của các hợp chất hóa học trong tinh dầu cam

quýt Ngoài ra, chiết xuất từ dâu tằm (loài Morus), lõi gỗ mít (Artocarpus

heterophyllus) cũng giàu ba loại polyphenol trên, có hiệu quả cao trong làm

sáng da do hoạt tính ức chế tyrosinase [7, 8, 12]

Đặc biệt với dạng hợp chất kết hợp flavone – flavanone chiết xuất từcây bứa ở ven biển thì lại cho hoạt tính ức chế tyrosinase cao hơn cả acidkojic [12]

Các hợp chất isoflavonoid và chalcone được chiết xuất từ rễ các loài

cam thảo Glycyrrhiza thuộc họ đậu có tác dụng ức chế hoạt động của

tyrosinase làm giảm số lượng melanin trên da Thậm chí hoạt động củaisoflavonoid còn mạnh hơn nhiều lần hoạt động của arbutin và acid kojic [12]

Hợp chất cuối cùng trong nhóm hợp chất polyphenol là coumarin Đây

là ester của acid phenylpropanoid với nhân H – benzopyranone, chúng cũng có

vai trò ức chế tyrosinase Trong số các hợp chất coumarin, aloesin là một hợp

chất được tách chiết từ cây lô hội (Aloe vera) có tác dụng dưỡng da rất tốt [14]

1.2.2.2 Benzaldehyde và dẫn xuất benzoate

Các hợp chất benzaldehyde và các dẫn xuất benzoate có thể được chiết

xuất từ một số loài thực vật như rễ của cây mao lương (Pulsatilla cernua), lá cây nhân sâm (Panax ginseng)… có hiệu quả trong việc ức chế hoạt động của

tyrosinase [12]

Hầu hết các hợp chất benzaldehyde ức chế tyrosinase đều không tìmthấy ở thực vật nhưng lại có mặt ở nấm Protocatechualdehyde là hợp chất

được tách chiết từ loài nấm thượng hoàng ( Phellinus linteus) có hiệu quả

làm sáng da gấp 7 – 8 lần so với acid kojic [12]

Đối các hợp chất benzoate, chúng ức chế tyrosinase bằng việc tạo phứccàng cua với nhân đồng của enzyme Trong số các hợp chất benzoate thì acidgallic (3,4,5-trihydroxybenzoate), đặc biệt là các dẫn xuất ester của nó có hoạttính ức chế tyrosinase Các nghiên cứu đã cho thấy các este mạch ngắn(<C10) bị oxi hóa bởi tyrosinase, nhưng các ester mạch dài (>C10) lại ức chếđược enzyme mà không bị oxi hóa nhưng khả năng ức chế tyrosinase của nórất thấp, thấp hơn 30 lần so với acid kojic [9] Tuy nhiên, có một số dẫn xuấthydroxy flavonoid của acid galic được chiết xuất từ lá trà xanh lại có hiệu quả

ức chế enzym tyrosine cao như GCG ((+)gallocatechin-3–O–gallate) và

EGCG ((-)-epigallocatechin-3-O-gallate) [12, 30]

1.2.2.3 Các lipid và steroid mạch dài

Gần đây, các nhà khoa học đã tìm thấy một số lipid mạch dài nhưngkém hiệu quả ức chế tyrosinase như glycosphingolipid, β-glucopyranose được

chiết xuất từ lá cây bồ hòn (Guioa villosa) có tác dụng ức chế hoạt động

tyrosinase nhưng khả năng ức chế chỉ bằng một nửa của acid kojic Thậm chí,

khả năng ức chế hoạt động của tyrosinase của acid trans-geranic được tách

chiết từ cây sả (Cymbopogon citrates) chỉ bằng 1/10 của acid kojic Duy chỉ

có lipit mạch dài trilinolein là có hiệu quả ức chế tyrosinase tương tự acidkojic bằng cách tạo phức càng cua với nhân đồng của enzyme [12]

Ngoài các lipid mạch dài, có một số steroid được chiết xuất từ thực vậtcũng có hiệu quả trong việc ức chế tyrosinase tương đương acid kojic Ví dụ

như các steroid được chiết xuất từ cây cỏ ba lá (Trifolium balansae), hay các

triterpenoid glycoside tách từ rễ của cây hoàng kì hay cây đậu ván dại

(Astragalus taschkendicus), các diterpenoid tách chiết từ cây ô dầu (Aconitum

leave), các monoterpenoid tách chiết từ cây nghệ tây (Crocus sativus)… [12].

Tuy khả năng ức chế hiệu quả tyrosinase của các steroid kị nước vàcác lipid mạch dài đã được chứng minh nhưng chúng vẫn chưa được thửnghiệm rộng rãi và cũng ít được sử dụng trong công nghệ mỹ phẩm hiệnnay [12]

1.3 Một số đặc điểm sinh học và tác dụng của cây bách bộ (Stemona cochinchinensis) và cây mít (Artocarpus heterophyllus)

1.3.1 Cây bách bộ (Stemona cochinchinensis)

1.3.1.1 Phân loại

+ Tên thường gọi: cây bách bộ thân đứng, bách bộ Nam bộ [4]

+ Tên khoa học: Stemona cochinchinensis Gagnet

Họ: Bách bộ (Stemonaceae)

1.3.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố

Cây bách bộ được phát hiện ở Nam Bộ (Đồng Nai) [4]

1.3.1.3 Đặc điểm hình thái và tác dụng của cây bách bộ

Cây bách bộ S cochinchinensis là loại cỏ không leo có thân khí sinh

cao 10-30 cm Lá có phiến hình tim dài 4-5 cm, gân từ đáy 9, gân tam cấpngang; cuống 4-5 cm, mảnh Hoa 2-3, nhỏ, màu đỏ sẫm, trên cọng mảnh; lá

đài 2, cánh hoa 2, cao 8 mm; tiểu nhuỵ 4; noãn sào hình chuỳ, cao 4 mm,noãn 2, đứng [4].

1.3.2 Cây mít

1.3.2.1 Phân loại

Tên thường gọi: Mít

Tên khoa học: Artocarpus heterophyllus

Chi Artocarpus, họ Moraceae, bộ Rosales, ngành Angiospermae, giới

Plantae [1]

1.3.2.2 Nguồn gốc và sự phân bố

Cây mít có nguồn gốc từ Ấn Độ và được phân bố rộng rãi khắp các tỉnhtrong nước ta [1]

1.3.2.3 Đặc điểm hình thái và tác dụng của cây mít

Thân gỗ lớn, cao đến 20 m Cành non có long mềm Lá nguyên hìnhtrái xoan, rộng, phiến dày, bóng, màu lục đậm, có gân nổi rõ Hoa đơn tính.Cụm hoa đực sau khi truyền phấn thì thui đi Cụm hoa cái thường mọc ngaytrên thân hay trên cành già, gồm nhiều hoa, mỗi gai ở ngoài mặt cụm hoa cáitương ứng với một hoa cái Quả phức to, vỏ ngoài nhiều gai nhọn, gồm nhiềuquả thịt mềm, có hạt lớn [1]

Hình 1.3 Cây và củ bách bộ Stemona cochinchinensis [4].

Múi mít thơm, ngon ngọt có thể ăn được Ngoài ra một số nghiên cứucòn cho thấy chiết xuất lá mít có khả năng chống oxi hóa, làm chậm sự lãohóa tế bào, ngoài ra mít cũng được sử dụng trong y học dân gian để ngăn chặncác bệnh về da, bao gồm cả mụn trứng cá và viêm da… [1, 3]

1.4 Tình hình nghiên cứu về khả năng làm sáng da của các chiết xuất từ

các loài bách bộ và mít trên thế giới và Việt Nam

1.4.1 Tình hình nghiên cứu khả năng làm sáng da của các chiết xuất các loài bách bộ và mít trên thế giới

Trên thế giới, từ lâu đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng làm sáng dacủa các chiết xuất từ cây mít

Năm 1995, C.N Lin và cộng sự đã phân lập được khoảng 11 flavonoid

từ cây mít Trong đó, ngoài 9 flavonoid đã được công bố trong các bài báotrước đó thì các tác giả còn phân lập được thêm 2 flavonoid mới nữa là 5,2'-dihydroxy-7,4'-dimethyoxyflavanone và 8 (γ, γ-dimethylallyl) -5,2 ', 4'-

Hình 1.4 Cây mít Artocarpus heterophyllus [49].

trihydroxy-7-methoxyflavone [28] Những flavonoid này có khả năng chốngoxi hóa, ức chế tyrosinase [12].

Năm 2006, E.T Arung cùng cộng sự đã đã phân tích cao phân đoạn củachiết xuất lõi gỗ mít và phân lập được các flavonoid gồm artocarpin (1),cudraflavone C (2), 6-prenylapigenin (3), kuwanon C (4), norartocarpin (5)and albanin A (6)có khả năng ức chế sự sản sinh melanin trong tế bào khối u

ác tính B16 mà không ức chế tyrosinase [7]

Cũng trong năm 2006, E.T Arung và cộng sự đã công bố tác dụng ứcchế sự tổng hợp melanin trong tế bào melanoma của artocapanone tinh sạch

từ A heterophyllus trong tế bào melanoma B16 [8].

Năm 2008, Z.P Zheng cùng cộng sự đã tách chiết được 14 hợp chất mới

từ chiết xuất lõi gỗ mít A heterophyllus như: artocarpfuranol (1),

dihydromorin (2), steppogenin (3), norartocarpetin (4), artocarpanone (5),artocarpesin (6), artocarpin (7), cycloartocarpin (8), cycloartocarpesin (9),artocarpetin (10), brosimone tôi (11), cudraflavone B (12), carpachromene(13), isoartocarpesin (14).Trong số đó, các hợp chất 1-6 và 14 cho thấy hoạtđộng ức chế tyrosinase nấm với với giá trịIC50 < 50 µM, mạnh hơn acid kojic

- một chất ức chế tyrosinase phổ biến (IC50= 71,6 µM) [51]

Năm 2009, Zeng ZP và cộng sự đã chứng minh được thành phần

norartocarpein và artocapesin trong cành nhỏ của cây mít A heterophyllus

có khả năng ức chế được hoạt động của enzym tyrosinase [52]

Năm 2012, N M Hashim và cộng sự đã nghiên cứu chiết xuất từ vỏ

cây mít tố nữ A obtusus và đã cô lập được ba xanthone là:

pyranocycloartobiloxanthone A - C (1), dihydroartoindonesianin (2) vàpyranocycloartobiloxanthone B (3) Các hợp chất này đã được chứng minh cóhoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn và ức chế tyrosinase Hợp chất 1 thể

hiện hoạt tính chống oxi hóa (quét gốc tự do DPPH) mạnh mẽ với giá trị IC50=

2 µg/ml so với acid ascorbic, α-tocopherol và quercetin Đồng thời hợp chất 1cũng có hoạt tính ức chế tyrosinase mạnh tương đương acid kojic và hoạt tínhkháng khuẩn [17]

Đặc biệt năm 2013, C.W Lee và các cộng sự đã chứng minh được khả

năng hấp thụ bức xạ tia cực tím từ dịch chiết gỗ cây mít A communis làmgiảm tế bào bị cháy nắng do tiếp xúc với tia cực tím mặt trời ở những conchuột không lông [24]

Đối với các loài bách bộ, tuy có nhiều nghiên cứu về thành phần hóahọc và hoạt tính sinh học của các chiết xuất bách bộ nhưng hiện trên thế giớichưa có nghiên cứu nào chứng minh tác dụng làm sáng da của chúng Nhữngnghiên cứu về các loài bách bộ chủ yếu cho thấy công dụng về khả năngkháng virus viêm gan B, diệt côn trùng gây hại, khả năng kháng khuẩn, khảnăng điều trị ung thư đa kháng thuốc, chữa ho, diệt giun, sát trùng [1]

Năm 2004, B Brem và cộng sự đã phân lập được dẫn xuất chromenol

từ S cochinchinensis và chứng minh hoạt tính chống oxy hoá (thông qua ức

chế gốc tự do DPPH) của dẫn xuất này có thể so sánh với hoạt tính của αtocopherol [11]

-Năm 2007, L.G Lin và cộng sự tại Phòng thí nghiệm nghiên cứu matúy, Học viện Khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu được khả năng kháng

khuẩn của chiết xuất củ cây bách bộ (S tuberosa) [32].

Năm 2007, P Limtrakul, và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng của chiếtxuất từ rễ cây bách bộ trong điều trị tế bào ung thư đa kháng thuốc [28]

Năm 2013, P Chaliewchalad và cộng sự cũng đã công bố kết quả

nghiên cứu tác dụng ức chế của cây bách bộ (S tuberosa) đến quá trình nhiễm

virut gây bệnh mụn rộp [13]

Gần đây nhất, năm 2014, nhóm nghiên cứu thuộc đại học Wollngong ởnước Úc gồm R.A Ramili, W Lie , S.G Pyne tìm ra bốn loại alkaloid từ rễ

của loài Stichoneuron caudatum thuộc họ bách bộ (Stemonaceae) Bốn loại

alkaloid đó là: stichoneurine F, stichoneurine G, sessilistemonamine E,sessilistemonamine F Trong đó, alkaloid loại thứ 3 có khả năng ức chếacetylcholinesterase, enzyme tham gia trong việc tái tổng hợp chất truyền tintrung gian acetylcholin ở xinap thần kinh Do đó nó có thể được dùng trongđiều chế thuốc ức chế thần kinh [39]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu khả năng làm sáng da của các chiết xuất các loài bách bộ và mít ở Việt Nam

Ở Việt Nam,có những nghiên cứu về tác dụng chữa giun sán, chữa

ho, sát trùng của dịch chiết cây bách bộ [1].Tuy nhiên, về khả năng làmsáng da của dịch chiết cây bách bộ thì hiện nay chưa có công bố nghiêncứu nào

Đối với cây mít đã có một số công trình khoa học được công bốtrong những năm gần đây

Năm 2012, Nguyễn Trung Nhân và cộng sự đã tinh sạch được bốnflavone từ dịch chiết methanol của lõi gỗ mít, trong có có nhiều chất có hoạttính ức chế tyrosinase và khả năng hấp thụ UVA, UVB đặc biệt làmorachalcone A [36]

Cũng trong năm 2012, Khoa Hóa học của trường Đại học Khoa học tựnhiên, Trường Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh mới công bố một

nghiên cứu về hoạt tính ức chế tyrosinase của chiết xuất lá mít Artocarpus

heterophyllus Phân tích các phân đoạn của dịch chiết methanol từ lá mít A heterophyllus, Nguyễn Khoa Hạ Mai và cộng sự đã cô lập được năm hợp chất

có khả năng ức chế tyrosinase, gồm có 2',3-dihydroxy-4,

4'-dimethoxychalcone, chrysophanol, emodin, physcion và acid

p-hydroxybenzoic Đây là các hợp chất được phân lập lần đầu tiên từ chi này.Kết quả cho thấy, hợp chất 5 có hoạt tính mạnh hơn cả, với giá trị IC50 đạt 9,4

µM, so với acid kojic (IC50= 44,6 µM) [3]

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

• Thực vật: Lõi gỗ mít Artocarpus heterophyllus và củ cây bách bộ

Các chủng vi sinh vật bao gồm:

- Vi khuẩn Gram (-): Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli

- Vi khuẩn Gram (+): Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,

Lactobacillus fermentum, Enterococus faecium

- Nấm Candida albicans

Tùy theo loại vi sinh vật và nấm kiểm định mà được nuôi cấy trên môitrường thích hợp:

+ Môi trường MHB, TSB cho vi khuẩn

+ Môi trường SDB cho nấm

2.1.2 Thiết bị và hóa chất

•Thiết bị nghiên cứu

Sử dụng trang thiết bị của Phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa sinh và Tế bàohọc của Khoa Sinh học, Phòng Hóa hợp chất thiên nhiên của Khoa Hóa học,trường ĐH Sư phạm Hà Nội, phòng Thử hoạt tính sinh học của Viện Hóa học

tyrosynase nấm, DPPH, L-DOPA, acid kojic, quercetin của hãng Sigma(Đức); acid gallic, acid ascorbic, DMSO và thuốc thử Folin-Ciocalteau đượcmua của hãng Merck (Đức).

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: Nghiên cứu này được thực hiện từ tháng 5/2013 đến tháng10/2014

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa sinh và Tế bào học, KhoaSinh học; phòng Hóa hợp chất thiên nhiên, Khoa Hóa học, Trường Đại học sưphạm Hà Nội và phòng Thử hoạt tính sinh học, Viện Hóa học, Viện Hàn lâmKhoa học và Công nghệ Việt Nam

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1.1.2 Phân đoạn cao tổng

Cao tổng được phân bố đều trong nước cất và tiến hành chiết phân lớplần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, ethylacetate Các phân đoạn được cất loại dung môi bằng máy cô quay chânkhông Các cao phân đoạn thu được tương ứng là n – Hexane (n-Hex),Ethyl acetate (EtoAc) và H2O Các cao phân đoạn được làm khô bằngmáy đông khô và bảo quản ở 0oC

2.3.1.2 Phương pháp khảo sát thành phần một số hợp chất thứ cấp

2.3.1.2.1 Sắc ký bản mỏng

Các mẫu có nồng độ 10 mg/ml (pha trong ethanol) được tiến hành chạysắc ký trên bản mỏng tráng sẵn silicagel 60F254 với kích thước phù hợp và vớicác hệ dung môi khác nhau để chọn ra hệ dung môi phù hợp nhất Hệ dungmôi sử dụng trong nghiên cứu là:

+ Hệ dung môi dùng cho cao phân đoạn n – Hex: n - Hexane – Ethylacetate với tỉ lệ 5:1

+ Hệ dung môi dùng cho cao phân đoạn EtoAc: ethyl acetate + 1%methanol

+ Hệ dung môi dùng cho cao phân đoạn H2O : Ethyl acetate –methanol) với tỉ lệ 4:1

Bản mỏng được kẻ 2 vạch trên và dưới tạo ra khoảng di chuyển củadung môi Nhúng ống mao quản vào dung dịch mẫu rồi chấm lên vạch kẻdưới của bản mỏng và chờ cho khô (lặp lại 3 lần) Dùng kẹp giữ sao cho bảnmỏng thẳng đứng trong cốc dung môi Chờ cho dung môi chạy đến vạch kẻtrên thì lấy bản mỏng ra khỏi dung môi Làm khô và soi bản mỏng dưới tiacực tím Phun đều chất hiện màu (dung dịch H2SO4 10%) trên mặt bản mỏngrồi sấy khô cho đến khi hiện màu Xác định hệ số lưu theo công thức:

R f = L 2 /L 1

Trong đó: Rf là hệ số lưu

L1 là khoảng di chuyển của dung môi

L2 là khoảng cách di chuyển của chất nghiên cứu

Thành phần trong hỗn hợp được xác định nhờ so sánh hệ số lưu củahỗn hợp (Rf) và hệ số lưu của một số hợp chất đã biết

2.3.1.2.2 Xác định hàm lượng phenol tổng số theo phương pháp Ciocalteau

Folin-Hàm lượng phenol tổng số được xác định theo phương pháp củaWaterhouse (2002), bằng cách sử dụng thuốc thử Folin – Ciocalteau và chấtchuẩn là acid gallic [44] Thuốc thử Folin – Ciocalteau có phức hợp phospho –

wolfram – phosphomolybdate Phức hợp này bị khử bởi các hợp chất phenoltạo thành sản phẩm phản ứng có màu xanh dương, hấp thụ cực đại ở bước sóng765nm Hàm lượng phenol có trong mẫu tỉ lệ thuận với cường độ màu.

Chuẩn bị dãy dung dịch acid gallic chuẩn pha trong ethanol Acidgallic được pha theo dãy nồng độ 0 ; 0,05 ; 0,1 ; 0,2 ; 0,5 mg/ml Trộn 10

µl chất chuẩn hoặc mẫu với 50µl thuốc thử Folin – Ciocalteau và 790 µl

H2O, lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Sau đó thêm 150µl

Na2CO3 10%, lắc đều rồi ủ trong 1 giờ 30 phút trong tối Đo độ hấp thụquang của dung dịch phản ứng bằng máy quang phổ ở bước sóng 765nm

Từ kết quả đo hấp thụ quang của chất chuẩn, vẽ đồ thị đường chuẩn(standard curve) và xác định hàm tương quan dạng: y = ax + b Từ đồ thịđường chuẩn và giá trị độ hấp thụ quang của mẫu tính được nồng độ phenol.Khi đó, hàm lượng phenol tổng số được tính bằng công thức:

P (mg GAE/ g mẫu) = C.V/m

Trong đó: P là hàm lượng phenol tổng số

C là nồng độ phenol trong dịch chiết

m là khối lượng cao chiết sử dụng để pha dịch chiết

V là thể tích dịch chiết

2.3.1.2.3 Xác định hàm lượng flavonoid tổng số

Hàm lượng flavonoid tổng số được xác định theo phương pháp củaSapkota và cộng sự (2010) dựa trên sự hình thành phức hợp Al – flavonoid[51] Độ hấp thụ quang được đo ở bước sóng 415 nm Quercetin được dùnglàm chất chuẩn

Mẫu và chất chuẩn được pha trong dung dịch ethanol 80% Dung dịchquercetin chuẩn được pha với dãy nồng độ: 0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 mg/ml Trộn

100 µl chất chuẩn hoặc mẫu với 20 µl Al(NO3)3 10%, 20 µl K – acetate 1M và

860 µl ethanol 80% Lắc đều rồi ủ trong 40 phút và đo ở máy quang phổ với

bước sóng 415 nm Từ đồ thị chất chuẩn, tính toán hàm lượng flavonoid tổng

số của các mẫu nghiên cứu tương tự như hàm lượng phenol tổng số

2.3.1.3 Phương pháp thử một số hoạt tính sinh học

2.3.1.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa (hoạt tính quét gốc tự do DPPH)

Hoạt tính quét gốc tự do DPPH được được tiến hành theo phương phápcủa Blois [11] Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa sẽ khử DPPHlàm mất màu tím của nó Được xác định bằng cách đo độ hấp thụ quang ởbước sóng λ = 517 nm

Hỗn hợp phản ứng bao gồm 20 µl dung dịch ở các nồng độ 2; 1; 0,5;0,1; 0,05 mg/ml và 180 µl dung dịch DPPH 0,3 mM Đối chứng được chuẩn

bị tương tự mẫu thử nhưng thay 20 µl mẫu bằng 20 µl ethanol Acid ascorbicđược dùng làm chất chuẩn với dãy nồng độ 0,5; 0,1; 0,05; 0,01; 0,005 mg/ml.Đĩa 96 giếng được ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút Mỗi nồng độ được đolặp lại 3 lần để lấy giá trị trung bình Hoạt tính quét gốc tự do DPPH đượctính theo công thức:

SA DPPH (%) = [(AĐC – ATN)/AĐC] x 100

Trong đó: SA DPPH (%) là % loại bỏ gốc tự do DPPH

AĐC là mật độ quang của đối chứng

ATN là độ hấp thụ quang của mẫu thử

Sau đó tính giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%) của mẫu thông qua đồ thị

và phương trình logarithm của khả năng ức chế theo nồng độ mẫu thử

trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, minimal inhibitory concentration) bằng mắtthường Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ứcchế hoàn toàn sự sinh trưởng của vi sinh vật Giá trị IC50 được tính toán dựatrên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ Genios Tecan và phần mềmRaw data.

Sử dụng các chất đối chứng sau:

- Kháng sinh Ampicillin cho các chủng vi khuẩn Gram (+) và chủng

khuẩn Gram (-) Escherichia coli với giá trị IC50 trong khoảng 0,05 – 2 µg/ml

- Hỗn hợp kháng sinh Pen/Strep (penicillin/streptomycin) cho chủng vi

khuẩn Pseudomonas aeruginosa với giá trị IC50 trong khoảng 4 – 5 µg/ml

- Amphotericin B cho nấm với giá trị IC50 trong khoảng 0,5 – 1 µg/ml

2.3.1.4 Phương pháp phân tích khả năng làm sáng da

2.3.1.4.1 Khả năng hấp thụ tia cực tím UVA và UVB

Khả năng hấp thụ tia cực tím UVA và UVB của các mẫu nghiên cứuđược tiến hành theo phương pháp của Wei và cộng sự [45]

Acid kojic và quercetin được chọn làm chất đối chứng dương Acidkojic, quercetin và các cao phân đoạn bách bộ và chất sạch lõi gỗ cây mítđược hòa tan trong dung dịch methanol và nước với tỷ lệ 1:4 để được nồng độ0,1 mg/ml Độ hấp thu quang của các dung dịch được đo ở các bước sóng UV

từ 280 đến 400 nm trên máy quang phổ UV-Vis

2.3.1.4.2 Xác định hoạt tính ức chế tyrosinase in vitro

Hoạt tính ức chế sinh tổng hợp melanin được tiến hành theo phươngpháp thử hoạt tính ức chế tyrosinase của Yagi và cộng sự [47] trong đó có sửdụng L-DOPA làm cơ chất

Hỗn hợp phản ứng (200µl) gồm: 100 µl dung dịch mẫu (ở các nồng độ

1, 5, 20, 100, 500 và 2000 µg/ml ); 20 µl dung dịch đệm phosphate pH 6,8; 40

µl L-DOPA và 40 µl tyrosinase Dung dịch mẫu, L-DOPA và enzyme được

pha bằng dung dịch đệm phosphate pH 6,8 Độ hấp thụ của lượngdopachrome tạo thành được đo ở bước sóng 475 nm sau 2 phút Acid kojicđược sử dụng làm chất chuẩn Hoạt tính ức chế tyrosinase của mẫu được tínhtheo công thức:

Hoạt tính ức chế tyrosinase (% ức chế) = [(AĐC – ATN)/AĐC] x 100

Trong đó: AĐC là giá trị độ hấp thụ quang của đối chứng (không có mẫuhay chất chuẩn); ATN là giá trị độ hấp thụ quang của mẫu và chất chuẩn

Từ đó tính toán nồng độ ức chế 50% (IC50) tương tự như đối với hoạttính quét gốc tự do DPPH

2.3.1.4.3 Phương pháp đánh giá sự ức chế sinh trưởng dòng tế bào

nm và tính toán phần trăm tế bào sống

2.3.1.4.4.Xác định khả năng làm sáng da trên mô hình động vật thực nghiệm

Chuột được nuôi ổn định trong khoảng 1 tuần với thức ăn do ViệnDịch tễ Trung ương cung cấp ở điều kiện phòng thí nghiệm của Bộ môn Hóasinh và Tế bào học trước khi tiến hành thí nghiệm.

Hai mươi con chuột chủng Swiss đồng đều về độ tuổi và cân nặng đượcchia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô gồm 5 con Trong đó:

- Lô 1: Lô đối chứng âm

- Lô 2: Lô đối chứng dương (acid kojic)

- Lô 3: Lô n-Hexane (cao phân đoạn n-Hexane của lõi gỗ mít)

- Lô 4: Lô Ethyl acetate (cao phân đoạn Ethyl acetate của lõi gỗ mít)Tất cả các con chuột ở các lô được cạo sạch lông ở phần lưng và đượcđánh dấu bằng ký hiệu riêng để phân biệt với nhau Hỗn hợp để bôi lên dachuột được pha trộn theo công thức: 10 mg mẫu thử + 0,5 g vaseline Lôchuột dối chứng âm chỉ được bôi vaseline

Sau khi bôi hỗn hợp đã được trộn theo công thức lên da chuột, chờkhoảng 30 phút để hỗn hợp này thấm vào da chuột Dùng đèn UV (8W) vớibước sóng 302 nm chiếu vào 4 lô chuột trong 15 phút Lặp lại thao tác này 5lần, mỗi lần cách nhau 2 ngày

Sau đó, tiến hành mổ chuột để toàn bộ mẫu da (phần cạo lông) Cácmẫu da được ủ trong dung dịch NaBr 2M ở 37oC trong 2h Sau đó ngâm cácmiếng da với 5ml PBS trong 30 phút Tách lớp biểu bì khỏi lớp hạ bì rồi ủtrong 0,1% L-DOPA (pha trong PBS) ở 37oC trong 3h Tiếp theo cố định cácmiếng biểu bì trong 10% formalin (pha trong PBS) ở 4oC trong 30 phút Rửacác miếng biểu bì với PBS Cuối cùng quan sát các sự tích lũy melanin ở các

tế bào da trong các mẫu ở độ phóng đại x 5000 [46]

2.3.2 Phương pháp xử lý thống kê số liệu

* Lập bảng thống kê số liệu theo các chỉ số đã nghiên cứu