Kỹ thuật nuôi cấy mô đã được áp dụng rất hiệu quả trong việc nhân giống các loài quý hiếm, những cây đột biến và cây lai. Đề tài: “Vi nhân giống cây hoa sứ thái” được thực hiện nhằm mục tiêu: Xác định được hiệu quả của môi trường nuôi cấy trên sự sinh trưởng và phát triển cây sứ Thái in vitro và ex vitro; Xây dựng qui trình nhân giống, tạo vật liệu phục vụ cho công tác giống cây hoa kiểng ở đồng bằng sông Cửu Long. Trong thí nghiệm này gồm 4 thí nghiệm: Hiệu quả của GA3 và BA trên sự nảy mầm của hạt sứ thái; Hiệu quả của NAA lên sự tạo rể của chồi hoa sứ thái in vitro; Ảnh hưởng của giá thể lên sự thuần dưỡng cây sứ thái. Kết quả cho thấy: Môi trường 2 mgl GA3 đã kích thích hạt sứ thái nẩy mầm và vươn cao tốt nhất; nghiệm thức 0.2 mgl BA đạt số chồi gia tăng cao hơn các nghiệm thức còn lại; Ở các nghiệm thức có sử dụng NAA có sự xuất hiện mô sẹo ở gốc của chồi lớn hơn so với đối trứng và những mô sẹo này sẽ giúp cây con sống sót được khi thuần dưỡng ở nhà lưới; nghiệm thức tro trấu + xơ dừa (1:1) đã giúp chồi tạo rễ nhiều hơn và nghiệm thức: tro + xơ dừa + đất (1:1:1) đã giúp chồi sinh trưởng tốt
TÓM LƯỢC Kỹ thuật nuôi cấy mô áp dụng hiệu việc nhân giống loài quý hiếm, đột biến lai Đề tài: “Vi nhân giống hoa sứ thái” thực nhằm mục tiêu: Xác định hiệu môi trường nuôi cấy sinh trưởng phát triển sứ Thái in vitro ex vitro; Xây dựng qui trình nhân giống, tạo vật liệu phục vụ cho công tác giống hoa kiểng đồng sông Cửu Long Trong thí nghiệm gồm thí nghiệm: Hiệu GA3 BA nảy mầm hạt sứ thái; Hiệu NAA lên tạo rể chồi hoa sứ thái in vitro; Ảnh hưởng giá thể lên dưỡng sứ thái Kết cho thấy: Môi trường mg/l GA3 kích thích hạt sứ thái nẩy mầm vươn cao tốt nhất; nghiệm thức 0.2 mg/l BA đạt số chồi gia tăng cao nghiệm thức lại; Ở nghiệm thức có sử dụng NAA có xuất mô sẹo gốc chồi lớn so với đối trứng mô sẹo giúp sống sót dưỡng nhà lưới; nghiệm thức tro trấu + xơ dừa (1:1) giúp chồi tạo rễ nhiều nghiệm thức: tro + xơ dừa + đất (1:1:1) giúp chồi sinh trưởng tốt MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN TÓM LƯỢC MỤC LỤC DANH SÁCH BẢNG DANH SÁCH HÌNH CHỮ VIẾT TẮT GIỚI THIỆU CHƯƠNG 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược sứ Thái 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Đặc tính thực vật 1.1.3 Kỷ thuật nhân giống sứ Thái 1.1.4 Giá trị sứ Thái 1.2 Sơ lược chất điều hoà sinh trưởng auxin cytokinin 1.2.1 Auxin 1.2.2 Cytokinin 1.2.3 Gibberellic acid (GA3) 1.3 Vi nhân giống trồng 1.3.1 Khái niệm vi nhân giống 1.3.2 Vai trò vi nhân giống 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình vi nhân giống 1.3.4 Các giai đoạn vi nhân giống CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương tiện 2.2 Phương pháp 2.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 2.2.2 Bố trí thí nghiệm 2.3 Phương pháp xử lý số liệu CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hiệu GA3 BA nảy mầm hạt sứ Thái 3.1.1 Tỉ lệ hạt nảy mầm 3.1.2 Chiều cao 3.1.3 Số 3.2 Hiệu BA lên nhân chồi sứ Thái 3.2.1 Chiều cao gia tăng 3.2.2 Số gia tăng 3.2.3 Số chồi gia tăng 3.3 Ảnh hưởng loại giá thể lên dưỡng sứ Thái 3.3.1 Tỉ lệ sống 3.3.2 Chiều cao gia tăng 3.3.3 Số rễ gia tăng chiều dài rễ gia tăng 3.4 Xây dựng quy trình vi nhân giống sứ Thái CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận 4.2 Đề nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH SÁCH BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1: Tỉ lệ (%) hạt nảy mầm trong môi trường có nồng độ khác sau 1-2 tuần nuôi cấy Bảng 2: Chiều cao (cm) chồi sứ Thái gieo từ hạt môi trường có nồng độ khác sau 1-2 tuần nuôi cấy Bảng 3:Số chồi sứ Thái gieo từ hạt môi trường có nồng độ khác sau 1-2 tuần nuôi cấy Bảng 4: Số chồi gia tăng chồi sứ Thái môi trường có nồng độ BA khác sau 1-4 tuần nuôi cấy Bảng 5: Chiều cao gia tăng (cm) chồi sứ Thái môi trường có nồng độ BA khác 1- tuần nuôi cấy Bảng 6: Số gia tăng chồi sứ Thái môi trường có nồng độ BA khác sau 1-4 tuần nuôi cấy Bảng 7: Số rễ gia tăng chiều dài rễ gia tăng chồi sứ Thái loại gái thể khác sau 1-4 tuần dưỡng Bảng 8: Chiều cao gia tăng chiều dài rễ gia tăng chồi sứ Thái loại giá thể khác sau 1-4 tuần dưỡng Bảng 9: Số gia tăng chồi sứ Thái loại giá thể khác sau 1- tuần dưỡng DANH SÁCH HÌNH Tên hình Trang Hình 1: Vật liệu thực vật (Trái sứ Thái) Hình 2: Hạt sứ Thái sau tuần nuôi cấy Hình Chồi sứ Thái nghiệm thức 0.2 mg/l BA TSKC Hình 4: Cây sứ Thái sau tuần dưỡng Hình 6: Cây sứ Thái nghiệm thức Tro +xơ dừa (1:1) Hình 7: Quy trình vi nhân giống sứ Thái CHỮ VIẾT TẮT BA Benzyl Adenine IAB Indol butyric acid IAA Indol acetic acid NAA α- Naphthalene acetic acid 2,4 – D Dichlorophenoxy acetic acid GA3 Gibberellic acid MS Murashige Skoog (1962) TSKC Tuần sau cấy TSKTD Tuần sau dưỡng GIỚI THIỆU Cây sứ sa mạc gọi sứ Thái có tên khoa học Adenium obesum Roem Và Schult , thuộc họ Apocynaceae (họ chúc đào), mệnh danh hoa hồng sa mạc xuất từ lâu, có nguồn gốc nước xa mạc Phi Châu Loài trồng phát triển nhiều nơi nước ta Với hình dáng đặc biệt cảu rễ, màu sắc hoa rực rỡ, đồng thời loài chụi hạn giỏi, dễ chăm sóc nên từ lâu sứ Thái có vị trí vững thị trường hoa cảnh Việt Nam Cây sứ dễ trồng, khả nhân giống nhanh, hoa đẹp Ngoài vẻ đẹp hoa, sứ uốn tạo thành kiểng, nhờ rễ đẹp Cấu tạo đặc biệt cảu rễ sứ giúp nghệ nhân sáng tạo muôn hình vạn trạng Chính điều làm cho sứ mang lại giá trị cao thị trường Cây sứ nhiều người ưa thích, trồng sứ đem lại hiệu cao (Huỳnh Văn Thới, 2000) Nhóm mọng nước, xương rồng sứ nghiên cứu nhân giống kỷ thuật in vitro nước tiên tiến Kỹ thuật có hiệu nhân giống loaif quý hiếm, đột biến lai từ mảnh nhỏ Đề tài “Vi nhân giống hoa sứ Thái (Adenium obesum Roem Và Schult )” thực nhằm tìm nồng độ chất điều hoà sinh trưởng thích hợp cho sinh trưởng, phát triển, sứ in vitro ex vitro, làm sở cho công tác chuyển gen lai tạo giống CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược sứ Thái 1.1.1 Nguồn gốc Sứ Thái hay gọi sứ xa mạc có tên tiếng anh Desert Rose hay Impala Lily (Phạm Hoàng Hộ, 2000) Tên khoa họ: Adenium obesum (Forssk) Roem Và Schult, thuộc họ Apocynaceae (họ Chúc Đào) Chúng có nguồn gốc vùng nhiệt đới cận nhiệt đới miền đông miền nam Châu Phi bán đảo Ả Rập 1.1.2 Đặc tính thực vật a Rễ: sứ có rễ rễ củ rễ cái: mọc trực tiếp từ thân cây, điểm tiếp giáp rễ thân đoạn vòng co (cỗ rễ) Rễ phần rễ lớn mọc trước tiên sứ hình thành rễ rễ phải lớn, phải mạnh để giữ cho sứ bám đất, không bị ngã, đổ gió lớn Khi trồng lâu ngày, rễ phìn to lồi lên mặt đất mang hình thụ bắt mắt Cây sứ trồng trực tiếp xuống đất rễ bò ngoằn ngoè không tập chung lại nên không thẩm mỹ trồng chậu Hơn trồng chậu giúp kiểm soát nguồn dinh dưỡng cho sứ tốt hơn, kịp thời bổ sung dinh dưỡng cho Cây sứ trồng đất hoa thiếu dinh dưỡng (Hoàng Đức Khương, 2006) Rễ (rể nhánh): phần rễ nhỏ mọc từ rễ cái, đầu rễ có rể cám nhiều lông, tơ mịn màu trắng để hút nước, phân chất dinh duongx nuôi Rễ mền, không chắn rễ cái, nên dễ bị dập, úng dẫn đến gây thối củ, rễ sứ Tuy không trực tiếp làm đẹp cho rễ rễ thành phần quan trọng sứ rễ nơi tiếp nhận nguồn dinh dưỡng cho bệnh thối củ sứ đa phần xuất phát từ việc rễ bị tổn thương, lan rễ cần quan tâm đến rễ Thường trồng lâu, rễ bò lan ra, bít lỗ thoát nước đáy chậu nên làm sứ bị úng nên thối chết (Huỳnh Văn Thơi, 2000) Cây sứ trồng lâu cần kiểm tra thường xuyên lỗ thoát nước Rễ sứ trồng chậu thường phát triển thành “nùi” rễ, hút hết chất dinh dưỡng nên rễ cần “dọn” lại, cắt bỏ rễ không thẩm mỹ Nếu xét vẻ đẹp toàn diện sứ theo thang điểm rễ chiếm vị trí chủ chốt, tương đương với hoa sứ sứ loại kiểng có hoa, sau xét đến cành, lá, tán… Nhưng với sứ chơi theo dạng bonsai, chơi gốc rễ coi 80% vẻ đẹp Hơn rễ to, khoẻ nuôi cành, lá, hoa đẹp (Hoàng Đức Khương, 2006) Củ: có sứ trồng từ hột có “củ” phần tiếp giáp thân sứ rễ Cây sứ trồng từ cành giâm chiết củ Nếu phần lớn chất dinh dưỡng trồng từ cành nằm rễ sứ hột nằm củ Củ phìn to để trữ lượng cho sứ Củ to, đẹp trữ nhiều nước, chất dinh duõng Quan sát sứ trồng từ hạt thấy dường thân, củ rể liền lạc đoạn tiếp giáp thân rễ tròn phình dần phát triển to Đôi củ sứ phát triển mạnh nên trữ hết nguồn dinh dưỡng dẫn đến rễ không phát triển nhiều (Huỳnh Văn Thới, 2000) b Thân Thân sứ phần mọc lên từ đoạn cỗ rễ tiếp giáp với củ rễ Là phần xương sống cho sứ Thân nhỏ màu xanh lớn trở thành màu xám mốc Thân có dạng thân gỗ gồm nhiều khoanh, bên mô gỗ cứng bên khoanh mang mủ, căt ngang thấy xuất lớp keo trong, dần chuyển màu sang đục trăng sữa Thân mang nhiều cành làm cho tàn Khi muốn sứ nhiều cành, nhánh để có tán sum xuê thân thường cắt ngang sát gốc Đặc biệt với sứ hột, cành- nhánh đâm từ thân nên không cắt ngang thân thân vươn cao nghiêu không, dễ ngã đổ (Hoàng Đức Khương, 2006) Nhưng sứ hột cắt sát thân lớn lên, nhiều cành mọc mạnh tua tủa từ cổ rẽ khiến phần thân dường biến mắt, củ cụm cành khiến cân đối hình dáng c Cành, nhánh Nhánh sứ phần mọc từ thân cây, màu xanh sáng màu thân “non” Nhánh mang mọc so le Nhánh tạo nên cấu trúc tán Cây sứ đẹp phần nhánh mọc tạo nên hài hoà chung Đối với sứ lớn, nhánh lớn nên cần cắt nhánh để tạo thành nhánh mọc từ chỗ cắt tạo cho sum xuê, nhiều hoa Nhánh cần ý chăm sóc thường ghép giống lên nhánh sứ ghép trực tiếp lên thân (Huỳnh Văn Thới, 2000) d Lá Lá sứ dày mộng nước thường có màu xanh bóng mọc đầu cành Với nhiều giống sứ phong phú kiểu dáng Lá trơn, láng có lông tơ mịn; màu từ xanh đến nâu, đỏ; đuôi có chóp nhọn có gai nhỏ hoặc lõm vào Giữa trục có đường gân mang gân phụ chạy dọc ngang Gân chìm bật hẳn lên Vì sứ loài mang tính sa mạc nên già rụng nên phần cành sứ già trụi mọc đầu cành Màu đỉnh nhọn cho ta biết xác màu hoa (Hoàng Đức Khương, 2006) e Hoa Hoa yếu tố quan trọng sứ nào, có nhiều màu khác nhau: đỏ, trắng, hồng, tím, vàng…hoặc trắng hồng, đỏ đen, trắng tím có viền… đa dạng Hoa nở theo chùm hoa, chụm hoa có từ đến 10 hoa; giống siêng hoa có tới 20 hoa chùm nở dần tháng hết Có giống hoa nỡ dần hoa (không bắt mắt có hoa) Cánh hoa: Hoa sứ đa phần có cánh xoè to ra, có hoa 6,7,8 cánh đột biến không bề vững Cánh tròn, hình đầu cánh nhọn; cánh mọc khít cánh xen sát với cánh chồng lên làm hoa tròn trịa đẹp cánh rời rạc; cánh dúm quăn; cánh cưa Có giống hoa có hai tầng cánh, lớp lớn hơn, lớp cánh nhỏ (Huỳnh Văn Thới, 2000) Họng hoa: Thường hình tròn nằm đầu ống phễu hoa hoa cánh hoa, nơi cánh hoa chụm lại thành khối Họng thường có màu vàng, đỏ, trắng, cam, xanh Hoa trắng thường có họng vàng, xanh; hoa đỏ có họng đỏ, vàng; hoa tím họng màu tím Do in vitro nuôi cấy điều kiện hoà toàn thích hợp (nguồn dinh dưỡng điều kiện môi trường ) sản xuất quanh năm Có thể sử dụng nhân giống in vitro để làm mẹ cho bước nhân giống 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình vi nhân giống Trong trình tái sinh từ tế bào (hay mẫu mô) chuyển hoá chía làm hai giai đoạn: Giai đoạn biệt hoá: Là đưa tế bào chuyển hoá trở lại trạng thái chưa chuyển hoá (tế bào phôi); Giai đoạn tái biệt hoá: giai đoạn tế bào phản biệt hoá phát triển thành Trong tái sinh, tuỳ theo giai đoạn (phản biệt hoá hay tái biệt hoá) mà môi trường nuôi cấy cần có thay đổi thích hợp, chủ yếu thay đổi chất điều hoà sinh trưởng, sau vitamin chất hữu Đường khoáng chất có thay đổi không lớn Bên cạnh điều kiện môi trường, yếu tố quan trọng trạng thái sinh lý, sinh hoá tế bào mà điểm khả tổng hợp chất hữu cơ, khả tổng hợp chất sinh trưởng điều đáng lưu ý trình tái sinh hình thái Ngoài ra, phân chia tế bào để tái sinh chồi để tái sinh chồi yếu tố tế bào bị chết hay bị thương tiết kích thích gọi hormon bị thương, Glyoxalase Enzyme bình thường chứa polyzosome không khuếch tán; huỷ hoại tế bào, enxyme giải phóng thuỷ phân dicacbonyl làm tăng sinh sản tế bào thực vật nuôi cấy in vitro trình tái sinh dễ dàng hay khó khăn tuỳ vào gống loài thực vật, thực vật dễ dàng tái sinh thường làm vật liệu thăm dò cà rốt, thuốc lá, khoai tây… Nhiều thực vật khó nuôi cấy khó tái sinh, đa số thực vật bậc cao mầm (Nguyễn Bảo Toàn, 2004) 1.3.4 Các giai đoạn vi nhân giống Vi nhân giống Debergh Zimmerman (1991) chia thành năm giai đoạn khác nhau, giai đoạn có chức riêng (Nguyễn Bảo Toàn, 2004) Giai đoạn 0: Lựa chọn chuẩn bị mẹ Khởi đầu trình vi nhân giống cần phải có lựa chọn cẩn thận cải thiện thật tốt điều kiện vệ sinh mẹ Tình trạng sinh lý mẹ nguông dùng làm mẫu cấy cải thiện kỹ thuật tưới nhỏ giọt, ghép nhiều tầng (Nguyễn Bảo Toàn, 20004) làm cho mẫu cấy non Ngoài ra, thủ tục để phát làm giảm hay loại trừ mầm bệnh vi khuẩn, víu điều cần thiết (George, 1993) Giai đoạn 1: Khử trùng mẫu cấy Đây kết hợp phương pháp khử trùng đầy đủ tỉ lệ sống cao mẫu cấy không bị nhiễm Thực tế điều khó đạt 100% kỹ thuật vô trùng mẫu Để nâng cao tỉ lệ tuyệt trùng, cần ý đến nồng độ hoá chất thời gian khử trùng Nồng độ thời gian khử trùng thay đổi tuỳ theo loài kích thước mẫu cấy (Nguyễn Bảo Toàn, 2004) Giai đoạn 2: Nhân chồi Toàn trình nhân giống vô tính in vitro nhằm mục đích tạo hệ số nhân cao George (1993) cho số lượng chồi nhân lên phụ thuộc vào số lần cấy chuyền nồng độ kích thích tố sử dụng môi trường Mục tiêu giai đoạn tăng nhanh số lượng cá thể sinh phôi soma, tăng số lượng chồi bên, tạo chồi bất định Chồi bên chồi cảm ứng in vitro cách làm tăng số chồi hữu Một mẫu cấy có mang chồi đơn phát triển thành chồi hay cụm chồi tuỳ thuộc vào loài thực vật môi trường nuôi cấy Sau vài lần cấy truyền chồi tạo chuyển sang giai đoạn để cảm ứng rể (Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002) Giai đoạn 3: Tạo rễ tiêng dưỡng Mục đích giai đoạn giúp cho gia tăng chiều cao tạo rễ đầy đủ làm tăng tỉ lệ sống sót cao chuyển trồng bên Do chồi từ giai đoạn nhỏ chưa có khả tự phát triển đất phân trộn (George, 1993) nên chúng chuyển sang môi trường cảm ứng rễ để trở thành hoàn chỉnh (Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002) Nishitha et al (2006) sử dụng môi trường ½ MS lỏng cho thấy tạo rễ Chonemorpha grandiflora hiệu so với môi trường đặc Giai đoạn 4: Thuần dưỡng Mục đích giai đoạn làm giảm mức độ chết in vitro chuyển từ trạng thái sống dị dưỡng sang tự dưỡng nhà lưới Để tăng tỉ lệ sống sót bên thiết phải trải qua thời gian tập quen dần với điều kiện gần giống bên tăng cường ánh sáng, nhiệt độ (George, 1993) cho biết tưới phun sương giai đoạn hiệu để trì độ ẩm Nishitha et al (2006) Chonememorpha grandiflora dưỡng giá thể đất cát đạt tỉ lệ sống sót 90% sau 15 ngày dưỡng CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương tiện Vật liệu thực vật: Sử dụng hạt sứ Thái khoảng 15- 20 ngày tuổi (hình 1) Thiết bị: Sử dụng trang thiết bị phòng thí nghiệm nuôi cấy mô sinh lý thực vật như: Nồi hấp khử trùng nhiệt ướt, tủ sấy, tủ cấy, keo thuỷ tinh, kính hiển vi, Hoá chất Hoá chất khử trùng mẫu vật: Cồn 70O, clorin 5% Khoáng đa lượng vi lượng theo công thức MS (Murashige Skoog, 1962) vitamin (Thiamin, pyridoxin, acid nicotinic, myo- inositol), chất điều hoà sinh trưởng (GA3, BA, NAA), chất khác (agar, đường sucrose, nước dừa, than hoạt tính) Thời gian thực hiện: Từ tháng 04/2009 đến tháng 07/2010 Địa điểm: Thí nghiệm thực phòng thí nghiệm nuôi cấy mô (nhiệt độ 26 ± Oc, cường độ chiếu sáng 1.500 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày) nhà lưới môn sinh lý- sinh hoá, khoa Nông Nghiệp sinh học ứng dụng, trường đại học Cần Thơ Hình 1: Vật liệu thực vật (trái sứ Thái) 2.2 Phương pháp 2.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy Sử dụng môi trường MS có bổ sung đường sucrose 30g/l, myo-inositol 100 mg/l, thiamine 1mg/l, pyridoxine mg/l, nicotinic acid mg/l nước dừa tươi 100 ml/l Chất điều hoà sinh trưởng bổ sung vào môi trường nuôi cấy BA, NAA, GA3 nồng độ thay đổi từ 0- mg/l (tuỳ giai đoạn nuôi cấy) Môi trường nuôi cấy có pH 5.8 Mỗi bình rót 40- 50 ml môi trường hấp khử trùng nhiệt độ 121OC, áp suất 1atm, thời gian 20 phút 2.2.2 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Hiệu GA3 BA nảy mầm hạt sứ thái Mục tiêu: Tìm nồng độ cuar GA3 BA thích hợp nảy mầm hạt sứ Thái Thí nghiệm bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên nhân tố, nghiệm thức, lần lặp lại, lần lặp lại keo, kéo cấy mẫu Kí hiệu nghiệm thức Nghiệm thức 1: Đối chứng Nghiệm thức 2: mg/l GA3 Nghiệm thức 3: 0.5 mg/l BA + mg/l GA3 Nghiệm thức 4: 1.5 mg/l BA + mg/l GA3 Nghiệm thức 5: mg/l BA + 1mg/l GA3 Cách tiến hành: Trái sứ thái rữa xà phòng Sau khử trùng bề mặt vỏ trái cồn 70O Tiếp tục trái sứ khử trùng clrorin 5% (trong 15 phút) Sau trái rửa lại 3-4 lần nước cất khử trùng Trái sau khử trùng, tách lấy hạt để bố trí thí nghiệm Chỉ tiêu theo dõi: Số chồi gia tăng, chiều cao gia tăng (cm), số gia tăng Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng giá thể lên dưỡng sứ Thái Mục tiêu: Tìm loại giá thể thích hợp cho sứ Thái cấy mô Thí nghiệm bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên nhân tố gồm nghiệm thức, lần lặp lại, lần lặp lại gồm mẫu Ký hiệu nghiệm thức: Nghiệm thức 1: Tro + sơ dừa (1:1) Nghiệm thức 2: Tro + đất (1:1) Nghiệm thức 3: Tro + xơ dừa + đất (1:1:1) Cách tiến hành: Giá thể xả vòi nước, sau đem hấp khử trùng Cây sau tuần nuôi cấy môi trường rễ MS + 0.1 mg/l NAA, chồi đạt chiều cao khoảng 1.9 – 2.4 cm, số trung bình 9- 10 đem vườn ươm để dưỡng Các khay chứa mẫu đặt vào buồng plastic điều kiện nhiệt độ (27 2OC), ẩm độ (80 5OC), cường độ ánh sáng (2.500- 3.000 lux) Thường xuyên theo dõi nhiệt độ, ánh sáng ẩm độ buồng plastic để xử lý kịp thời Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ sống, số rễ gia tăng, chiều dài rễ, chiều cao gia tăng, số gia tăng 2.3 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu tỉ lệ phần trăm, biến động khoãng từ 0% - 100% chuyển đổi sang ArcSIn trước phân tích thống kê theo công thức asin (sprt (x) /10)* 180/3.1416 Các giá trị 0% thay 1/4n, giá trị 100% thay 100- 1/4n, n số mẫu dựa để tính phần trăm, x giá trị phần trăm cần chuyển đổi (Gomez Gomez, 1984) Xử lý số liệu chương trình MSTATC, phân tích phương sai so sánh trung bình nghiệm thức theo kiểm định LSD mức ý nghĩa 1% 5% CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hiệu GA3 BA nảy mầm hạt sứ Thái 3.1.1 Tỉ lệ hạt nảy mầm Qua kết Bảng cho thấy tỉ lệ hạt nảy mầm tuần sau cấy (TSKC) nghiệm thức đối chứng mg/l GA3 đạt cao 34.4% 23.8%, nhiên chúng không khác biệt với nghiệm thức 1.5 mg/l BA + mg/l GA3 (17.5%), khác biệt với nghiệm thức lại mức ý nghĩa 5% Đến thời điểm TSKC cho thấy tỉ lệ nảy mầm nghiệm thức đối chứng đạt cao 88.8%, khác biệt với tất nghiệm thức lại mức ý nghĩa 1% Bảng 1: Tỉ lệ (%) nảy mầm hạt sứ thái sau 1-2 tuần nuôi cấy môi trường khác Nghiệm thức Đối trứng mg/l GA3 0.5 mg/l BA + mg/l GA3 1.5 mg/l BA + mg/l GA3 mg/l BA + mg/l GA3 F CV (%) Thời gian sau cấy (tuần) 34.4 a 23.8 a 5.0 b 17.5 ab 0.0 b * 81.91 88.8 a 23.8 b 11.3 b 17.5 b 4.3 b ** 49.11 Chú ý: Trong cột, số có chữ theo sau giống khác biệt không ý nghĩa thống kê dùng phép kiểm định LSD, (*): khác biệt mức ý nghĩa 5%, (**): khác biệt mức ý nghĩa 1% 3.1.2 Chiều cao Qua kết Bảng cho thấy thời điểm TSKC chiều cao nghiệm thức có sử dụng GA3 đơn GA3 kết hợp BA không khác biệt chiều cao biến thiên từ 1.1 cm đến 1.3 cm, so với đối chứng (0.0 cm) khác biệt mức ý nghĩa 1% Tương tự thời điểm TSKC chiều cao chồi nghiệm thức có sử dụng GA3 đơn GA3 kết hợp BA không khác biệt chiều cao biến thiến từ 1.2 cm đến 1.7 cm cao so với đối chứng khác biệt mức ý nghĩa 1% Bảng 2: Chiều cao (cm) chồi sứ Thái sau 1-2 tuần nuôi cấy môi trường khác Thời gian sau cấy (tuần) Nghiệm thức Đối trứng mg/l GA3 0.5 mg/l BA + mg/l GA3 1.5 mg/l BA + mg/l GA3 mg/l BA + mg/l GA3 F CV (%) 1.0 1.1 1.1 1.2 1.3 b a a a a ** 34.06 1.0 b 1.2 a 1.3 a 1.7 a 1.6 a ** 44.02 Ghi chú: Trong cột, số có chữ theo sau giống khác biệt ý nghĩa thống kê dùng phép kiểm định LSD, (**): khác biệt ý nghĩa 1% 3.1.3 Số Qua kết bảng cho thấy thời điểm TSKC số nghiệm thức mg/l GA3 cao (2.0 lá) không khác biệt với nghiệm thức mg/l BA + mg/l GA3 (1.7 lá) khác biệt với nghiệm thức lại mức ý nghĩa 1% Tương tự, thời điểm TSKC số nghiệm thức mg/l GA3 cao (2.0 lá) không khác biệt với nghiệm thức mg/l BA + mg/l GA3 (1.7 lá) khác biệt với nghiệm thức lại mức ý nghĩa 1% Bảng 3: Số chồi sứ Thái sau 1-2 tuần nuôi cấy môi trường khác Thời gian sau cấy (tuần) Nghiệm thức Đối trứng mg/l GA3 0.5 mg/l BA + mg/l GA3 1.5 mg/l BA + mg/l GA3 mg/l BA + mg/l GA3 F CV (%) 1.0 d 2.0 a 0.9 c 1.0 bc 1.7 ab ** 32.89 0.0 c 2.0 a 1.0 b 1.0 b 1.7 ab ** 30.44 Ghi chú: Trong cột, số có chữ theo sau giống khác biệt ý nghĩa thống kê dùng phép kiểm định LSD, (**): khác biệt mức ý nghĩa 1% Qua kết thí nghiệm thời điểm TSKC cho thấy nghiệm thức đối trứng đạt tỉ lệ hạt nảy mầm cao 88.8%, nghiệm thức mg/l GA3 đạt 23.8% hạt nảy mầm nghiệm thức đối trứng hạt nảy mầm hình thành mô sẹo, chồi bị hạn chế phát triển (hình 2A), nghiệm thức mg/l GA3 chồi phát thành tốt (hình 2B) Hình 2: Sinh trưởng sứ Thái sau tuần nuôi cấy môi trường: (A) Đối trứng, (B) 2mg/l GA3 3.2 Hiệu BA nhân chồi sứ Thái 3.2.1 Số chồi gia tăng Qua kết bảng cho thấy thời điểm TSKC, gia tăng số chồi gia tăng không đáng kể nên nghiệm thức khác biệt ý nghĩa thống kê thời điểm TSKC cho thấy số chồi gia tăng nghiệm thức 0.2 mg/l BA cao 0.8 chồi khác biệt nghiệm thức lại mức ý nghĩa 5% Tuy nhiên, thời điểm TSKC số chồi gia tăng nghiệm thức khác biệt ý nghĩa thống kê Bảng 4: Số chồi sứ Thái gia tăng môi trường có nồng độ BA khác sau 1- tuần nuôi cấy Nồng độ BA (mg/l) 0.2 0.5 F CV (%) 0.0 0.0 0.2 0.0 ns 9.57 Thời gian sau cấy 0.2 0.3 0.2 0.4 0.6 0.9 0.2 0.3 ns ns 18.69 25.19 0.5 b 0.4 b 1.2 a 0.7 b * 19.74 Ghi chú: Trong cột, số có chữ theo sau giống khác biệt ý nghĩa thông kê dùng phép kiểm định LSD, (ns): khác biệt ý nghĩa thông kê, (*): khác biệt mức ý nghĩa 5% 3.2.2 Chiều cao gia tăng Qua kết bảng cho thấy thời điểm 1, TSKC chiều cao gia tăng nghiệm thức khác biệt ý nghĩa thống kê Ở thời điểm TSKC, nghiệm thức 0.5 mg/l BA cho chiều cao gia tăng cao 1.2 cm khác biệt với nghiệm thức lại mức ý nghĩa 5% Bảng 5: Chiều cao gia tăng (cm) chồi sứ Thái sau – tuần nuôi cấy môi trường có nồng độ BA khác Nồng độ BA (mg/l) Thời gian sau cấy 0.2 0.5 F CV (%) 0.0 0.0 0.2 0.0 ns 9.57 0.2 0.2 0.6 0.2 ns 18.69 0.3 0.4 0.9 0.3 ns 25.19 0.5 b 0.4 b 1.2 a 0.7 b * 19.74 Ghi chú: Trong cột, số có chữ theo sau giống khác biệt ý nghĩa thống kê dùng phép kiểm định LSD, (ns): khác biệt ý nghĩa thống kê, (*): khác biệt mức ý nghĩa 5% 3.2.3 Số gia tăng Qua kết bảng cho thấy thời điểm 1,2 TSKC số gia tăng nghiệm thức khác biệt ý nghĩa thống kê Bảng 6: Số gia tăng chồi sứ Thái môi trường có nồng độ BA khác 1-4 tuần nuôi cấy Nồng độ BA (mg/l) 0.2 0.5 F CV (%) 0.5 0.1 1.0 0.8 ns 46.41 Thời gian sau cấy 0.9 1.6 1.4 1.2 3.4 4.1 2.1 2.5 ns ns 47.28 57.00 2.0 b 1.3 b 4.8 a 3.1 ab ** 30.21 Ghi chú: Trong cột, số có chữ theo sau giống khác biệt ý nghĩa thống kê dùng phép kiểm định LSD, (ns): khác biệt ý nghĩa thông kê, (**): khác biệt mức ý nghĩa 1% Ở thời điểm TSKC, nghiệm thức 0.5 mg/l BA cho số gia tăng cao 4.8 không khác biệt với nghiệm thức mg/l BA (3.1 lá) khác biệt với nghiệm thức lại mức ý nghĩa 1% Qua kết thí nghiệm cho thấy thời điểm TSKC, nghiệm thức 0.2 mg/l BA (hình 3) đạt số chồi gia tăng cao nghiệm thức lại Hình 3: Chồi sứ Thái tuần sau nuôi cấy môi trường có bổ sung BA 0.2 mg/l BA 3.4 Ảnh hưởng loại giá thể lên dưỡng sứ Thái 3.4.1 Tỉ lệ sống Sau tuần dưỡng tất nghiệm thức cho thấy tỉ lệ sống sứ Thái đạt 100% Các sinh trưởng phát triển tốt A B C Hình 5: Cây sứ Thái sau tuần dưỡng A- Tro + sơ dừa (1:1); B- Tro + đất (1:1); C- Tro + xơ dừa + đất (1:1:1) 3.4.2 Số rể gia tăng chiều dài rễ Qua kết bảng 11 cho thấy thời điểm TSKTD, số rễ gia tăng cao nghiệm thức tro + sơ dừa (1:1 ) 2.6 rễ khác biệt với nghiệm thức lại mức ý nghĩa 5% Kết bảng 11 cho thấy TSKTD, chiều dài rễ nghiệm thức biến thiến từ 0-1 cm khác biệt ý nghĩa thống kê Bảng 7: Sự tạo rễ chồi sứ Thái sau tuần dưỡng loại giá thể khác Nghiệm thức Tro + xơ dừa (1:1) Tro + đất (1:1) Tro + sơ dừa + đất (1:1:1) F CV (%) Số rễ 2.6 a 0.2 b 1.0 b * 50.94 Chiều dài rễ (cm) 1.0 0.0 0.5 ns 43.89 Ghi chú: Trong cột, số có chữ theo sau giống khác biệt ý nghĩa thống kê dùng phép kiểm định LSD, (*): khác biệt mức ý nghĩa 5%, (ns): khác biệt ý nghĩa thống kê 3.4.3 Chiều cao gia tăng Qua kết bảng 12 cho thấy thời điểm 1,2,3 tuần sau dưỡng (TSKTD) chiều cao gia tăng nghiệm thức không khác biệt nhau, sau tuần dưỡng chiều cao tăng 0.1 cm tất nghiệm thức Riêng TSKTD cho thấy nghiệm thức tro + sơ dừa (1:1) cho chiều cao gia tăng 0.3 cm nghiệm thức lại có chiều cao gia tăng 0.4 cm khác biệt ý nghĩa thống kê Bảng 8: Chiều cao gia tăng (cm) chồi sứ Thái sau – tuần dưỡng loại giá thể khác Nghiệm thức Tro + sơ dừa (1:1) Tro + đất (1:1) Tro + sơ dừa + đất (1:1:1) F CV (%) Thời gian sau dưỡng (tuần) 0.1 0.1 0.1 0.2 0.2 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 ns 11.09 ns 11.01 ns 10.24 ns 10.86 Ghi chú: Trong cột, số có chữ theo sau giống khác biệt ý nghĩa thống kê dùng phép kiểm định LSD, (ns): khác biệt ý nghĩa thông kế 3.4.4 Số gia tăng Từ kết bảng 13 cho thấy thời điểm TSKTD số gia tăng khác biệt ý nghĩa thống kê thời điểm TSKTD cho thấy số gia tăng cao nghiệm thức tro + sơ dừa + đất (1:1:1) khác biệt với nghiệm thức lại mức ý nghĩa 5% Tương tự, thời điểm tuần sau dưỡng cho thấy số gia tăng cao nghiệm thức tro + sơ dừa + đất (1:1:1) khác biệt với nghiệm thức lại mức ý nghĩa 5% Bảng 9: Số gia tăng chồi sứ Thái loại giá thể khác sau 1- tuần dưỡng Nghiệm thức Tro + sơ dừa (1:1) Tro + đất (1:1) Tro + sơ dừa + đất (1:1:1) F CV (%) Thời gian sau dưỡng (tuần) 0.8 0.6 1.8 0.8 0.6 2.4 1.0 b 0.8 b 3.0 a 1.6 b 0.8 b 4.0 a Ns 57.25 ns 52.82 * 53.02 * 55.28 Ghi chú: Trong cột, số có theo sau giống khác biệt có ý nghĩa thống kê dùng phép kiểm định LSD, (ns): khác biệt ý nghĩa thống kê, (*): khác biệt mức ý nghĩa 5% Qua kết thí nghiệm cho thấy thời điểm tuần sau dưỡng tỉ lệ sống đạt 100%, nghiệm thức tro + sơ dừa (1:1) (Hình 6) giúp chồi tạo rễ nhiều nghiệm thức lại Tuy nhiên nghiệm thức Tro + sơ dừa + đất (1:1:1) giúp chồi sinh trưởng tốt (đạt số cao nghiệm thức lại thời điểm 3- TSKTD Hình 6: Cây sứ Thái nghiệm thức Tro + sơ dừa 3.5 Xây dựng quy trình vi nhân giống sứ Thái Qua kết nghiên cứu thí nghiệm trên, đề nghị quy trình vi nhân giống sứ Thái sau (Hình 7) Hình 7: Sơ đồ quy trình vi nhân giống sứ Thái CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Kết nghiên cứu “Vi nhân giống hoa sứ Thái” cho thấy Giai đoạn khởi đầu, môi trường nuôi cấy MS bổ sung mg/l GA3, thích hợp để hạt sứ Thái nảy mầm vươn cao tốt Giai đoạn nhân chồi, bổ sung 0.2 mg/l BA cho số chồi gia tăng cao sau tuần nuôi cấy Giai đoạn dưỡng, giá thể tro + sơ dừa (1:1) thích hợp cho chồi sứ Thái tạo rễ nghiệm thức Tro + sơ dừa + đất (1:1:1) giúp chồi sinh trưởng tốt 4.2 Đề nghị Nghiên cứu tiếp nồng độ khoáng (MS/2), NAA than hoạt tính giai đoạn tạo rễ [...]... thời điểm 3- 4 TSKTD Hình 6: Cây sứ Thái ở nghiệm thức Tro + sơ dừa 3.5 Xây dựng quy trình vi nhân giống cây sứ Thái Qua kết quả nghiên cứu của các thí nghiệm trên, chúng tôi đề nghị quy trình vi nhân giống cây sứ Thái như sau (Hình 7) Hình 7: Sơ đồ quy trình vi nhân giống cây sứ Thái CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Kết quả nghiên cứu Vi nhân giống cây hoa sứ Thái cho thấy Giai đoạn khởi... giâm để nhân giống c Nhân giống sứ Thái bằng chiết cành Là phương pháp rất hiệu quả trong vi c nhân giống sứ, gần như cây giống đạt trên 90% vì từ lúc chiết nhánh cây đến khi ra rễ thì các nhánh sứ vẫn nuôi trên mình mẹ 1.1.4 Giá trị cây sứ Thái Cây được trồng làm cảnh Nhiều bộ phận của cây cũng được sử dụng làm thuốc Vỏ cây sắc uống nhuận tràng, hoa dùng hạ huyết áp Lá và thân cây được dùng như cây dừa... thực vật mà nhân giống in vitro không thể thực hiện do nhân giống in vitro có thể cảm ứng được sự trẻ hoá của mô Vi c nhân giống cây in vitro tạo được những cây sạch bệnh Do cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoà toàn thích hợp (nguồn dinh dưỡng và điều kiện môi trường ) do đó có thể sản xuất cây con quanh năm Có thể sử dụng cây nhân giống in vitro để làm cây mẹ cho các bước nhân giống tiếp... của 8 loài Pedicularis 1.3 Vi nhân giống cây trồng 1.3.1 Khái niệm về nhân giống Nuôi cấy mô tế bào thực vật là sự nuôi cấy mô trùng các cơ quan, mô, tế bào thực vật trên môi trường nuôi cấy được xác định rõ; vi c nuôi cấy được duy trì dưới các điều kiện kiểm soát Kỹ thuật nuôi cấy mô mang tính thương mại chủ yếu trên cở sở vi nhân giống Vi nhân giống là vi c nhân đúng kiểu cây của một kiểu gen được... in vitro Vi nhân giống thông thường là phương pháp nhân nhanh và giảm giá thành sản phẩm (Nguyễn Bảo Toàn, 2004) 1.3.2 Vai trò của vi nhân giống Theo các tác giả Pierik, 1975 Anonymous, 1980; Van Assche, 1983; Gebhard et al, 1983; Kunneman – Kooij, 1984 trích từ Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002 thì nhân giống có những lợi sau: Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống vô tính in vitro... hơn các nghiệm thức còn lại Hình 3: Chồi sứ Thái 4 tuần sau khi nuôi cấy trong môi trường có bổ sung BA 0.2 mg/l BA 3.4 Ảnh hưởng của các loại giá thể lên sự thuần dưỡng của cây sứ Thái 3.4.1 Tỉ lệ sống Sau 4 tuần thuần dưỡng ở tất cả các nghiệm thức cho thấy tỉ lệ sống của cây sứ Thái đều đạt 100% Các cây đều sinh trưởng và phát triển tốt A B C Hình 5: Cây sứ Thái sau 4 tuần thuần dưỡng A- Tro + sơ... vào màu hoa, hoa trắng thì trái màu xanh, hoa đỏ trái màu đỏ pha nâu xanh (Hoàng Đức Khương, 2006) g Hạt trong một cặp trái có từ 100 đến 150 hạt Có những cặp trái lớn có thể cho vài trăm hạt Hai đầu hạt có hai chùm lông mịn giúp hạt phát tán đi xa khi trái chín, bung Hạt có kích thước như hạt lúa và cũng to, nhỏ, thuôn dài hoặc mập mạp tuỳ giống 1.1.3 Kỹ thuật nhân giống sứ Thái a.Kỹ thuật nhân giống. .. bào ở thực vật trong nuôi cấy in vitro quá trình tái sinh có thể dễ dàng hay khó khăn tuỳ vào gống loài thực vật, nhưng thực vật dễ dàng tái sinh thường được làm vật liệu thăm dò như cây cà rốt, thuốc lá, khoai tây… Nhiều thực vật khó nuôi cấy và khó tái sinh, đa số thực vật bậc cao và cây một lá mầm (Nguyễn Bảo Toàn, 2004) 1.3.4 Các giai đoạn của vi nhân giống Vi nhân giống đã được Debergh và Zimmerman... cây sứ thỉnh thoảng cũng cho trái, nhất vào mùa khô, từ tháng giêng đến tháng 5 Trái sứ có từng cặp như sừng trâu dài khoảng 20- 30 cm, mỗi trái chứa từ 50- 100 hạt Hạt sứ to, trụ tròn, dài như hạt lúa, có vỏ mềm màu trắng với chùm lông tơ để phát tán đi xa, rất dể nẩy mầm khi ươm Đây là cách để người ta lai tạo ra những giống mới bằng phương pháp thụ phấn chéo giữa hoa của các cây sứ khác nhau b .Nhân. ..Nhuỵ hoa: là cơ quan sinh sản của hoa (hữu tính), có nhuỵ đực và nhuỵ cái Trong ống hoa có 5 cọng nhuỵ hoa dài mọc ra bên ngoài Sự dài ngắn của nhuỵ cũng tuỳ thuộc vào từng giống nên khả năng giao phấn giữa các giống khác nhau f Trái sau khi hoa sứ được thụ phấn (do điều kiện tự nhiên hoặc tác động của con người), nơi cuống hoa phần bầu noãn sẽ phình to thành trái ... sau: Nhân giống vô tính in vitro nhanh nhân giống vô tính in vitro Có thể tiến hành số loài thực vật mà nhân giống in vitro thực nhân giống in vitro cảm ứng trẻ hoá mô Vi c nhân giống in vitro... tím có vi n… đa dạng Hoa nở theo chùm hoa, chụm hoa có từ đến 10 hoa; giống siêng hoa có tới 20 hoa chùm nở dần tháng hết Có giống hoa nỡ dần hoa (không bắt mắt có hoa) Cánh hoa: Hoa sứ đa phần... tính thương mại chủ yếu cở sở vi nhân giống Vi nhân giống vi c nhân kiểu kiểu gen tuyển chọn cách sử dụng kỹ thuật in vitro Vi nhân giống thông thường phương pháp nhân nhanh giảm giá thành sản