Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật

Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật

Bài 13 Giới thiệu số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật Phiếu thông tin chủng vi sinh vật bảo quản: Đại học Quốc gia Hà Nội Thông tin chung chủng vi sinh vật bảo quản Trung tâm Công nghệ Sinh học Bảo tàng Giống chuẩn vi sinh vật (VTCC) Nấm sợi Nấm men Xạ khuẩn Vi khuẩn Tên khoa học: Giống (Genus) Loài (Species) Dưới lồi (Subspecies) Tên khác có (synnonym): Nguồn phân lập: Nơi phân lập: Thời gian bắt đầu bảo quản VTCC: Người phân lập: Người cung cấp: Nơi cung cấp: Ký hiệu chủng VTCC: Ký hiệu lý lịch chủng từ bảo tàng khác: VTCC < < < Chủng chuẩn (Type) < < Chủng tự nhiên (wild) Đột biến (cụ thể…) 10 Hình thức sinh sản: 11 Gây bệnh cho: Người Động vật 12 Dấu chuẩn di truyền (nếu có): 13 Hình thái tế bào, khuẩn lạc: 14 Khả ứng dụng: Thực vật Không 15 Tài liệu liên quan: 16 Các phương pháp bảo quản: Đông khô Lạnh sâu Nitơ lỏng Cấy truyền 17 Mơi trường ni cấy thích hợp: 18 Nhiệt độ ni cấy thích hợp: 19 Ghi chú: Chức sưu tập vi sinh vật: Bảo quản vi sinh vật có tầm quan trọng đặc biệt, làm tảng cho nghiên cứu ứng dụng liên quan đến nhiều lĩnh vực: sinh học, y học, nông nghiệp môi trường Nhiệm vụ quan trọng Bộ sưu tập chủng vi sinh vật thu thập, làm giàu chủng vi sinh vật hữu ích bảo quản chúng theo phương pháp thích hợp Việc thu thập chủng vi sinh vật nhiều cách phân lập, tuyển chọn từ môi trường, trao đổi nước quốc tế Các chủng vi sinh vật phải định hướng theo mục tiêu cụ thể Bộ sưu tập, ví dụ chủng vi sinh vật chuẩn, chủng có hoạt tính sinh học chủng làm sở cho tra cứu nghiên cứu tính đa dạng vi sinh vật Bảo quản chủng vi sinh vật công việc không dễ dàng, xuất phát từ mục đích bảo quản khơng trì khả sống vi sinh vật, chủng, tránh tạp nhiễm mà cịn đảm bảo tính ổn định di truyền đặc tính sinh học suốt q trình bảo quản Thực tế khơng có phương pháp bảo quản vạn dùng chung cho nhóm vi sinh vật mà nhóm vi sinh vật thích hợp với vài phương pháp bảo quản định Các chủng vi sinh vật bảo quản cung cấp cho người sử dụng nhiệm vụ quan trọng sưu tập vi sinh vật thu thập cung cấp thông tin quan trọng chủng vi sinh vật bảo quản cho người sử dụng như: môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, nhu cầu dinh dưỡng, tính an tồn sinh học, tên phân loại v.v Như yêu cầu cán phụ trách Bộ sưu tập vi sinh vật phải có kiến thức vững vi sinh vật, di truyền học, sinh hoá học, sinh lý vi sinh vật bệnh học vi sinh vật để kiểm soát đặc tính quan trọng vi sinh vật bảo quản Một số điểm lưu ý Bộ sưu tập vi sinh vật: 3.1 Duy trì khả sống vi sinh vật bảo quản: Trong thực phương pháp bảo quản trình bảo quản tế bào vi sinh vật bị chết phải áp dụng phương pháp bảo quản thích hợp nhằm hạn chế thấp khả chết tế bào 3.2 Quan tâm đến số lượng tế bào tiến hành bảo quản: Trong trình bảo quản số lượng tế bào vi sinh vật giảm dần theo thời gian cần tính tốn số lượng vi sinh vật thời điểm bảo quản thích hợp để trì số lượng vi sinh vật sống thời gian bảo quản dài 3.3 Duy trì đặc tính di truyền ổn định chủng vi sinh vật bảo quản: Nói chung với chủng vi sinh vật bảo quản, đặc biệt với chủng vi sinh vật chuẩn, chủng vi sinh vật có ứng dụng cơng nghiệp u cầu trì đặc tính sinh học, tính trạng di truyền quan trọng Các phương pháp bảo quản khơng thích hợp dẫn đến đột biến plasmid Vì cần phải chọn phương pháp bảo quản thích hợp cho chủng 3.4 Tính chủng vi sinh vật bảo quản: Chủng vi sinh vật từ bảo quản đến sử dụng phải đảm bảo chủng theo tên đặc điểm sinh học đặc trưng Đây yêu cầu tiên công việc Bảo tàng vi sinh vật, mà thao tác phương pháp tiến hành phải thực cho hạn chế tới mức tối thiểu chủng bảo quản nhằm tránh tạp nhiễm 3.5 Kinh phí cần cho Bộ sưu tập vi sinh vật: Kinh phí bao gồm kinh phí lương cho cán bộ, thiết bị, vật tư hoá chất, nhà xưởng điện nước tiêu hao Các kinh phí tuỳ thuộc vào quy mơ Bộ sưu tập giống vi sinh vật phương pháp bảo quản, phạm vi dịch vụ thực khách hàng Tên Bảo tàng vi sinh vật (viết tắt) Nước Số lượng chủng vi sinh vật ATCC Mỹ 73507 DSMZ Đức 14460 NBRC Nhật 18300 Bảng Quy mô số sưu tập giống vi sinh vật STT Tên Bảo tàng vi sinh vật, Nước Giá thành (USD) ATCC, Mỹ 80 CBS, Hà Lan 60 VKM, Nga 45 Thái Lan 40 Bảng Giá thành cho bảo quản chủng vi sinh vật hàng năm 3.6 Bảo quản chủng có giá trị: Đối với chủng vi sinh vật có giá trị tuỳ theo yêu cầu mà cần thực nhiều phương pháp khác bảo quản nơi khác để hạn chế khả đặc tính quý chủng rủi ro ngẫu nhiên (cháy nổ, động đất, chiến tranh v.v ) 3.7 Cung cấp chủng giống cho khách hàng: Đối với chủng cần cung cấp nhiều cho khách hàng (hoặc chủng cần cho nghiên cứu thường xuyên) cần phải bảo quản với số lượng lớn với phương pháp thích hợp cho việc vận chuyển đến khách hàng 3.8 Cung cấp thông tin liên quan đến chủng bảo quản: Chất lượng Bộ sưu tập giống liên quan đến số liệu, thông tin chủng vi sinh vật bảo quản Do đó, nhu cầu nghiên cứu để thu nhận thông tin cần thiết cung cấp cho khách hàng quan trọng 3.9 Kiểm tra chất lượng chủng vi sinh vật bảo quản: Các chủng Bộ sưu tập vi sinh vật cần phải tuân theo qui định nghiêm ngặt kiểm tra định kỳ theo thời gian bảo quản tỷ lệ sống sót, mức tạp nhiễm, thay đổi đặc tính di truyền dấu chuẩn di truyền, tồn plasmid, đặc điểm phân loại, khả sinh chất có hoạt tính sinh học…Một cách đánh giá khả sống sót chủng vi sinh vật bảo quản dựa theo phương trình sau: t = 8Log(So/Log So-Log Sac) Trong đó: t - Thời gian mẫu bảo quản ampoule So - Số lượng tế bào sống sót sau bảo quản Sac - Số lượng tế bào sống sót sau tiến hành thí nghiệm 3.10 Cơ sở liệu Bộ sưu tập vi sinh vật: Ngày nay, tin học lĩnh vực xâm nhập làm thay đổi sâu sắc đến lĩnh vực đời sống việc quản lý Bộ sưu tập vi sinh vật khơng cịn ngoại lệ Người ta ứng dụng phần mềm máy tính phù hợp để quản lý chủng vi sinh vật bảo quản, thông tin liên quan chương trình kiểm tra chất lượng định kỳ Sử dụng tin học cơng việc có tiện ích lớn, giúp cho người quản lý nắm bắt toàn thông tin lý lịch chủng vi sinh vật dễ dàng tra cứu, làm báo cáo khoa học theo tiêu chí riêng Nói chung với sưu tập có số lượng vi sinh vật khơng lớn sử dụng phần mềm: Microsoft Access, Access Visual Basic Giới thiệu chung số phương pháp bảo quản vi sinh vật: Trong phần mô tả phương pháp dùng chung cho đối tượng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, xạ khuẩn, vi tảo) 4.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật: Hình Bảo quản phương pháp cấy truyền môi trường thạch Đây phương pháp bảo quản đơn giản, chủng vi sinh vật cấy mơi trường thích hợp (dịch thể hay thạch) ống nghiệm hay bình tam giác để điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển Sau chủng vi sinh vật chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ thích hợp Q trình lặp lại thời hạn định, đảm bảo chủng vi sinh vật chuyển đến môi trường trước già chết Thực tế có nhiều chủng vi sinh vật thích hợp với phương pháp bảo quản như: Staphylococi, Coliform sống vài năm theo cách Cho dù phương pháp phương pháp phổ biến dùng sở nghiên cứu sử dụng chủng vi sinh vật đặc biệt chủng dùng cho nghiên cứu Tuy nhiên, phương pháp bộc lộ nhiều nhược điểm sau: - Dễ bị tạp nhiễm dễ dẫn đến chủng giống gốc - Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữu chủng trình bảo quản - Phải nghiên cứu theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp chủng bảo quản - Tốn nhiều công sức để cấy truyền - Giống gốc sai sót dùng mơi trường cấy truyền khơng thích hợp - Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi đặc điểm sinh học đột biến xuất sau lần cấy truyền * Phương pháp làm nước môi trường bảo quản: Phương pháp thường dùng cho chủng nấm sợi nấm men Theo phương pháp chủng vi sinh vật bảo quản với chất mang phổ biến sau: a Trên đất, cát silicagel Các nghiên cứu cho thấy bào tử nấm sống 4-5 năm bị làm khô đất mà không bị thay đổi đặc tính sinh học Ngày silicagel chất mang dùng phổ biến có hiệu bảo quản nấm men, nấm sợi b Bảo quản giấy: Các chủng nấm men nấm sợi làm khơ giấy sau bọc giấy bạc đựng hộp kín Ưu phương pháp bảo quản lượng mẫu lớn c Bảo quản gelatin: Để thực phương pháp này, người ta tạo dịch huyền phù chủng vi sinh vật mơi trường có gelatin Sau giọt mẫu làm khô đĩa petri Phương pháp bảo quản vi khuẩn vài năm Nhìn chung, khơng có phương pháp vạn cho bảo quản nhóm vi sinh vật khác Thực khó đánh giá cách đầy đủ xét theo yêu cầu đặt Chính mà phương pháp bảo quản phải kiểm nghiệm thực tế với loại vi sinh vật, từ kết chọn phương pháp thích hợp đồng thời sử dụng phương pháp khác 4.2 Phương pháp đông khô vi sinh vật phương pháp đông khô trực tiếp: a Phương pháp đơng khơ: Hình Đơng khơ vi sinh vật Đơng khơ q trình mà nước lấy khỏi mẫu mẫu trạng thái lạnh sâu Ở vi sinh vật huyền phù mơi trường thích hợp làm lạnh môi trường chân không Thiết bị đông khô hút nước cuối mẫu làm khô đến mức định Mẫu hàn kín môi trường chứa mẫu chân không Đây phương pháp phổ biến có hiệu cao cho bảo quản đối tượng vi sinh vật khác nấm sợi, nấm men, vi khuẩn số virut Tuy nhiên, phương pháp ứng dụng tảo, động vật nguyên sinh tế bào động vật b Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp (L-drying): Ngồi phương pháp đơng khơ mơ tả trên, cịn có phương pháp đơng khơ trực tiếp Khác biệt với phương pháp chỗ dịch huyền phù vi sinh vật làm khô nhanh chế độ chân khơng thích hợp mà mẫu khơng cần làm lạnh từ trước Phương pháp đặc biệt có ý nghĩa nhóm vi khuẩn khơng có khả sống nhiệt độ thấp giai đoạn tiền đông Các thông số quan trọng cần quan tâm thực phương pháp là: - Tuổi vi sinh vật bảo quản - Thành phần dịch huyền phù tế bào vi sinh vật - Tốc độ đông khô - Nhiệt độ đông khô thấp - Khoảng thời gian làm khô mẫu độ ẩm cuối mẫu Phương pháp nhanh thuận lợi cho đợt bảo quản số lượng lớn mẫu Thông thường theo phương pháp vi sinh vật bảo quản từ 10-20 năm Nói chung hai phương pháp có nhiều ưu điểm so với phương pháp trước thời gian bảo quản lâu, tiết kiệm công sức sai sót nhãn mác tạp nhiễm Tuy nhiên, nhược điểm lớn phương pháp giá thành thiết bị Độ ổn định chủng vi sinh vật bảo quản theo đợt đông khô khác Hơn chủng trước đem sử dụng phải hoạt hố mơi trường thích hợp số lần để phục hồi đặc tính sinh học 4.3 Phương pháp bảo quản lạnh sâu: Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu vi sinh vật bảo quản môi trường dịch thể nước cần cho hoạt động sống vi sinh vật bị bất hoạt nhiệt độ lạnh sâu (-196 °C -> -80 ° C) Hình Bảo quản lạnh sâu Với phương pháp này, tế bào bị vỡ trình làm lạnh làm tan mẫu Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào việc tích luỹ chất điện giải mẫu bảo quản hình thành tinh thể nước tế bào Để khắc phục nhược điểm người ta bổ sung chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu làm tan nhanh glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide) Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu thực thang nhiệt độ khác -20° C, -30° C, -40° C, -70° C, -140°C -196° C Nói chung mức nhiệt độ cao -30° C cho hiệu thấp tế bào chịu nồng độ muối cao sinh từ chất điện giải Phương pháp bảo quản có hiệu với nhiều nhóm vi sinh vật khác nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn virut Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu nitơ lỏng phương pháp vạn Phương pháp thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo dòng tế bào động vật Tuy nhiên, phương pháp bộc lộ số nhược điểm đầu tư kinh phí cho thiết bị điện, nitơ lỏng rủi ro cháy nổ Đặc biệt phương pháp khơng thích hợp với chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến Nói chung phương pháp thường dùng với chủng vi sinh vật có đặc tính q mà khơng thích hợp với phương pháp đơng khơ Hình Bảo quản nitơ lỏng Một số phương pháp phổ biến sử dụng bảo quản nhóm vi sinh vật cụ thể: Trong phần giới thiệu cụ thể số phương pháp thông dụng 5.1 Các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn xạ khuẩn: Bảo quản vi khuẩn: a Phương pháp lyophilization): đông khô (Freeze drying/ Đây phương pháp phổ biến sử dụng bảo tàng vi sinh vật giới Phương pháp đông khô hạn chế thay đổi đặc tính vi sinh vật bảo quản thời gian dài Phương pháp đông khô trình bày phương pháp dùng NCTC (National Colleciton Type Culture, Anh) 1, Nuôi vi khuẩn cho đông khô: Vi khuẩn cấy môi trường ống thạch nghiêng thích hợp Tuy nhiên, chuẩn bị dịch vi khuẩn môi trường dịch thể phải làm đậm đặc tế bào li tâm Tuổi tế bào quan trọng thường chọn tế bào nằm pha sinh trưởng log 2, Chuẩn bị đệm mẫu: Có thể dùng hai loại đệm sau: + Đệm huyết thanh- inositol; Meso-inositol: gam Huyết ngựa (số 3): 100 ml Thanh trùng phương pháp lọc vi khuẩn, sau phân 5ml vào bình vơ trùng + Đệm inositol: Môi trường dinh dưỡng bột số 2: 2.5 gam Meso-inositol: gam Nước cất: đủ 100 ml Phân ml vào bình khử trùng nhiệt độ 121OC 3, Chuẩn bị dịch tế bào: Mật độ tế bào có ý nghĩa quan trọng chất lượng bảo quản Thơng thường thu sinh khối từ ống thạch nghiêng dùng cho 1-2 ml đệm pha mẫu để tạo dịch huyền phù tế bào Mật độ vi khuẩn thông thường cần đạt 10 10 (đối với vi sinh vật khơng có bào tử) Mật độ giảm với vi sinh vật có bào tử Hai đệm pha mẫu dùng với vi khuẩn trường hợp enterobacteria khơng dùng đệm huyết gây thay đổi đặc tính miễn dịch vi khuẩn 4, Chuẩn bị ống đông khô: Ống đông khô rửa sau ngâm qua đệm với dịch acid lỗng (HCl 2%) lại rửa sạch, làm khô chuẩn bị nút bông, ống trùng khô khử trùng theo phương pháp thông thường 5, Chuẩn bị mẫu trước đông khô: Lượng dịch huyền phù vi khuẩn đưa cẩn thận pipet pasteur vào ống đông khô khoảng 0.1- 0.2 ml Chú ý thao tác phải cẩn thận tránh dính mẫu vào thành hay phía ống đông khô 6, Bước tiền đông khô: Mục tiêu bước làm bay bị lạnh đơng tạo đá Trước tiến hành đông khô mẫu chuẩn bị qua bước tiền đơng (như trình bày trên) sau bước tiền đông khô tiến hành mẫu lắp vào hệ thống đơng khơ q trình làm nước điều kiện lạnh tiến hành khoảng 7, Tạo chỗ thắt ống đông khô: Sau bước tiền đông khô, yêu cầu phải tạo vết thắt Việc tạo vết thắt thực với hệ thống đèn hàn Tuy nhiên, sở bảo quản vi sinh vật sử dụng hệ thống hàn tạo vết thắt thiết bị tự động 8, Hậu đông khô: Trong bước mẫu lại tiếp tục làm khô độ ẩm cuối đạt khoảng 1% Thời gian cho bước thay đổi từ 1-2 9, Hàn ống đông khô: Việc hàn ống trực tiếp thiết bị đơng khơ (manifold) cần có kinh nghiệm cẩn thận Trước hết phải tiến hành khố van sau thực thao tác hàn ống đông khô 10, Kiểm tra độ chân không ống đông khô: Người ta sử dụng thiết bị đèn phát mức độ chân không Với mẫu đạt độ chân khơng cần thiết xuất màu xanh tím nhạt Đối với mẫu khơng đạt tiêu chuẩn khơng có tín hiệu màu tím đậm 11, Kiểm tra khả sống mẫu: Đếm số lượng tế bào phương pháp chủ yếu để đánh giá chất lượng bảo quản Việc đếm thực trước sau đông khô Các bước kiểm tra thực sau năm để đánh giá chất lượng mẫu đơng khơ Nói chung khả sống vi sinh vật có bào tử cao vi sinh vật khơng có bào tử loại gram dương cao vi sinh vật gram âm Tuy nhiên, với vi sinh vật kỵ khí u cầu phải tiến hành theo qui trình, tránh vi sinh vật tiếp xúc với oxy 12, Bảo quản mẫu: Mẫu thông thường bảo quản 4OC hay nhiệt độ phòng b Phương pháp giữ lạnh sâu: 1, Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu: Tế bào nuôi cấy mơi trường nhiệt độ thích hợp đầu pha log 2, Pha dịch tế bào với glycerol DMSO trùng trước để đạt nồng độ cuối 10% mật độ tế bào 106 3, Dịch huyền phù tế bào đưa vào ống lạnh sâu đóng nắp (trong trường hợp hàn ống thuỷ tinh, cần để dịch xanh metylene 0.05% để phát ống bị rị rỉ) Tồn mẫu để nhiệt độ phòng 30 phút cân áp suất thẩm thấu tế bào Trong trường hợp có nitơ lỏng mẫu chuyển sang bình nitơ lỏng Mẫu đưa vào lạnh sâu cần theo tốc độ định Thông thường tốc độ lạnh dao động 1-3 C/phút để đạt tới nhiệt độ -30OC ban đầu Sau mẫu làm lạnh tiếp với tốc độ cao 10-15 O C/phút để đạt tới nhiệt độ lạnh cần thiết (-100 OC đến -80 OC) Hiện nay, có thiết bị làm lạnh O ... kiểm sốt đặc tính quan trọng vi sinh vật bảo quản Một số điểm lưu ý Bộ sưu tập vi sinh vật: 3.1 Duy trì khả sống vi sinh vật bảo quản: Trong thực phương pháp bảo quản trình bảo quản tế bào vi sinh. .. cần tính tốn số lượng vi sinh vật thời điểm bảo quản thích hợp để trì số lượng vi sinh vật sống thời gian bảo quản dài 3.3 Duy trì đặc tính di truyền ổn định chủng vi sinh vật bảo quản: Nói chung... tính sinh học chủng làm sở cho tra cứu nghiên cứu tính đa dạng vi sinh vật Bảo quản chủng vi sinh vật công vi? ??c khơng dễ dàng, xuất phát từ mục đích bảo quản khơng trì khả sống vi sinh vật, chủng,