phương pháp phổ khối lượng

Ưu điểm : Cho biết khối lượng phân tử của các mẫu phân tích, cấu trúc hóa học của của phân tử mẫu thông qua thông tin cung cấp bởi các mảnh.Nhược điểm : Không áo dụng cho những chất khôn

Lê Nhất Tâm

• Kỹ thuật phân tích hiệu quả

• Độ chính xác cao

• Kỹ thuật phân mảnh

• Rất hửu hiệu để xác định cấu tạo

của các hợp chất

Lịch sử hình thành phương pháp khối phổ Những nhà nghiên cứu tiên phong

desorption ionization (MALDI).

w Paul discovered the ion trap technique.

1922 Nobel Prize for Chemistry

(mass

spectrograph, of isotopes, in a large number of non-radioactive elements)

Wolfgang Paul

1989 Nobel Prize for Physics

(for the development of the ion trap technique)

John Bennet Fenn

2002 Nobel Prize for Chemistry (for the development of Soft Desorption ionization

Method )

Koichi Tanaka

2002 Nobel Prize for Chemistry (mass spectrometric analyses of biological macromolecule s)

Nobel prize pioneers

Mass spectrometer

Lý thuyết Mass Spectrometry

Trong mass spectrometer,

Các hiện tương đều xãy ra

tuần tự như nhau, ngoại trừ

các nguyên tử và phân tử

bị tách ra khi đi qua điện

trường và từ trường Tiến

trình này xãy ra trong không

gian nhỏ

Mass spectrometer giống như lăng kính

Trong lăng kính, ánh sáng là

được phân tách thành những

thành phân khác nhau dựa

trên bước sóng của chúng Và

rồi những bức xạ này được

xác định thông qua sự tương

tác detector chuyển hóa thành

những tính hiệu về điện

Tương tự như trong mass

spectrometer các ion được

tách bằng sự khác nhau về

khối lượng và cũng được xác

định bởi detector ion.

NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library 2005

By U.S Department of Commerce

Publisher: Wiley Number Of Pages:

Publication Date: 2005-07-22 ISBN-10 / ASIN: 047175594X ISBN-13 / EAN: 9780471755944 Binding: CD-ROM

NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library is the most popular library for GC/MS instruments, with 190,825 spectra presented.

This software offers:

Các thành phần cơ bản của Mass Spectrometer

Thiết bị phổ khối lượng làm 3

nhiệm vụ chính:

+ Chuyển chất nghiên cứu thành

thể khí ( làm bay hơi mẫu ở áp

suất thấp và nhiệt độ thích hợp

+ Tạo ra các ion từ các phân tử

khí đó

+ Phân tách các ion đó rồi ghi lại

tín hiệu theo tỷ số M/z.e Vì xác

suất tìm thấy z > 1 là rất nhỏ và

điện tích của điện tử là 1 nên M

chính là khối lượng của các ion

Thiết bị phổ khối lượng

là sản xuất

ra ion và xác định khối lượng của chúng

Mass spectrometer

Sample Introduction Techniques

Initial pressure of sample is 760 mmHg or

Mass spectrometer

Direct Insertion sample introduction technique

Là một kỹ thuật đơn giãn Mẫu được lấy bằng syringe đặt biệt và tiêm thẳng vào buồng ion hóa Sau đó là những tác động cho quá trình giãi hấp như giãi hấp bằng laser hay gia nhiệt tạo điều kiện hóa hơi và ion hóa

Direct infusion or injection sample introduction technique

Thường xuyên được sử dụng có có hiểu quả cao.

Dùng trong kỹ thuật kết nối như GC-MS and HPLC-MS

Ionization Methods used in Mass spectrometry

+ Một proton H + được khử ra khỏi hợp chất tạo một anion.

+ Sử dụng cho mẫu acid như phenols, carboxylic acid, sulfonic acid etc + Dùng trong MALDI, APCI and ESI

Hình thành một ion phức bằng cách công hợp một cation kim loại vào phân tử trung hòa như Na + , K + , NH4+

Thường dùng đối với Carbohydrates

Dùng trong các kỹ thuật MALDI, APCI and ESI

Transfer of a charged molecule to the gas phase

Cation được chuyển từ pha lỏng sang pha khí

Sử dụng trong MALDI or ESI

Kỹ thuật phóng Electron

Electron được phóng ra hình thành ion dương Thường là những hợp chất không phân cực có khối lượng phân tử thấp như anthracene.

Kỹ thuật bẩy Electron (EC)

Một điện tích âm tích điện trừ 1 được hình

thành do quá trình hấp thu hay giử một điện từ

Kỹ thuật sử dụng cho các hợp chất halogen

•Electron Ionization (EI)

•Chemical Ionization (CI)

• Electrospray Ionization (ESI)

•Nanoelectrospray Ionization (NanoESI)

•Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)

•Atmospheric pressure photoionization (APPI)

•Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS)

•Fast Atom Bombardment (FAB)

•Thermal ionization (TI)

Các nguồn ion hóa trong mass

spectrometer

Năng lượng được cung

cấp để nung nóng dây

tóc kim loại, làm phát ra

những điện tử Những

điện tử này được tăng

tốc qua một điện trường

có điện thế khoảng 70eV

trước khi đi vào buồng

chứa mẫu Áp suất trong

buồng ion hóa đạt

Các điện tử va chạm với các phân

tử trung hòa tạo ra những mảnh ion, gốc tự do hay phân tử trung hòa

nhỏ Sau đó các ion đi qua một điện trường 400-4000V để tăng tốc, vận tốc ion tỷ lệ với khối lượng của

chúng

Đây là một phương pháp rất phổ

biến dùng nhiều trong GC-MS Quá trình tạo ra nhiều mảnh rất hửu

hiệu khi xác định cấu trúc chất

Electron Ionization (EI)

Ảnh hưởng của năng lượng ion hóa

Electron Ionization (EI)

Quá trình ion hóa theo EI

Electron Ionization (EI)

Quá trình ion hóa pentobarbital

Electron Ionization (EI)

Ưu điểm : Cho biết khối lượng phân tử của các mẫu phân tích, cấu trúc hóa học của của phân tử mẫu thông qua thông tin cung cấp bởi các mảnh.

Nhược điểm : Không áo dụng cho những chất không bền nhiệt hoặc không bay hơi, không phân biệt được các đồng phân.

Electron Ionization (EI)

Khái quát về ion hóa hóa học

+ Ion hóa hóa học là kỹ thuật tạo ra ion dùng trong phân tích quang phổ khối lượng

+ Trong kỹ thuật CI ngoài mẫu và khí mang, còn một lượng lớn khí thử đưa vào buồng ion hóa Lượng khí thử rất lớn so với mẫu hầu như các điện tử phát ra từ dây tóc đều va chạm vào khí thử tạo ion khí thử

+ Các ion khí thử va chạm, phản ứng với các phân tử mẫu tạo ra các ion mẫu.

+ Năng lượng ion hóa trong CI là rất nhỏ so với EI nên số

phân mảnh tạo ra là ít Xác suất hình thành các ion mẹ là lớn nên thường dùng xác định trọng lượng phân tử

+ Có hai cơ chế hình thành ion là ion hóa hóa học dương và ion hóa hóa học âm.

Chemical Ionization (CI)

Tiến trình được bắt đầu với thuốc thử ở thể khí như methane,

isobutane, or ammonia những chất này bị ion hóa bởi dòng điện

tử mang năng lượng cao tạo ra những ion dương khác nhau

Tiếp theo dòng ion này va chạm vào các phân tử khí cần xác định tạo ra những mảnh ion

Ưu điểm : Dùng CI khi phương pháp EI không cho thấy mủi ion phân tử

Nhược điểm: Không áp dụng cho những hợp chất không bền

nhiệt, hay không bay hơi

Ion hóa hóa học dương

Kỹ thuật Ion hóa hoa học dương gồm có 4 quá trình cơ bản:

+ Chuyển proton (Proton transfer)

+ Tách Hydride ( Hydride abstraction)

+ Cộng thêm (addition)

+ Trao đổi điện tích (Charge exchange)

Kỹ thuật ion hóa hóa học

Chuyển proton hóa

Sự chuyển proton có thể biểu diễn như sau:

BH+ + M MH+ +B

+ Khí thử B đã đi qua quá trình ion hóa bằng proton hóa Trong trường hợp này ái lực proton của chất cần phân tích lớn hơn ái lực proton của khí thử nên H+ di chuyển từ BH+ sang MH+ tạo ra ion phân tích dương

+ Trường hợp này thường thấy ở CH5+

, C2H5+ chuyển H+ qua chất cần phân tích tạo ra [M-H]+

+ Ái lực của khí thử là vấn đề chính trong hình thành cation chất xác định Khí thử CH4 được dùng nhiều do ái lực proton của nó thấp

Kỹ thuật ion hóa hóa học

Tách hydride

Trong quá trình ion khí thử Ion chất phản ứng được tạo ra do sự mất hydrua khi tương tác với các ion khí thử Điều này rất thường gặp đối với những alkan mạch dài

Ví dụ khi khí thử là CH4, quá trình tạo ion khí thử là CH5+

. Sự hình thành ion mẫu như sau:

CH5+ + M CH4+ H2 + [M-H] +

Kỹ thuật ion hóa hóa học

Cộng hợp cation vào phân tử

Với nhiều hợp chất hóa học sự tách H+ hay H- không ưu đãi về mặt nhiệt động học quá trình Trong những trường hợp này khí thử thường đủ hoạt tính để cộng hợp với chất phân tích tạo ra ion như: [M-C3H7]+

, [M-C2H5]+

, [M-C3H5]+Ứng với các mủi pick ( M+43), ( M+ 29), (M+41)

Kỹ thuật ion hóa hóa học

Ion hóa trao đổi điện tích

Sự ion hóa trao đổi điện tích có thể mô tả bằng phản ứng sau:

Trong đó X + là khí thử đã được ion hóa, M là chất phân tích Khi các khí thử được sử dụng cho trao đổi điện tử là những khí trơ như He, Ne, Ar,

CO2, N2, H2 v.v Không có khả năng phản ứng với chất phân tích

Kỹ thuật ion hóa hóa học

Ion hóa hóa học âm (NCI)

Kỹ thuật NCI được thực hiện bằng bộ phận phân tích thế phân cực đổi chiều để chọn ion Trong kỹ thuật này, khí thử thường

được xem là khí đệm và khí bị bắn phá điện tử từ dây tóc ở năng lượng cao sẽ xãy ra phản ứng :

Ví dụ như khí thử là CH4 ta có phản ứng như sau:

Điện tử nhiệt là điện tử phát ra từ khí thử nên có năng lượng thấp hơn Chính những enhiệt là những điện tử phản ứng với với các

phân tử mẫu

Kỹ thuật ion hóa hóa học

Cơ chế hình thành NCI thường gồm các kỹ thuật sau :

+ Bắt giử điện tử (Electrone capture)

+ Bắt giử điện tử phân mảnh.(Dissociative electrone capture)+ Hình thành cặp ion (ion pair formation)

Kỹ thuật ion hóa hóa học

Ion hóa bắt giử điện tử

Kỹ thuật ion hóa bắt giử điện tử là kỹ thuật thường gặp trong NCI Trong những điều kiện có thể kỹ thuật này có độ nhạy cao hơn PCI từ 10- 1000 lần

Phản ứng bắt giử điện tử có thể mô tả như sau :

Trong đó MX là phân tử mẫu, enhiệt là điện tử sinh ra do tương tác giữa các điện tử năng lượng và khí thử Trong nhiều trường hợp ion MX+ không bền có thể xãy ra phản ứng nghịch tạo MX tách một điện tử

Kỹ thuật này thường xãy ra ở những dị tố như các nguyên tử

thuộc nhóm hologen

Kỹ thuật ion hóa hóa học

Bắt giử điện tử phân mảnh

Kỹ thuật bắt giử điện tử phân mảnh giống như bắt giử điện tử,

điểm khác biệt là trong kỹ thuật bắt giử điện tử phân tử mẫu bị

phân ly tạo một gốc tự do và một anion Cơ chế của bắt giử điện

tử phân mảnh có thể minh họa như sau:

Các ion và gốc tự do hình thành từ quá trình bắt giử điện tử có thể tái kết hợp tạo thành tạo thành phân tử ban đầu

Kỹ thuật ion hóa hóa học

Kỹ thuật hình thành cặp ion

Cơ chế hình thành cặp ion nhìn chung giống với cơ chế bắt giử điện tử phân mảnh, điểm khác biệt là tạo ra cặp ion dương và âm.Phương trình mô tả sự phân mảnh có thể như sau:

+ Một điểm khác biệt nữa là điện tử không bị bắt giử như hai

trường hợp trên mà vẩn tồn tại sau khi phân mảnh

+ Nguyên do của sự phân mảnh là do sự phân bố không đều về mật độ điện tử liên kết

Kỹ thuật ion hóa hóa học

Electrospray Ionization (ESI)

Do không có sự phân mảnh nên các đại phân tử thành các hạt tích điện nhỏ hơn, thay vì nó biến phân tử được ion hóa thành những giọt nhỏ Những giọt nhỏ này sau đó

sẽ tạo thêm thành những giọt nhỏ hơn, tạo

ra các phân tử với các proton đính kèm Các ion phân tử proton sau đó sẽ được đưa qua máy phân tích khối lượng để phát hiện, và khối lượng của mẫu có thể được xác định

Kỹ thuật eletrospray ionization

Calculations for m/z in spectrum: [M+6H] 6+ [M+5H] 5+ [M+4H] 4+ m/z = 15006/6 =

2501 m/z = 15005/5 =3001 m/z = 15004/4 = 3751[M + 3H] 3+ [M + 2H] 2+ [M + H] 1+ m/z = 15003/3 = 5001 m/z = 15002/2 = 7501 m/z = 15001/1= 15001

- Dung dịch mẫu đi vào vào phun ESI, nơi đặt một điện thế cao.

- Vòi phun ESI phun dung dịch mẫu dưới dạng sương tạo ra

những giọt sương mù tích điện trên bề mặt

- Sự tích điện gia tăng khi dung môi hóa hơi từ những giọt sương

- Mật độ tích điện bề mặt của những hạt sương gia tăng làm cho tương tác tỉnh điện tăng sẽ làm cho hạt bị vỡ chia thành những giọt sương mới nhỏ hơn Tiến trình lập lại như trên cứ như vậỵ tạo ra những hạt sương rất nhỏ

- Từ những giọt sương rất nhỏ tích điện cao tạo ra những ion

mẫu chuyển vào thể khí bằng lực đẩy tỉnh điện

- Những ion đi vào khối phổ và được phân tích

Kỹ thuật eletrospray ionization

• Phân tích Phtốt trong phổ khối lượng 70,000 Da

• Là phương pháp ion hóa mền nhất có khả năng tạo ra

những phức bằng quá trình cho nhận e trong pha khí

• Không bị ảnh hưởng của nền mẫu

Kỹ thuật eletrospray ionization

Ưu điểm

Nhược điểm

Kỹ thuật eletrospray ionization

• Sự hiện diện của các muối, cặp ion của thuốc thử như TFA

có thể làm giảm độ nhạy

• Sự tạo phức có thể làm giảm độ nhạy

• Không thể phân tích nhiều thành phần

• Những ion đa hóa trị rất dể nhầm lẫn nhất là phân tích hổn hợp

• Cần độ tinh kiết cao

Nanoelectrospray Ionization

Đầu mủi phun được thiết kế rất nhỏ và

nó được đặt ở vị trí rất gần với đường

dẫn tới thiết bị phân tích khối phổ Sự

điều chỉnh hợp lý khá đơn giản này thu

được kết quả là làm tăng hiệu quả và

làm giảm lượng mẫu đo

• Tăng sensitive

•Tỷ lệ dòng thấp

• Kích cở hạt nhỏ (~5µ)

Trong APCI dòng chất lỏng được đưa trực tiếp vào nguồn ion hóa Tất cả các bước tiếp theo đều xãy ra ở đây Các hạt lỏng dưới tác dụng của hơi nóng dể dàng hóa hơi phân ly Các phân tử khí được giử ở đây tiếp tục bị ion hóa ở áp suất thường

Atmospheric Pressure Chemical

Ionization (APCI)

Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)

Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)

Atmospheric Pressure Chemical

Ionization (APCI)

Trong kỹ thuật ion hóa APCI, các ion được sinh ra và được phân tích như sau:

-Vòi phun APCI phun dung dịch mẫu thành những giọt sương

-Những giọt sương được hóa hơi trong ống thép nhiệt độ cao

-Thế được áp vào kim đặt gần lối ra của ống thép Thế cao tạo ra

sự phóng điện vòng tròn hình thành những ion phản ứng qua

chuổi những phản ứng hóa học với những phân tử dung môi và khí Nito bao quanh

-Những ion phản ứng lại phản ứng lại phân tử mẫu để hình thành những ion mẫu

- Những ion mẫu vào phổ khối và được phân tích

-Thường sử dụng trong LC-MS

Ưu điểm

•Khi những ion dung môi hiện diện ở áp suất thường, thì sự ion hóa hóa học của các ion phân tử phân tích có hiệu quả cao

• Ở áp suất thường các ion phân tử mẫu thường xuyên va chạm với ion của thước thử

•Quá trình dịch chuyển proton hay phản ứng proton hóa dể xãy ra

• Quá trình cộng điện tử hay khử proton tạo ([M-H]-) dể hình thành

• Những ion đa hóa trị không tồn tại do quá trình ion hóa có năng lượng cao hơn ESI

Atmospheric Pressure Chemical

Ionization (APCI)

So sánh giữa ESI và APCI

Kỹ thuật thường xãy ra với HPLC Kỹ thuật này dùng phân tích các hợp chất không phân cực

APPI hóa hơi mẫu bằng tia ultra-violet APPI có độ nhạy cao hơn ESI or APCI.

Nhiều quá trình ion hóa đòi hỏi

năng lượng khoảng 10eV

tương ứng với các photon có

bước sóng từ 83nm-153nm

nằm trong vùng tử ngoại chân

không do đó có thể tiến hành

bằng va chạm photon.

Khối phổ đạt được tương tự

như EI Do năng lượng nhỏ

hơn nên phổ này chủ yếu cho

các ion phân tử và một số mảnh

có số khối lớn

Atmospheric pressure

photoionization (APPI)

Atmospheric pressure photoionization (APPI)

(350-Atmospheric pressure

photoionization (APPI)

Matrix-assisted laser desorption

Ionization- MS (MALDI-MS)

+ Trong kỹ thuật này người ta đưa từ

ngoài vào một chất nền Chất nền là

những chất có phân tử lượng lớn

thường là những axit hửu cơ yếu

+ Chất nền được trộn đều với chất cần

phân tích

+ Sự chiếu xạ hổn hợp gồm chất nền

và chất phân tích bằng tia laser kết quả

dẫn tới sự bay hơi của chất nền mang theo cả

chất cần phân tích.Trong kỹ thuật này chất nền đóng một vai trò rất quang trọng Các phân tử mẫu hóa hơi nhưng không trực tiếp hấp thu năng lượng laser Điều này dẫn tới các phân tử không bị tia laser biến đổi

+ Chất manh thường dùng trong kỹ thuật này là axit sinapinic hay gentisic.

+ Hổn hợp này hấp thu ở mạnh ở bước sóng laser 355nm Khi chiếu tia laser lên, do hổn hợp hấp thu năng lượng lớn, chất phân tích được giãi hấp ra khỏi chất mang và rồi có sự trao đổi proton giữa chất mang bị quang hoạt với chất cần khảo sát dẫn tới tạo ra ion chất cần khảo sát

Matrix-assisted laser desorption

Ionization- MS (MALDI-MS)