Phương pháp phổ khối lượng (Mass Spectrometry - MS)

A Lý thuyết Phương pháp phổ khối lượng (Mass Spectrometry - MS) phương pháp phân tích dụng cụ quan trọng phân tích thành phần cấu trúc chất Bắt đầu từ cuối kỷ XIX, Goldstein (1886) Wein (1898) thấy chùm tia ion dương tách khỏi tác dụng điện trường từ trường Năm 1913, F.W Aston (nhà bác học đạt giải Nobel năm 1922 cho nghiên cứu đồng vị) nghiên cứu thấy khí neon tự nhiên gồm loại có khối lượng nguyên tử khác (isotope) 20 22 (g/mol) Hàng loạt nghiên cứu phương pháp phổ khối lượng chế kỹ thuật ion hoá, thiết bị phân tích phổ khối ứng dụng phương pháp phổ khối lượng lĩnh vực hoá học, vật lý, sinh học, …đã thực máy GC/MS đời năm 1950, máy HPLC/MS phát minh năm 1970… Ngày nay, phương pháp phân tích phổ khối lượng có ứng dụng rộng rãi nhiều ngành với ứng dụng như: Xác định khối lượng, cấu trúc phân tử; Nhận dạng, định danh cấu trúc chuỗi peptip, protein; Nghiên cứu đồng vị; Định tính, định lượng chất nồng độ vết vi lượng mẫu sinh học, thực phẩm, nông thuỷ sản, môi trường Cơ sở lý thuyết phương pháp khối phổ - Phương pháp phổ khối lượng kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng điện tích ion (m/z) tạo thành pha khí từ phân tử nguyên tử mẫu Tỷ số biểu thị đơn vị khối lượng nguyên tử (Atomic mass unit) Dalton amu = Da khối lượng nguyên tử hydro Sơ đồ cấu tạo thiết bị khối phổ kế Thí nghiệm xác định đồng vị Neon (mass spectrometer) F.W Aston năm 1913 - Các ion tạo thành buồng ion hóa, gia tốc tách riêng nhờ phận phân tích khối trước đến phận phát (detector) Quá trình phân tích khối phát thực môi trường chân không (áp suất khoảng 10-5 đến 10-8 Torr) - Đối với hợp chất hữu cơ: Cơ sở phương pháp MS ion hoá phân tử trung hoà thành ion phân tử mang điện tích bắn phá, phá vỡ cấu trúc phân mảnh phân tử trung hoà thành mảnh ion, gốc mang điện tích (có khối lượng nhỏ hơn) phần tử mang lượng cao theo sơ đồ sau: + Ion hoá phân tử trung hoà thành ion phân tử mang điện tích: ABCD + e Æ ABCD+ + 2e Æ ABCD2+ + 3e Æ ABCD- (> 95%) + Phân mảnh phân tử trung hoà thành mảnh ion, gốc mang điện tích: ABCD + e* Æ ABn+ + C + Dm- Sự phân mảnh phân tử trung hoà thành mảnh ion, gốc mang điện tích tuân theo định luật bảo toàn khối lượng Năng lượng bắn phá (năng lượng ion hoá) yếu tố định phân mảnh hợp chất Khi lượng bắn phá mẫu (khoảng 10eV) với lượng ion hóa phân tử gây nên ion hóa phân tử Nếu lượng ion hóa tăng lên (3050eV) bẻ gẫy số liên kết phân tử, tạo nhiều mảnh Đó ion phân tử trung hòa có khối lượng bé Quá trình phân mảnh đặc trưng cho cấu trúc phân tử có mặt nhóm chức đặc thù, cung cấp cho người phân tích thông tin hữu ích cấu tạo nhận dạng chất phân tích Quá trình phân mảnh sở giúp ta biện giải phổ, nhận dạng khẳng định cấu trúc chất phân tích Cấu tạo nguyên lý vận hành phổ kế phổ kế kết nối HPLC Sơ đồ khối cấu tạo phận khối phổ kế Một khối phổ kế bao gồm phộ phận chính: Bộ nạp mẫu – đưa mẫu vào (inlet), Bộ nguồn ion hoá (ion source), phân tích khối (mass analyzer), phát ion (detector) ghi/ xử lý số liệu (data system) 2.1 Bộ phận nạp mẫu: Chuyển mẫu cần phân tích vào nguồn ion hoá thiết bị khối phổ Có hai phương pháp nạp mẫu chính, tuỳ thuộc vào trạng thái vật lý chất cần phân tích: − Nạp mẫu dạng khí: Áp dụng chất khí, chất lỏng (dễ bay hơi) syringe tiêm mẫu kết nối với hệ sắc ký khí (GC/MS), sắc khí lỏng (LC/MS) − Nạp mẫu trực tiếp: Áp dụng với rắn, tinh thể, sơn keo Mẫu đựng cối chuyên dụng (Φ # 1mm), gắn đốt đưa vào buồng chân không Sau hút chân không, cối đựng mẫu làm nguội đưa vào buồng ion hoá, đâu đốt nóng từ từ bay Sự đời kỹ thuật ion hoá tiên tiến (ion hoá mềm) ion hoá chùm tia laser hay phản hấp thụ/ ion hoá mẫu chùm tia laser (MALDI - Matrix-assisted laser desorption/ionization) bắn phá nhanh nguyên tử (FAB - fast atom bombardment), trình nạp mẫu chất rắn không cần phải sử dụng cối chuyên dụng tương tự trình nạp mẫu chất khí lỏng Do trình nạp mẫu từ áp suất thường (760mmHg) vào buồng chân không cao (10-510-8 Torr) phải không ngắt chân không phận phân tích khối (mass analyzer) phát (detector) nên phận nạp mẫu nguồn ion hoá GC/MS LC/MS có khác biệt: − Với GC/MS, đầu GC đưa trực tiếp vào nguồn ion hoá khối phổ kế nguồn ion hoá gắn liền với thiết bị phân tích khối Giao diện kết nối GC vào MS tương đối đơn giản Sơ đồ khối cấu tạo thiết bị GC/MS-MS (kiểu tứ cực chập ba) − Với LC/MS, đầu LC dòng dung môi pha động đưa trực tiếp toàn dòng dung môi vào khối phổ kế làm giảm chân không ảnh hưởng đến độ nhạy vận hành thiết bị Mặt khác, ion có thành phần dòng dung môi dễ dàng va chạm với phân tử, nguyên tử trung hòa làm lệch hướng di chuyển, bị bơm chân không khối phổ kế hút thải Do vậy, trình nạp mẫu từ LC vào MS thường phải có giao diện ghép nối phù hợp (đai chuyển, chia dòng, phun sương,…) Một ghép nối LC/MS cần có đặc tính: Cho phép chuyển mẫu hiệu xác từ LC sang MS mà không làm phá hủy hay chất phân tích, loại bớt dung môi rửa giải, giảm pha loãng mẫu làm chất phân tích; cho phép nhiều lựa chọn phương pháp cho LC điều kiện vận hành cho MS; dễ dàng bảo dưỡng vận hành; thời gian lưu píc sắc kí đồng giảm thiểu tối đa doãng píc Với thiết bị LC/MS, phận ion hoá thiết kế phù hợp với giao diện kết nối LC với MS thường đặt phía MS (vùng áp suất giảm) Dòng ion hình thành nguồn ion vào thiết bị phân tích khối (vùng chân không) thông qua hệ thống mao quản kết nối Sơ đồ khối cấu tạo thiết bị LC/MS-MS (nguồn ion hoá kiểu ESI – kết nối phun sương) Giao diện kết nối đai chuyển (moving belt) Giao diện kết nối chia dòng liên tục (nguồn ion FAB) 2.2 Nguồn ion hoá (ion source): Ion hoá phân tử trung hoà thành ion phân tử mang điện tích bắn phá, phân mảnh phân tử trung hoà thành mảnh ion, gốc mang điện tích phần tử mang lượng cao Những tiểu phân không bị ion hóa bị hút khỏi buồng ion qua bơm chân không thiết bị MS Các ion phân tử tạo thành tăng tốc độ thu gọn (hội tụ) Việc tăng tốc thực điện (2-10 kV), khỏi buồng ion hóa ion phân tử có tốc độ đạt cao Việc thu gọn thành chùm ion thực điện trường phụ để vào phần phân tích khối (mass analyzer) dòng ion tập trung, đồng Có nhiều loại nguồn ion hoá sử dụng kỹ thuật ion hoá khác dùng máy GC/MS LC/MS Kĩ thuật ion hóa va chạm điện tử (Electron Impact ionization): Trong nguồn ion electron tạo từ sợi dây tóc đèn đốt nóng, sau tăng tốc hướng tới anode va chạm với phân tử khí mẫu phân tích tiêm vào nguồn ion Nếu electron có đủ lượng, va chạm làm electron phân tử bị bắn theo phương trình: R+ e- Æ R.+ + 2e- Các ion hình thành sau va chạm qua điện trường khoảng 400 – 4000V để tăng tốc vào phận phân tích khối Tốc độ chuyển động ion tỷ lệ với khối lượng chúng Trong kỹ thuật ion hoá va chạm điện tử, khí mẫu có áp suất hóa cao nạp trực tiếp vào nguồn ion Các mẫu lỏng rắn phải làm nóng để làm tăng áp suất hóa Sơ đồ cấu tạo nguồn ion hoá kiểu va chạm điện tử Kĩ thuật ion hóa hóa học (Chemical ionization): Trong nguồn ion hóa hóa học, ion tạo thông qua va chạm phân tử chất phân tích với ion sơ cấp (thuốc thử) cho vào nguồn ion Trong nguồn ion, electron ion hóa thuốc thử (các phân tử H2, CH4, H2O, CH3OH, NH3, …) sau ion thuốc thử lại va chạm với va chạm với phân tử trung hoà chất cần phân tích tạo môi trường ion hóa qua loạt phản ứng Cả hai dạng ion âm dương chất phân tích tạo thông qua phản ứng hóa học với ion môi trường Kĩ thuật ion hóa điện trường (Field ionization): Là kĩ thuật sử dụng điện trường mạnh (8-12 kV) hai điện cực để tạo ion từ phân tử pha khí Các phân tử mẫu pha khí tiến gần tới bề mặt điện cực có điện (+) cao Khi điện trường bề mặt đủ mạnh (107-108 Vcm-1), điện tử phân tử mẫu chuyển vào điện cực, kết tạo thành cation gốc M+ Ion bị điện cực đẩy phía điện cực âm với khe nhỏ để ion vào phận phân tích khối FI kĩ thuật ion hóa mềm, ion có nội thấp nên phân mảnh Tuy nhiên cần sử dụng nhiệt để hóa mẫu nên kĩ thuật tương tự EI, CI thích hợp với hợp chất dễ bay bền với nhiệt Sơ đồ kĩ thuật ion hóa điện trường Kĩ thuật bắn phá nhanh nguyên tử (Fast Atom Bombardment): Trong kĩ thuật này, chùm tia sơ cấp nguyên tử/ phân tử trung hòa ion tập trung lên bề mặt mẫu chứa hoạt chất cần phân tích (chất cần phân tích hòa tan chất lỏng không bay hơi) Khi chùm tia sơ cấp có lượng cao bắn vào bề mặt dung dịch mẫu đẩy ion từ dung dịch Các ion tăng tốc nhờ điện để vào phận phân tích khối Kĩ thuật không gây ion hóa mà đẩy ion có sẵn dung dịch vào pha khí Sơ đồ hình thành ion kỹ thuật FAB Kĩ thuật phản hấp thụ ion hoá tia laser: Là kĩ thuật hiệu để tạo ion pha khí Các xung nhịp laser tập trung bề mặt mẫu (thường rắn) gây chia cắt bề mặt tạo tiểu plasma ion phân tử trung tính Chúng phản ứng với pha dày đặc gần bề mặt mẫu Các xung laser vừa có tác dụng làm bay mẫu vừa ion hóa mẫu Một kỹ thuật phản hấp thụ ion hoá tia laser ứng dụng rỗng rãi nguồn ion hoá thiết bị kĩ thuật MALDI (Matrix-assisted laser desorption/ionization) Kĩ thuật ion hóa MALDI, thực qua bước: Bước đầu tiên, chất phân tích hòa tan dung môi chứa dung dịch chất hữu phân tử nhỏ, gọi Các phân tử phải hấp thụ mạnh ánh sáng laser Hỗn hợp làm khô loại dung môi trước phân tích Các phân tử chất phân tích gắn vào để phân cách phân tử với Sơ đồ hình thành ion kỹ thuật MALDI Bước thứ hai xảy điều kiện chân không liên quan tới chia cắt phần dung dịch rắn cường độ xung nhịp laser thời gian ngắn Việc chiếu laser làm nóng nhanh chóng tinh thể tích tụ lượng lớn lượng pha đặc thông qua kích thích phân tử Làm nóng nhanh gây thăng hoa cục tinh thể nền, gây chia cắt bề mặt tinh thể phát triển vào pha khí, vận chuyển chất phân tích nguyên vẹn chùm Phản ứng ion hóa xảy điều kiện chân không suốt trình: ion hóa ánh sáng pha khí, chuyển proton trạng thái kích thích, phản ứng ion-phân tử,…Các ion tạo thành tăng tốc trường tĩnh điện hướng tới chất phân tích Kỹ thuật MALDI gây phân mảnh có khả giải hấp ion hóa phân tử lớn tới 100.000 Da Có thể tạo dạng ion âm dương Kĩ thuật ion hóa phun sương điện (Electron Spray Ionization): ESI kỹ thuật ion hóa ứng dụng cho hợp chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử lớn ESI có khả tạo thành ion đa điện tích (dương âm, tùy thuộc vào áp cực điện thế), xem kỹ thuật ion hóa êm dịu APCI, thích hợp cho phân tích hợp chất sinh học protein, peptide, nucleotide… polyme công nghiệp polythylen glycol Trong ESI, đầu ống dẫn mao quản, ảnh hưởng điện cao hỗ trợ khí mang, mẫu phun thành hạt sương nhỏ mang tích điện bề mặt Khí xung quanh giọt tạo nhiệt làm bay dung môi khỏi giọt sương, đó, mật độ điện tích bề mặt hạt sương gia tăng Mật độ điện tích tăng đến điểm giới hạn (giới hạn ổn định Rayleigh) để từ hạt sương phân chia thành hạt nhỏ lực đẩy lúc lớn sức căng bề mặt Quá trình lặp lại nhiều lần để hình thành hạt nhỏ Từ hạt nhỏ mang điện tích cao này, ion phân tích chuyển thành thể khí lực đẩy tĩnh điện sau sau vào phân tích khối Trong kỹ thuật ESI, phân tử thiết phải biến thành chất điện ly, tan dung dịch dùng để phun sương Điều phụ thuộc vào: dung môi sử dụng, pKa chất điện ly pH dung dịch Sơ đồ tạo ion dương nguồn ESI Kĩ thuật ion hóa hóa học áp suất khí (APCI – Atmospheric pressure chemical ionization): APCI dựa phản ứng ion-phân tử pha khí APCI chủ yếu sử dụng cho chất phân cực không phân cực có khối lượng phân tử 1500 Da thường tạo ion điện tích đơn Chất phân tích dung dịch đưa trực tiếp qua cột sắc ký lỏng tốc độ 0,2-1,0 mL/phút vào phận phun sương, tạo sương mỏng nhờ dòng khí nitrogen tốc độ cao Các giọt sương sau làm nóng để loại dung môi chuyển tới điện cực phóng hồ quang (corona needle) để ion hóa Tại có trao đổi proton để biến thành ion dương [M+H]+ trao đổi electron proton để biến thành ion âm [M–H]- Sau đó, ion đưa vào phân tích khối APCI kỹ thuật ion hóa thường sử dụng để phân tích hợp chất có độ phân cực trung bình, phân tử lượng nhỏ, dễ bay Sơ đồ tạo ion dương nguồn APCI Kĩ thuật ion hóa ánh sáng áp suất khí (APPI – Atmospheric Pressure Photoionization): APPI sử dụng photon để ion hóa phân tử pha khí Mẫu dung dịch bay nhờ phun sương nhiệt, sau chất phân tích tương tác với photon phát từ đèn Các photon gây loạt phản ứng pha khí dẫn đến ion hóa mẫu Sơ đồ tạo ion nguồn APPI Các kỹ thuật ion hoá EI, CI FI thường sử dụng máy GC/MS; kỹ thuật FAB, MALDI, ESI, APCI thường sử dụng máy LC/MS 2.3 Bộ phận phân tích khối (mass analyzer): Các ion hình thành nguồn ion hoá có khối lượng m điện tích z (tỷ số m/z gọi số khối) vào phận phân tích khối Bộ phận phân tích khối coi tim máy khối phổ, có nhiệm vụ tách ion có số khối m/z khác thành phần riêng biệt nhờ tác dụng từ trường, điện trường trước đến đến phận phát xử lý số liệu Có thể phân phân tích khối thành loại: Bộ phân tích từ; phân tích tứ cực; phân tích thời gian bay; phân tích cộng hưởng ion cyclotron Bộ phân tích từ: Bao gồm thiết bị khối phổ hội tụ đơn (Single Focusing Magnetic Deflection hay Sector mass analyser) thiết bị khối phổ hội tụ kép (Double focusing magnetic sector mass spectrometer hay double focusing sector field mass spectrometer) Các ion tr ớc khỏi buồng ion hóa tăng tốc nhờ điện trường U, qua nam châm hình ống có từ trường H Các ion chuyển động theo hình vòng cung bán kính r từ tr ờng Với r: 2mU r= H z Æ m H r = z 2U Vậy với giá trị U H định số khối m/z tỷ lệ với bán kính r Từ biểu thức nhận thấy ion có m/z khác tách khỏi giá trị r vòng cung chuyển động chúng khác Một máy hội tụ đơn thường có độ phân giải thấp (1000 – 5000) thiết bị khối phổ hội tụ thường có độ phân giải cao (10.000 – 100.000) tách ion thiết kế thêm điện tr ờng bên cạnh từ tr ờng nam châm Các ion tr ớc qua từ tr ờng hình quạt, qua điện tr ờng tĩnh điện để tách biệt lần thiết bị khối phổ hội tụ kép có độ phân giải cao so với thiết bị khối phổ hội tụ đơn Sơ đồ cấu tạo nguyên lý phân tách ion thiết bị phân tích khối hội tụ đơn Sơ đồ cấu tạo thiết bị phân tích khối hội tụ kép Bộ phân tích tứ cực: Bao gồm phân tích tứ cực đơn, phân tích tứ cực chập ba bẫy ion kiểu tứ cực *Bộ tứ cực (quadrupole): Gồm có cực kim loại đặt song song sát Có khoảng không cực để ion bay qua Dòng điện chiều (DC) điện xoay chiều cao tần đặt vào cặp đối diện tứ cực Cả trường không làm tăng tốc dòng ion từ nguồn làm chúng dao động quanh trục trung tâm chuyển động ion có số khối định đến phận phát Các ion vào trường tứ cực theo hướng trục z đồng thời dao động theo hướng trục x, y ảnh hưởng trường điện tần số cao Chỉ dao động ion có m/z đặc biệt không tăng lên theo biên độ dao động qua tâm tứ cực dọc theo trục Các ion khác có biên độ dao động tăng va đập vào thành điện cực trước vượt qua điện cực vào detector Phương trình tổng quát phổ tứ cực sau: m V =K 2 z r f Trong K: số, V: điện áp tần số cao, r: khoảng cách điện cực đối nhau, f: tần số dao động ion Bằng cách thay đổi tần số cực, ion có tỷ số m/z khác vượt qua khoảng không để đến detector với khoảng thời gian khác (các ion tách theo số khối chúng) Sơ đồ nguyên tắc phân tích khối phổ kế tứ cực Độ phân giải phổ kế tứ cực thông th ờng đạt từ 500 – 1000, muốn nâng cao Rs, thường phải nối – tứ cực với (Rs đạt tới 20.000) Phổ khối tứ cực kiểu chập ba, gồm tứ cực nối tiếp Q1, Q2 Q3 Q1 tách ion lựa chọn số ion ban đầu (ion mẹ) đưa vào tứ cực Q2 Trong buồng Q2 với áp suất cao, ion mẹ bị phân mảnh va chạm với khí trơ có mặt buồng nitơ, agon, heli Nhờ va chạm lượng động học ion chuyển thành nội nên chúng phân mảnh tiếp tạo ion nhỏ (ion con) Các ion hình thành dẫn đến Q3 phân tích khối tách riêng đến detector Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba *Bẫy ion tứ cực (ion trap): Hoạt động theo nguyên lý phân tích khối tứ cực, có điểm khác ion lưu giữ đưa dần khỏi bẫy Các ion sau vào bẫy ion theo đường cong ổn định bẫy lại điện áp RF đặt điện cực vòng Các ion trở nên không ổn định, dao động có hướng phía detector Do điện áp RF khác hệ thống mà thu phổ khối lượng đầy đủ Các ion tồn bẫy chọn riêng phân tích theo khác m/z, đồng thời chọn riêng thực trình bắn phá để thu đượccác mảnh ion con, từ thực phân tích theo m/z ion (khối phổ lần).Về nguyên tắc ion tồn bẫy thời gian đủ lâu thực đến MSn lần, nhiên thực tế thường có khả thực đến khối phổ lần Sơ đồ cấu tạo phân tích khối phổ kế bẫy ion Bộ phân tích thời gian bay (Time of flight): Các ion khỏi buồng ion hóa gia tốc nhờ 10-20 kV bay qua ống phân tích (không có trường điện từ) có chiều dài đến 2m phận phân tích khối Phân tích thời gian bay dựa sở gia tốc ion tới detector với lượng Do ion có lượng lại khác khối lượng nên thời gian tới detector khác Các ion nhỏ tới detector nhanh có vận tốc lớn ion lớn chậm hơn, vậy, thiết bị gọi thiết bị phân tích thời gian bay tỉ số m/z xác định thời gian bay ion Thời gian bay ion tới detector phụ thuộc vào khối lượng, điện tích lượng động học ion Độ phân giải phân tích thời gian bay thấp có ưu điểm khối lượng ion phân tích không bị hạn chế Để tăng độ phân giải thiết bị kéo dài thời gian bay ion (thiết bị W-TOF) ghép nối TOF với TripleQuad iontrap Sơ đồ nguyên tắc phân tích khối phổ kế TOF Phổ kế TOF đơn TOF kép (W-TOF, TOF độ phân giải cao) Bộ phân tích cộng hưởng ion (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance mass spectrometry): Các ion giữ buồng cộng hưởng từ trường mạnh bên điện trường theo hướng trục Giống cộng hưởng từ hạt nhân, tất ion buồng kích thích xung tần số radio băng rộng Các ion hấp thu lượng phù hợp để cộng hưởng Các ion loại hấp thu lượng (cộng hưởng) chuyển động đồng tạo tần số định phụ thuộc vào m/z Tất tần số ion tạo ghi nhận dạng dao động cảm ứng tự tắt dần theo thời gian sau biến đổi Fourier để trở thành dạng phổ khối truyền thống Thiết bị khối phổ FT-ICR nguyên tắc phân tích khối 2.4 Bộ phận phát (detector): Sau khỏi phận phân tích khối lượng, ion đưa tới phần cuối thiết bị khối phổ phận phát ion Bộ phận phát cho phép khối phổ tạo tín hiệu ion tương ứng từ electron thứ cấp khuếch đại tạo dòng điện tích di chuyển Có hai loại phận phát phổ biến: phận phát nhân electron (electron multiplier) phận phát nhân quang (photomultiplier) Bộ phận phát nhân electron detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao Các ion đập vào bề mặt dinot làm bật electron Các electron thứ cấp sau dẫn tới dinot tạo electron thứ cấp nhiều nữa, tạo thành dòng electron Bộ phận phát nhân quang giống thiết bị nhân electron, ion ban đầu đập vào dinot tạo dòng electron Khác với detector nhân electron, electron sau va đập vào chắn phospho giải phóng photon Các photon phát nhân quang hoạt động thiết bị nhân electron Ưu điểm phương pháp ống nhân quang đặt chân không nên loại bỏ khả nhiễm bẩn Sơ đồ hoạt động detector electron multiplier (trái) photomultiplier (phải) Một số thông số đặc trưng phổ khối lượng ý nghĩa 3.1 Phổ đồ: Cách biểu diễn phổ khối lượng thông thường dùng vạch thẳng đứng có độ cao tỉ lệ với cường độ có vị trí trục nằm ngang (trục hoành) tương ứng với tỉ số m/z ion Cường độ trục thẳng đứng (trục tung) cường độ tương đối Thông thường người ta chọn pic mạnh làm pic quy cho có cường độ 100/100 Cường độ pic khác tính % so với pic Các pic xếp theo giá trị m/z từ thấp đến cao, số pic ghi rõ giá trị m/z Phổ khối ethyl benzen (MW = 106) 3.2 Độ phân giải phổ khối: Độ phân giải khả tách số khối liền M M + ΔM Độ phân giải R MS tính theo công thức: M ΔM Nếu R lớn M M + ΔM gần nhau, nghĩa máy có R lớn phân biệt hạt có khối lượng gần Ví dụ : Với M = 28 có bốn chất ứng với khối lượng M ≈ 28 CO, C2H4 , N2 ,CH2N R= Giá trị xác bốn hợp chất cho bảng Công thức Khối lượng CH2N 28.031300 C2H4 28.081724 N2 28.006148 CO 27.994915 ΔM 0.012576 0.012576 0.011233 0.023809 0.025152 0.036385 Để phân biệt hai tín hiệu CH2N CO thiết bị phải có độ phân giải: R= 28 M = = 770 ΔM 0.036385 Nhưng để phân biệt hai tín hiệu N2 CO thiết bị cần phải có độ phân giải: R= M 28 = = 2493 ΔM 0.011233 Các thiết bị có R< 1000 thiết bị có độ phân giải thấp Thiết bị có R > 10000 thiết bị có độ phân giải cao Tuỳ theo hãng, SOP thẩm định lắp đặt thiết bị với giá trị độ phân giải thường tiến hành chất chuẩn có M định thường xác định độ phân giải vị trí ½ chiều cao píc Trường hợp có ion, R xác định ½ chiều cao pic (FHHM) 5% chiều cao Xác định độ phân giải có xen phủ píc 3.3 Độ xác phổ khối (mass accuracy): Độ xác phổ khối đại lượng đo mức độ chênh lệch số khối thực nghiệm phân tử khối lượng thực: Δm = mreal − mmeasured Độ xác phổ khối thường biểu thị giá trị ppm: ppm = 10 × Δm / mmeasured Ví dụ: Khối lượng lý thuyết (theoretical mass) = 1000; khối lượng đo (measured mass) = 999.9 độ xác phổ khối độ sai lệch phổ khối (mass error) = 100ppm Giá trị độ xác phổ khối có mối quan hệ với giá trị độ phân giải Một thiết bị có độ phân giải thấp có độ xác phổ khối cao Phổ khối mẫu thử đo với thiết bị có độ phân giải thấp (trái) độ phân giải cao (phải) 3.4 Phổ khối ion nguyên tử đồng vị: Đa số nguyên tố thiên nhiên gồm hỗn hợp nhiều đồng vị Do ion phân tử tín hiệu ion M+ có ion phân tử có khối lượng [M-1]+, [M+1]+ , [M+2]+… làm cho khối phổ có nhiều tín hiệu lân cận M+ Các nguyên tử đồng vị nguyên tố có số điện tích hạt nhân, khác số nơtron nhân khác khối lượng nguyên tử Vì tính chất đồng vị tuyệt đối giống nhau, nên hàm lượng tương đối đồng vị nguyên tố hợp chất hóa học giống thân nguyên tố Do nguyên tố tinh khiết 19F, 31P, 127I phổ đồ có vạch, nguyên tố C (12C 13C) phổ đồ có vạch (tương ứng với 12C) có vạch bên cạnh (m/z+1, tương ứng với 13C), nguyên tố Cl (35Cl 17Cl), Br (79Br 81Br) phổ đồ tồn vạch cạnh (m/z m/z+2) Phổ đồ Benzen (vạch đồng vị Carbon) Phổ đồ Benzyl chloride (vạch đồng vị Cl) 3.5 Phổ khối ion đa điện tích: Thiết bị khối phổ hoạt động dựa đo tỷ số khối lượng chia điện tích (m/z) Phổ khối thường gán mảnh đơn/1 điện tích Tuy nhiên số hợp chất (các peptid, protein…) số kỹ thuật ion hoá ESI, laser… ion phân tử mang nhiều điện tích đó: mảnh khối ứng với điện tích đơn M/z, mảnh khối ứng với điện tích đôi [M+1]/(z+1), với điện tích [M+2]/(z+2)… Phổ đồ myoglobin tim ngựa Xác định số khối tương ứng với ion đa điện tích dựa vào: tính chất chất cần phân tích (nếu biết); đặc điểm thiết bị khối phổ kỹ thuật ion hoá; dựa vào vạch phổ phổ đồ vạch phổ đồng vị Ví dụ, với trường hợp đơn điện tích vạch đồng vị C 1,0 amu, trường hợp điện tích đôi vạch đồng vị C 0,5 amu Một số kỹ thuật ghi phổ Phổ khối lần (MS) phổ khối nhiều lần (2 lần – MS/MS): Trong phân tích khổ phối, việc xác định xác ion (M+ hay chất phân mảnh) quan trọng cho việc xác định hợp chất cần phân tích Một hợp chất xác định điều kiện định cho ion có số khối xác định phổ đồ Tuy nhiên, ion có số khối xác định phổ đồ lại xuất phát từ nhiều hợp chất khác Trong phân tích hỗn hợp phương pháp sắc ký – khối phổ, điều kiện sắc ký chưa đảm bảo việc phân tách việc nhận định ion thông qua số khối phổ đồ bị ảnh hưởng Đối với trường hợp này, MS lần cho kết không xác so với kỹ thuật khối phổ nhiều lần có tính chọn lọc khối cao Giản đồ so sánh khối phổ lần (MS) khối phổ lần (MS/MS) Hình vẽ ví dụ cho thấy cần chất phân tích tạp chất có số khối (m/z = 325) song có chế phân mảnh khác Nếu phân tích sắc ký – khối phổ lần với điều kiện sắc ký mà hai chất đồng rửa giải không xác định phân biệt khối phổ lần (MS) phân biệt khối phổ lần (MS/MS) 4.1 Quét toàn phổ (Full Scan) Khi thao tác với chế độ scan, MS nhận tất mảnh ion phổ đồ toàn ion tất chất suốt trình phân tích Thường dùng để nhận danh hay phân tích chất phân tích có nồng độ đủ lớn Đối với MS tứ cực chập ba, chế độ Full scan MS thường lựa chọn để khảo sát ion mẹ, chế độ Full scan MS/MS quét tất ion tạo thành thường sử dụng để xác định ion cho tín hiệu ổn định bền Cơ chế ghi phổ full scan MS phổ kế tứ cực Cơ chế ghi phổ full scan MS/MS phổ kế tứ cực chập ba 4.2 Selected Ion Monitoring (SIM) Trong chế độ SIM, MS ghi nhận tín hiệu số mảnh ion đặc trưng cho chất cần xác định Phổ đồ SIM cho tín hiệu ion lựa chọn trước đó, dùng để nhận danh hay so sánh với thư viện có sẵn Đối với MS tứ cực chập ba, chế độ SIM thường lựa chọn để khảo sát lượng phân mảnh biết ion mẹ Cơ chế ghi phổ SIM phổ kế tứ cực 4.3 SRM (Selected Reaction Monitoring) MRM (Multiple Reaction Monitoring) Đối với MS tứ cực chập ba, máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS/MS), kỹ thuật ghi phổ MS/MS có độ nhạy cao thường sử dụng SRM MRM + SRM: cô lập ion cần chọn, sau phân mảnh ion cô lập đó, mảnh ion sinh ra, cô lập mảnh ion cần quan tâm đưa vào đầu dò để phát + MRM: thực tế, yêu cầu mặt kỹ thuật phân tích vi lượng nên ion cần quan tâm thường từ trở lên, kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng SRM Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập tứ cực thứ (thực chất buồng va chạm) thu ion con, cô lập (hoặc nhiều) ion cần quan tâm tứ cực thứ đưa vào đầu dò để phát Cơ chế ghi phổ SRM phổ kế tứ cực chập ba Một số ứng dụng phương pháp khối phổ 5.1 Xác định khối lượng nguyên tử khối lượng phân tử * Xác định nguyên tử đồng vị: Phổ khối lượng ban đầu dùng để xác định khối lượng nguyên tử đồng vị Dùng máy phổ khối lượng người ta xác định khối lượng mà hàm lượng % đồng vị Đại đa số đồng vị tìm xác định phương pháp phổ khối lượng Ví dụ: Khi khảo sát khí xenon phương pháp phổ khối lượng ta tìm đồng vị với hàm lượng tự nhiên giảm dần theo trật tự sau: 123Xe, 129 Xe, 131Xe, 134Xe, 136Xe, 130Xe, 128Xe, 124Xe, 126Xe * Xác định khối lượng phân tử: Nếu ion phân tử tạo mà đủ bền khối lượng phân tử xác định trực tiếp từ pic có giá trị m/z cao có cường độ không phụ thuộc vào áp suất Có trường hợp mà khối lượng phân tử xác định phương pháp thông thường (do đặc điểm chất, lượng chất ) phương pháp phổ khối lượng giải pháp tối ưu Ví dụ nhờ có pic ion phân tử phổ khối lượng người ta xác định Fe(CO)4(CF2CF2CF2CF2) không dạng polime mà monome với M=368u Đối với trường hợp hợp chất không đủ bền, cách sử dụng kỹ thuật ion hoá khác nhau, ion hoá mềm, giảm lượng ion hoá phân rã người ta xác định khối lượng phân tử số trường hợp 5.2 Xét đoán cấu trúc phân tử Phân tích khối phổ cho xác khối lượng ion phân tử M+ khối lượng mảnh ion Bên cạnh xác định xem xét thêm pic đồng vị [M+1]+, [M+2]+ tỷ số cường độ chúng so với M Đồng thời thông qua phân tích phổ xác định hiệu số khối lượng ion phân tử mảnh ion hiệu xuất mảnh ion Từ thông tin xác định công thức nguyên chất phân tích Sau phân tích định tính công thức nguyên chất phân tích cần phải tiếp tục nghiên cứu kỹ phổ khối kết hợp với phổ cộng hưởng từ hạt nhân phổ IR,… để xác định công thức cấu tạo chất phân tích Một số ví dụ, nguyên tắc xét đoán công thức nguyên dựa vào phổ khối lượng: - Nếu gặp pic [M+1]+ có cường độ 3,3% cường độ M+ ta suy đoán phân tử có nguyên tử C, ion [M+1]+ đóng góp 13C, hàm lượng 13 C tự nhiên 1,1% cường độ pic [M+1]+ gần n.1,1% (nếu số C hợp chất n) - Nếu phổ đồ có pic m/z = 94 m/z = 96 có cường độ gần nhau, ta nghĩ pic tương ứng với phân tử CH3Br 79Br (50,54%), 81Br(49,96%) Ví dụ: Quá trình xét đoán công thức nguyên chất cần phân tích dựa khối phổ 5.3 Ứng dụng phương pháp khối phổ kiểm nghiệm thuốc Đặc tính bật khối phổ tính chọn lọc độ nhạy cao Vì mà khối phổ thường sử dụng để xác định lượng siêu vết mẫu có thành phần phức tạp định tính, định lượng thuốc chất chuyển hoá dịch sinh học, độc chất học; định lượng dư lượng thuốc trừ sâu, chất bảo quản, chất cấm mẫu thực phẩm, mỹ phẩm, dược liệu, thuỷ hải sản môi trường… - Định tính: Tiến hành so sánh phổ chất cần phân tích so với phổ chuẩn thư viện phổ so với phổ chất chuẩn - Định lượng: Dựa vào tương quan đáp ứng mẫu thử so với đáp ứng mẫu chuẩn biết nồng độ Ngoài ra, phương pháp khối phổ sử dụng để xác định mức độ tinh khiết chất chuẩn mẫu chất cần phân tích 5.4 Ứng dụng phương pháp khối phổ công nghệ sinh học * Peptid Mass Fingerprinting (PMF): Cả ba protein 1, 2, có số khối (m/z = 4842.5) có trật tự xếp acid amin khác Do sử dụng emzym cắt phù hợp sử dụng lượng phân mảnh phù hợp protein phân mảnh thành ion có số khối khác đặc trưng cho chất, thông qua phổ khối nhận dạng định danh protein * Proteomic Peptid Sequencing: Xây dựng phương pháp LC/MS với thiết bị khối khổ kiểu tứ cực chập ba (TSQ) Để định tính, định lượng thuốc dịch sinh học, mẫu độc chất, xác định dư lượng chất cấm mẫu thuỷ hải sản, thực phẩm, dược liệu môi trường, phòng thí nghiệm thường sử dụng thiết bị TSQ với nguồn ion hoá kiểu API (Ion hóa áp suất thường lượng thấp - Atmospheric Pressure ionization - low energy) ghép nối với thiết bị HPLC UPLC số ưu điểm sau: GC-MS: • Hợp chất bay hơi; • Lưu lượng khí 1-5mL/min; • Phân cực thấp; • Nguồn ion háo lượng cao (va chạm điện tử Electron Impact ionization - EI, gây phân mảnh nguồn ion) LC-MS: • Hợp chất không bay không bền nhiệt; • Phân cực trung bình đến cao; • Tốc độ dòng 1mL/min (tương ứng lưu lượng khí 1.000mL/min); • Ion hóa áp suất thường lượng thấp (ion hoá mềm, không gây phân mảnh nguồn ion) thường sử dụng nguồn ESI APCI Phạm vi ứng dụng GC LC nguồn ion hoá Do đặc điểm ghép nối LC MS, dòng LC không kết nối trực tiếp vào MS mà thông qua giao diện nguồn ion hoá, việc sử dụng điều kiện sắc ký nguồn ion hoá phụ hợp cho hiệu suất ion hoá cao, vừa có tác dụng loại bỏ tạp chất, không làm pha loãng mẫu chuyển lượng mẫu tối đa MS định nhiều đến độ đặc hiệu đặc biệt độ nhạy thiết bị phương pháp - Khi kết nối LC - MS xây dựng điều kiện HPLC cần lưu ý điểm sau: o Dung môi pha động không chứa thành phần đệm vô cơ; chứa thành phần đệm dễ bay hơi, có sức căng bề mặt thấp o Tốc độ dòng pha động để mức tối ưu nhỏ Tốc độ dòng pha động cao, tốc độ khí cung cấp cho nguồn ion hoá để bay dung môi phải lớn Æ ảnh hưởng đến khả chuyển mẫu vào MS (quá trình chuyển mẫu vào MS nguồn ion hoá phun sương chủ yếu thực theo nguyên tắc chênh lệch áp suất) o Tỉ lệ nước, chất pha động cao, cần thiết phải cung cấp nhiệt cho nguồn ion hoá để hỗ trợ trình bay dung môi o Đối với mẫu phức tạp tượng suy giảm hiệu suất ion hoá nguồn ion (ion suppression – matrix effect) tạp chất đồng rửa giải Do vậy, nên lựa chọn điều kiện sắc ký phân tách chất đồng rửa giải gây ảnh hưởng có - Lựa chọn nguồn kiểu nguồn ion hoá cần vào đặc điểm như: o Khối lượng, mức độ phân cực khả ion hoá, khả solvat hoá, tạo cặp ion, …của chất cần phân tích (phân tử lượng lớn, độ phân cực cao nên lựa chọn nguồn ESI, phân tử lượng nhỏ, độ phân cực trung bình lựa chọn nguồn APCI); o Đặc điểm dung môi pha động: Lực ion, sức căng bề mặt, khả bay pha động, pH, thành phần tỷ lệ pha động, tỷ lệ nước pha động, tốc độ dòng pha động,… - Lựa chọn kiểu khối phổ MS MS-MS: Căn vào đặc điểm hoạt chất cần phân tích, phương pháp xử lý mẫu mẫu, yêu cầu định tính hay định lượng * Các thông số cần tối ưu hoá phương pháp LC-MS: - Nguồn ion hoá: + Thế ion hoá; + Tốc độ khí nguồn ion hoá (khí mang, khí bổ trợ, khí làm nguồn); + Nhiệt độ nguồn ion hoá - Nhiệt độ mao quản chuyển ion hoá; - Thế phận hội tụ nguồn ion; - Ion ban đầu (mảnh mẹ); - Năng lượng để phân mảnh ion mẹ tạo thành ion - Ảnh hưởng mẫu B Thực hành XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AMLODIPIN TRONG DỊCH SINH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-MS/MS Thực hành quy trình tối ưu hoá điều kiện sắc ký - khối phổ cho hoạt chất Amlodipin nội chuẩn Tiến hành phân tích mẫu chuẩn amlodipin huyết tương người phương pháp HPLC-MS/MS (dựng đường tuyến tính, đánh giá độ đúng, độ xác ngày) QUY TRÌNH PHÂN TÍCH Điều kiện sắc ký: Thiết bị phân tích: Thermo, VKN/TĐSH/53.02 Cột sắc ký: EC 50/2 nuclodur C18 Bảo vệ cột: Rp18, x 3mm Tốc độ dòng: 0,4 mL/p Pha động: MeCN: MeOH: 2-propanol: CH3COONH4 Thể tích tiêm: 10 µL Detector: TSQ quantum ultra Nội chuẩn Felodipin gốc: Cân xác khoảng 25 mg Felodipine, hoà tan 100 mL MeOH (A).Hút mL (A)/50 mL MeOH : H2O (1:1) (B) Hút mL (B)/20 mL MeOH : H2O (1:1) Chuẩn Amlodipine gốc: Cân xác khoảng 35 mg Amlodipine besilat, hòa tan 100 mL MeOH (A) Dung dịch chuẩn làm việc: Hút mL (A)/ 50 mL MeOH : H2O (1:1) (B) Hút mL (B)/ 100mL H2O (100ng/mL) Chuẩn bị dung dịch chuẩn nước Mẫu Blank Zero S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 10 20 50 75 100 (-) Nồng độ (ng/mL) V HT trắng (mL) Vbình (mL) 0 1 10 15 0 100 50 20 20 20 20 20 Chuẩn bị mẫu kiểm tra nước Chuẩn bị tương tự mẫu chuẩn làm việc để có dung dịch WSQC có nồng độ Amlodipine khoảng 100 ng/mL H2O Mẫu LQC MQC HQC Nồng độ (ng/mL) 40 80 VWSQC (mL) 16 Vbình (mL) 100 20 20 Chuẩn bị đường chuẩn mẫu kiểm tra QC HT: Phối hợp dung dịch chuẩn mẫu QC nước với HT theo tỷ lệ : Xử lý mẫu: 1mL HT + 100µL IS Lắc xoáy 5s Thêm 0,5mL NH3 0,1M Lắc xoáy 15s Thêm 6,5 mL dung môi diethylether: cloroform (7:3) Lắc học 10 phút Ly tâm 4000 vòng/phút x phút Hút 5mL dung môi cô N2 Hòa tan cắn 0,3 mL pha động tiêm sắc ký [...]... dụng cơ bản của phương pháp khối phổ 5.1 Xác định khối lượng nguyên tử và khối lượng phân tử * Xác định nguyên tử các đồng vị: Phổ khối lượng ban đầu được dùng để xác định khối lượng nguyên tử của các đồng vị Dùng máy phổ khối lượng người ta xác định được không những khối lượng mà cả hàm lượng % của các đồng vị Đại đa số các đồng vị đã được tìm ra và được xác định bằng phương pháp phổ khối lượng Ví dụ:... phổ khối (mass accuracy): Độ chính xác phổ khối là đại lượng đo mức độ chênh lệch giữa số khối thực nghiệm của phân tử và khối lượng thực: Δm = mreal − mmeasured Độ chính xác của phổ khối thường được biểu thị bằng giá trị ppm: ppm = 10 6 × Δm / mmeasured Ví dụ: Khối lượng lý thuyết (theoretical mass) = 1000; khối lượng đo được (measured mass) = 999.9 thì độ chính xác phổ khối hoặc độ sai lệch phổ khối. .. ion; - Ion ban đầu (mảnh mẹ); - Năng lượng để phân mảnh ion mẹ tạo thành ion con - Ảnh hưởng của nền mẫu B Thực hành XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AMLODIPIN TRONG DỊCH SINH HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-MS/MS 1 Thực hành quy trình tối ưu hoá các điều kiện sắc ký - khối phổ cho hoạt chất Amlodipin và nội chuẩn 2 Tiến hành phân tích các mẫu chuẩn amlodipin trong huyết tương người bằng phương pháp HPLC-MS/MS... thuật khối phổ nhiều lần do có tính chọn lọc khối cao hơn Giản đồ so sánh khối phổ 1 lần (MS) và khối phổ 2 lần (MS /MS) Hình vẽ dưới là ví dụ cho thấy cần chất phân tích và tạp chất có cùng số khối (m/z = 325) song có cơ chế phân mảnh khác nhau Nếu phân tích bằng sắc ký – khối phổ 1 lần với điều kiện sắc ký mà hai chất đồng rửa giải thì sẽ không xác định được phân biệt trên khối phổ 1 lần (MS) chỉ... pha động,… - Lựa chọn kiểu khối phổ MS hoặc MS-MS: Căn cứ vào đặc điểm của hoạt chất cần phân tích, phương pháp xử lý mẫu và nền mẫu, yêu cầu định tính hay định lượng * Các thông số cần tối ưu hoá đối với phương pháp LC-MS: - Nguồn ion hoá: + Thế ion hoá; + Tốc độ khí của nguồn ion hoá (khí mang, khí bổ trợ, khí làm sạch nguồn); + Nhiệt độ của nguồn ion hoá - Nhiệt độ mao quản chuyển ion hoá; - Thế của... bằng các phương pháp thông thường (do đặc điểm của chất, hoặc do lượng chất quá ít ) thì phương pháp phổ khối lượng là giải pháp tối ưu Ví dụ nhờ có pic ion phân tử trong phổ khối lượng người ta đã xác định được Fe(CO)4(CF2CF2CF2CF2) không ở dạng polime mà là monome với M=368u Đối với trường hợp hợp chất không đủ bền, bằng cách sử dụng các kỹ thuật ion hoá khác nhau, ion hoá mềm, giảm năng lượng ion... chất là n) - Nếu trên phổ đồ có các pic m/z = 94 và m/z = 96 có cường độ gần bằng nhau, ta có thể nghĩ các pic này tương ứng với phân tử CH3Br vì 79Br (50,54%), 81Br(49,96%) Ví dụ: Quá trình xét đoán công thức nguyên của chất cần phân tích dựa trên khối phổ 5.3 Ứng dụng của phương pháp khối phổ trong kiểm nghiệm thuốc Đặc tính nổi bật của khối phổ là tính chọn lọc và độ nhạy cao Vì vậy mà khối phổ thường... xenon bằng phương pháp phổ khối lượng ta tìm được 9 đồng vị với hàm lượng tự nhiên giảm dần theo trật tự sau: 123Xe, 129 Xe, 131Xe, 134Xe, 136Xe, 130Xe, 128Xe, 124Xe, 126Xe * Xác định khối lượng phân tử: Nếu ion phân tử tạo ra mà đủ bền thì khối lượng phân tử được xác định trực tiếp từ các pic có giá trị m/z cao nhất và có cường độ không phụ thuộc vào áp suất Có những trường hợp mà khối lượng phân... tích (nếu biết); đặc điểm của thiết bị khối phổ và kỹ thuật ion hoá; dựa vào các vạch phổ chính trên phổ đồ và các vạch phổ đồng vị Ví dụ, với trường hợp đơn điện tích thì vạch đồng vị của C hơn kém nhau 1,0 amu, đối với trường hợp điện tích đôi vạch đồng vị của C sẽ hơn kém nhau 0,5 amu 4 Một số kỹ thuật ghi phổ Phổ khối 1 lần (MS) và phổ khối nhiều lần (2 lần – MS /MS): Trong phân tích khổ phối, việc... cũng có thể xác định được khối lượng phân tử trong một số trường hợp 5.2 Xét đoán cấu trúc phân tử Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các ion phân tử M+ và khối lượng các mảnh ion Bên cạnh cũng xác định được đó xem xét thêm các pic đồng vị [M+1]+, [M+2]+ và tỷ số cường độ của chúng cùng so với M Đồng thời thông qua phân tích phổ cũng xác định được hiệu số khối lượng của ion phân tử