Sản xuất Glucoamylase và pectinase từ Aspergillus niger:Nấm mốc Aspergillus niger được giữ giống trên môi trường Czapekdox.Thành phần môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme glucoamylase gồm: cám gạo 70%, bã sắn 5%, acid oleic 3%, nước cất và thành phần khoáng Czapek tạo độ ẩm 50%. Nuôi cấy trong 54 h ở nhiệt độ phòng 3.Thành phần môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme pectinase gồm: cám gạo 65,5%, trấu 21,5%, bột cà rốt 11%, (NH4)2SO4 2%, độ ẩm 55%. Nuôi cấy trong 48h ở nhiệt độ phòng 1.Hòa tan môi trường qua nuôi trong nước cất hoặc dung dịch đệm thích hợp (VD. nước cất), tỉ lệ nước và môi trường là 3:1. Chiết lấy dịch lỏng qua vải lọc. Ly tâm dịch qua lọc 4000 vòngphút trong 10 phút. Thu dịch sau ly tâm ta được enzyme ở dạng hòa tan.
VI SINH THỰC PHẨM Food microbiology Chapter 3: Các chế điều hòa trao đổi chất vi sinh vật (Điều hòa sinh tổng hợp enzyme) NGUỒN ENZYME Enzyme từ vi sinh vật • • • Amylase, protease: Aspergillus oryzae KC, A oryzae 1476, Bacillus subtilis, … Pectinase: A awamori, Renin (chymosin): Renin từ VSV bền nhiệt (khó bất hoạt hơn), hương vị hiệu suất đông Thể chủ: Aspergillus oryzae, Kluyveromyces lactis (TLTK: Công nghệ SX enzyme, protein ứng dụng GS.TS Nguyễn Thị Hiền NXB GDVN, 2012.) Nguyên tắc tuyển chọn vi sinh vật Ở đâu có chất có VSV phân giải chất • Tự nhiên: có ưu điểm hệ gen ổn định Nhược điểm suất sinh học không cao, chưa thích nghi sản xuất quy mô công nghiệp • Ngân hàng giống vi sinh vật (Trung tâm giữ giống) Mục đích Lựa chọn phân lập chủng có hoạt lực cao việc tạo thành enzyme mong muốn • Nấm mốc trở thành nguồn vi sinh vật chủ yếu dùng sản xuất enzyme Sàng tuyển enzyme Giai đoạn 1: • • • • Tìm ý tưởng Xác định cần thiết ưu thương mại Đánh giá mức độ tiếp nhận thị trường Đầu tư nghiên cứu Giai đoạn 2: • • Xác định tính chất enzyme: nhiệt độ, pH cho suất tối ưu, độ ổn định, số động học, khả bị ức chế Cải tiến QTCN lên men sản xuất enzyme Lên men Tách chiết Cô đặc Loại tế bào Tách chiết Tinh Hoàn thiện QTCN lên men sản xuất enzyme • • • • Tổng hợp enzyme Thu nhận Tinh Tạo chế phẩm Glucoamylase pectinase từ Aspergillus niger • • Nấm mốc Aspergillus niger giữ giống môi trường Czapek-dox Thành phần môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme glucoamylase gồm: cám gạo 70%, trấu 22%, bã sắn 5%, acid oleic 3%, nước cất thành phần khoáng Czapek-dox tạo độ ẩm 50% Nuôi cấy 54h nhiệt độ phòng [3] • Thành phần môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme pectinase gồm: cám gạo 65,5%, trấu 21,5%, bột cà rốt 11%, (NH4)2SO4 2%, độ ẩm 55% Nuôi cấy 48h nhiệt độ phòng [1] • Hòa tan môi trường qua nuôi nước cất dung dịch đệm thích hợp (VD nước cất), tỉ lệ nước cất môi trường 3:1 Chiết lấy dịch lỏng qua vải lọc Ly tâm dịch qua lọc 4000 vòng/phút 10 phút Thu dịch sau ly tâm ta enzyme dạng hòa tan β-GALACTOSIDASE từ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS Thu sinh khối thu enzyme beta-galactosidase thô • Giống VK hoạt hóa môi trường MRS lỏng nuôi môi trường cảm ứng sinh beta-galactosidase gồm: lactose (10 g/l), cao nấm men (60 g/l), cao thịt (10 g/l), Tween 80 (6 g/l), K2HPO4 (3 g/l), KH2PO4 (1 g/l), CH3COONa (3 g/l), MgSO4.7H2O (0,5 g/l), MnSO4(0,15 g/l) • Quá trình lên men thựcc erlen 500 ml, 37oC, pH 6,0, tốc độ lắc 100 vòng/phút 50 • Kết thúc trình lên men, ly tâm canh trường 5000 vòng/phút 15 phút, 4oC thu nhận sinh khối β-GALACTOSIDASE từ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS Thu sinh khối thu enzyme beta-galactosidase thô • Rửa sinh khối hai lần dung dịch đệm sodium phosphate 0,05M, pH 7,0 Bảo quản sinh khối -20oC • Beta-galactosidase thu nhận cách phá vỡ tê bào vi khuẩn phương pháp xử lý sóng siêu âm dịch huyền phù vi sinh vật 5% w/v đệm sodium phosphate pH 7,0, công suất siêu âm 396kW, thời gian siêu âm 3,2 phút Dịch huyền phù sau xử lý sóng siêu âm đem ly tâm 6000 vòng/phút, 4oC, 15 phút, để thu dịch enzyme thô Quy trình phân lập giống tự nhiên: Thu mẫu Hòa loãng Cấy lên môi trường Nuôi Thuần khiết Kiểm tra Khi hòa loãng vsv dễ chết nước cất nước muối sinh lý dùng dung dịch pepton 0,1% Đối với vsv yếm khi nuôi phải cho thêm chất khử, gắn paraffin nuôi môi trường oxy Click to edit Master text styles Second level Third level Fourth level Fifth level 2.2 Thu nhận từ trung tâm giữ giống + Mỹ: ABBOTT, ATCC, NRRL… + Canada: CANAD - 212 + Nhật: FERM, HIR… + Úc: CC + Trung Quốc: IMASP + Việt Nam: Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật Việt Nam (Vietnam Type Culture Collection hay gọi tắt VTCC) 3.Cải tạo giống vi sinh vật *Ưu điểm: + Cho suất cao + Thời gian lên men ngắn tạo bọt lên men + Ít tạo sản phẩm phụ trình lên men + tạo đựoc nhiều sản phẩm quý mà chủng khác insulin, kháng nguyên Hbs (chống viêm gan B) + Khả chống chịu với điều kiện bất lợi môi trường cao 3.Cải tạo giống vi sinh vật *Nhược điểm: -Yêu cầu kỹ thuật cao - Trong trình sản xuất xuất hiện tượng hồi biến * Phương pháp tạo giống + Đột biến nhân tạo + Tái tổ hợp gen: Biến nạp, tiếp hợp, tải nạp + Lựa chọn thường xuyên Giữ giống vi sinh vật *Ý nghĩa: Giữ đặc tính quý (không bị thoái hóa) vi sinh vật bảo đảm cung cấp giống cho trình sản xuất *Nhiệm vụ việc giữ giống: Sử dụng kỹ thuật cần thiết để giữ cho vsv có tỷ lệ sống cao, đặc tính di truyền không bị biến đổi không bị tạp nhiễm * Các phương pháp giữ giống: + Bảo quản môi trường thạch nghiêng định kỳ cấy chuyển: Bảo quản tủ lạnh với hiệt độ – C, thời gian tối đa tháng Ưu điểm: Đơn giản sử dụng phổ biến Nhược điểm: Thời gian bảo quản ngắn, tính chất chủng dễ bị thay đổi qua lần cấy chuyển + Giữ giống cát đất sét vô trùng Đất cát xử lý để đạt đến độ mịn vô trung tuyệt đối, sau trộn với vi sinh vật đem bảo quan không gian kín Ngoài cát đất sét người ta sử dụng hạt ngũ cốc silicagen Phương pháp bảo quản giống chủ yếu áp dụn cho vsv sinh bào tử nấm mốc xạ khuẩn +Giữ gống phương pháp lạnh đông Nguyên tắc: Ức chế phát triển vi sinh vật điều kiện lạnh sâu (-25 750C) Các chất bảo quản: Glyxerin 15% Huyết ngựa Dung dich glucoza lactoza 10% Quá trình làm lạnh từ từ: 1-2 C/phút Thời gian cấy chuyển định kỳ: 0 T = -15 đến -20 C: tháng/lần T0 = -30 C : tháng/lần T0 = -40 C: 12 tháng/lần T0 = -50 C: 36 tháng/lần T0 = -70 C: 120 tháng/lần Phương pháp náy đạt hiệu cao sử dụng phổ biến + Giữ giống phương pháp lạnh khô: Các chất bảo vệ: Glutamate: 3% Lactoza: 1,2% + pepton 1,2% Saccharoza 8% + 5% sữa + 1,5% gelatin Đây phương pháp giữ giống tối ưu nhất, giữ giống qua hàng chục năm với tỷ lện sống cao, không bị biến tính chiếm diện tích bảo quản + Giữ giống ngân hàng gen Nhân giống vi sinh vật Trường hờp tế bào sinh dưỡng: Cần phải tạo môi trường thích hợp để tăng số lượng tế bào thời gian ngắn Người ta thương nhân giống môi trường dịch thể (nuôi cấy chìm) Trường hợp bào tử (đối với xạ khuẩn nấm môc): Thường nhân giống môi trường bán rắn thu bào tử máy hút bụi chổi quét, sau bảo quản nơi sạch, mát… * Giai đoạn phòng thí nghiệm Đây giai đoạn hoạt hóa giống Cấy chuyển sang ống môi trường dinh dưỡng vô trùng nuôi chúng điều kiện phòng thí nghiệm Giai đoạn xưởng Giống cấy chuyển số lần từ môi trường sang môi trường nhiều (nhân giống cấp 1, 2, 3…) kết trình nhân giống phải thu tỷ lệ giống giao đọng từ 1-10% so với thể tích môi trường dinh dưỡng Chú ý: Kết thúc khâu nhânh giống cần phải kiểm tra chất lượng, số lượng giống trước cấy vào nồi lên men + Nhân giống sản xuất Sơ đồ nuôi cấy giống 1.Thùng gây men 150 l cấp chứa 100 l dịch; 2.Thùng đường hóa thêm xử lý dich đường; Hai thùng gây men cấp II có dung tích dung tích thùng đường hóa thêm 10% so với thùng lên men [...]...GIỐNG VI SINH VẬT 1.Yêu cầu về giống vi sinh vật trong CNLM + Cho năng suất cao, chất lượng tốt, ít sản phẩm phụ không mong muốn + Sử dụng nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền + Thời gian lên men ngắn + Dễ tách sinh khối hay sản phẩm sau khi lên men + Vi sinh vật phải thuần chủng, không chứa vi sinh vật lạ, đặc biệt là không chứa bacteriophage ký sinh + Chủng vi sinh vật phải khỏe, phát triển... giống vi sinh vật *Nhược điểm: -Yêu cầu kỹ thuật cao - Trong quá trình sản xuất có thể xuất hiện hiện tượng hồi biến * Phương pháp tạo giống mới + Đột biến nhân tạo + Tái tổ hợp gen: Biến nạp, tiếp hợp, tải nạp + Lựa chọn thường xuyên 4 Giữ giống vi sinh vật *Ý nghĩa: Giữ được những đặc tính quý (không bị thoái hóa) của vi sinh vật và bảo đảm cung cấp giống cho các quá trình sản xuất *Nhiệm vụ của vi c... chịu với điều kiện bất lợi của môi trường + Dễ bảo quản và ổn định các đặc tính sinh lý, sinh hóa trong thời gian sử dụng + Có khả năng thay đổi các đặc tính bằng các kỹ thuật đột biến, kỹ thuật gen để không ngừng nâng cao chất lượng sản phẩm 2 Nguồn giống vi sinh vật 2.1 Phân lập trong tự nhiên Để phân lập được chủng vsv ta phải tiến hành làm giàu số lượng tế bào vsv đó trong môi trường và điều kiện... trung tuyệt đối, sau đó trộn với vi sinh vật và đem bảo quan trong không gian kín Ngoài cát và đất sét người ta còn sử dụng các hạt ngũ cốc hoặc trên silicagen Phương pháp bảo quản giống này chủ yếu áp dụn cho vsv sinh bào tử như nấm mốc hoặc xạ khuẩn +Giữ gống bằng phương pháp lạnh đông Nguyên tắc: Ức chế sự phát triển của vi sinh vật trong điều kiện lạnh sâu (-25 750C) Các chất bảo quản: Glyxerin 15%... + Vi t Nam: Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật Vi t Nam (Vietnam Type Culture Collection hay gọi tắt là VTCC) 3.Cải tạo giống vi sinh vật *Ưu điểm: + Cho năng suất cao + Thời gian lên men ngắn ít tạo bọt trong khi lên men + Ít tạo sản phẩm phụ trong quá trình lên men + tạo đựoc nhiều sản phẩm quý mà chủng khác không có được như insulin, kháng nguyên Hbs (chống vi m gan B) + Khả năng chống chịu với điều. .. trong môi trường và điều kiện thuận lợi nhất đối với chúng và ức chế các chủng không mong muốn Quy trình phân lập giống trong tự nhiên: Thu mẫu Hòa loãng Cấy lên môi trường Nuôi Thuần khiết Kiểm tra Khi hòa loãng đối với vsv dễ chết trong nước cất và nước muối sinh lý thì dùng dung dịch pepton 0,1% Đối với vsv yếm khi khi nuôi phải cho thêm chất khử, gắn paraffin hoặc nuôi trong môi trường không có oxy... phương pháp lạnh khô: Các chất bảo vệ: Glutamate: 3% Lactoza: 1,2% + pepton 1,2% Saccharoza 8% + 5% sữa + 1,5% gelatin Đây là phương pháp giữ giống tối ưu nhất, có thể giữ giống qua hàng chục năm với tỷ lện sống cao, không bị biến tính và chiếm ít diện tích bảo quản + Giữ giống bằng ngân hàng gen 5 Nhân giống vi sinh vật Trường hờp là tế bào sinh dưỡng: Cần phải tạo môi trường thích hợp để tăng số lượng... dụng các kỹ thuật cần thiết để giữ cho vsv có tỷ lệ sống cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không bị tạp nhiễm * Các phương pháp giữ giống: + Bảo quản trong môi trường thạch nghiêng và định kỳ cấy chuyển: 0 Bảo quản trong tủ lạnh với hiệt độ 4 – 6 C, thời gian tối đa là 3 tháng Ưu điểm: Đơn giản được sử dụng phổ biến Nhược điểm: Thời gian bảo quản ngắn, tính chất của chủng dễ bị thay đổi. .. thể (nuôi cấy chìm) Trường hợp là bào tử (đối với xạ khuẩn và nấm môc): Thường nhân giống trên môi trường bán rắn và thu bào tử bằng máy hút bụi hoặc chổi quét, sau đó bảo quản nơi sạch, mát… * Giai đoạn phòng thí nghiệm Đây chính là giai đoạn hoạt hóa giống Cấy chuyển sang các ống môi trường dinh dưỡng vô trùng và nuôi chúng trong điều kiện phòng thí nghiệm Giai đoạn ở xưởng Giống được cấy chuyển một... trường nhiều (nhân giống cấp 1, 2, 3…) và kết quá trình nhân giống thì phải thu được tỷ lệ giống giao đọng từ 1-10% so với thể tích môi trường dinh dưỡng Chú ý: Kết thúc khâu nhânh giống cần phải kiểm tra chất lượng, số lượng giống trước khi cấy vào nồi lên men + Nhân giống trong sản xuất Sơ đồ nuôi cấy giống 1.Thùng gây men 150 l cấp 1 chứa 100 l dịch; 2.Thùng đường hóa thêm và xử lý dich đường; 3 và 4