các cơ chế điều hòa biểu hiện gen ở tế bào Prokaryote

4 Điều hòa biểu hiện gene Gene Sự biểu hiện và hoạt động của gene Các quá trình điều hòa RNA Protein... 7 Tóm tắt điều hòa phiên mã ở Prokaryote • Genome: DNA dạng vòng, trần không

1

Các cơ chế điều hòa biểu hiện

gene ở tế bào Prokaryote

Chương 2

• Điều hoà biểu hiện gene &

• Điều hoà dịch mã

Câu hỏi

•  Gene là gì?

•  Tại sao một gene lại được biểu hiện?

•  Khi nào gene được biểu hiện?

•  Gene được biểu hiện ở mức độ nào?

•  Tế bào kiểm soát sự biểu hiện?

•  Tại sao những tế bào khác nhau lại có mô hình biểu hiện gene khác nhau?

•  Tại sao một gene được biểu hiện ở tế bào này

mà không phải tế bào khác?

4

Điều hòa biểu hiện gene

Gene

Sự biểu hiện và hoạt động của gene

Các quá trình điều hòa

RNA Protein

5

Các quá trình điều hòa

3. Tốc độ phân rã của mRNA

của môi trường

• Điều hoà dương tính: hoạt hoá hoạt động của gen

• Điều hoà âm tính: ức chế/ kìm hãm hoạt động của gen

• Sự tự điều hoà: protein tự điều hoà quá trình phiên mã

7

Tóm tắt điều hòa phiên mã ở Prokaryote

•  Genome: DNA dạng vòng, trần không chứa protein histon à không hình thành cấu trúc NST

•  Các gene thường tập trung thành cụm và chịu sự kiểm soát bởi

operon (VD: các gene liên quan đến quá trình tổng hợp 1 amino acid nhất định)

•  RNA thường là polycistronic: nhiều protein được mã bởi 1 bản

•  Dạng mô hình phụ thuộc vào operon tạo ra các sản phẩm gene cần thiết cho việc sử

dụng năng lượng, còn gọi là các operon điều hòa trao đổi chất (VD: lac operon)

•  Dạng mô hình điều hòa liên quan đến tạo ra các sản phẩm cần thiết cho tổng hợp các phân tử nhỏ (amino acid) Sự biểu hiện gene ở dạng này bị giảm (attennuated) bởi các

trinh tư có mặt trong phân tử RNA được phiên mã (VD: tryp operon)

Tóm tắt điều hòa phiên mã ở Prokaryote

9

10

11

MÔ HÌNH ĐIỀU HOÀ CẢM ỨNG

(Lac OPERON)

•  Operon là một nhóm các

gene được phiên mã

cùng một thời điểm

•  Operon thường điều

khiển quá trình hoá sinh

•   Operon Vi khuẩn

•  Gene cấu trúc: mã hoá cho các gene từ một mRNA (Polycistronic)

•  Promoter – nơi RNA polymerase bám vào

•  Operator – cạnh vùng promoter, nơi các protein điều hoà

bám vào

•  A repressor (~proteins) bám vào một trình tự DNA nhất định

để xác định vị trí gene cụ thể được hay không được phiên

mã

•  Gene điều hoà mã hoá cho các repressor protein

• Operon được phiên mã thành polycistronic mRNA

• Ba yếu tố chính tham gia điều hoà số lượng RNA được tạo ra:

ü  Trình tự nucleotide nằm bên trong hoặc bên ngoài gene ü  Proteins bám vào các trình tự trên

ü  Môi trường

•  E coli sử dụng:

ü  Đường đơn (monosaccharide): glucose

ü  Đường đôi (disaccharide): lactose

•  Tuy nhiên, lactose cần được thuỷ phân trước khi sử

dụng

•  Do đó, vi khuẩn lựa chọn sử dụng glucose khi nó có thể

E.Coli thích ứng với môi trường

16

lac Operon

•  Lac operon chứa 3 gene: lac z, lac y, và lac a

•  β-galactosidase được mã hoá bởi gene lac z

•  β-galactosidase thuỷ phân lactose thành

Cơ chế Lactose trong E coli

•  Lactose là nguồn carbon

thứ cấp

•  Lactose được thuỷ phân

thành monosaccharide

Phản ứng thuỷ phân lactose bởi

β-Galactosidase

1.  Khi có mặt Glucose và không có mặt Lactose

trong E.coli thì E.coli không tạo ra

β-galactosidase

2.  Khi có mặt Glucose và có mặt Lactose trong

E coli thì E.coli không tạo ra β-galactosidase

3.  Khi không có Glucose và không có mặt

Lactose trong E.coli thì E.coli không sản xuất β-galactosidase

4.  Khi không có mặt glucose và có mặt Lactose

trong E.coli thì E.coli sản xuất β-galactosidase

Điều hoà bởi lac operon

Khi có mặt Lacotose

•  Một lượng nhỏ đường allolactose được tạo ra trong tế bào

vi khuẩn; gắn vào vị trí repressor protein ở vị trí hoạt hoá khác (vị trí allosteric)

•  Điều này làm cho repressor protein thay đổi hình dạng của

nó (thay đổi cấu hình) Nó sẽ định vị trên vùng operator RNA polymerase có thể bám vào vị trí promoter

• z • y • a

•  DNA

Khi có mặt Lacotose

•  Một lượng nhỏ đường allolactose được tạo ra trong tế bào

vi khuẩn; gắn vào vị trí repressor protein ở vị trí hoạt hoá khác (vị trí allosteric)

•  Điều này làm cho repressor protein thay đổi hình dạng của

nó (thay đổi cấu hình) Nó sẽ định vị trên vùng operator RNA polymerase có thể bám vào vị trí promoter

• Promotor site

• z • y • a

•  DN

•  Thì RNA polymerase có thể định vị trên vị trí

promoter nhưng nó không thể bền vững và bị rời ra

• Promotor site

• z • y • a

• Repressor protein removed

• RNA polymerase

•   Khi có mặt Glucose và Lactose

Glucose vắng mặt và Lactose có mặt

•  Cần một protein khác, gọi là activator protein; để ổn định RNA polymerase

•  Activator protein CHỈ hoạt động khi vắng mặt Glucose

•  E coli CHỈ tạo ra enzyme để chuyển hoá các đường

khác trong khi vắng mặt đường glucose

Ảnh hưởng kết hợp Glucose và Lactose trên lac Operon

•   Lactose thấp, repressor bám vào: ức chế

•   Lactose cao, repressor ức chế nhưng vẫn cho phiên mã

•   Glucose cao, CRP không bám vào phiên mã bị giảm

•   Glucose thấp, cAMP cao và CRP ràng buộc: hoạt hoá

• cAMP receptor protein (CRP) là một protein điều hoà dương của lac operon

•   cAMP: cyclic adenosine monophosphate

Carbohydrates Activator

protein

Repressor protein

RNA polymerase

lac Operon

+ GLUCOSE

+ LACTOSE

Không bám vào DNA

Rời khỏi vị

trí operator

Rời khỏi vị trí promoter

Bám vào vị trí operator

Bị khoá bởi repressor

Bị khoá bởi repressor

Rời khỏi vị trí operator

Bám vào vị trí promoter

Phiên mã

•   TÓM TẮT

Lac operon

29

Hiện tượng ức chế trao đổi chất

(catabolite repressor)

•  Glucose + lactose à lac operon không hoạt động ?

•  Glucose giảm à cAMP tăng

•  cAMP + CRP (cAMP recepter protein) à phức

Vai trò của cAMP

32

Ứng dụng của lac operon trong thực tiễn

1.  lac promoter (đỏ),

2.  lac operator (xanh)

3.  gene mã hóa cho T7 RNA polymerase (hồng)

4.  lac inducer (xanh)

5.  Genome tế bào chủ (đen)

34

pET vector

•  Gene kháng kháng sinh (amp R )

•  Gene lacI (xanh đậm)

•  T7 transcription promoter (đỏ)

•  Vùng lac operator (xanh nhạt) ở đầu 3’

của PT7

•  Vùng polylinker (đen)

•  2 điểm khởi đầu sao chép: f1 origin và

điểm khởi đầu sao chép truyền thống

35

Điều hòa biểu hiện gene

pET vector

•  Khắc phục với các protein “toxic” đối với tế bào

•  Một gene mã hóa cho lysozyme sẽ phân giải lượng T7 pol (basal level)

37

IPTG vs lactose ?

•  Lactose bị trao đổi (phân giải bởi tế bào) Tế bào sẽ sử dụng hết dẫn đến hiệu quả cảm ứng giảm dần

•  IPTG cảm ứng tương tự, nhưng không bị chuyển hóa

(không bị phân giải bởi enzyme), vì vậy nồng độ chất

cảm ứng không thay đổi trong suốt quá trình tổng hợp protein

38

MÔ HÌNH ĐIỀU HOÀ KÌM HÃM

(Trp OPERON)

Tryptophan Operon trong E coli :

Ức chế và suy giảm

ức chế của quá trình phiên mã đầu tiên và bị suy giảm (trước khi kết thúc) phiên mã khi trytophan phổ biến trong môi

trường

• Điều khiển tổng hợp các enzyme cho việc tổng hợp tryptophan

•   TrpR: Repressor gene

•   Phiên mã từ TrpL tới TrpA

•   Phiên mã từ TrpC tới TrpA

•   t và t ’ : trình tự kết thúc phiên mã

•   O: vùng operator

•   P1 và P2: vùng promoter

trp Operon

• Trp Operon luôn luôn ON

• TrpR gene cũng ON: tạo các protein repressor bất

hoạt

• Khi tế bào không tổng hợp đủ protein (ví dụ, nghèo dinh dưỡng)

• có cần thiết để tiếp tục tổng hợp trp không?

Khi nồng độ Tryptophan thấp, phiên mã thông qua phiên mã trp Operon

Khi nồng độ Tryptophan cao vừa đủ, phiên mã dừng lại ở trình tự kìm hãm

(suy giảm)

•  E coli trp operon là một hệ thống kìm hãm âm

tính (negative)

•  Sự phiên mã của 5 gene cấu trúc trong vùng trp operon bị kìm hãm bởi sự có mặt ở một nồng độ nhất định của tryptophan

• KHÔNG có typtophan (hoặc nồng độ thấp): Operon

phiên mã

• CÓ typtophan: Operon bị ức chế

•   TÓM TẮT

• Polypeptide subunits that make up

enzymes for tryptophan synthesis

• (a) Tryptophan absent, repressor inactive, operon on

• (b) Tryptophan present, repressor active, operon off

49

Điều hòa “ Attenuation ” của trp operon

51

1 Lac operon được biểu hiện khi

A.  Lượng glucose cao và có mặt lactose

B.  Lượng glucose cao và vắng mặt lactose

C.  Lượng glucose thấp và có mặt lactose

D.  Lượng glucose thấp và vắng mặt lactose

E.  Lượng glucose thấp, bất chấp lactose có mặt hay không

2 Trong phức hợp với ……… CAP protein sẽ bám vào vị trí gắn nằm trong

vùng operon và sự biểu hiện của lac operon sẽ được…

5 Khi vắng mặt lactose, lac repressor sẽ:

A.  Hoạt hóa và gắn với operator

B.  Hoạt hóa và không gắn với operator

C.  Bất hoạt và không gắn với promoter

D.  Bất hoạt và có thể gắn với operator

E.  Bất hoạt và không thể gắn với operator

53

•   Cấu trúc chromatin (Chromatin structure): histone, CpG methylation à

khả năng tiếp cận của RNA pol & TFs với gene

thay đổi gene)

Eukaryote với sự tham gia của rất nhiều yếu tố

modification): cap, poly adenine hóa, alternative splicing, đặc hiệu mô (tissue specific)

Điều hòa biểu hiện Eukaryote

56

mRNA, sự bền vững, cấu trúc chromatin)

acylation, disulfide bond formations,

amino acid trong chuỗi à tính bền vững

Điều hòa biểu hiện Eukaryote

57

Nhiễm sắc chất (chromatin)

và sự điều hòa biểu hiện gene

•  Cấu trúc chromatin có 2 dạng (nhuộm màu): dị nhiễm sắc

(heterochromatin) và nhiễm sắc (euchromatin)

•  Heterochromatin xoắn chặt hơn euchromatin, thường nằm gần tâm động

•  Heterochromatin thường không được phiên mã, euchromatin xoắn lỏng

lẻo, thường diễn ra quá trình phiên mã

•  Kỹ thuật tế bào học à phát hiện vùng hoạt động của NST à Cấu trúc

chromatin liên quan đến hoạt động gene

•  Các cơ chế: Methyl hóa các gốc cytidine trong DNA (> 90% tồn tại ở cặp

CG hay CpG), trình tự promoter thường giàu CpGs từ 10 đến 20 lần so với phần còn lại của genome

59

A.  Di chuyển của gene ADE2 gần

telomer à không biểu hiên à sắc tố

đỏ

Trong một colony xuất hiện một số có sắc tố trắng do ADE2 được hoạt hóa một cách ngẫu nhiên

B.  Dạng wildtype có mắt đỏ, dạng đột biến mắt trắng Hiện tượng này là do vận chuyển một phần NST vùng

heterochromatin

62

Tháo xoắn và phiên mã

•  Gene mã hóa cho β-globin ở người và gà Gene này gồm 5 cluster, trải rộng khắp 50,000 nucleotide, được phiên mã duy nhất ở các tế bào máu Mỗi gene được “bật” ở những giai đoạn phát triển khác nhau và ở những cơ quan khác nhau

•  Một loạt các protein điều hòa cần thiết cho việc “bật” các gene này phải có mặt đúng cả không gian và thời gian Toàn bộ cụm gene được điều khiển

“ bật hoặc tắt” liên quan đến sự hoạt hóa của chromatin

•  Bằng chứng: Kiểm tra độ mẫn cảm của các gene globin với DNase I Ở các tế bào gene globin không được biểu hiện, DNA trong những gene này hoàn toàn kháng với DNase I à chứng tỏ chúng được bao bọc rất chặt trong cấu trúc chromatin Đối với những tế bào biểu hiện globin, toàn bộ cụm gene này trở lên rất nhạy cảm với DNase I

63

A.  2 giai đoạn hoạt hóa cụm gene globin Giai đoạn 1: cấu trúc chromatin bị cải biến, giảm mức

độ xoắn ! lỏng lẻo hơn

B Giai đoạn 2: các protein điều hòa có mặt gắn vào những

vị trí đã được cải biến

65

Chức năng của vùng điều khiển locus và sự hoạt hóa chromatin

66

Liên hệ giữa Methyl hóa DNA

và cấu trúc chromatin

•  Các protein tham gia vào quá trình phiên mã gắn với các vùng

CpGs đã được methyl hóa

•  MeCP2 (methyl CP binding protein 2) Khi MeCP2 gắn với CpG đã được methyl hóa dẫn đến ức chế phiên mã

•  Khi MeCP2 bị phoshoril hóa nó gắn với DNA với ái lực thấp (lỏng lẻo) Khả năng gắn của MeCP2 với DNA phụ thuộc vào trạng thái phosphoril hóa của nó Khi MeCP2 bị phosphoril hóa à hoạt hóa cấu trúc chromatin à phiên mã diễn ra

•  Thiếu protein MeCP2 dẫn đến hội chứng Rett syndrome

67

Rett syndrome thường gặp ở nữ

68

Cải biến protein histon

Sự cải biến protein histon bao gồm

•  methylation

•  acetylation,

•  phosphorylation

69

Cải biến histon

•  Acetyl hóa histon thường gặp ở các cấu trúc chromatin đang hoạt động (active) và phiên mã thường xuyên xảy

ra trong những vùng histon được acetyl hóa

•  Ngược lại, các histon không được acetyl hóa thường

gắn với những vùng heterochromatin và hoạt động phiên

mã không xảy ra

70

Cải biến histon

•  Phosphoril hóa xảy ra trước tiên trong đáp ứng các tín hiệu

bên ngoài: các yếu tố kích thích sinh trưởng, sốc nhiệt, stress

•  Tầm quan trọng của phosphoril hóa histon trong kiểm soát

hoạt động gene thể hiện rõ ở hội chứng Coffin-Lowry

•  Bệnh do sai hỏng gene RSK2 mã hóa cho enzyme phosphoril hóa histone Coffin-Lowry hội chứng là một dạng chậm phát triển trí tuệ liên kết với NST X: giảm khả năng nghe, chậm

phát triển, nhận thức chậm và chủ yếu ảnh hưởng đối với nam giới

75

Tháo xoắn và phiên mã

•  Gene mã hóa cho β-globin ở người và gà Gene này gồm 5 cluster, trải rộng khắp 50,000 nucleotide, được phiên mã duy nhất ở các tế bào máu Mỗi gene được “bật”

ở những giai đoạn phát triển khác nhau và ở những cơ quan khác nhau

•  Một loạt các protein điều hòa cần thiết cho việc “bật” các gene này phải có mặt đúng

cả không gian và thời gian Toàn bộ cụm gene được điều khiển “bật hoặc tắt” liên quan đến sự hoạt hóa của chromatin

•  Bằng chứng: Kiểm tra độ mẫn cảm của các gene globin với DNase I Ở các tế bào gene globin không được biểu hiện, DNA trong những gene này hoàn toàn kháng với DNase I à chứng tỏ chúng được bao bọc rất chặt trong cấu trúc chromatin Đối với những tế bào biểu hiện globin, toàn bộ cụm gene này trở lên rất nhạy cảm với DNase

I

78

Chức năng của vùng điều khiển locus và sự hoạt hóa chromatin

79

Tài liệu tham khảo