Nghiên cứu biến tính Dendrimer polyamidoamine bằng polymer tương hợp sinh học ứng dụng mang thuốc (TT)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- NGUYỄN THỊ TRÂM CHÂU NGHIÊN CỨU BIẾN TÍNH CÁC DENDRIMER POLYAMIDOAMINE BẰNG POLYME

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

- NGUYỄN THỊ TRÂM CHÂU

NGHIÊN CỨU BIẾN TÍNH CÁC DENDRIMER POLYAMIDOAMINE BẰNG POLYMER TƯƠNG HỢP SINH HỌC (PEG VÀ PLURONIC) ỨNG

Trang 2

Công trình được hoàn thành tại:

Phòng Vật liệu hóa dược, Viện Khoa học vật liệu ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam

Những người hướng dẫn khoa học:

1 PGS TS NGUYỄN CỬU KHOA

2 TS TRẦN NGỌC QUYỂN

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện tổ chức tại Viện Khoa

học vật liệu ứng dụng, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam, Số 1, Mạc

Đĩnh Chi, Q.1, TP Hồ Chí |Minh

vào hồi giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

Thư viện Quốc gia Việt nam,

Thư viện Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Trang 3

Ngày càng có nhiều loại thuốc đang được sử dụng phải đối mặt với các vấn đề về độ hòa tan, tác dụng sinh học, độ hấp thụ kém và thời gian tồn trữ ngắn Ngoài ra, các thuốc đặc trị có rất nhiều tác dụng phụ Đặc biệt thuốc chống ung thư không những gây độc với tế bào ung thư mà còn gây độc đối với cả các tế bào lành

Nhiều báo cáo khoa học chỉ ra rằng việc đóng gói các loại thuốc điều trị ung thư vào các hệ chất mang polymer hay nanopolymer đã nâng cao đáng kể độ tan trong nước và độ ổn định lưu trữ thuốc, giúp tăng cường hoạt động chống khối u và giảm tác dụng phụ của thuốc Dendrimer PAMAM là một trong những chất mang nanopolymer có thể làm việc như một công cụ hữu ích cho việc phân phối các loại thuốc, cũng như liệu pháp gen và hóa trị [14, 22,

35, 44, 53, 68, 74-76]

Tuy nhiên, có một nhược điểm của dendrimer PAMAM là gây ra độc tính trong máu và

ly giải tế bào do tương tác mạnh mẽ của các nhóm -NH2 ở trên bề mặt PAMAM với màng tế bào, dẫn đến sự phá vỡ màng tế bào, đồng nghĩa là diệt tế bào [44, 53, 79, 88]

Để giải quyết vấn đề này, các nhóm -NH2 trên bề mặt dendrimer PAMAM được biến tính bằng các polymer tương hợp sinh học, làm triệt tiêu điện tích dương của các nhóm amine trên hoặc ngăn chặn sự tiếp xúc giữa các nhóm -NH2 với màng tế bào giúp giảm độc tính, tạo

ra khả năng tương tác sinh học cao của chất mang, từ đó nâng cao hiệu quả mang thuốc và điều trị [14, 35, 80, 83] Ngoài ra việc biến tính bề mặt PAMAM cũng có thể làm tăng khả năng mang thuốc của PAMAM

Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất đề tài “Nghiên cứu biến tính dendrimer polyamidoamine bằng polymer tương hợp sinh học (PEG và Pluronic) ứng dụng mang thuốc”

2 MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN

Nghiên cứu tổng hợp chất mang thuốc trên cơ sở biến tính dendrimer PAMAM bằng polymer tương hợp sinh học (Pluronic, Polyethylene glycol), với mục tiêu làm giảm độc tính của PAMAM (tăng tính tương hợp sinh học) và tăng khả năng mang thuốc của PAMAM

Trang 4

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU LUẬN ÁN

1 Tổng hợp dendrimer PAMAM đến thế hệ G5.0 từ tâm ethylenediamine (EDA)

2 Nghiên cứu biến tính 4 thế hệ dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 bằng các Polyethylene glycol 4000 (PEG4K), Polyethylene glycol 6000 (PEG6K), Polyethylene glycol

10000 (PEG10K), Polyethylene glycol 12000 (PEG12K)

3 Nghiên cứu biến tính 4 thế hệ dendrimer PAMAM G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 bằng các Pluronic P123, Pluronic F68, Pluronic F127 và Pluronic F108

4 Nghiên cứu tổng hợp dendrimer PAMAM G4.0-F127 với các tỷ lệ mol PAMAM/F127 khác nhau

5 Nghiên cứu hiệu quả nang hóa thuốc chống ung thư 5-Fluorouracil (5-FU) của các chất mang nano PAMAM-PEG và PAMAM-Pluronic

6 Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-Fluorouracil của hệ dendrimer PAMAM

G4.0-PEG6K/5-FU trong in vitro với môi trường đệm PBS (pH=7.4)

7 Khảo sát tốc độ giải phóng thuốc 5-Fluorouracil của hệ dendrimer PAMAM

G4.0-P123/5-FU và PAMAM G4.0-F127/5-FU trong in vitro với môi trường đệm PBS (pH=7.4)

8 Nghiên cứu độc tính tế bào ung thư vú MCF-7 và nguyên bào sợi (Fibroblast) đối với các hệ chất mang nano dendrimer PAMAM, PAMAM-PEG, PAMAM-Pluronic, PAMAM-PEG/5-FU và PAMAM-Pluronic/5FU

4 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN

- Tổng hợp và biến tính các thế hệ dendrimer PAMAM với các polymer tương hợp sinh

học PEG và Pluronic nhằm tạo ra hệ chất mang thuốc có tính tương hợp sinh học và khả năng mang thuốc cao

- Việc nghiên cứu biến tính PAMAM bằng các polymer PEG và Pluronic với các khối lượng phân tử khác nhau làm cơ sở khoa học cho điều kiện phản ứng gắn kết số lượng mạch PEG hay Pluronic khác nhau lên phân tử PAMAM tạo các hệ PAMAM biến tính có kích thước nano khác nhau và có khả năng mang thuốc khác nhau, đặc biệt thuốc chống ung thư 5-

Trang 5

(2) Về mặt so sánh nang hóa thuốc trong chất mang PEG và Pluronic thì PAMAM G4.0-PEG và PAMAM G4.0-Pluronic có khả năng nang hóa thuốc tốt hơn cả Trong đó, PAMAM-Pluronic nang hóa thuốc kỵ nước 5-FU tốt hơn PAMAM-PEG tương ứng

PAMAM-(3) Khả năng mang thuốc của PAMAM-P123> PAMAM-F127> PAMAM-F108 > PAMAM-F68 chịu ảnh hưởng giá trị HLB hơn là ảnh hưởng của mạch cấu trúc

6 BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN

Luận án có 169 trang với 30 bảng, 102 hình, 8 đồ thị Ngoài phần mở đầu (2 trang), kết luận (3 trang), danh mục các công trình công bố (2 trang) và tài liệu tham khảo (14 trang), phụ lục(15 trang), luận án được chia thành 3 chương như sau:

Chương 1: Tổng quan 41 trang

Chương 2: Thực nghiệm 26 trang

Chương 3: Kết quả và biện luận 66 trang

Trang 6

Tổng quan một số công trình nghiên cứu trong lĩnh vực tổng hợp, biến tính PAMAM làm hệ mang thuốc chống ung thư

Nhìn chung trong những năm gần đây, có rất nhiều nghiên cứu về biến tính dendrimer PAMAM bằng polymer tương hợp sinh học Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng phương pháp hoạt hóa Pluronic, PEG bằng NPC và khống chế bằng tỷ lệ mol 1:1 (Pluronic/PEG : NPC) và sử dụng xúc tác (pyridine) hay dung môi (benzene) trong quá trình phản ứng Nhược điểm của phương pháp này là dễ xảy ra khả năng Pluronic hay PEG bị hoạt hóa cả hai đầu bằng NPC và kết quả có thể Pluronic hay PEG liên kết cả 2 đầu vào PAMAM, tạo lớp màng bao phủ bề mặt PAMAM và ngăn cản một phần thuốc không đi vào khoảng trống trong cấu trúc PAMAM [67, 110, 124] Mặt khác, chưa thấy công bố nào sử dụng một

hệ Pluronic có khối lượng phân tử khác nhau để biến tính chuỗi các thế hệ PAMAM, nhằm xây dựng một hệ thống về sự ảnh hưởng cấu trúc dendrimer PAMAM các thế hệ, cấu trúc Pluronic các loại đến mức độ biến tính, độc tính tế bào và hiệu quả nang hóa thuốc Vì vậy trong công trình nghiên cứu của luận án này, chúng tôi tập trung biến tính dendrimer PAMAM thế hệ G2.0, G3.0, G4.0, G5.0 bằng 4 loại PEG và 4 loại Pluronic có khối lượng phân tử khác nhau để xây dựng tính hệ thống về mức độ biến tính và khả năng mang thuốc của các nanopolymer

Trang 7

CHƯƠNG 2 NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ

Hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu của luận án là các hóa chất tinh khiết của các hãng Sigma–Aldrich, Acros Organics (Mỹ), Merck (Đức), Amresco (Hàn Quốc)

Thiết bị và dụng cụ chính được sử dụng như máy đông khô chân không FDU-2100 Eyela (Nhật Bản) tại Viện Công nghệ hóa học, Viện HLKH&CN VN; máy JEOL JEM 1400 (Nhật Bản) chụp hình TEM, tại Trường Đại học Bách Khoa, TP HCM; máy phân tích quang phổ hồng ngoại FTIR Equinox 55 Bruker (Đức), tại Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng, Viện HLKH&CN VN; máy sắc ký gel GPC Agilent 1260 (Hoa Kỳ);sắc ký lỏng HPLC đo bằng máy Agilent 1260 (Hoa Kỳ); Phân tích dòng chảy tế bào đo tại PTN-SHPT- BM Di truyền tại Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP HCM

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Sử dụng phương pháp divergent để tổng hợp nano-dendrimer PAMAM các thế hệ

Sử dụng phương pháp phổ 1H NMR, FTIR và GPC để xác định thành phần cấu trúc

và khối lượng phân tử của PAMAM các thế hệ và PAMAM biến tính với các polymer tương hợp sinh học

Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM để khảo sát hình thái của sản phẩm PAMAM-PEG và PAMAM-Pluronic

Sử dụng các phương pháp nhuộm SRB, nhuộm MTT và nhuộm huỳnh quang

FDA/EB để đánh giá độc tính tế bào in vitro

Sử dụng UV-Vis và HPLC để đánh giá khả năng mang và nhả thuốc của PEG/5-FU và PAMAM-Pluronic/5-FU

Sử dụng các kỹ thuật nuôi cấy tế bào để đánh giá tương hợp sinh học của các loại hydrogel và hydrogel composite tổng hợp

2.3 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

2.3.1 Tổng hợp PAMAM dendrimer đến thế hệ G5.0 từ core ethylenediamine (EDA)

Quá trình tổng hợp PAMAM dendrimer thế hệ G5.0 qua 12 giai đoạn, bắt đầu từ giai đoạn tổng hợp thế hệ G -0.5 xuất phát bởi core ethylenediamine (EDA) lần lượt đến các thế

hệ ké tiếp G0, G0.5, G1.0, G1.5, G2.0, G2.5, G3.0, G3.5, G4.0, G4.5 và G5.0 (hình 2.1)

Trang 8

Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp PAMAM dendrimer các thế hệ 2.3.2 Tổng hợp biến tính dendrimer PAMAM các thế hệ G2.0; G3.0; G4.0; và G5.0 với các PEG 4000 (PEG4K); PEG 6000 (PEG6K); PEG 10000 (PEG10K) và PEG 12000 (PEG12K)

Để kết nối PEG vào phân tử dendrimer PAMAM với các nhóm NH2 trên bề mặt thông

qua ba giai đoạn, cần thiết phải sử dụng pnitrophenyl chloroformate (NPC) và tyramine (TA) tạo chất trung gian Cấu trúc của sản phẩm trung gian NPC-PEG-NPC, NPC-PEG-TA

và của sản phẩm PAMAM-PEG được xác định qua các kết quả phân tích phổ 1H-NMR, FTIR,

2.3.7 Xác định độc tính tế bào của các chất mang nano

Độc tính các hệ chất mang nano được xác định lên tế bào ung thư vú MCF-7 và nguyên bào sợi (Fibroblast)

Trang 9

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 TỔNG HỢP PAMAM TỪ THẾ HỆ G-0.5 ĐẾN THẾ HỆ G5.0

3.1.1 Xác định cấu trúc các dendrimer PAMAM dựa vào phổ khối lượng MS

Phổ khối lượng MS là phương pháp hiệu quả để xác định khối lượng phân tử các polymer

Hình 3.1 Phổ MS của dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G2.0 Phổ MS chứng minh sản phẩm từ G-0.5 đến G 2.0 đúng với cấu trúc sản phẩm, phù hợp với lý thuyết (Hình 3.1 và bảng 3.1)

Bảng 3.1 Khối lượng phân tử các dendrimer PAMAM dựa vào phổ MS

Trang 10

Tuy MS là phương pháp hiệu quả để xác định khối lượng phân tử, nhưng với các dendrimer có khối lượng phân tử lớn từ G2.5 (M = 6049) trở đi thì MS không xác định được

Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của nhóm Schwartz [98] và Hood [46] Cho nên 1H-NMR có thể là phương pháp hiệu quả để theo dõi, đánh giá khối lượng phân tử và độ chuyển hóa của dendrimer và đặc biệt là các dendrimer [25, 29, 49, 58, 73, 112-113] và đặc biệt là các dendrimer ở thế hệ (G) lớn [47, 69]

Độ dịch chuyển hóa học cho các proton đặc trưng trong dendrimer PAMAM đã được ghi nhận theo nhiều báo cáo trước [38, 88-89, 98, 102, 106, 119, 124]

Trong kết quả phổ 1HNMR tương ứng với proton điển hình trong cấu trúc dendrimer:

-CH2CH2N< (a) tại δH = 2.6 ppm; -CH2CH2CO (b) tại δH = 2.82.9 ppm;

-CH2CH2CONH- (c) tại δH = 2.3-2.4 ppm; -CH2CH2NH2 (d) tại δH = 2.72.8 ppm;

-CONHCH2CH2N- (e) tại δH = 3.2-3.4 ppm; -CH2CH2COOCH3- (g) tại δH = 2.4-2.5 ppm và

-COOCH3 (h) tại δH = 3,7 ppm Dưới đây là kết quả 1H-NMR của dendrimer PAMAM các thế hệ (Hình 3.2) [74]

1H-NMR PAMAM G-0.5: tại δH = 2.497 ppm (a), δH = 2.756-2.784 ppm (b), δH = 2.454 ppm (g) và δH = 3.628-3.702 ppm (h)

2.386-1H-NMR PAMAM G0.0: tại δH = 2.561-2.573 ppm (a), δH = 2.771-2.815 ppm (b), δH

= 2.373-2.400 ppm (c), δH = 2.728-2.753 ppm (d) và δH = 3.246-3.336 ppm (e)

1H-NMR PAMAM G0.5: tại δH = 2.536-2.560 ppm (a), δH = 2.730-2.783 ppm (b), δH

= 2.338-2.394 ppm (c), δH = 3.255-3.312 ppm (e), δH = 2.423-2.496 ppm (g) và δH = 3.674 ppm (h)

Trang 11

3.631-1H-NMR PAMAM G4.0: tại δH = 2.550 ppm (a), δH = 2.770 ppm (b), δH = 2.352 ppm (c), δH = 2.746-2.758 ppm (d) và δH = 3.225-3.259 ppm (e)

1H-NMR PAMAM G5.0: tại δH = 2.544 ppm (a), δH = 2.849 ppm (b), δH = 2.340 ppm (c), δH = 2.761 ppm (d) và δH = 3.239-3.251 ppm (e)

Trang 12

Hình 3.2 Phổ 1H-NMR của dendrimer PAMAM thế hệ G-0.5 đến G5.0

Theo kết quả phổ 1H-NMR, các peak đặc trưng của proton tại vị trí (a) và (e) luôn xuất hiện rõ ràng và không trùng lặp với bất kỳ peak khác, nên hai peak này được chọn sử dụng để tính toán đánh giá dendrimer PAMAM theo công thức tính khối lượng phân tử dendrimer thông qua phổ 1H-NMR như sau:

( e ) 2

( a ) 2

( e ) 2

( a ) 2

H( C H )

H( C H ) NMR

H H

( e ) 2 ( C H )

H

 

2 ( C H )

H

 

 : Tổng số proton ở vị trí (e) và (a) tính trong công thức phân tử dendrimer PAMAM

MLT: Khối lượng phân tử của dendrimer PAMAM theo lý thuyết được tính dựa vào công thức phân tử

Áp dụng công thức trên, khối lượng phân tử (KLPT) các dendrimer PAMAM được tính toán dựa vào phổ 1H-NMR không khác nhiều so với KLPT tính dựa vào công thức phân tử (Bảng 3.1)

Cụ thể:

Tính toán KLPT dendrimer PAMAM G-0.5: sử dụng giá trị diện tích peak của các proton tại vị trí b và a trong phổ 1H-NMR (peak b và a là 8,000 và 4,000; tương ứng NMR =

Trang 13

8,000/4,000=2); tổng số proton tính trong công thức phân tử dendrimer PAMAM G-0.5 (peak

b và a là 8 và 4, tương ứng LT =8/4=2) MNMR được tính như sau:

Bảng 3.2 Khối lượng phân tử dựa trên 1H-NMR của PAMAM G-0.5 đến G5.0

Khối lượng phân tử của PAMAM được tính trên phổ 1H-NMR thường nhỏ hơn từ 0-7%

so với lý thuyết Điều này cho thấy khối lượng dendrimer PAMAM tính được từ phổ 1NMR có độ sai lệch không lớn nên có thể dùng để xác định KLPT dendrimer PAMAM có trọng lượng phân tử lớn hơn trong khi phương pháp đo MS không xác định được

H-Phân tử PAMAM các thế hệ ≤ G5.0 đã được tổng hợp thành công và có cấu trúc tương đối hoàn chỉnh và ổn định nên có thể ứng dụng trong lĩnh vực y-dược

3.2 TỔNG HỢP PAMAM-PEG

NPC-PEG-TA, PAMAM và PAMAM-PEG

Các hệ chất mang PAMAM-PEG (PAMAM PEG4K, PEG6K, PEG10K, G2.0-PEG12K, G3.0-PEG4K, G3.0-PEG6K, G3.0-PEG10K, G3.0-PEG12K, G4.0-PEG4K, G4.0-PEG6K, G4.0-PEG10K, G4.0-PEG12K, G5.0-PEG4K, G5.0-PEG6K, G5.0-PEG10K, G5.0-PEG12K) được tổng hợp thông qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau:

Trang 14

G2.0-Hình 3.3 Sơ đồ tổng hợp NPC-PEG-NPC (a), NPC-PEG-TA (b), PAMAM-PEG (c) Phản ứng biến tính PAMAM (G2.0, G3.0, G4.0, G5.0) với nhiều PEG độ dài mạch carbon khác nhau (PEG4K, PEG6K, PEG10K, PEG12K) có các bước phản ứng, các phổ đồ

1H-NMR tương tự nhau, nên ở đây chúng tôi sử dụng phổ đồ của phản ứng PAMAM với PEG4K làm ví dụ, còn phổ đồ của các PEG còn lại sẽ có ở phần phụ lục 4, 5, 6

Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-PEG-NPC, NPC-PEG-TA, PAMAM-PEG đo trong dung môi CDCl3

Giai đoạn 1: Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của NPC-PEG-NPC được thể hiện qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân (hình 3.4 và phụ lục 4) Phổ đồ có các tín hiệu của các proton

có trong PEG như sau: tín hiệu δH = 3,40-3,79 ppm là proton của nhóm methylene (-OCH2

-CH2O-) trên EO và tín hiệu của proton methylene liên kết trực tiếp với nhóm carbonate ở δH

= 4,44 ppm (-CH2-O-NPC) Sự xuất hiện của hai tín hiệu đôi ở δH = 7,39 ppm và δH = 8,29

ppm là hai tín hiệu đặc trưng của proton nhóm NPC (-CH=CH-) Độ hoạt hóa PEG đạt trên

90% được tính từ tỷ lệ tích phân của proton thơm (NPC) và proton methylene (PEG) Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu Park [64] và Nguyen [26]

Hình 3.4 Phổ 1H-NMR của NPC-PEG4K- NPC Phổ đồ 1H-NMR của các NPC-PEG-NPC khác được thể hiện ở phụ lục 4 và cũng cho kết quả tương tự như ở phổ đồ 1H-NMR của NPC-PEG4K-NPC

Định dạng
Số trang	28
Dung lượng	2,17 MB