Phân lập, định danh và khảo sát một số tính chất của vi khuẩn lactic từ mắm rò

Các nguồn vi khuẩn lactic có thể tìm thấy ở trong một số sản phẩm lên men như: rau quả muối chua, kim chi, sữa chua, pho mai… Mắm là sản phẩm nước chấm quen thuộc.. Với xu thế hiện công

PHẦN 1

MỞ ĐẦU

Xã hội ngày càng phát triển, nhu cầu về ăn uống càng được chú trọng, thực phẩm không chỉ dùng để ăn no mà còn yêu cầu rất cao về chất lượng Xuất phát từ nhu cầu đó mà các nhà nghiên cứu thực phẩm đã và đang phát triển các sản phẩm thực phẩm theo hướng thực phẩm chức năng Một trong những sản phẩm chức năng mang lại nhiều lợi ích cho người tiêu dùng

là sản phẩm có bổ sung chế phẩm probiotic Đây là một chế phẩm sinh học được sản xuất từ

vi khuẩn lactic Probiotic giúp cơ thể hấp thụ các chất dinh dưỡng, các thành phần như vitamin K

Vi khuẩn lactic đóng vai trò quan trọng sản xuất cũng như bảo quản thực phẩm Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn gram dương, oxydase và catalase âm tính, có dạng hình que hay hình cầu, không tạo bào tử, tạo ra acid lactic là sản phẩm cuối cùng chủ yếu trong quá trình lên men carbonhydrate [21] Các nguồn vi khuẩn lactic có thể tìm thấy ở trong một số sản phẩm lên men như: rau quả muối chua, kim chi, sữa chua, pho mai…

Mắm là sản phẩm nước chấm quen thuộc Nguyên lí chung của quá trình sản xuất mắm

là sự phân giải protein của cá nhờ hệ vi sinh vật cá Vi khuẩn lactic đóng vai trò quan trọng quyết định hương vị, chất lượng của mắm

Với xu thế hiện công nghiệp hóa hiện đại hóa, các sản phẩm lên men truyền thống không chỉ sản xuất nhỏ lẻ ở quy mô hộ gia đình mà được sản xuất công nghiệp.Vì vậy nhu cầu về sử dụng vi khuẩn lactic như nguồn giống khởi đầu cho quá trình lên men thực phẩm cũng như ứng dụng các khả năng của vi khuẩn này trong thực phẩm ngày càng cao

Huế là vùng đất phong phú về thiên nhiên, có đường bờ biển dài các loại hải sản đa dạng, bên cạnh đó có rất nhiều các sản phẩm truyền thống: mắm ruốc, mắm nêm, mắm cá nục

và mắm rò Đặc biệt mắm rò là sản phẩm của quá trình lên men truyền thống nhờ vi khuẩn lactic phân giải protein từ cá kình khi còn nhỏ nên chứa một hệ vi khuẩn lactic rất phong phú

Để góp phần hoàn thiện các sản phẩm thực phẩm cũng như khai thác một số tính chất có

lợi của hệ vi khuẩn lactic, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân lập, định danh và khảo sát một

số tính chất của vi khuẩn lactic từ mắm rò”.

PHẦN 2 TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệu về mắm rò

2.1.1 Sơ lược về mắm rò

Mắm rò là đặc sản tiêu biểu ở Huế, là loại nước chấm không thể thiếu khi

sử dụng món thịt luộc trong bữa ăn của người Huế Mắm rò được làm từ nguyên liệu là cá kình nhỏ Loài cá này sống chủ yếu ở vùng nước lợ hoặc vùng biển nóng và êm Cá kình thịt ngọt, mềm, xương nhỏ, nên sau khi làm mắm, ta có thể

nhai nguyên con.

Quá trình làm mắm rò thực hiện rất công phu và qua nhiều công đoạn phức tạp Cá sau khi đánh bắt về tiến hành rửa cho sạch nhớt Yêu cầu không được làm nát cá sau đó sẽ tiến hành rửa, nước rửa phải là nước biển hoặc nước muối pha loãng Cá sau khi ráo nước sẽ được muối theo công thức: Sáu phần cá, một phần muối hột, ướp khoảng mười lăm phút đến nửa giờ cho cá thấm đều muối Sau đó, cho vào lu vại, ém chặt xuống bằng nẹp tre Sau để qua ba mươi ngày lên men là có thể ăn được.

Hình 2.1 Mắm rò

2.1.2 Cơ sở của quá trình sản xuất mắm rò

Quá trình lên men tạo thành mắm là quá trình oxy hóa khử sinh học dưới tác dụng của hệ enzyme của vi sinh vật và enzyme trong ruột cá Sản phẩm tạo

ra của quá trình lên men là axit lactic.

Hai quá trình chính diễn ra trong quá trình lên men để hình thành nên sản phẩm mắm: trình lên men tạo thành axit lactic từ các nguồn cơ chất khác nhau

và quá trình thủy phân protein thành các axit amin và các peptides.

Quá trình lên men lactic tạo ra nhiều sản phẩm trung gian tạo hương vị đặc trưng cho mắm Quá trình này gồm nhiều giai đoạn, giai đoạn đầu của quá trình chuyển hóa là tạo sản phẩm chung axit pyruvic Tiếp đến axit pyruvic bị khử thành axit lactic, cùng với quá trình này là quá trình lên men rượu, lên men axit acetic, axit propionic và axit butylic…

Sự phối hợp của các thành phần chính là axit lactic cùng với rượu etylic, axit acetic… Theo thời gian sẽ tạo nên hương vị cho sản phẩm

Quá trình thủy phân protein diễn ra do sự hoạt động của hệ enzyme protease có trong bản thân nguyên liệu, trong quá trình này protein sẽ bi thủy phân tạo thành các sản phẩm: Protein Pepton Polipeptide Peptide Axit amin

Đây là một dạng ươn thối thường gặp ở thuỷ sản Quá trình này về bản chất là không có lợi cho sản phẩm vì nó tạo ra các hợp chất amin có mùi khó chịu Tuy nhiên các hợp chất này nếu

tồn tại ở một hàm lượng nhỏ sẽ tạo nên hương vị đặc trưng cho sản phẩm, nhất là khi phối hợp với các axit bay hơi Vì vậy vấn đề cần giải quyết của quá trình làm mắm chính là việc khống chế kiểm soát quá trình thuỷ phân protein [10].

2.2 Tổng quan về vi khuẩn lactic

2.2.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacteriacae Các chủng vi khuẩn thuộc họ

này có đặc điểm hình thái, sự chuyển hóa và tính chất sinh lý tương tự nhau Chúng được xác định là vi khuẩn gram dương hình cầu hoặc que, catalase và oxidase âm tính, không di động, không hình thành bào tử, nhiều loài là những vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, vi hiếu khí và có khả năng tồn tại cả hiếu khí cũng như

kỵ khí [21].

Nhóm vi khuẩn lactic gồm các chủng khác nhau: Lactobacillus,

Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus [16].

Vi khuẩn lactic tồn tại trong cơ thể con người, động vật và trên cây cỏ Trong cơ thể người nó có mặt ở đường ruột cũng có thể có ở đường sinh dục trong hệ hô hấp [36].

Trong công nghệ thực phẩm vi khuẩn lactic đóng vai trò quan trọng Chúng

có mặt trong các sản phẩm lên men như: sữa chua, phomat, cải chua, cà muối, măng chua, kim chi, trong các loại mắm, nước mắm… Vai trò của vi khuẩn lactic tạo cấu trúc và hương vị cho các sản phẩm lên men Đối với nước mắm và các sản phẩm mắm như mắm ruốc, mắm nêm, mắm rò thì vi khuẩn lactic ngoài vai trò sinh hương chúng còn có vai trò thủy phân protein quyết định đến độ chín của nước mắn cũng như các loại mắm khác Tuy nhiên sự phát triển không kiểm soát cũng là nguyên nhân gây hư hỏng thực phẩm Theo nghiên cứu của

Udomsil (2010) cho biết Tetragenococcus halophilus có khả năng thủy phân

protein Bảy chủng đã được chọn vào ứng dụng trong hoạt động thủy phân

protein và sinh các hợp chất gây hương trong 64 chủng Tetragenococcus

halophilus đã được phân lập [77] Trong cùng một sản phẩm thực phẩm có thể

tồn tại nhiều loài vi khuẩn lactic nhưng không phải loài nào cũng có các đặc tính

có lợi cho sản phẩm mà chỉ có một vài loài Ví dụ: Lactobacillus, Leuconotoc,

Pediococcus quyết định quá trình lên men trong các sản phẩm lên men rau quả,

còn trong các sản phẩm lên men từ sữa vi khuẩn lactic đóng vai trò quyết định

chất lượng sản phẩm chỉ có Lactococcus.

2.2.2 Những đặc điểm chủ yếu phân biệt các chi vi khuẩn lactic

Các chi của vi khuẩn lactic có nhiều đặc điểm giống nhau về hình thái

Theo Axelsson (2004), vi khuẩn lactic gồm các chi chính sau: Aerococcus,

Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconotoc, Oenococcus, Pediococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella Việc

khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu vi khuẩn lactic bởi việc này giúp công nghệ vi sinh xác định đến cấp độ chi của loài vi khuẩn lactic thông qua đặc điểm sinh lý, sinh hóa Từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình nghiên cứu Những đặc điểm sinh lý, sinh hóa sử dụng trong việc phân biệt giữa các chi là: Khảo sát khả năng phát triển ở 10˚C, 45˚C, khả năng chịu hai nồng độ muối 6%, 18%, khả năng chịu pH tại hai giá trị là 4,4; 9,6 Khả năng sinh CO 2 từ glucose và khả năng sinh axit lactic [18].

Qua khả năng lên men các loại đường khác nhau để tạo axit người ta phân loại các chi vi khuẩn lactic Hiện nay nhờ thành tựu của sinh học phân tử, có thể phân loại vi khuẩn lactic bằng một số phương pháp như DGGE, giải trình tự DNA ribosome 16S.

Bảng 2.1 Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lacic

10 o C

Phát triển ở

45 o C

Phát triển ở

pH 4,4

Phát triển ở

pH 9,6

Phát triển ở NaCl 6,5%

Phát triển ở NaCl 18%

Sinh axit lactic

(Nguồn:Axelsson, 2004) +: Dương tính; −: âm tính; ±: khác nhau giữa các loài; ND: chưa xác định

a: một cách kiểm tra tương đối kiểu lên men axit lactic là đồng hình hay dị hình, nếu đồng hình sẽ cho kết quả âm tính và ngược lại.

b: Có thể sinh một lượng nhỏ CO2 tùy thuộc vào loại môi trường

c: Khác nhau tùy theo loài

2.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic

2.2.3.1 Quá trình lên men lactic

Quá trình chuyển hóa yếm khí gluxit thành axit lactic nhờ hoạt động sống của vi sinh vật, điển hình là vi khuẩn lactic được gọi là quá trình lên men Có hai kiểu lên men lactic : lên men đồng hình và lên men dị hình.

 Lên men lactic đồng hình.

Quá trình lên men đồng hình axit pyruvic tạo thành thông qua con đường Embden-Mayerhor-Panas Pyruvic tạo thành axit lactic nhờ enzyme lactatedde- hydrogenaes.

Hình 2.2 Cơ chế của quá trình lên men đồng hình [5]

Lượng acid lactic hình thành chiếm 90 – 98% trong sản phẩm và chỉ một lượng nhỏ axit axetic, CO2, etanon và axeton được tạo thành do pyruvat bị khử cacbon [5]

Phương trình tổng quát:

C6H12O6 CH3COCOOH + 2H CH3CHOHCOOH + 22,5 kcal

 Lên men lactic dị hình

Do vi khuẩn lactic không có enzyme cơ bản của sơ đồ Parnas, vì vậy xilulose 5-Photphate sẽ được tạo thành theo con đường pentozo- phosphate.

Embden-Mayerhor-Hình 2.3 Sơ đồ lên men lactic dị hình

(Nguồn: Prescott và cs (2002) [66]Trong trường hợp này chỉ có 50% lượng đường tạo thành axit lactic, ngoài ra còn có các sản phẩm phụ khác như: axit axetic, etanon, CO2 Các sản phẩm phụ tương tác với nhau tạo thành este có mùi thơm

2.2.3.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic rất phức tạp Vi khuẩn lactic đòi hỏi môi trường dinh dưỡng rất cao đặc biệt là vi khuẩn lên men đồng hình, rất kén chọn thành phần dinh dưỡng trong môi trường và chỉ phát triển được trong môi trường có tương đối đầy đủ các axit amin hoặc các hợp chất nitơ phức tạp hơn cũng như các thành phần vitamin [8], [9]

 Nhu cầu dinh dưỡng cacbon

Nguồn năng lượng quan trọng hơn đối với vi khuẩn lactic là monossaccarit

và disaccharide, trong đó phải kể đến glucose, lactose, saccrose và maltose Vi khuẩn lactic cũng có thể sử dụng được cả các polysaccharide (dextrin, tinh bột) cho mục đích năng lượng của chúng.

 Nhu cầu dinh dưỡng Nitơ

Phần lớn các vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp các chất hữu

cơ phức tạp có chứa nitơ Vì vậy, chúng rất cần các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường để đảm bảo sự phát triển của mình Đa số các vi khuẩn lactic sử dụng nguồn nito dưới dạng nhiều hỗn hợp các amino axit Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn cần những hợp chất hữu cơ phức tạp chứa nitơ như sản phẩm thủy phân protein từ thịt, casein, pepton.

 Nhu cầu vitamin và các chất hữu cơ khác

Hầu hết các vi khuẩn lactic không tự tổng hợp được các vitamin trong khi vai trò của nhóm chất này đối với chúng lại rất có ý nghĩa Cũng như đối với các vi sinh vật khác, các vitamin vừa kích thích sự phát triển (tham gia vào nhóm ngoại của các enzyme) vừa điều hòa quá trình cân bằng năng lượng của cơ thể Chính vậy trong các môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic người ta thường phải bổ sung các nguồn cơ chất chứa nhiều vitamin như dịch chiết khoai tây, cà rốt, nước ngô hoặc dịch tự phân nấm men…

Ngoài các axit min và các vitamin, sự phát triển của vi khuẩn lactic còn cần đến một loạt các nhân tố hữu cơ khác Các chất này có tác dụng điều hòa sinh trưởng và khả năng tích

tụ một số sản phẩm trao đổi chất Tiêu biểu cho nhóm này phải kể đến các axit hữu cơ và các bazơ nitơ như Adenin, Guanin, Hypoxantin, Uraxin, Thinin, Thimidin và chất kích thích Biotin

Các loại axit béo như oleic, linolenic cũng có tác dụng điều hòa sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic

 Nhu cầu của muối vô cơ

Để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic cần rất nhiều hợp chất vô cơ từ Cu, Fe, Na, K, P, S, Mn, Mg, đặc biệt là Mn Chính

Mn ngăn cản quá trình tự phân của tế bào và cần thiết cho quá trình sống bình thường của vi khuẩn này Đối với vi khuẩn lactic thì Mn2+, Mg2+, Fe2+ có tác động tích cực đến sự phát triển và sản sinh axit lactic [1].

2.2.4 Phân loại chủng vi khuẩn lactic

2.2.4.1 Enterococcus, Lactobacillus, Steptococcus, Vagococcus

Chi Streptococcus là một chi lớn và khó phân loại một cách hoàn hảo Chi Streptococcus được phân thành 3 nhóm: sinh mủ, miệng và liên cầu khuẩn streptococci “khác.Một số tác nhân gây bênh nổi bật như S pyogenes và S agalactiae nằm ở nhóm sinh mủ S pneumonia là loài trước kia thuộc nhóm sinh

mủ nhưng bây giờ được chuyển qua nhóm miệng [73] Trong thực phẩm được sử

dụng nhiều nhất là loài S themorphilus chủ yếu là trong các sản phẩm sữa S

themorphilus là loài thuộc nhóm miệng, đây là loàicó khả năng chịu nhiệt độ cao,

chúng có thể phát triển ở 52˚C [41].

Trong công nghệ chế biến sữa Lactococcus đóng vai trò rất quan trọng đặc biệt là Lc lactis Ba loài của Lc.lactis có thể được phân biệt là: Lc.lactis subsp.lactis, Lc.lactis subsp.cremoris và Lc.lactis subsp.hordniae Trong đó Lc.lactis subsp.lactis, Lc.lactis subsp.cremoris có vai trò quan trọng trong chế biến sữa Dựa vào các đặc điểm về nhiệt độ,

pH, nồng độ muối khác nhau để phân biệt các chi Lactococcus, Streptococcus và Enterococcus Lactococcus không thể phát triển ở 40˚C, nồng độ muối 6,5%, pH 9,6 trong khi

đó Enterococcus có thể phát triển bình thường ở ba điều kiện trên Đối với Steptococcus thì

các loài thuộc nhóm này không có cùng qui luật

Vagococcus là chi mới được mô tả dễ bị nhầm lẫn với Lactococcus, nhưng các chi được

phân biệt rõ ràng bởi thành phần axit béo

Enterococcus không có vai trò quan trọng trong ngành công nghệ thực phẩm Một số loài như E faecalis là loài có thể gây bệnh cơ hội Tuy nhiên hiện nay, các chế phẩm của E faecium

và E faecalis được sử dụng như là probiotic Enterococcus cũng đã được chứng minh là có mặt

trong một số loại phô mai địa phương ở phía nam châu Âu [33]

2.2.4.2 Aerococcus, Pediococcus, Tetragenococcus

Vi khuẩn lactic dạng tetrad gồm có 3 chi: Aerococcus, Pediococcus, Tetragenococcus Aerococcus là chi ít được ứng dụng trong công nghệ thực phẩm.

Pedicoccus đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ thức phẩm [31] Chúng là

dạng vi khuẩn lactic lên men đồng hình, chịu axit, tồn tại trong thực phẩm theo hai hướng là

tiêu cực và tích cực Hai loài P.damnosus là một tác nhân chính làm hỏng bia, vì sự phát triển của chúng có thể dẫn đến sự tạo thành diacetyl và acetoin, làm cho bia có vị giống bơ P acidilactici và P.pentosaceus được sử dụng làm giống nuôi cấy khởi đầu trong sản xuất xúc

xích và ủ thức ăn gia súc [39] Chúng còn có vai trò quan trọng trong sự chín của phô mai Hai loài này được phân biệt bởi đặc tính chính là các loại đường lên men, thủy phân

arginine,tăng trưởng ở mức pH khác nhau (7,0 và 4,5).

Chi Tetragenococcus trước đây được coi là Pediococcus halophilus Chi này có vai trò

quan trọng trong các thực phẩm, chịu được nồng độ muối cao như sản phẩm nước mắm, nước tương Chúng có khả năng chịu được nồng độ muối cao (18%) và cần nồng độ muối 5% để phát triển Đây là đặc điểm để phân loại với các vi khuẩn lactic khác [18]

2.2.4.3 Leuconostoc, Oenococcus, Weissella

Chi Leuconostoc được xem như là vi khuẩn lactic dạng hình cầu, lên men dị hình, chỉ sản xuất D-lactic từ glucose, không sản xuất ammonia từ arginine Rất dễ nhầm lẫn giữa Leuconostoc

với một số vi khuẩn lên men dị hình dạng cầu – trực

Weissella trước đây được xem như Ln paramesenteroides; Ln confusus; Ln viridesens Weissella gồm các vi khuẩn “giống như Leuconostoc” Chi này vừa có dạng hình

cầu vừa có dạng hình que [18]

Ln oenos là tên gọi của Leuconostoc rượu vang theo các nghiên cứu phát sinh loài tiết

lộ Dựa vào axit cuối cùng và khả năng chịu cồn có thể phân biệt Oenococcus và Leuconostoc nhưng việc phân biệt giữa Weissella và Leuconostoc vẫn là một vấn đề nan giải [38]

2.2.4.4 Lactobacillus và Carnobacterium

Lactobacillus là chi lớn nhất trong nhóm vi khuẩn lactic Chúng là những vi khuẩn gram

dương, catalase âm tính, sinh trưởng trong điều kiện kỵ khí không bắt buộc hoặc vi hiếu khí Chi này gồm rất nhiều loài, chúng có các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác nhau, nên để phân

biệt giữa các loài trong chi Lactobacillus có thể dựa vào đặc điểm sinh lý, sinh hóa Các loài trong chi Lactobacillus có thể tiến hành cả lên men lactic đồng hình thông qua con đường Embden-

Meyerhof hoặc dị hình thông qua con đường pentose-phosphate Chúng phát triển mạnh trong môi trường có tính axit, tùy loài mà pH dao động từ 4,5 đến 6,4

Nhiều loài trong Lactobacillus được ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, chúng

thường được sử dụng trong ủ chua thức ăn và lên men rau quả Chúng là những vi khuẩn rất phổ biến trong tự nhiên, chúng còn được tìm thấy trong khoang miệng, đường tiêu hóa và

âm đạo của người và động vật Các vi khuẩn lactic có nhiều lợi ích khi tồn tại trong cơ thể vật chủ như kích thích tiêu hóa, ngăn ngừa tiêu chảy, kích thích hệ miễn dịch

Các loài thuộc chi Carnobacterium ban đầu được phân loại là nhóm III của chi Lactobacillus, bao gồm: Lb divergens, Lb carnis, và Lb piscicola Tuy nhiên các nghiên cứu sau này đã chỉ ra một số tính chất khác biêt so với Lactobacillus là có khả năng sống sót ở pH

9,6, thành phần axit béo Do đó chúng được tách ra và tạo thành một chi riêng biệt

Carnobacterium được tìm thấy trong thịt và các sản phẩm thịt nơi mà chúng có thể sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ [18].

2.2.5 Một số tính chất có lợi của vi khuẩn lactic

2.2.5.1 Khả năng chịu muối của vi khuẩn lactic

Các sản phẩm sản xuất theo phương pháp lên men phải chứa một nồng độ muối nhất định như: Cải bắp muối chua có nồng độ muối là 1,8-2,25%, dưa chuột muối chua có nồng độ

muối là 6%-10% [7].Việc khảo sát khả năng chịu muối của các chủng vi khuẩn lactic có vai

trò lớn trong ngành công nghệ thực phẩm Vi khuẩn lactic sẽ được nghiên cứu khai thác để bổ sung vào một số qui trình công nghệ sản xuất nhằm tăng giá trị của sản phẩm

Nhiều nghiên cứu đã khảo sát khả năng chịu muối của vi khuẩn lactic trong khoảng dao

động lớn từ 0% - 40% Những nghiên cứu về khả năng chịu muối của vi khuẩn lactic như Kozaki và các cộng sự (1992), Axelsson (2004), Lee (2010), Sunilvà Basappa (2013).

Kozaki và các cộng sự (1992) nghiên cứu khả năng chịu muối của vi khuẩn lactic ở các nồng độ muối là 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7% và ảnh hưởng của các nồng độ này đến khả năng lên men của vi khuẩn lactic đối với rau quả Kết quả thu được tất cả các loài đều có khả năng chịu muối tốt ở các nồng độ này, mật độ tế bào sau 24 giờ phát triển so với 0 giờ là tăng một cách

rõ rệt [47]

Axelsson (2004) nghiên cứu vi khuẩn lactic phát triển tốt ở hai nồng độ muối là 6,5% và 18% Kết quả này chứng tỏ rằng vi khuẩn lactic có khả năng phát triển ở hai ngưỡng nồng độ muối [18] Theo nghiên cứu của Lee (2010), khảo sát khả năng chịu muối của vi khuẩn lactic trong khoảng rộng từ 0% đến 40% Tác giả nghiên cứu sự phát triển của vi khuẩn lactic qua các nồng độ muối: 0%, 10%, 20%, 30% và 40% Kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn lactic

có khả năng chịu muối ở các nồng độ này [49]

Karimpour (2013) tiến hành khảo nghiệm khả năng phát triển của L Rhamsonus, L plantarum tại nồng độ muối 15% và cho thấy chúng có khả năng phát triển tại nồng độ muối

này [40]

Sunil và Basappa (2013), hai tác giả này tiến hành khảo sát khả năng chịu muối của

Lactococcus garvieae tại nồng độ 5%, 15%, 25%, kết quả thu được là Lactococcus garvieae

có khả năng phát triển tốt ở 5%, phát triển yếu ở 15% và không phát triển ở 25% [75]

Theo công bố của Udomsil (2010) đã khảo sát khả năng chịu muối của Tetragenococcus halophilus được phân lập từ nước mắm Kết quả cho biết Tetragenococcus halophilus có khả

năng phát triển ở nồng độ muối 25% và lựa chọn 7 chủng trong 64 chủng đã phân lập để ứng dụng trong các sản phẩm có nồng độ muối ở 25% nhằm thực hiện hoạt động thủy phân protein và tạo nên các hợp chất sinh hương để bổ sung vào một số qui trình sản xuất [76]

2.2.5.2 Tiềm năng probiotic của vi khuẩn lactic

a Định nghĩa probiotic

Probiotic đã được các nhà nghiên cứu định nghĩa trong suốt nhiều năm Qua các nghiên cứu giúp hiểu rõ hơn về mối quan hệ của chúng với sức khỏe đường ruột Probiotic có nguồn gốc từ Hy Lạp, mang nghĩa là “sự sống” Theo đó các định nghĩa về “probiotic” được bắt nguồn trong suốt các thời gian sau

Theo Lilly và Stilwell (1965) đã định nghĩa về probiotic là “yếu tố thúc đẩy tăng trưởng bởi vi sinh vật”

Theo ILSI (International Life Scienes Institute) Europe Working Group (1998): “Thực phẩm bổ sung vi sinh vật có lợi cho sức khỏe vật chủ”

Schrezenmeir và Vrese (2001) định nghĩa về probiotic “Một sản phẩm có chứa vi sinh vật đạt số lượng thích hợp và chúng làm thay đổi hệ vi sinh vật cho vật chủ theo chiều hướng

có lợi đến sức khỏe của vật chủ”

FAO/WHO (2001) và Reid et al (2003) hướng vào mục đích sức khỏe đã đưa ra định nghĩa “Vi sinh vật sống mà khi dùng với số lượng hợp lý sẽ có lợi cho sức khỏe người tiêu dùng” [18]

b Lợi ích của probiotic

 Kích thích hệ miễn dịch

Hệ miễn dịch gồm có miễn dịch tự nhiên và miễn dịch nhân tạo Thành phần quan trọng trong hệ miễn dịch tự nhiên là: đại thực bào (Macrophage), tế bào trung tính (Neutrophil), tế bào giết tự nhiên (natural killer – NK), dehuyết tương Chúng là hàng rào đầu tiên bảo vệ cơ thể chống lại vi sinh vật bằng cách trình diện kháng nguyên sau đó tiêu diệt tế bào của chúng Tuy nhiên có những tác nhân gây bệnh mà hệ miễn dịch tự nhiên không nhận diện được thì hệ thống miễn dịch do thích nghi cung cấp thêm các công cụ bảo vệ trong khi hệ thống miễn dịch tự nhiên thì điều chỉnh sự khởi đầu và hướng dẫn các phản ứng miễn dịch tương ứng Chủng probiotic có thể thay đổi các thông số của miễn dịch, kích thích hoạt động của các tế bào miễn dịch Sự có mặt của vi khuẩn lactic còn

có khả năng kích thích sản sinh kháng thể IgA [19]

 Giảm nguy cơ tiêu chảy, kìm hãm vi sinh vậ gây bệnh đường tiêu hóa

Nhiều nghiên cứu cho thấy việc sử dụng sản phẩm chứa probiotic có tác dụng ức chế sự phát triển của các loài gây bệnh tiêu chảy cấp do vi khuẩn

Salmonella, Clostridium cũng như virut Rota.Theo nghiên cứu Klingberg, và các

cộng sự (2004) đã khảo nghiệm về khả năng kháng S.typhimurium, E.coli… [44].

Các vi sinh vật gây bệnh của probiotic bị ức chế theo hai hướng:

Một là, chúng là những vi sinh vật sống khi vào trong đường tiêu hóa, chúng sẽ cạnh tranh chất dinh dưỡng, cạnh tranh chỗ cư trú với vi sinh vật gây bệnh, tiết ra các enzyme hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa Hai là, chúng có khả năng sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn như bacteriocin Nhiều nghiên

cứu đã khảo sát về khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh như Salmonella, E

coli, S aureus…Ví dụ, nghiên cứu của Ghyandeep (2010) đã khảo sát khả năng

kháng S aureus của Lactobacillus [34].

 Giảm nguy cơ nhiễm Helycobacter pylori

Khoảng 50% dân số trên thế giới bị nhiễm loại vi khuẩn helycobacter

pylori Đây là loài vi khuẩn rất nguy hiểm nếu chúng tồn tại lâu trong cơ thể sẽ

dẫn đến viêm loét dạ dày và ung thư dạ dày Nhiều nghiên cứu cho thấy, probiotic có thể ức chế loài vi khuẩn này và làm giảm hoạt tính enzyme urease

là enzyme tạo điều kiện thích nghi cho vi khuẩn Helycobacter pylori tồn tại

trong dạ dày [30]

 Giảm hấp thu cholesterol và lượng cholesterol trong huyết thanh

Sử dụng các sản phẩm probiotic có khả năng làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu [30] Do chủng Lactobacillus liên kết với cholesterol

trong khoang ruột vì thế giảm khả năng hấp thu cholesterol vào máu [51]

Toranto (1998) và cộng sự của mình đã tiến hành thử nghiệm trên chuột

mắc chứng cholesterol cao và nhận thấy việc đưa một lượng nhỏ Lactobacillus

reuteri trong 7 ngày làm giảm lượng cholesterol và triglyceride tổng số tương

ứng là 38% và 40% [30]

Mohan (1990) đã chứng minh các bệnh nhân cao cholesterol trong huyết

thanh được điều trị bằng cách bổ sung Lactobacillus sporogenes đã giảm được

32% lượng cholesterol trong huyết thanh so với tổng số sau 3 tháng điều trị [30]

 Ngăn ngừa ung thư

Nghiên cứu của Baldwin, và cộng sự (2010) cho rằng Lactobacillus

acidophilus và Lactobacillus casei có thể được dùng như chất phụ gia trong chống

ung thư hóa trị Probiotic và prebiotic kết hợp với nhau có khả năng ngăn ngừa ung thư đại trực tràng [20]

2.2.5.3 Tiêu chí tuyển chọn probiotic

 Khả năng chịu pH thấp

Để ứng dụng các chế phẩm probiotic trong y học cũng như làm thực phẩm chức năng thì các chế phẩm này phải chịu được điều kiện khắc nghiệt pH thấp của dạ dày Do đó để vi khuẩn lactic có thể có tiềm năng probitic thì trước hết chúng phải sống và tồn tại trong điều kiện của môi trường Theo nghiên cứu thì

pH dạ dày của người dao động từ 1 - 4.

Đã có nhiều nghiên cứu để khảo sát tính chất này, một số nghiên cứu khảo sát khả năng sống sót của chủng nghiên cứu ở các mốc pH từ 1 đến 3 hoặc 4, một số nghiên cứu chỉ khảo sát ở pH đại diện của dạ dày (pH = 2-2,5)

 Khả năng chịu muối mật

Khi chọn vi khuẩn làm probiotic thì cần phải khảo sát khả năng chịu muối mật của loài vi khuẩn lactic đó, để tồn tại được trong ruột non thì loài đó phải chịu được muối mật Thành phần chính trong muối mật là muối của của axit cholic và các dẫn xuất của nó, có chứa nhân cholesterol Để khảo sát khả năng này, các nhà nghiên cứu dùng mật bò với nồng độ từ 0,1%-0,3% để tiến hành Nồng độ này tương ứng với nồng độ muối mật trong ruột người [44]

 Khả năng bám dính

Bám dính là khả năng liên kết của bề mặt tế bào vi khuẩn probiotic với vật chủ Chỉ tiêu quan trọng trong việc đánh giá khả năng bám dính của vi khuẩn probiotic có liên quan đến tác động của chúng với vật chủ, đó là khả năng tự kết dính, đồng kết dính và bám dính với đường ruột của vật chủ.

Khả năng tự kết dính là khả năng các tế bào vi khuẩn cùng loại tự dính với nhau trong môi trường lỏng Nhờ khả năng này mà vi khuẩn lactic có thề hình thành các quần thể khuẩn lạc trong dịch lỏng, tạo ra sự hỗ trợ về mặt sinh thái đối với các tế bào trong quần lạc

Khả năng đồng kết dính là khả năng dính với nhau của 2 hoặc nhiều tế bào vi khuẩn của

2 hoặc nhiều loài khác nhau Với khả năng này vi khuẩn lactic có thể đồng kết dính với các tế bào của các loài gần gũi với chúng và tạo ra hiệu quả tương tự sự tự kết dính Do đó chúng tạo ra sự ức chế mạnh hơn lên vi khuẩn gây bệnh

Khả năng bám dính với đường ruột Đây là tính chất rất quan trọng bởi khả năng này giúp vi khuẩn có thể bám vào đường ruột để tồn tại và phát triển như vậy chúng mới có thể cạnh tranh nơi cư trú, chất dinh dưỡng với các vi khuẩn gây hại khác [23], [44], [69]

 Khả năng kháng kháng sinh

Một số chủng vi khuẩn lactic có thể kháng được một số kháng sinh [43]

Một nghiên cứu tại Trung Quốc đã đưa ra khả năng kháng 11 loại kháng sinh

(Ampicillin, Penicilin, Roxithromycin, Chloramphenicol, Tetracy-cline, Chlortra

cycline, Lincomycin, Kanamycin, Streptomycin, Neomycin, Genamycin) của 43

chủng vi khuẩn lactic (18 loài Lactobacillus bulgaricus và 25 loài Streptococcus thermophilus) Trong đó tất cả các chủng của L bulgaricus và S thermophiles

đều kháng được với Kanamycin Penicillin và Roxithromycin thì tất cả các chủng của S.thermophilus đều kháng được, còn khả năng kháng 2 loại kháng

sinh này của L bulgaricus theo phần trăm tương ứng so với S thermophilus là

23,5 % và 64,7% [81].

Khả năng này có thể liên quan đến một số gen trên nhiễm sắc thể, tranposome hoặc plasmid Đó cũng chính là mối lo khi các chủng probiotic có khả năng này là liệu chúng có thể chuyển các gen này cho các vi khuẩn gây bệnh hay không Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa

có những thông tin có liên quan về các vấn đề lâm sàng gây ra do hiện tượng này

Theo kết luận WHO/FAO trong khuyến cáo về probiotic (2001) thì các plasmid của một

số chủng Lactobacillus sp và Bifidobacterium sp, nhất là các chủng phân lập từ ruột người có

thể chứa gen kháng kháng sinh [30]

 Khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh

Việc kháng được các vi khuẩn gây bệnh mang lại con người sức khỏe tốt và phòng ngừa nhiều bệnh Trong hệ tiêu hóa của con người từ khoang miệng đến ruột non chứa nhiều vi khuẩn có lợi cũng như có hại Những lợi khuẩn probiotic

có thể ức chế lại Salmonella, E coli… là các vi khuẩn thường gây bệnh về tiêu

hóa Do trong quá trình sinh trưởng và phát triển, chúng sinh ra các chất kháng khuẩn như Bacteriocin, H2O2 Và bản thân chúng có thể kìm hãm sự phát triển các loại vi khuẩn gây bệnh do chúng cạnh tranh chất dinh dưỡng, nơi cư trú với các vi sinh vật gây bệnh trong quá trình sinh sống và phát triển trong hệ đường ruột [50], [80].

 Khả năng thủy phân muối mật

Như ta đã biết thành phần của muối mật gồm các muối của axit cholic và các dẫn xuất của nó, có chứa nhân cholesterol Để hấp thu cholesterol và các axit béo trong ruột, gốc cholate liên kết với các axit béo tạo thành dạng choleic và đi vào tĩnh mạch ruột Ở gan sẽ xảy ra quá trình tách gốc cholate, phục hồi lại muối mật và axit béo Vi khuẩn lactic và một số loại vi khuẩn đường ruột khác không chỉ kháng được nồng độ muối mật cao của đường ruột mà còn có khả năng thủy phân chúng.

Theo nghiên cứu của Gilliland và Walker, loài L acdophilus có tính năng

làm giảm Cholesterol trong ruột lợn cũng có thể làm giảm cholesterol trong máu đối với người Nhiều nghiên cứu về probiotic đã phát hiện được nhiều chủng vi khuẩn có khả năng này [65].

2.2.5.4 Tình hình nghiên cứu về tính chất probiotic trong và ngoài nước

a Tình hình nghiên cứu về tính chất probiotic trong nước

Ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn lactic và những lợi ích từ nó tuy nhiên vẫn còn hạn chế

Đỗ Thị Bích Thủy và Nguyễn Thị Diễm Hương (2012) đã tiến hành xác định và khảo

sát một số tính chất có lợi của Lactobacillus fermentum phân lập từ dưa cải chua ở Huế Kết quả nghiên cứu cho thấy Lb fermentum DC1 trong cải chua là chủng có nhiều triển vọng

trong ứng dụng làm chế phẩm probiotic [13]

Đào Thị Lương (2010) và cộng sự đã phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học cao nhằm ứng dụng trong bảo quản thức ăn gia súc, giúp cho quá trình lên men

hiệu quả hơn [6].

Đỗ Thị Bích Thủy (2010) đã tiến hành phân lập, tuyển chọn, xác định và khảo sát một

số tiềm năng probiotic của chủng Lactobacillus fermentum MC9 từ sản phẩm măng chua Huế

[12] Dương Nhật Linh (2011) và các cộng sự đã phân lập và sàng lọc một số vi khuẩn lactic

có tiềm năng làm probiotic [4]

Nguyễn Thị Hoài Hà (2006) và cộng sự nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin

của loài L plantarum L24 trên môi trường MRS và điện di tinh sạch bacteriocin và khảo sát

một số tính chất của chúng và định danh loài bằng giải trình tự DNA ribosome 16S [3] Nguyễn Vũ Tường Vy (2007) và cộng sự đã khảo sát khả năng chịu muối mật, axit và kháng kháng sinh của một số vi sinh vật dùng làm nguyên liệu sản xuất probiotic đường uống,

trong đó có Lb acidophilus, Lb casei [17].

Trần Bảo Khánh và Đỗ Thị Bích Thủy (2010) đã phân lập được 10 chủng vi khuẩn từ

sản phẩm nem chua trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế Trong đó Lactobacillus plantarum

N1có khả năng sinh tổng hợp axit lactic cao nhất

Hồ Trung Thông và Hồ Lê Quỳnh Châu (2009) đã tiến hành nghiên cứu khả năng sống sót trong môi trường đường tiêu hóa của động vật của một số chủng vi sinh vật nhằm từng bước chọn lọc tạo nguyên liệu sản xuất probiotic [11]

Qua đó có thể thấy được tình hình nghiên cứu vi khuẩn lactic ở Việt Nam đang được đầu

tư, cũng có nhiều kết quả nhất định Tuy nhiên các nghiên cứu này chưa được đầy đủ

b Tình hình nghiên cứu về tính chất probiotic ngoài nước

Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã và đang tập trung phân lập và định danh các chủng vi khuẩn lactic từ nhiều nguồn khác nhau, làm tiền đề cho các nghiên cứu về probiotic Các nghiên cứu nổi bật về định danh và phân lập tiêu biểu như sau:

Gần đây, Doan và cộng sự (2012) đã sử dụng kết hợp 2 phương pháp (GTG)5-PCR fingerprinting và MALDI-TOF MS để định danh 119 loài vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua ở Thanh Hóa và Hà Nội Kết quả cho thấy sự đa dạng cao về nguồn vi khuẩn lactic có trong nem chua ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam Chúng thuộc nhiều loại khác nhau như:

Leuconostoc fallax, Pediococcus acidilactici, Leuconostoc citreum, Weissella cibaria, Lactobacillus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, Weissellaparamensenteroides, Lactobacillus rosiae, Lactobacillus paracasei, Lactococcus lactis… Công trình này được

thực hiện ở phòng thí nghiệm vi sinh thuộc bộ môn sinh lý, sinh hóa, vi sinh- Khoa khoa học, Đại Học Ghent, Bỉ Nhóm tác giả đã khẳng định rằng, phương pháp định danh vi sinh vật bởi thiết bị MALDI-TOF MS là phương pháp mới, có hiệu quả kinh tế, phân tích nhanh và cho độ chính xác cao [29]

Neti và Dizon (2011) đã khảo sát các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa và hình thái tế bào cùng với

việc giải trình tự 16S rRNA để định danh được 9 loài vi khuẩn lactic thuộc Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sp, Weissella paramesenteroides và Pediococcus acidilactici được

phân lập từ sản phẩm lên men quả sầu riêng, Tempoyak Đây là báo cáo đầu tiên cho sự hiện

diện của Weissella sp và Pediococcus sp trong tempoyak Các tế bào sống của vi khuẩn lactic ở

tempoyak làm cho nó trở thành một thực phẩm chức năng và có tiềm năng như sản phẩm

probiotic [59].

Kos và cộng sự (2003) nghiên cứu khả năng bám dính của Lactobacillus axitophilus

M92 đã nhận thấy có sự suy giảm khả năng tự kết dính và bám dính đường ruột khi loại bỏ lớp protein bề mặt [46]

Corzo và cộng sự (1999), Maragkoudakis và cộng sự (2006) đã nghiên cứu về probiotic

đã phát hiện được nhiều chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng được nồng độ muối mật cao của đường ruột và thủy phân chúng [27], [54]

Liong và Shah (2005) đã khảo sát khả năng chịu axit và muối mật của 11 chủng vi khuẩn lactic [51] Maragkoudakis và cộng sự (2006) đã khảo sát tiềm năng probiotic của các

chủng vi khuẩn lactic phân lập từ các sản phẩm sữa, trong đó có tiến hành khảo sát khả năng chịu acid và muối mật bò 0,3% [54] Ngoài ra có thể kể thêm các nghiên cứu của Mongkol và cộng sự (2009), Maria (2006), Santiago và cộng sự (2008)…

Renata và cộng sự (2004) cũng đã kiểm tra khả năng ức chế vi khuẩn gây hại của vi khuẩn

lactic đối với hai loài Listeria innocua và Staphylococcus aureus [68]

Ashmaig và cộng sự (2009) đã phân lập được 24 chủng vi khuẩn lactic từ 12 mẫu sữa lạc đà lên men (gariss) bằng cách sử dụng các thử nghiệm sinh hóa và khả năng lên men

carbonhydrate Trong đó có 2 nhóm chính, nhóm 1 có 7 chủng được xác định là Lactobacillus platarum (66,6%), nhóm 2 có 6 chủng là Lactococcus raffinolactis (33,3%) Các nhóm nhỏ đang được phân loại như Lactococcus raffinolactis Lactobacillus animalis, Lactobacillus brevis, Lactobacillus divergens, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus fermentum, Lactococcus alimentarium [19].

Khả năng chịu muối mật thường được nghiên cứu với hai nồng độ chủ yếu là 0,3%, 0,5% Nhiều công trình nghiên cứu về khả năng chịu muối mật cho thấy hầu như các loài vi khuẩn lactic đều có khả năng chịu muối mật ở hai nồng độ này Nghiên cứu của Gomathi và các cộng sự (2014) khảo sát khả năng chịu muối mật với 0,3% mật bò và Zamfir (2012) khảo sát khả năng chịu muối mật với nồng độ mật bò ở 0,3% và 0,5% của các chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ rau quả lên men tại Rumani [34], [35]

Khả năng chịu pH thấp, khả năng kháng muối mật, khả năng sinh tổng hợp bacteriocin… là những tính chât probiotic được các nhà khoa học nghiên cứu nhiều nhất

2.2.6 Một số ứng dụng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như nông nghiệp, công nghiệp, y học, công nghệ thực phẩm, môi trường… đặc biệt là những ứng dụng trong công nghệ bảo quản và chế biến thực phẩm

2.1.1.1 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

 Sản xuất sữa chua, kem chua, fomat

Để thu được các sản phẩm có chất lượng cao người ta thường cấy vi khuẩn lactic vào sau khi thanh trùng Passteur Người ta cho vào sữa hạt kefia hoặc các men chua trong đó có vi khuẩn lactic, nấm men và một số vi khuẩn khác để có kefia, sữa ngựa chua có rượu Quá trình lên men kết thúc ta thu được một loại

nước giải khát có chứa 1-2% rượu, 1% axit lactic [10].

 Trong sản xuất nước mắm và mắm

Vi khuẩn lactic đóng vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất nước mắm cũng như các loại mắm Cùng với sự tham gia của các loài vi khuẩn hiếu khí

như: Bacillus subtilic, vi khuẩn lactic không những có khả năng thủy phân, vi

khuẩn lactic còn tạo nên một phần hương vị của của nước mắm trong quá trình trao đổi chất [76] Quá trình sinh hương của lactic trong nước mắm là quá trình phức tạp dưới tác dụng của vi khuẩn lactic thì sản phẩm tạo ra không chỉ là axit lactic mà còn tạo thành các sản phẩm phụ Sự kết hợp giữa các sản phẩm này tạo nên mùi hương cho sản phẩm [70]

 Ứng dụng muối chua rau quả

Chi Lactobacillus, Leuconotoc, Pediococcuslà nhóm vi khuẩn lactic chiếm

ưu thế trong quá trình lên men rau quả Entorococcus, Lactococcus đã được xác

định là khởi đầu cho quá trình lên men nhưng chúng chỉ có nghĩa ý trong quá trình lên men tự nhiên [64].

Không phải tất cả các loại rau quả đều có thể muối chua, vì hàm lượng đường trong mỗi loại là khác nhau, điều quan trọng về mặt lên men là trong rau quả phải có lượng đường tối thiểu nào đó thì mới có thể muối chua được Nguyên tắc của muối chua rau quả là tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic phát triển đồng thời hạn chế vi khuẩn gây thối rữa Vi khuẩn lactic có nhiệm vụ chuyển lượng đường trên bề mặt rau quả thành axit lactic tạo nên vị ngọt đồng thời là chất bảo quản làm cho rau quả không bị hỏng [10].

2.1.1.2 Ứng dụng trong xuất axit lactic và muối lactate

Quá trình lên men nhờ vi khuẩn lactic tạo axit lactic là hợp chất hữu cơ Axit lactic được dùng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp thuộc da, công nghiệp dệt, công nghiệp chất dẻo, y dược và cả trong nông nghiệp Rỉ mật, đường, tinh bột đã được đường hoá là nguyên liệu chính dùng để sản xuất axit lactic Các vi khuẩn dùng

để sản xuất axit lactic là vi khuẩn lên men lactic đồng hình, bao gồm Lactobacillus delbruckii, Lactobacillus coagulans hoặc cầu khuẩn Streptococcus lactis Các loại vi khuẩn này đều

thuộc loại vi khuẩn ưa nhiệt và có khả năng tích lũy được nhiều axit lactic Hướng nghiên cứu hiện nay trong việc sản xuất axit lactic thông qua lên men lactic là tuyển chọn dòng sinh axit lactic cao [26], [57] tối ưu hóa khả năng lên men lactic, lên men lactic với nguồn nguyên liệu

rẻ tiền [61], [79] và gây biến đổi di truyền để thu được các chủng sản xuất cao

2.1.1.3 Ứng dụng ủ chua thức ăn gia súc

Việc ủ chua thức ăn (còn gọi là ủ xanh hay ủ ướp) là xếp chặt thức ăn thô xanh vào

hố kín không có không khí Trong quá trình ủ đó các vi khuẩn biến đổi các đường dễ hoà tan như sacarose, glucose, fructose, pentose thành axit lactic, axit acetic, và các axit hữu

cơ khác Chính các axit này làm hạ thấp độ pH của môi trường thức ăn ủ chua xuống ở mức 3,8 - 4,5 Ở độ pH này hầu hết các loại vi khuẩn và các enzym của thực vật đều bị ức chế Do vậy thức ăn ủ có thể bảo quản được trong một thời gian dài [20]

2.2.6.4 Một số ứng dụng khác

Bên cạnh những ứng dụng trên vi khuẩn lactic còn ứng dụng trong các lĩnh vực khác như : Trong

y học, trong ngành mỹ phẩm, trong ngành vật liệu xây dựng…

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn lactic được phân lập từ sản phẩm mắm rò từ các chợ trên địa bàn thành phố Hu

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Các bước tiến hành thí nghiệm được tóm tắt ở sơ đồ hình 3.1

Khả năng chịu axit

Định danh ở cấp độ loài bằng phương pháp MALDI – TOF MS, giải trình tự gen pheS

Mắm ròLấy mẫuPhân lập, chọn khuẩn lạc thuầnĐịnh danh sơ bộ bằng cách xác định hình thái khuẩn lạc, xác định hình thái tế bào, thử

catalaseKhảo sát một số tính chất của chủng lactic

phân lập được

Khả năng

tự kết dínhKhả năng kháng khuẩnKhả năng chịu muối

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3.2.2 Phương pháp phân lập

Các mẫu mắm rò được thu thập ngẫu nhiên ở các chợ trên địa bàn thành phố Huế và đưa

về phòng thí nghiệm Nghiền mẫu và hòa tan vào nước muối sinh lý đã được thanh trùng Cấy trang 50µl dung dịch mẫu trên môi trường MRS rắn (bảng 3.1), pH 6,2; ủ ở 37oC trong 48 giờ

để thu được khuẩn lạc đơn Cấy ria các khuẩn lạc đơn sang môi trường MRS rắn 2 lần để thu được dòng thuần [25]

Dùng phương pháp nhuộm Gram và thử hoạt độ catalase để tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn lactic Các chủng vi khuẩn có Gram dương và catalase âm tính sẽ được chọn

để tiếp tục nghiên cứu

3.2.3 Phương pháp nhuộm gram

Nguyên tắc: Cơ chế của phản ứng nhuộm gram là khả năng bắt màu của nguyên sinh

chất và màng tế bào

Tiến hành:

Bước 1: Nhuộm bằng dung dịch tím gentians trong 30 giây đến 1 phút, rửa nước

Bước 2: Nhuộm thêm dung dịch lugol và giữ trong 1 phút, rửa nước

Bước 3: Khử màu bằng cách nhỏ dung dịch alcohol 90%, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa lại bằng nước

Bước 4: Nhuộm tiếp bằng dung dịch Fucshin trong 1 phút, rửa nước, để khô

Kết quả: Mẫu được quan sát ở vật kính dầu 100x Vi khuẩn Gram dương bắt màu tím, Gram âm bắt màu hồng [2]

3.2.4 Phương pháp thử nghiệm catalase

Tiến hành: Dùng que cấy đã vô trùng bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn, lấy một

lượng nhỏ sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt trên một phiến kính sạch Nhỏ một giọt H2O2 3% lên sinh khối vi khuẩn trên phiến kính và ghi nhận sự xuất hiện bọt khí

Kết quả: Thử nghiệm là dương tính khi có hiện tượng sủi bọt khí do O2 được tạo ra

ngược lại là âm tính Nếu có bọt khí xuất hiện thì chủng vi khuẩn trên có catalase dương tính (+), nếu không có tức là catalase âm tính (-) [14]

Môi trường dung để nuôi cấy, tăng sinh giữ giống là môi trường MRS lỏng Dùng NaOH 1N và HCl 1N để điều chỉnh pH của môi trường về 6,2 Môi trường được thanh trùng

ở 1210C trong 15 phút

Giống được nuôi cấy trong môi trường MRS lỏng, pH 6,2 ở 37oC Bảo quản giống trong môi trường MRS lỏng có bổ sung 20% glycerol ở - 20oC Giống bảo quản được cấy chuyền 2 lần qua môi trường MRS lỏng ở 37oC trong 24 giờ trước khi sử dụng

3.2.5 Phương pháp tăng sinh

Nguyên tắc:

Trong môi trường lỏng, vi khuẩn có khả năng tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng dễ dàng hơn, khả năng phát triển ổn định, do đó thu được sinh khối để tiếp tục thực hiện các công đoạn nghiên cứu tiếp theo

Tiến hành:

Chủng ban đầu được bảo quản trong môi trường MRS lỏng có chứa 30% glycerol, dùng pipetman hút 100μl chủng gốc cho vào ống eppendoft chứa 900μl môi trường MRS lỏng và tiển hành nuôi trong tủ ấm 370C trong 24 – 48h

3.2.6 Định danh ở cấp loài bằng phương pháp MALDI – TOF MS

Phương pháp MALDI – TOF được dùng để định danh các chủng được phân

lập [56].

MALDI – TOF MS (matrix-assited laser desorption ionization and time of light mass spectrometry) được sử dụng để phân tích trong nhiều lĩnh vực và nó cho phép xác định trọng lượng phân tử và đặc tính cấu trúc của phân tử với tốc độ cao, dễ sử dụng, độ nhạy cao Nó đã được công nhận bởi nhiều nhà nghiên cứu như là một phương pháp phân loại và định danh vi sinh vật [22], [28], [42], [67]

MALDI – TOF MS so với các phương pháp thông thường hoặc xác định dựa trên PCR, thì MALDI – TOF MS có các ưu điểm là thời gian phân tích ngắn, lượng mẫu yêu cầu thấp và chi phí cho hóa chất ít hơn [24] MALDI – TOF MS phân loại và định danh vi khuẩn dựa trên phát hiện các protein, peptide hoặc axit nucleic [72]

Khối phổ MALDI – TOF MS được thể hiện bởi các đỉnh khối phổ (mass spectral peak) thể hiện khối lượng của các peptide và protein trong tế bào Theo một số công trình nghiên cứu đã công bố rằng protein chiếm 15% tổng trọng lượng của tế bào trong đó có 20% là protein ribosome chiếm 3% tổng trọng lượng tế bào Trong tế bào có khoảng 17000 protein ribosome và một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng một phần quan trọng của các tín hiệu quang phổ khối lượng có nguồn gốc từ protein ribosome [53] Vì vậy các đỉnh khối phổ cho thấy khối lượng phân tử của các peptide và protein ribosome cung cấp thông tin cho việc xác định các

vi khuẩn ở cấp chi, loài và trong một số trường hợp ở cấp dưới loài

Nguyên tắc:

Sau khi chiếu tia laser vào hỗn hợp phân tích và chất nền, vị trí bức xạ nhanh chóng nóng lên, kích thích dao động Do sự kích thích dao động của chất phân tích, protein nguyên vẹn được chuyển thành dạng khí ion Các ion này được đầu dò (detector) nhận biết tạo ra các đỉnh trên màn hình thể hiện đặc tính của các peptide và protein trong tế bào vi sinh vật Khối phổ thu được được so sánh với khối phổ lưu trữ ở các thư viện để xác định chủng vi khuẩn.Trong phương pháp MALDI – TOF MS thì sự lựa chọn chất nền phù hợp với mẫu phân tích đóng vai trò quan trọng Nếu lựa chọn chất nền phù hợp thì hỗn hợp chất nền và mẫu phân tích mới bị kích thích để tạo thành ion, còn nếu chất nền không phù hợp với mẫu phân tích thì không

có sự tạo thành của ion Các dẫn xuất của axit benzoic như: axit 2,5-dihydroxybenzoic, dẫn xuất của axit cinnamic như: axit α-cyano-4-hydroxycinnamic cũng như các hợp chất thơm khác nói chung làm chất nền phù hợp với các mẫu phân tích là protein và peptide [32]

3.3.7 Định danh bằng phương pháp giải trình tự gen PheS

Nguyên tắc: Dựa vào sự tương đồng trình tự liên tục của gen PheS với ngân hàng gen

BCCM/LMG của trường Đại Học Gent (Gent, Bỉ) hoặc Ngân hàng trình tự nucleotit quốc tế (EMBL) Sử dụng chương trình FASTA để xác định loài có mối quan hệ gần nhất đã biết của

trình tự trong phần gen pheS.

3.2.8 Khảo sát khả năng chịu muối

Khả năng chịu muối của các chủng vi khuẩn lactic được đánh giá qua giá trị OD600nm sau khi nuôi chúng trong môi trường MRS lỏng có chứa các nồng độ muối tương ứng là 10%, 15%, 20%, 25% qua các mốc giờ là 2 ngày, 4 ngày, 6 ngày

Tiến hành: Theo phương pháp của Kobayashi (2004) được tiến hành như sau [45]:

- Nuôi chủng trong fancol 50ml với thể tích môi trường là 25ml trong 24 giờ ở 37˚C

- Ly tâm 4000 vòng/phút ở 4˚C trong 20 phút nhằm mục đích thu sinh khối

- Loại bỏ môi trường và rữa sinh khối bằng nước muối sinh lý trong hai lần

- Tái huyền phù trong nước muối sinh lý bằng vontex và phân phối 1000 µl vào ependoff

- Đo OD600nm để đạt OD ~ 108

- Phân phối mỗi ependoff chứa 1000µl huyền phù vào 10 ependoff chứa 900 µl môi trường bổ sung các nồng độ muối 10%,15%, 20%, 25%

- Đo OD600nm tại 0 giờ

- Ủ mẫu trong tủ ấm ở 37˚C và đo OD600nm sau 2 ngày, 4 ngày, 6 ngày

3.2.9 Khảo sát khả năng chịu axit

Khả năng chịu pH thấp của các chủng khảo sát được đánh giá qua lượng vi khuẩn sống sót sau khi ủ ở pH 2 qua các mốc thời gian 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ Số tế bào vi khuẩn sống sót được xác định theo phương pháp Lee [48]

Tiến hành: Chủng được nuôi cấy trong 24 giờ, ly tâm thu sinh khối ở 5000 vòng/phút trong

10 phút ở nhiệt độ phòng, rửa sinh khối bằng đệm phosphate 0,1M pH 7,2 hai lần, sau đó tái huyền phù trong 1ml đệm bằng votex, trộn 1ml dịch sau khi tái huyền phù với 24,5 ml dung dịch NaCl 0,2%, pH = 2 (pH được chỉnh bằng dịch HCl 5M)

Mẫu được lấy theo các mốc thời gian 0, 1, 2, 3 giờ Lấy 50 µl huyền phù vi khuẩn có độ pha loãng thích hợp được cho vào đĩa petri vô trùng Sau đó, đổ một lớp môi trường MRS agar nhiệt độ 43oC lên và xoay đĩa để phân tán đều tế bào vi khuẩn Lớp MRS agar 43oC thứ hai tiếp tục được đổ khi lớp thứ nhất vừa đông Chờ cho lớp thứ hai đông và ủ đĩa vào tủ ấm ở

37oC trong 48 giờ Số khuẩn lạc xuất hiện sau khi ủ được ghi nhận Kết quả số tế bào sống sót (log CFU/ml) được tính theo công thức:

Log CFU/ml = log (Ai Di / V)

Trong đó: Ai là số khuẩn lạc trung bình trên một đĩa

Di là độ pha loãng

V là dung tích huyền phù cho vào mỗi đĩa (50µl)

3.2.10 Khảo sát khả năng tự kết dính

Nguyên tắc: Khi các tế bào vi khuẩn tự kết dính lại với nhau thì sẽ tạo nên những hạt có

kích thước lớn hơn và lắng xuống trong dung dịch Do đó theo thời gian mật độ tế bào ở bề mặt dịch vi khuẩn sẽ giảm đi Mức giảm của OD phản ánh tỷ lệ vi khuẩn đã kết dính

Tiến hành: Thí nghiệm được tiến hành phương pháp của Kos và cộng sự (2003) [46],

gồm các bước sau:

- Nuôi cấy chủng trong môi trường MRS qua 24 giờ ở 37oC không lắc

- Ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút, ở nhiệt độ phòng để thu sinh khối

- Rửa sinh khối bằng đệm PBS (pH 7,2) 2 lần

- Tái huyền phù trong đệm PBS sao cho OD600nm = 1

- Phân phối 6ml huyền phù (OD600nm = 1) vào ống nghiệm, vortex 10 giây để trộn đều dịch

- Lấy 1ml huyền phù ở mỗi ống nghiệm đo OD mẫu 0 giờ

- Ủ yên tĩnh các ống nghiệm có chứa huyền phù (OD600nm = 1) ở 37oC trong 5 giờ để tạo điều kiện cho các vi khuẩn lactic tự kết dính và lắng xuống

- Đo OD 600nm của dịch bề mặt ở mỗi ống nghiệm

- Tỷ lệ tự kết dính (%) được tính bằng công thức:

)(

Trong đó: At: Độ hấp thụ tại thời điểm 5 giờ

A0: Độ hấp thụ tại thời điểm 0 giờ

3.2.11 Khảo sát khả năng kháng khuẩn

Sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch để khảo sát khả năng sinh bacteriocin của vi

khuẩn lactic theo phương pháp của Mishra và Prasad (2005) [58].

Cách tiến hành:

- Chủng được nuôi trong fancol ở 37˚C trong 24 giờ

- Ly tâm thu sinh khối rồi loại bỏ sinh khối, lấy dịch trong và điều chỉnh dịch trong về pH6,5 bằng NaOH 2N, bảo quản ở 4˚C

- Đỗ đĩa hai lớp, lớp dưới là môi trường MRS 2% agar, lớp trên là LB đặc 1% agar và chứa vi sinh vật gây bệnh (trộn vi sinh vật gây bệnh với môi trường ở 45˚C)

- Đục lỗ tạo giếng thạch trên đĩa peptri chứa vi sinh vật gây bệnh với đường kính kích thước lỗ 10mm

8 Phân phối 50µl vào mỗi giếng thạch và ủ ở tủ lạnh 4˚C trong 15 phút nhằm tăng khả năng khuếch tán của bacteriocin vào trong giếng thạch

- Ủ trong tủ ấm 37 ˚C trong 24 giờ và đo kích thước vòng kháng khuẩn

3.2.12 Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm SPSS 20 và exel 2010 để xử lý số liệu

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn lactic từ mắm rò

Từ sản phẩm mắm rò ở Huế đã phân lập được 12 chủng vi khuẩn.Kết quả khảo sát về đặc điểm như nhuộm Gram, thử catalase với kết quả như sau:

Bảng 4.1 Các chủng vi khuẩn được phân lập từ mắm rò

trên địa bàn thành phố Huế

Màu trắng sữa hơi hồng, hình tròn,

8 M27 To trắng sữa, bề mặt lồi thấp Hình que +

Hình tròn, viền xung quanh màu

-11 M39 Nhỏ, trắng sữa, bề mặt lồi thấp Hình que +

-12 M45 Màu trắng hơi vàng, hình tròn Hình que +

-M45

Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi

khuẩn lactic phân lập được

M39

M30

M27

M13

Qua kết quả ở bảng 4.1 và hình 4.1, ta thấy hệ vi khuẩn trong mắm rò rất đa dạng Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái và tế bào, cho thấy sự khác biệt về hình thái, kích thước

và màu sắc của các chủng vi khuẩn Trong đó chiếm đa số là khuẩn lạc dạng hình tròn, màu trắng, có đến 8 chủng vi khuẩn hình que, 4 chủng hình cầu, 7 chủng Gram (+), 5 chủng Gram (-) Khi khảo sát một số đặc tính hóa sinh của chủng thì có 7 chủng dương tính và 5 chủng âm tính với khả năng sinh catalase

Đối chiếu với nghiên cứu về các đặc điểm sinh lý, sinh hóa vi khuẩn lacic của Axelsson ( 2004) ta tiến hành định danh sơ bộ được 5 chủng nghi ngờ vi khuẩn lactic là M45, M39, M30, M27, M13.

Sau khi phân lập, các chủng vi khuẩn nghi ngờ vi khuẩn lactic được gửi định tại phòng thí nghiệm vi sinh thuộc bộ môn sinh lý, sinh hóa, vi sinh- Khoa khoa học, Đại Học Ghent, Bỉ.

4.2 Kết quả định danh của vi khuẩn lactic phân lập từ mắm rò

Sau khi định danh sơ bộ bằng cách dựa và hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và thử catalase và xác định được năm chủng nghi ngờ vi khuẩn lactic Chúng tôi tiến hành gửi mẫu định danh tại phòng thí nghiệm vi sinh thuộc bộ môn sinh

lý, sinh hóa, vi sinh- Khoa khoa học, Đại Học Ghent, Bỉ.

Kết quả phương pháp MALDI – TOF đã phân các chủng vi sinh vật phân lập được, thành nhóm chứa các chủng có khối phổ tương đồng với nhau Trong

đó, mỗi nhóm gồm các chủng có các đỉnh trong khối phổ tương đồng với nhau Kết quả phân tích MALDI – TOF năm chủng vi khuẩn lactic phân lập từ mắm rò gồm 2 nhóm.

Bảng 4.2 Phân nhóm các chủng vi sinh vật có khối phổ MALDI – TOF

tương đồng