Định Lượng Tổng Nấm Men Nấm Mốc

Trong thực phẩm nếu có thể sinh trưởng và phát triển của nấm men, nấm mốc có thể làm thay đổi màu của thực phẩm, phát sinh mùi, vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cấu trúc của thực phẩm, mộ

TIỂU LUẬN MÔN

PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG NẤM MEN NẤM MỐC

TP.HCM, ngày 9 tháng 10 năm 2015

GVHD: NGUYỄN THỊ KIM OANH

SVTH: Nhóm 3 LỚP: Thứ 2, Tiết 10-11

Danh sách nhóm

1 Trần Thị Mỹ Dung 2022130063 Tổng hợp word, tìm tài liệu

2 Nguyễn Hoàng Việt 2022130030 Chỉnh sửa word

3 Bùi Thị Thanh Hương 2022130033 Tìm tài liệu

5 Nguyễn Thị Vân Anh 2022130038 Tìm tài liệu

6 Thái Thị Tuyết Hà 2022130001 Tổng hợp power point, báo cáo

Mục lục

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG NẤM MEN-NẤM MỐC

1 Tổng quan về nấm men và nấm mốc

Nấm men và nấm mốc là nhóm vi sinh vật rất đa dạng, cho đến nay có hơn 400,000 loài nấm men và nấm mốc đã được mô tả Đây là nhóm vi sinh vật nhân thật, có vách tế bào là lớp vỏ chitin, có nhân và các bào quan khác Tất cả các loài nấm men và nấm mốc đều thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng cần nguồn dinh dưỡng cung cấp năng lượng

từ môi trường bên ngoài, vì thế vi sinh vật này thường xuyên được phân lập từ thực phẩm hay các nguồn giàu dinh dưỡng khác Ta có thể phân biệt nấm men và nấm mốc theo các khái niệm cơ bản như sau:

− Nấm mốc có cấu tạo hình sợi phân nhánh, tạo thành một hệ chằng chịt phát triển rất nhanh gọi là khuẩn ti thể hay hệ sợi nấm

− Nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, phát triển thành các khuẩn lạc tròn, lồi viền đều, bóng hoặc mờ trên bề mặt môi trường thạch nấm Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là mầm để tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn của khuẩn ty Trong thực phẩm nếu có thể sinh trưởng và phát triển của nấm men, nấm mốc có thể làm thay đổi màu của thực phẩm, phát sinh mùi, vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cấu trúc của thực phẩm, một số tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm

− Quá trình tăng trưởng của nấm men và nấm mốc phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố từ môi trường Hầu hết nấm mốc, nấm men đều thuộc nhóm vi sinh vật ưa mát, nhiệt

độ thích hợp cho sự phát triển của chúng trong khoảng 20 – 280C, một số ít trong nhóm này ưa lạnh hay ưa nóng Nước hoạt tính cũng là một nhân tố ảnh hưởng rất quan trọng đến tăng trưởng Hầu hết các loài nấm men nấm mốc và nấm men phát

triển tốt trong cơ chất có nước hoạt tính khoảng 85% hay lớn hơn, một số ít loài có thể tăng trưởng trong cơ chất có nước hoạt tính thấp hơn khoảng 60 – 70% Nấm mốc và nấm men tăng trưởng được trong vùng pH từ 2 - 9, trong đó pH thích hợp nhất nằm trong khoảng 4 – 6,5 Hầu hết nấm mốc, nấm men đều thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, một số có thể phát triển trong điều kiện vi hiếu khí Một số loài có thể tiếp nhận oxy nguyên tử từ cơ chất của chúng, nhưng dù ở dạng nào, oxy vẫn là nguyên tố cần thiết cho quá trình phát triển của nấm mốc và nấm men

Mật độ nấm men và nấm mốc trong mẫu được xác định chung dưới dạng tổng nấm men và nấm mốc bằng kỹ thuật pha loãng, trãi hộp và đếm khuẩn lạc trên môi trường Dichloran 18% Glycerol Agar (DG 18) hay Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC) Môi trường DRBC được sử dụng cho các loại mẫu thực phẩm và thức ăn chăn nuôi có hoạt độ nước lớn hơn 0.95 như thịt, trứng, các sản phẩm sữa ( trừ sữa bột ) rau quả, các loại pate tươi… Môi trường DG18 được sử dụng cho các loại mẫu thực phẩm

và thức ăn chăn nuôi có hoạt độ nước nhỏ hơn hoặc bằng 0.95 như quả khô, bánh ngọt, mứt, thịt khô, cá muối, ngũ cốc, đậu đỗ và các sản phẩm đậu đỗ, bột mì, quả hạch, gia vị…

Trong thực phẩm, khi có sự hiện diện của mốc và men, chúng phát triển làm thay đổi màu của thực phẩm, phát sinh mùi, vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cấu trúc của thực phẩm, một số tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm

2 Phương pháp định lượng tổng nấm men nấm mốc

2.1 Phương pháp 1: Phương pháp truyền thống

2.1.1 Phạm vi áp dụng.

Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 8275-1,2:2012 (ISO 21527-1,2:2008) dùng để định lượng nấm men và nấm mốc trong các sản phẩm thực phẩm hoặc trong thức

ăn chăn nuôi có hoạt độ nước lớn hơn 0.95% và hoạt độ nước nhỏ hơn hoặc bằng 0.95%

2.1.2 Nguyên tắc

1. Chuẩn bị các đĩa nuôi cấy bề mặt, sử dụng môi trường nuôi cấy chọn lọc qui định Tùy chọn vào số lượng khuẩn lạc dự kiến, sử dụng lượng xác định của mẫu (nếu

sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (nếu sản phẩm ở dạng khác), hoặc các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu/huyền phù

Có thể chuẩn bị các đĩa bổ sung trong cùng điều kiện, sử dụng các dung dịch thập phân của mẫu thử hoặc các huyền phù ban đầu

2. Ủ các đĩa đã cấy trong điều kiện hiếu khí ở 25⁰C ± 10C trong 5 ngày Các đĩa thạch có thể được để trong ánh sáng khuếch tán từ 1 ngày đến 2 ngày, nếu cần

3. Đếm các khuẩn lạc/các chồi, khẳng định việc nhận dạng các khuẩn lạc nghi ngờ bằng kính phóng đại hoặc kính hiển vi (để phân biệt các khuẩn lạc của nấm men với các khuẩn lạc của vi khuẩn), nếu cần

4. Số lượng nấm men và nấm mốc trong một gam hoặc một mililit mẫu được tính từ

số lượng khuẩn lạc/chồi/mầm thu được trên các đĩa đã chọn ở các mức pha loãng tạo ra các khuẩn lạc có thể đếm được Nấm men và nấm mốc được đếm riêng, nếu cần

Xác định số lượng nấm men và nấm mốc trong mẫu bằng kỹ thuật pha loãng và đổ đĩa, một khối lượng mẫu xác định được cấy trang trên môi trường DG18 ( Dichloran Glycerol Agar ) hay DRBC ( Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar ) Sau khi ủ

250C trong 5-7 ngày, đếm số khuẩn lạc nấm men và nấm mốc riêng biệt

2.1.3 Môi trường và hóa chất.

DRBC

NaOH 10%

Bảng 1 Môi trường và hóa chất.

2.1.3.1 Dịch pha loãng

2.1.3.1.1 Yêu cầu chung

Xem TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả các phần), TCVN 6263 (ISO 8261) và tiêu chuẩn cụ thể có liên quan đến sản phẩm

CHÚ THÍCH: có thể bổ sung các tác nhân hoạt động bề mặt như natri poly (oxyetylen) sorbatitanmonooleat [0,05 % nồng độ khối lượng] vào dịch pha loãng để giảm các màng bào tử nấm mốc và bào tử dính

Khuyến cáo sử dụng canh thang nước pepton 0,1% (nồng độ khối lượng) làm dịch pha loãng, trừ khi để chuẩn bị mẫu thử cụ thể

2.1.3.1.2 Thành phần của canh thang nước pepton 0,1 % (nồng độ khối lượng)

Dịch thủy phân mô động vật hoặc thực vật bằng enzym 1,0 g

Dịch thủy phân mô động vật hoặc thực vật bằng enzyme (1,0g) là hàm lượng để vi sinh vật phát triển không nhằm mục đích tăng sinh

2.1.3.1.3 Chuẩn bị canh thang nước pepton 0,1% (nồng độ khối lượng)

Hòa tan các thành phần trên trong nước, đun nóng nếu cần

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 250C, nếu cần

2.1.3.2 Môi trường nuôi cấy

2.1.3.2.1 Thạch dichloran-rose bengal chloramphenicol (DRBC)

Thành phần

Sản phẩm thủy phân mô động vật hoặc thực vật bằng

Dichloran (2,6-dicloro-4-nitroanilin) 0,002 g

2.1.3.2.2 Thạch dicloran glycerol 18% (nồng đồ khối lượng) (DG18)

Thành phần

Sản phẩm thủy phân casein bằng enzym 5,0 g

Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 1,0 g

Magie sulfat (MgSO4.H2O) 0,5 g

Dichloran (2,6-dicloro-4-nitroanilin) 0,002 g

Nước cất hoặc nước đã loại ion 1 000 ml

a Tùy vào sức đông của thạch

 Vai trò của các thành phần trong môi trường

Sản phẩm thủy phân mô động vật hoặc thực vật bằng enzyme chứa phong phú các chất đạm hữu cơ, cũng có một số vitamin và đường cung cấp các chất dinh dưỡng cho vi sinh vật phát triển

D-Glucoza (C6H12O6) là nguồn vật chất cung cấp C trong quá trình sinh trưởng của

vi sinh vật Trong tế bào nguồn C trải qua một loạt quá trình biến hoá hoá học phức tạp sẽ biến thành vật chất của bản thân tế bào và các sản phẩm trao đổi chất Ngoài ra, nguồn C còn là nguồn cung cấp năng lượng tốt cho vi sinh vật

Kali dihydro phosphat (KH2PO4) : là thành phần của acid nucleic, nucleoprotein, phospholipid, coenzyme, ATP… Làm nên hệ thống đệm giúp điều chỉnh pH môi trường

Magie sulfat (MgSO4.H2O): là thành phần trung tâm hoạt tính của một số emzyme, thành phần của sắc tố quang hợp

− Môi trường có chứa dichloran và rose bengal nên ức chế sự kéo dài khuẩn ty nấm mốc mọc nhanh , vì thế cho phép phát hiện những nấm mốc mọc chậm

− Rose bengal là chất dễ bị phân hủy trong ánh sáng, nên cần giữ môi trường

trong tối

Glycerol khan có vai trò khử độc cho môi trường Với phương pháp bảo quản lạnh sâu, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung Glycerol làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh

Thạch dùng để làm rắn môi trường chứ không phải là cơ chất dinh dưỡng cho vi sinh vật sử dụng

Cloramphenicol là kháng sinh, có tác dụng kìm khuẩn, nhưng có thể diệt khuẩn ở nồng độ cao hoặc đối với những vi khuẩn nhạy cảm cao

Nước là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy, là yếu tố quan trọng nhất quyết định sự phát triển của mọi sinh vật Sự trao đổi chất, quá trình sinh tổng hợp các cấu trúc tế bào, nghĩa là các phản ứng sinh hóa chỉ có thể xảy ra trong môi trường nước trong môi trường không có nước mọi hoạt động dinh dưỡng đều bị dừng lại, bởi ở trạng thái khô các chất dinh dưỡng đều không thể thâm nhập vào tế bào

2.1.3.2.3 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Yêu cầu chung

Hòa các thành phần trên vào nước bằng cách đun sôi để hòa tan, trừ chloramphenicol Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 5,6 ± 0,2 ở 250C, nếu cần Cho thêm 10 ml dung dịch chloramphenicol 1% (nồng độ khối lượng) trong etanol

và trộn Phân phối môi trường này vào các vật chứa có dung tích thích hợp Khử trùng 15 min bằng hấp áp lực ở 1210C

Làm nguội ngay môi trường trong nồi cách thủy được duy trì ở nhiệt độ từ 440C đến

470C Làm nguội đến dưới 500C và phân phối các lượng 15 ml vào các đĩa Petri vô trùng

Để yên cho môi trường đông đặc và làm khô bề mặt thạch theo TCVN 6404 (ISO 7218) và TCVN 8128 (ISO/TS 11133) (tất cả các phần), nếu cần

Sử dụng ngay hoặc bảo quản nơi tối thiểu TCVN 8128 (ISO/TS 11133) (tất cả các phần) cho đến khi sử dụng

CẢNH BÁO - Không để môi trường tiếp xúc với ánh sáng, vì khi tiếp xúc với ánh sáng có thể sinh ra các sản phẩm gây độc cho tế bào làm ảnh hưởng đến kết quả định lượng.

2.1.3.2.4 Phương pháp bổ sung chlortetracycline clohydric

Việc phát triển quá mức vi khuẩn có thể là một vấn đề (ví dụ: thịt tươi), do đó khuyến cáo sử dụng chloramphenicol (50 mg/l) và chlortetracycline (50 mg/l) Trong trường hợp nay, chuẩn bị môi trường cơ bản như trên nhưng chỉ sử dụng 50 mg chloramphenicol rồi phân phối các lượng 100 ml và khử trùng Đồng thời chuẩn bị dung dịch Chlortetracycline clohydric 0,1 % (khối lượng) trong nước (vì dung dịch này không

ổn định nên phải chuẩn bị ngay trước khi sử dụng) và lọc để khử trùng Ngay trước khi sử dụng, thêm 5 ml dung dịch này một cách vô trùng vào 100 ml môi trường cơ bản và đổ ra đĩa Không khuyến cáo sử dụng gentamicin vì việc sử dụng gentamicin cho thấy ức chế một số loài nấm men

2.1.3.2.5 Phương án bổ sung các nguyên tố với lượng vết.

Để cho nấm mốc thể hiện hoàn toàn hình thái, cụ thể là sắc tố của chúng, thì cần đến nguyên tố với lượng vết mà có thể không có trong DRBC Để nhận biết các nấm mốc trên môi trường này, thì thêm dung dịch nguyên tố với lượng vết sau đây với 1 ml trên 1li môi trường, trước đó đã được hấp áp lực: 1 g ZnSO4.7H2O; 0,5 g CuSO4.5H2O; 100 ml nước cất hoặc nước đã loại ion

2.1.3.2.6 Phương án bổ sung Tergitol (đối với môi trường DRBC)

Để tránh Mucoraceae mọc quá dày trên các đĩa thạch, thì nên bổ sung Tergitol(1

ml/l) vào môi trường nuôi cấy

2.1.4 Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Có thể dùng dụng cụ sử dụng một lần để thay thế cho các dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần nếu nó có các đặc tính kỹ thuật phù hợp

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN

6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau:

1. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 250C ± 10C

2. Pipet xả hết, vô trùng, dung dịch danh nghĩa 1 ml, được chia vạch 0,1 mlít

3. Nồi cách thủy, hoặc dụng cụ tương tự, có khả năng duy trì nhiệt độ ở 440C đến

470C

4. Máy đo pH, có độ chính xác 0,1 đơn vị pH ở 250C

5. Chai, bình và ống nghiệm, để đun sôi và bảo quản môi trường nuôi cấy và pha

loãng dung dịch

6. Đĩa Petri vô trùng, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, đường kính từ 90 mm đến 100

mm

7. Kính hiển vi, để phân biệt nấm men với các tế bào vi khuẩn (có trường sáng, độ

khuếch đại từ 250 lần đến 1 000 lần)

8. Que dàn mẫu, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo (đường kính nhỏ hơn 2 mm và dài 80

mm) Đường kính không được vượt quá 2 mm để giảm thiểu lượng mẫu dính vào que khi kết thúc dàn mẫu

9. Kính khuếch đại hai thị kính, để phân biệt các khuẩn lạc/tế bào nấm men và nấm

mốc (khuếch đại từ 6,5 lần đến 50 lần)

2.1.5 Thực hành.

Đồng nhất mẫu bằng máy Stomacher trong 60 giây

Cân 10g/25g đối với mẫu rắn hoặc hút 10ml/25ml đối với mẫu lỏng + 90/225ml

Saline Pepton Water

Pha loãng

DRBC hoặc DG18

DRBC hoặc DG18

DRBC hoặc DG18 DRBC hoặc

DG18

Hình 1 Quy trình định lượng tổng nấm men-nấm mốc

2.1.5.1 Các bước tiến hành

Bước 1 Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu

Mục đích: chuẩn bị mẫu cho các giai đoạn tiếp theo trong quá trình phân tích thực hiện được chính xác hơn, chuyển vi sinh vật trong mẫu ban đầu vào dung dịch pha loãng, đồng nhất mẫu, tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển, chứ không nhằm mục đích tăng sinh

Cân chính xác 10g/25g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thể tích 10ml/25ml đối với mẫu lỏng của phần mẫu thử đại diện với sai số cho phép ±5%, cho vào túi nhựa vô trùng ( bình tam giác )

Cho dung dịch pha loãng SPW 90/225ml (sai số cho phép ±5%) vô trùng vào túi nhựa ( bình tam giác ) chứa mẫu SPW tạo môi trường đẳng trương và không làm tổn thương vi sinh vật

Đồng nhất mẫu và dung dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác có mẫu và dung dịch pha loãng trong 2÷3 phút Việc này giúp phóng thích vi sinh vật trong mẫu ra bên ngoài trộn với dung dịch pha loãng mẫu, để các bước phân tích tiếp theo được chính xác hơn

Để vi sinh vật không bị tổn thương do thay đổi nhiệt độ đột ngột, thì nhiệt độ của dịch pha loãng trong suốt trong quá trình thao tác luôn phải giữ xấp xỉ bằng nhiệt độ phòng

Dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch bằng que dàn mẫu vô trùng cho đến

khi khô bề mặt thạch Ủ 250C/3-5 ngày

Đọc kết quả Chọn các đĩa mọc ≤ 150 khuẩn lạc/mầm/chồi ở hai độ pha loãng

liên tiếp

Tính và biểu thị kết quả

Do các bào tử lắng xuống nhanh trong pipet, nên để pipet ở tư thế nằm ngang (không để đứng) khi được làm đầy với một thể tích của huyền phù hoặc dung dịch pha loãng thích hợp

Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng bằng máy vortex để tránh các phần tử có vi sinh vật lắng xuống

Bước 2 Pha loãng mẫu

Mục đích: dung dịch sau khi pha loãng sẽ có mật độ vi sinh vật phù hợp cho kỹ thuật phát hiện, định lượng hoặc phân lập vi sinh vật thành những khuẩn lạc riêng biệt Từ

đó chúng ta có thể gián tiếp xác định được mật độ tế bào hay bào tử có trong thực phẩm cũng như phân lập để tạo dòng thuần vi sinh vật

Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ±5% cho vào một ống nghiệm chứa 9ml dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp

Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5-10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10-2 (đối với các loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10-1) Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10-3, 10-4, 10-5 ,… cho đến khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp

Bước 3 Cấy và ủ mẫu

Cấy: là những thao tác chuyển vi sinh vật từ môi trường đang sống sang môi trường thuận lợi hơn cho sự phát triển của chúng

Ủ mẫu: là quá trình đảm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi nhất cho sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật

Mục đích:

− Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các nguyên liệu vật phẩm cần nghiên cứu

− Tiến hành nhân giống vi sinh vật một cách nhanh chóng

− Bảo tồn các giống thuần khiết

− Nghiên cứu các đặc tính sinh học và hệ thống sinh học của chúng

Dùng pipet vô trùng chuyển 0.1 ml mẫu thử lỏng 0.1 ml huyền phù ban đầu đối với sản phẩm ở dạng khác cho vào đĩa thạch DRBC hoặc DG18