Đang tải... (xem toàn văn)
Kinh nghiệm xây dưng và phát triển PCR và một số kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu và chẩn đoán.Kinh nghiệm xây dưng và phát triển PCR và một số kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu và chẩn đoánKinh nghiệm xây dưng và phát triển PCR và một số kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu và chẩn đoánKinh nghiệm xây dưng và phát triển PCR và một số kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu và chẩn đoán
Kinh nghi m xây d ng phát tri n PCR/real-time PCR m t s k thu t sinh h c phân t khác nghiên c u ch n oán T yêu c u th c t ph i ti p c n n n y h c hi n i ch n oán i u tr C n m t gi i pháp toàn di n v ch n oán sinh h c phân t b nh viêm gan virus B viêm gan virus C m n tính B nh viêm gan virus B viêm gan virus C m n tính h u qu c a tình tr ng nhi m virus viêm gan B (HBV=Hepatitis B virus) virus viêm gan C (HCV=hepatitis C virus) gây B nh nhân có th b nhi m HBV HCV qua ng máu nh tiêm chích, truy n máu, nh r ng, châm c u, làm móng, hay th thu t xâm l n b i d ng c b nhi m virus Ngoài ra, nhi m trùng HBV HCV có th xãy qua ng tình d c, m truy n qua sinh n Theo thông tin t T Ch c Y T Th Gi i m t s nhà nghiên c u n c, Vi t Nam m t nh ng qu c gia ng hàng u v t n su t nhi m HBV qua xét nghi m phát hi n kháng nguyên b m t c a virus (HBsAg) máu, v i t l ng i bình th nhiên c a m t ng ng có HBsAg d th nh n c a h ng di n ti n t i b nhi m HBV a s t kh i h th ng mi n d ch t o kháng th b o v kháng th c ng tính 10-30% Th c hi u HBsAg Ch có m t s ít, h th ng mi n d ch không th di n c kháng nguyên b m t c a virus có th kháng nguyên l t o c áp ng mi n d ch v y mà ng i b mang HBV c th lâu dài lúc xét nghi m phát d hi n HBsAg c ng ng tính N u tác nhân nguy c gây t n h i t bào gan (nh u ng r u, béo phì, gan nhi m c S 4: H ng d n ch nh xét nghi m i u tr theo dõi i u tr c hi u b nh nhân b b nh viêm gan hi u qu virus B m n tính 144 m , hay b tác nhân lý hoá khác) HBV ch nhân b n thành virus không hoàn ch nh (ch có v capsid mà lõi DNA) t o virus hoàn ch nh, v y h ch ng cm ts l ng r t gi i h n i lành mang HBV mà (carrier) ch không phát tri n thành viêm gan m n tính Tuy nhiên n u có nguy c th ng t n t bào gan xãy HBV s phát tri n nhi u h n t bào gan, v y l ng virus hoàn ch nh s c phóng thích nhi u h n vào máu ( 10 copies/1ml máu) th i gây t n h i t bào gan tr thành b nh viêm gan m n tính N u không ki m soát c s nhân b n c a HBV viêm gan m n tính s d n x gan r i có th d n Do v y, tr n ung th gan hay i th ng c m t ng nh t thi t ph i cho ch ng n ung th gan i có xét nghi m HBsAg d nh làm th nghi m xác n h u qu khó tránh kh i ng tính nhà lâm sàng nh xem máu c a ng i nhi m có mang HBV hoàn ch nh hay không b ng xét nghi m PCR phát hi n HBV-DNA, n ud ng tính ph i bi t s l không b ng xét nghi m qPCR d ng HBV hoàn ch nh có 105 copies/1ml hay ng HBV-DNA N u l nh l i 10 không c n thi t ph i i u tr HBV v n nhân b n r t gi i h n t bào gan ch a gây t n h i t bào gan Nh ng n u l xét gan có b t n th v ng HBV máu t bình th n bình th ng virus 105 c n ph i xem ng ch a thông qua xét nghi m men gan ALT N u l ng (1,5 hay t i a l n bình th ng 19IU) ph i cho ch ng, nam bình th ng ALT ng 33UI nh i u tr b ng thu c kháng virus nh lamivudine, adefovir, entecavir, interferon hay s d ng t ban u li u pháp k t h p lamivudine v i adefovir, v i entecavir, hay v i interferon N u l ng ALT v n bình th có b th ng ph i làm sinh thi t gan làm xét nghi m gi i ph u b nh xem gan ng t n mô h c không, hay n u không mu n làm sinh thi t gan có th làm fibroscan gan c a b nh nhân giá tr fibroscan c ng có th cho bi t tình tr ng t n h i mô gan dù không xác b ng sinh thi t gan Ngoài ra, c ng c n thi t ph i làm thêm th nghi m nh l ng AFP (alpha foeto-protein) b nh nhân ch c n có b ng ch ng mô h c có t n th v n ph i cho ch ng gan hay l ng AFP v t gi i h n bình th ng nh i u tr b nh nhân b ng thu c kháng virus nh Hi n nhà i u tr không o v ng tr s ch c HBV kh i c th b nh nhân nhi m HBV r t d dàng b tái phát sau ng ng i u tr Lý y u HBV t n t i nhân t bào gan d i d ng cccDNA (covalently closed circular 145 làm ngu n g c di truy n c a virus, d ng không h b tác DNA) ng b i thu c kháng virus nucleosides analogs hi n Tuy nhiên có nhi u b ng ch ng cho th y n u không ki m soát mà l ng HBV hoàn ch nh máu lên cao b nh viêm gan m n tính s có nguy c di n ti n ti n tri n ho c ung th gan Do v y, sau ã b t virus B m n tính, nhà i u tr ph i th xét nghi m qPCR c) hay PCR hi n nh l nh l u i u tr b nh nhân b viêm gan ng xuyên theo dõi hi u qu ã cho b nh nhân b ng cách ph i mà h n suy gan m t bù, hay x gan ng HBV-DNA (n u l n l ng HBV-DNA v n ng HBV-DNA d i ng ng virus d ng phát kh ng ch i m c phát hi n v y mà ph i theo dõi s tái xu t hi n virus tháng N u sau m t th i gian i u tr c hi u (th không gi m log (100 l n), hay không i u tr , xét nghi m HBV-DNA d n ng virus kháng thu c, phát hi n t n ng nh k m i ng tháng) mà l ng virus ng 103/ml, hay trình ng tính tr l i, bác s i u tr ph i ngh n kh c bi t kháng lamivudine Lúc xét nghi m sinh h c phân t mà bác s nên ch nh th c hi n b nh nhân xét nghi m nh genotype t bi n kháng lamivudine, adefovir entecavir virus HBV c a tu thu c vào genotype mà có th ng ng phát hi n Quan i m b ng xét nghi m PCR phát hi n HBV-DNA máu c a b nh nhân b nh nhân nh l i ng c a nhà i u tr hi n ph i liên t c trì li u pháp kháng virus l c hi u nh k m i tháng cho b nh nhân làm nh tính phát hi n HBV-DNA (n u HBV-DNA d ng) cho i u tr t bi n i u ch nh li u pháp kháng virus thích h p Tr th qu nhà ng c lâm ây, sàng ánh giá hi u i u tr c hi u qua xét nghi m mi n d ch cho bi t có d u hi u chuy n o huy t S b nh nhân, 5: S h ng d n ch nh theo dõi hi u qu b nh nhân viêm gan virus C m n tính 146 i u tr c hi u ngh a HBeAg (kháng nguyên ti t c a HBV - m t thông s cho bi t có tình tr ng virus nhân b n) tr nên âm tính xu t hi n kháng th kháng HBe Tuy nhiên HBV có th có t bi n precore làm cho virus không th t o v n có c kháng th kháng HBe nên mu n xác nh c kháng nguyên HBe mà c ch c ch n có chuy n huy t th t s hay không nhà lâm sàng ph i ch o nh xét nghi m phát hi n t bi n precore b nh nhân HBeAg [-], có kháng th kháng HBeAg, mà HBVDNA v n [+] Ngoài ra, nghiên c u g n ây c ng cho bi t r ng t bi n precore (v trí 1896) n di n c bi t core-promoter (v trí 1762/64) có liên quan ti n viêm gan m n tính, x gan, ung th gan b nh nhân Do v y xét nghi m sinh h c phân t phát hi n nhà i u tr S t bi n precore hi n c ng m t yêu c u th c ti n t m t tóm t t qui trình cho ch nh xét nghi m i u tr theo dõi i u tr viêm gan B m n tính Ngoài viêm gan B, nhi m viêm gan virus C c ng m t v n tâm hi n nay, t l ng r tc n c quan c bi t t i Vi t Nam Theo ghi nh n v tình hình nhi m viêm gan C i bình th ng Vi t Nam nhi m virus viêm gan C kho ng 2-10%, xem nh thu c nhóm qu c gia có t l nhi m virus viêm gan C cao th nhì th gi i Khác v i nhi m viêm gan B v i a s tr kháng th b o v lo i tr n 85% ng trùng; có xu t hi n kháng th i nhi m t o c virus m t s h n tr thành ng c i lành mang i nhi m viêm gan virus C mi n d ch b o v , dù có c hi u (anti-HCV [+]), b di n ti n n x gan v i 20% s t l ng ng h p ng ó có nguy c di n ti n n viêm gan m n tính r i n ung th gan Do v y mà dù i nhi m viêm gan C t i Vi t Nam th p h n nhi m viêm gan B nh ng tình tr ng b nh t t nhi m virus viêm gan C mang l i cao, không thua mà th m chí h n viêm gan B Nguy hi m nh v y nh ng b nh viêm gan C m n tính l i m t b nh mà d i ánh sáng c a y h c hi n toàn v i xác su t thành công có th i u tr i l i m t b nh có th ch a kh i n 60% Tuy nhiên, c hi u viêm gan C m n tính b ng interferon chu n nh t hi n nay, bác s c n ph i xác gan C máu b ng xét nghi m có th cho c hoàn c ch nh ph i h p v i ribavirin phát nh b nh nhân ang mang virus viêm nh tính HCV-RNA xét nghi m anti-HCV ch xét nghi m sàng l c cho truy n máu ch không ph i xét nghi m ch n oán lâm sàng, h n n a m t ng i có k t qu anti-HCV [+] v n có th không mang 147 virus viêm gan C mà ch k t qu c a tình tr ng nhi m m m b nh tr kh i Sau xác nh c ng i b nh d ng tính HCV-RNA, tr i u tr bác s c n ph i làm thêm hai xét nghi m n a nh l c cho ch nh ng HCV-RNA nh genotype c a virus Lý bác s c n ph i ánh giá hi u qu cho b nh nhân sau tháng r i sau tháng i u tr ph nh l ng l i HCV-RNA N u k t qu nh l c ó ã i u tr mà ã ng pháp ánh giá ng cho th y virus bi n m t sau tháng i u tr ây áp ng siêu vi nhanh v i d h u thành công i u tr r t t t N ul ng virus gi m 100 l n (trên hay b ng log) sau tháng b t ây áp ng siêu vi s m có th t c N u l ánh giá i u tr khác có d quy t ã cho hi u qu có th ti p ng virus không gi m log có th ph b nh nhân không hi u qu c n ph i cân nh c c ng d u i u tr ng pháp i u tr ã cho i u ch nh (dùng lo i interferon c l c t t h n, b t bu c b nh nhân ph i tuân th h n ) nh th i gian i u tr bác s c n ph i bi t genotype c a HCV b nh nhân, n u genotype c n ph i trì th i gian i u tr 48 tu n hay h n, n u thu c genotype khác th i gian i u tr có th ng n h n 24 tu n Sau hoàn t t th i gian c n ph i i u tr b nh nhân, tr bác s c n ph i xác c quy t nh ng ng i u tr , nh xem b nh nhân ã s ch HCV-RNA ch a b ng xét nghi m nh tính HCV-RNA ch ng ng i u tr HCV-RNA hoàn toàn âm tính Sau ã ng ng i u tr b nh nhân ã s ch virus, bác s v n ph i khuy n cáo b nh nhân làm xét nghi m nh ính HCV-RNA m i tháng m t l n có b tái phát không B t c lúc HCV-RNA d theo dõi xem b nh nhân ng tính l i ó d u hi u tái phát y có th bác s ph i xem xét i u tr l i cho b nh nhân c ng ph i theo th c hi n l i qui trình xét nghi m nh S C n xét nghi m k p th i nh y c m h n vi sinh gây b nh mà ph tóm t t qui trình nêu ch n oán phát hi n tác nhân ng tiên vi sinh hay mi n d ch không h u hi u Bên c nh b nh viêm gan m n tính virus B virus C, y h c Vi t Nam c ng ph i i phó v i b nh nhi m trùng khác mà v n gây b nh r t c n thi t ph i có ph phát hi n tác nhân vi sinh ng ti n xét nghi m nh y c m h n, k p th i h n, an toàn h n Theo ánh giá c a t ch c y t th gi i, Vi t Nam m t 22 n c mang gánh n ng nhi m lao cao nh t th gi i Ngoài v i tình tr ng gia t ng t l 148 nhi m HIV/AIDS hi n t i Vi t Nam (có th 300.000 theo d T ) nguy c ph i ng Do v y mà v n oán c a B Y i phó v i tình tr ng nhi m lao t ng cao c ng nâng cao n ng l c c a phòng thí nghi m lâm sàng xét nghi m phát hi n lao m t v n mà y h c Vi t Nam ph i pháp nhu m tìm tr c khu n kháng acid (AFB), t v i ph nh y phát hi n ch ng t 64% lao ph i, 27% lao ph i, ch 9% lao màng não; h n n a nhu m kháng acid b ph thu c nhi u vào k n ng c a ng th xác nh i c lame k t qu c ng không c b nh nhân có th t s nhi m lao hay không có th có nhi u tr c khu n kháng acid khác không ph i vi khu n lao hi n di n b nh ph m V i ng pháp nuôi c y ph nh y có th cao h n 77% lao ph i, 67% lao ph i 39% lao màng não nh ng th i gian tr c tu n n u s d ng ph có c k t qu không th ng pháp c y nhanh v i môi tr ph i tháng n u s d ng ph ng pháp c y v i môi tr ng MGITT hay ng Lowenstein Jensen Chính v y nên t i b nh vi n hay phòng khám, có r t nhi u tr ng h p b nh nhân có d u hi u lâm sàng X-quang r t nghi ng lao ph i, h u h t tr ng h p lâm sàng ch n oán nghi ng lao ph i hay lao màng não mà k t qu xét nghi m bác s nh n c v n th ng soi không th y, c y không Th c t ã òi h i nhà lâm sàng ph i yêu c u xét nghi m PCR phát hi n lao b nh ph m khác theo nhi u nghiên c u th gi i, PCR ã c i thi n k nh y phát hi n lao không ch lao ph i mà c lao ph i lao màng não H n n a k t qu PCR c ng cho phép xác ph i làm thêm xét nghi m vi sinh xác kháng acid hay nuôi c y, v i PCR ng ch nh nhi m lao mà không c n nh nh i v i ph ng pháp nhu m i làm xét nghi m phát hi n o n DNA ích c hi u cho vi khu n lao ch không ph i cho mycobacteria khác không ph i lao M t b nh nhi m khác mà th c t òi h i ph i tri n khai xét nghi m khu ch nucleic acid c s c a k thu t PCR i phát hi n tác nhân gây b nh, ó b nh s t Dengue gây s t xu t huy t D nhiên vi c ch n oán lâm sàng m t b nh nhân có ph i ang b s t Dengue gây s t xu t huy t hay không th t s không khó m y m t b nh nhân ã xu t hi n b t th ng v s l ng ti u c u (gi m ti u c u) dung tích h ng c u (t ng dung tích h ng c u) hay ã có tri u ch ng i vào shock Tuy nhiên 149 có th phát hi n nh ng ngày c b nh nhân có ph i s t Dengue hay s t xu t huy t Dengue u c a b nh th t s c m t v n nan gi i giai o n s m v m t lâm sàng hay c n lâm sàng, b nh nhân bi u hi n m t s t siêu vi Th nghi m mi n d ch h c phát hi n kháng th th m chí kháng th IgM, c ng ch có th b t ud c hi u h n c hi u Dengue, ng tính vào ngày th hay c a b nh lúc k t qu xét nghi m không h u d ng lâm sàng n a bi u hi n lâm sàng c a s t Dengue hay s t xu t huy t Dengue ã rõ Vì không th ch n oán xác nh c s t Dengue hay s t xu t huy t Dengue nh ng ngày c a b nh nên có th có hai tình hu ng: (1) Ho c b nh nhân không i u tr k p th i v y vào u c theo dõi n b nh vi n ã vào b nh c nh shock n ng bác s s ph i r t v t v m i c u c b nh nhân hay s tr tay không k p; (2) Ho c mùa d ch s t xu t huy t b nh vi n s b tràn ng p b nh nhân lâm sàng nghi ng s t xu t huy t mà ch a có b ng c ch ng minh b nh nhân ang b s t Dengue hay s t xu t huy t Dengue Do v y th c t hi n òi h i phòng thí nghi m lâm sàng ph i có m t ph nh ng ngày ng ti n s c u c a b nh, ph có th ch n oán phát hi n Dengue s m ng ti n y khác h n th nghi m RT- PCR phát hi n RNA c a virus Dengue máu b nh nhân nh l r t cao máu nh ng ngày ng virus xu t hi n u c a b nh, th m chí ngày u tiên c a b nh Trong s n ph khoa hi n nay, nhà lâm sàng c ng nh nghiên c u y h c c ng r t c n thi t ph i có k t qu phát hi n xác sinh thi t c t cung nh c genotype HPV t qu t hay phát hi n s m nguy c sinh ung th c t cung ph n khoa h c ã ch ng minh c tác nhân gây ung th c t cung ph n m t s genotype HPV nguy c cao (nh 16, 18 ) Xét nghi m nh v y không th th c hi n c b ng ph ng pháp t bào h c hay mô h c mà ph i thu t sinh h c phân t khu ch sau ó xác nh trình t i m t o n DNA c th c hi n b ng k c hi u vùng gene L1 c a virus c hi u genotype c a virus, ó k thu t PCR theo sau lai phân t Hi n ngành y t c a c ng ph i i phó thêm v i b nh có nguy c gây d ch cao nh cúm gà H5N1, m t bi n pháp d ch b nh ng i phó v i i ph i phát hi n s m tác nhân H5N1 m u 150 b nh l y t ng i nghi ng nhi m b nh nh s m phát hi n c b nh nhân s m d ch lây cho ng i c i u tr s m cách ly phát hi n H5N1, không th xây d ng ph c hi u c ng i phó Tuy nhiên ng pháp virus h c nh nuôi c y t i phòng thí nghi m lâm sàng i u không h u d ng lâm sàng k t qu nuôi c y không th có nhanh c, phòng thí nghi m lâm sàng cc p t nghi m thích h p h u d ng nh t ng th i c ng không an toàn khó có v an toàn sinh h c Do v y xét có th th c hi n c t i phòng thí nghi m lâm sàng khác h n xét nghi m RT-PCR phát hi n H5N1 xét nghi m ch òi h i ph i th c hi n phòng thí nghi m có trang b an toàn sinh h c c p k t qu xét nghi m không ch nh y c m mà có th n tay lâm sàng ch vòng không gi sau l y m u i phó v i i d ch HIV/AIDS, vi c ph bi n ki n th c tránh lây nhi m hay tránh hành vi có nguy c cao b lây nhi m c ng tr ng, v n c hi u có hi u qu cho b nh nhân nhi m HIV/AIDS c ng v n qu n lý y t c n ph i th c hi n có c i u tr nhi m HIV/AIDS m i có th tr l i v i c ng nh l mà nhà c hi u hi u qu b nh nhân ng s gi m thi u nguy c lây nhi m ng virus máu d ch c th c a b nh nhân s b kh ng ch d phát hi n có th i u tr có th thay i ng ng c m t cách hi u qu cho b nh nhân nhi m HIV/AIDS, nhà y h c c n ph i có ph b nh nhân i u ng ti n xét nghi m i phát nh l ng c virus máu i u tr m i m t l hay xu t hi n tr l i trình i u tr Do v y xét nghi m ng virus t ng lên nh l ng virus HIV m t xét nghi m r t c n thi t ph i tri n khai k thu t d ti p c n nh t hi n th c hi n xét nghi m k thu t real-time PCR Ngoài vi c theo dõi hi u qu tr c hi u, xét nghi m phát hi n cho tr s sinh yêu c u mà ph ng nh l i u ng HIV có giá tr ch n oán phát hi n cháu có b nhi m b nh t m truy n qua không, m t ng pháp mi n d ch phát hi n kháng th c hi u HIV không th c có th tr có k t qu HIV [+] qua mi n d ch nh ng kháng th áp c hi u HIV phát hi n máu tr có th ch kháng th t m truy n qua th i k bào thai V i ti n b hi n v ghép t ng t i Vi t Nam, xét nghi m phát hi n CMV m t xét nghi m r t c n thi t ph i th c hi n ng 151 i cho c quan tránh nguy c ng i nh n b nhi m r i bùng phát b nh ang ph i nh n li u pháp c ch mi n d ch sau ghép N u ch d a vào xét nghi m phát hi n kháng th ng c hi u CMV huy t c a i cho t ng k t qu ch c ch n s không c hi u nói lên mang CMV s truy n tác nhân gây b nh sang ng c ng i cho i nh n kháng th có th t n t i r t lâu sau b nh nhên kh i b nh Do v y c n ph i có m t xét nghi m phát hi n tr c ti p tác nhân CMV b ch c u c a máu ng áp ng i cho, xét nghi m c yêu c u xét nghi m PCR/real-time phát hi n/ nh l ng CMV-DNA Ngoài ra, th c t c a n n y h c hi n òi h i nhà lâm sàng l i mà ang ti p c n hi n c ng c ph c v yêu c u xét nghi m phát hi n và/hay ng nhi u tác nhân gây b nh khác b ng ph ng pháp khu ch s c a k thu t PCR real-time PCR Ví d nh i nucleic acid c phát hi n nguyên hi m mu n ph n , nhà lâm sàng c n ph i có xét nghi m PCR phát hi n C trachomatis N gonorrhoeae m u qu t c t cung n c ti u phát hi n tác nhân viêm não màng não virus, xét nghi m PCR phát hi n HSV hay RT-PCR phát hi n Enterovirus 71 d ch não tu r t c n c tri n khai phát hi n H pylori m u sinh ti t v t loét d dày tá tràng xét nghi m PCR phát hi n tác nhân c ng xét nghi m không th thi u c Hay c giám sát nhi m khu n b nh vi n, xét nghi m PCR phát hi n S aureus kháng methicillin (MRSA) t tay qu t m i tr c c a nhân viên y t ng c n thi t ph i c th c hi n c ng nh k t qu có i ch m sóc b nh nhân c ng xét nghi m r t nh y c m cao qui trình th c hi n n gi n c nhanh h n nhi u so v i xét nghi m vi sinh truy n th ng n th c t tri n khai k thu t PCR, real-time PCR Các rào c n V y th c t ã òi h i nhà khoa h c, c bi t nhà y h c ph i nhanh chóng phát tri n ng d ng k thu t sinh h c phân t hi n i, nh t PCR real-time PCR vào ch n oán h tr cho theo dõi i u tr b nh nhân t i Vi t Nam Tuy nhiên cho n hi n nhi u nhà khoa h c c ng nh qu n lý y t n c ng n ng i v i kh n ng Các lý h cho là: (1) th nghi m r t khó th c hi n c m t cách chu n m c t i phòng thí nghi m lâm sàng; (2) giá 152 thành th nghi m có th cao v t kh n ng c a ng i b nh Chúng ta th phân tích có úng nh v y không? Th nghi m PCR real-time PCR có th t s khó th c hi n c m t cách chu n m c t i phòng thí nghi m lâm sàng? PCR real-time PCR k thu t nhân b n DNA ng nghi m d a vào chu k nhi t nh nguyên li u dNTP, enzyme polymerase ch u nhi t, m t c p m i o n oligonucleotide n dài kho ng 20-25 base có trình t b sung c hi u v i hai u c a o n DNA ích c n nhân b n Nh chu k nhi t mà o n DNA ích c nhân b n theo c p s nhân sau 30 c nhân b n thành hàng t b n d dàng xác c phát hi n V i ph c g i PCR kinh i n), k t qu PCR (ngày nh kích th c và/hay d a vào lai v i dò c a s n ph m khu ch ích không V i ph n 40 chu k , o n DNA ích ng pháp PCR c phát hi n d a vào i n di c hi u i xem có trùng kh p v i kích th xác nh trình t c và/hay trình t ng pháp real-time PCR k t qu PCR c c hi u o n DNA c trình ch y PCR mà không c n ph i th c hi n giai o n phân tích sau PCR nh kh n ng phát hu nh quang c a ng ph n ng trình ch y PCR m t có s n ph m khu ch l i xu t hi n PCR mix Hu nh quang s s m xu t hi n s ng o n DNA ích ban u m u th cho vào PCR mix nhi u, nh nguyên lý mà real-time PCR không ch l ng c DNA ích ban Nh khu ch th nói cho c dùng phát hi n mà nh u có m u th i r i m i phát hi n nên PCR real-time PCR t c nh y có n ch a có m t k thu t có th so sánh n i: Gi i h n th p nh t có th phát hi n c m t phân t Chính v y, PCR real-time PCR m t công c r t h u d ng phát hi n tác nhân vi sinh v t gây b nh Tuy nhiên m t câu h i c nhi u ng c m t i t li u PCR real-time PCR có c hi u không m t nh y cao nh v y? Vì theo lý lu n th ng kê thông th t nh y cao ph i so sánh c hi u s th p xu ng tr l i t ng xét nghi m c câu h i này, c hi u c a PCR so v i nuôi c y phát hi n tác nhân vi sinh v t gây b nh Nuôi c y xét nghi m c hi u nh t v t gây b nh ch có nuôi c y m i xác nh phát hi n tác nhân vi sinh c s hi n di n tác nhân vi sinh v t gây b nh có m t m u th Qua nhìn phân t s th y nuôi 153 n m u âm tính Có ch ng âm huy t t ng ng i bình th ng, ch ng d ch a 100 copies/ml plasmid chèn úng o n DNA ích nh v y ch ng minh nh y c a ph n ng úng nh khai báo Các n ng c p d ng b n v ng nh v y mà PCR efficiency DNA ích chu n c ng ng chu n c xây d ng ng c c cung t R 0.990 t 90-105% (8) Xét nghi m kit RT real-time PCR phát hi n nh l ng HCV-RNA huy t b nh nhân nhi m HCV d a PCR khu ch i m t o n vùng -NC c a genome c a HCV Xét nghi m kit t c hi u nh y 50 copies/ml huy t Có ch ng n i t i RNA phiên mã t plasmid chèn DNA tái t h p s d ng m i nh ng cho s n ph m khu ch v ys i có trình t khác bi t cDNA ích nh c phát hi n phân bi t v i s n ph m khu ch i t DNA ích v i nguyên t c kit real-time PCR phát hi n HBV Ch ng n i t i l ng t i thi u cho vào v i m u th nh RNA phát hi n ch ng d ó ki m tra c c ch Ch ng âm huy t t c cung c p c hi u qu tách chi t ng ng i bình th ng, có ng ch a 100 copies/ml plasmid chèn úng o n DNA ích nh v y ch ng minh c c ng c cung c p nh y c a ph n ng úng nh khai báo Các n ng DNA ích chu n d ng A b n v ng nh v y mà chu n ng c xây d ng t R 0.990 PCR efficiency t 90-105% C (9) Xét nghi m kit RT real-time PCR nh l B ng HIV1-RNA huy t b nh nhân nhi m HIV/AIDS dùng theo dõi hi u qu i u tr c hi u Xét nghi m d a PCR khu ch o n c hi u im t NK Hình 75: K t qu xét nghi m nh genotype HBV v i kit HBV genotype-PCR (A), xét nghi m phát hi n t bi n YMDD NK kháng lamivudine c a HBV v i kit HBVlamiR-PCR (B), NK nh genotype HCV v i kit HCVinoLIPA xét nghi m genotype-core PCR (C) vùng gag gene c a genome c a HIV1 Xét nghi m kit t nh y 100 copies/ml huy t Có ch ng n i t i RNA phiên mã t plasmid chèn DNA tái t h p s d ng 161 ng m i nh ng cho s n ph m khu ch i có trình t khác bi t cDNA ích nh v y s c phát hi n phân bi t v i s n ph m khu ch DNA i t ích v i nguyên t c kit real-time PCR phát hi n HBV Ch ng n i t i c cung c p thi u l ng t i cho vào v i m u th nh ó ki m tra c hi u qu tách chi t RNA phát hi n âm huy t t th c c ch Ch ng ng ng i bình ng, có ch ng d ng ch a 100 copies/ml plasmid chèn úng o n DNA nh v y ch ng minh ích c nh y c a ph n ng úng nh khai báo Các n ng DNA ích chu n c ng c p c cung d ng b n v ng nh v y mà ng chu n xây d ng c t R 0.990 PCR efficiency t 90- Hình 76: M t s b xét nghi m PCR RT-PCR phát hi n tác nhân virus gây b nh tôm Các b xèt nghi m t y chu n m c k thu t cho xét nghi m PCR RT-PCR dành cho ch n oán 105% (10) Ngoài ra, có th cung c p thêm gi i pháp toàn di n v xét nghi m sinh h c phân t dùng ch n oán theo dõi hi u qu i u tr viêm gan virus B viêm gan virus C m n tính, c ng ã phát tri n xét nghi m kit nh : Nested multiplex PCR v trí 204 180 nh genotype HBV, PCR-RFLP phát hi n kháng lamivudine c a HBV, PCR core kit 162 t bi n YMDD t i nh genotype HCV ng ph ng pháp lai v i dò inoLIPA (hình 75) Các xét nghi m kit hoàn toàn có th tri n khai c t i phòng thí nghi m có trang b ph ng ti n PCR (11) Trong l nh v c th y s n, công ty Nam Khoa c ng m t công ty hàng u phát tri n u tiên c b xét nghi m PCR realtime PCR phát hi n xác nh t l tôm nhi m virus WSSV, MBV, HPV, IHHNV, GAV, YHV, TSV, MrNV v i y chu n m c dành cho ch n oán Công ty nhà tiên phong phát tri n ph thu t ng pháp xác nh l ng t ng Nam Khoa phat tri n nh t l tôm nhi m b nh b ng ph ng pháp real-time b ng k i Hình 76 minh h a m t s kit PCR RT-PCR công ty phát hi n virus gây b nh cho tôm Và th c t tri n khai k thu t k thu t sinh h c phân t khác Th t s cho ch n hi n nay, nhu c u n t nhà lâm sàng nghiên c u y h c không òi h i ph i phát tri n ng d ng k thu t PCR real-time PCR, mà òi h i nhà khoa h c ph i s m a k thu t sinh h c phân t hi n i khác vào ng d ng M t k thu t mà nh n th y r t c n ph i th c hi n c ó k thu t gi i trình t Quan i m c a ng d ng k thu t không ch nghiên c u mà ph i ph c v cho ch n oán lâm sàng Chính v y mà n m 2005, ã u t máy gi i trình t CEQ8000 có ch c n ng: gi i trình t , phân tích o n, phát hi n SNP N m 2007 ã nâng c p thêm ch c n ng th c hi n nghiên c u bi u hi n gen ng th i u t thêm thi t b gi i trình t ABI 3130XL có 16 capillaries V i ch c n ng gi i trình t , ã thành công tri n khai xét nghi m: (1) thu nh n TQPCR; (2) nh genotype HCV b ng k thu t gi i trình t tr c ti p s n ph m PCR c t xét nghi m nh l ng HCV-RNA b ng kit nh genotype phát hi n NK t bi n kháng lamivudine, adefovir entecavir b ng k thu t gi i trình t tr c ti p s n ph m PCR khu ch HBV; (3) Phát hi n t bi n precore c a HBV HCV RT realtime i t gene rt c a tiên oán d h u viêm gan virus B m n tính; (4) Phát hi n M tuberculosis kháng rifampicine, INH, ethambutol tr c ti p t b nh ph m v i k t qu ch vòng 72 gi Ngoài ra, ch c n ng khác c a CEQ8000 nh ch c n ng phân tích o n c ng ã nghi m xác c tri n khai xét nh quan h huy t th ng, ch c n ng phát hi n SNP c ng ang 163 c tri n khai phát hi n tính a d ng loài c u ung th hi u qu t bi n, ch c n ng bi u hi n gene nghiên i u tr thu c tr ung th K t lu n ã m t nhà khoa h c, c ng có nh ng tri th c nh t n t sách v hay ph ti p c n làm ng ti n tra c u mà ngày hôm r t d dàng ã nhà nghiên c u l nh v c y h c c ng có mong mu n c m t i u ó t ki n th c mà ang có gi i quy t m t s nh ng th c t n nh Các tri th c c V n y u có th ng d ng òi h i c a ch n oán nghiên c u y h c tri th c mà có không ch tri th c suông mà ph i bi n thành s n ph m? ây câu h i mà ngh r t nhi u ng bi t c vào i mu n tr l i Chúng ngh có câu th c a Goethe có l s giúp có m t kim ch nam tr l i câu h i trên: !Knowing is not enough, we must apply Willing is not enough, we must do∀ V i l i phóng d ch c a m t ng i b n c a chúng tôi: !Tri th c s ch ng bao gi N u không em trãi nghi m v i i c v ng c ng tr thành vô ngh a N u c ng i ôm m ng gi a ch i v i∀ Ngoài ra, cho tránh b nhà s n xu t n c chê bai v m t ch t l ng có t thua cu c cho TI N NÀO C A tri th c v n n Ó, mà ph i tr l i b ng trau d i nh cao khoa h c TRI TH C N Ó 164 ng, N ÂU CH T L NG ng d ng sinh h c phân t ch n óan viêm gan siêu vi Các câu h i th ng g p Viêm gan siêu vi B Tôi i th máu có k t qu d ng tính HBsAg, v y có b không? kháng nguyên b m t c a virus viêm gan B M t ng ng tính t c ng HBsAg d i th máu th y i ó ang b nhi m virus viêm gan B Nh v y có b nguy hi m không? có c n ph i i u tr hay không? a s ng s t o i b nhi m virít viêm gan B s có c kháng th ch ng HBsAg (g i anhti-HBsAg) tiêu di t gan B Ng i ó th máu s d mi n d ch l i không th t o d c áp ng mi n d ch b o v , t c ng tính anti-HBsAg Tuy nhiên có m t s ng i ó có m t s mi n d ch virus N u h mi n d ch cân b ng u tranh qua l i gi a h c hay u th h n s ki m hãm c thành virus hoàn ch nh v y mà s hay s có r t virus hoàn ch nh vào máu Nh ng tr mang virus, n u th máu s th y HBsAg d ng h p c g i ng i lành ng tính nh ng d u hi u cho th y có virus hoàn ch nh HBV-DNA, t c acid nhân c a virus, th s l ih c kháng th b o v nên th máu lúc c ng ng tính v i HBsAg Trong c th c a ng không cho virus nhân b n c virus viêm ng âm tính hay d ng tính v i ng (s copies) r t th p (105) Chính v y mà n u ã b ch n oán b viêm gan B m n tính (tiêu chu n ch n oán HBV-DNA 105 copies/ml, ALT cao g p l n bình th th y t ch c gan b t n th không cho virus nhân b n ng hay xét nghi m sinh thi t ho c fibroscan ng) nh t thi t ph i gây t n th c i u tr c hi u ki m ch ng gan Nhi u nghiên c u ã cho th y n u 167 không c i u tr d ng phát hi n nguy c x gan hay ung th gan i ng kh ng ch s l V y làm th ng virus hoàn ch nh máu b nh nhân có th bi t nh ng ng i s r t cao c i u tr có hi u qu ? c n ph i c i u tr bao lâu? Sau b t b nh nhân u i u tr ms l c hi u kho ng tháng, bác s s cho xét nghi m l i máu c a ng virus viêm gan B (xét nghi m máu N u l nh l ng HBV-DNA) có ng HBV-DNA máu gi m h n tr 100 l n có ngh a i u tr có hi u qu , xét nghi m ph i c m i tháng m t l n cho ng n xét nghi m ng phát hi n K t bây gi tr DNA mà không c n ph i nh l t ng HBV-DNA cho k t qu d ng n a c ng c m i tháng l n trình i u tr mà DNA c a chúng b t bi n t bi n vùng kh i d ng cccDNA ng b i thu c kháng virus M t i u ch c ch n n u virus viêm gan B b nh nhân t tr t bi t có theo dõi xem c virus không cho nhân c virus chúng t n t i t bào gan (covalently closed circular DNA) không b tác i c hi u có th s kéo dài nhi u n m cho n thành công kh ng ch b n ch r t hi m lo i tr c làm liên t c i bác s ch c n cho xét nghi m phát hi n HBV- có tái phát không Th i gian i u tr n nhà y h c ch nh l c i u tr c i u tr hay vùng gen ti n lõi (precore mutation), ng (promoter mutation), nguy c b nh nhân s b x gan và/hay ung th gan r t cao, nên nh ng b nh nhân này, bác s ph i i u tr c hi u cho h su t i mà không Xin c t ngh a cho rõ h n t bi n precore/core promoter gì? Làm c có mang virus viêm gan B b i u tr c phép ng ng i u tr t bi n precore/core promoter? Tr c hi u, có c n làm xét nghi m bi t c b t u bi t có mang virus viêm gan B b t bi n precore/core promoter không? Trong b gen (DNA) c a virus viêm gan B có m t gene hoá thông tin di truy n giúp virus sinh nguyên c g i gene ti n lõi, mã c kháng nguyên e (HBeAg) kháng c virus ti t nhân b n Do v y n u máu b nh nhân có s xu t hi n HBeAg có ngh a có s nhân b n c a virus c th N u h th ng mi n d ch c a b nh nhân th ng th virus s b ch n l i không nhân b n th i máu b nh nhân xu t hi n Tr ng h p y h c g i có chuy n c ng c kháng th ch ng HBeAg (g i anti-HBeAg) i huy t ch ng minh 168 c h mi n d ch th ng th v i k t qu xét nghi m cho th y HBeAg tr nên âm tính, anti-HBeAg d ng tính, HBV-DNA không phát hi n c hay phát hi n c nh s l ng r t th p C ng trình d u tranh gi a virus v i h mi n d ch c a c th , có nh ng ch ng virus viêm gan B b t bi n precore/core promoter t o nên m t mã k t thúc gene v y mà virus không th t ng h p c g i b c kháng nguyên HBeAg, lúc virus t bi n precore v i k t qu xét nghi m cho th y HBeAg âm tính, AntiHBeAg d ng tính, HBV-DNA d ng tính v i s l ng cao, ng th i men gan tr i s t th t th ng ph n nh tình tr ng m t cân b ng gi a h mi n d ch i v i kh n ng nhân b n phá hu t bào gan c a virus Tr ng h p c a b n ch c n làm xét nghi m phát hi n nghi m cho k t qu HBV-DNA d HBeAg d t bi n precore th ng tính 10 copies/ml, HBeAg âm tính anti ng tính T i ph i làm xét nghi m phát hi n t bi n precore tr h p này? ó bác s ph i phân bi t v i tình tr ng chuy n không ph i t bi n precore mà chuy n ng i huy t N u i huy t bác s có th xem xét ng ng i u tr cho b n sau m t th i gian i u tr mà bác s cho c n thi t Còn n u t bi n precore ch c ch n bác s s không th ng ng mà ph i i u tr cho b n su t i Xét nghi m phát hi n t bi n precore hi n ã c công ty Nam Khoa th c hi n b ng gi i trình t v i nguyên t c dùng PCR khu ch bases vùng gene preS ch a i m b xem có t bi n r i gi i trình t tr c ti p t bi n t i i m (và c t i hai v trí r t quan tr ng liên quan sinh ung th v trí promoter) hay không Ngoài ra, trình i u tr mà HBV-DNA HBeAg d i m t o n dài 250 t nhiên d ng tính c ng ph i n kh n ng i v i b nh nhân ng tính tr l i HBeAg âm tính mà anti- c ch nh làm t bi n precore bi n xãy b nh nhân ang i u tr hay không? N u có c ng không th ng ng i u tr b nh nhân mà h ph i Ch c ph i phát hi n xem có ph i t t bi n precore c i u tr su t i c i u tr b ng thu c kháng virus m t th i gian dài r i!! Các thu c có hi u qu không có th b virus d kháng không? làm th c thu c ang s d ng b bi t kháng? Do ph i i u tr thu c kháng virus m t th i gian dài nên virus có c h i ti p xúc v i thu c kháng virus nh v y chúng có c h i b t bi n kháng thu c Do v y n u th i gian i u tr , xét nghi m theo dõi virus HBV-DNA b ng nhiên b tr l i 169 ng tính l ng HBV-DNA b t ng lên d n ây d u hi u cho bi t virus có kh n ng kháng l i thu c ang i u tr Lúc c n ph i xét nghi m thu c có b virus ph kháng không? Hi n công ty Nam Khoa ã phát tri n ng pháp gi i trình t m t o n gen 550bases phát hi n c r t nhi u i m vùng gene preS c a virus t bi n gây nên tình tr ng virus viêm gan B c lamivudine adefovir hai thu c kháng virus hi n ang Nam K thu t v nhi u v trí phát hi n xem c có th kháng c s d ng t i Vi t t tr i h n nhi u k thu t khác nh kh n ng phát hi n t bi n v y s cung c p cho bác s nhi u thông tin h n xác h n li u có nên thay cho quy t c nh i thu c không Nói tóm l i, t l nhi m virus viêm gan B t i Vi t Nam dân s cao (>15%) Tuy nhiên không ph i b nhi m virus viêm gan B ph i phân bi t h có ph i ng u c n ph i i lành mang virus ng m n tính Bác s ch nên i u tr cho ng i ã xác nghi m nh l nh l i ang b viên gan virus B nh b viêm gan virus B m n tính mà thôi, xét nghi m sinh h c phân t r t c n thi t nghi m phát hi n c i u tr mà c n ch nh b nh nhân xét ng HBV-DNA Khi ã i u tr cho b nh nhân xét ng HBV-DNA theo dõi hi u qu phân t khác c ng r t c n thi t ph i ch i u tr xét nghi m sinh h c nh b nh nhân, ví d xét nghi m phát hi n t bi n precore c ng r t c n ph i cho b nh nhân HBeAg âm tính, anti-HBeAb d ng tính mà HBV-DNA v n d precore hay không mà quy t nh b nh nhân có b t bi n i cho b nh nhân không t bi n gây kháng thu c c ng r t c n thi t ph i nh n u trình i u tr b ng nhiên HBV-DNA c a b nh nhân d tính v i s l Tôi ang xác nh xem li u có ph i i u tr su t Ngoài xét nghi m phát hi n c ch ng tính ng ng t ng lên tr l i c i u tr b ng thu c kháng virus cách ây tháng, cách ây vài ngày có làm xét nghi m HBV-DNA k t qu âm tính, nh ng t i HbeAg c a v n [+] v i tr s OD cao Tôi nghe nói HbeAg [+] HBV-DNA ph i [+], tr ng h p c a HbeAg [+] mà HBV-DNA l i [-]? úng nh v y, HbeAg [+] ch ng minh HBV c th b nh nhân ang h at ng ang nhân b n, v y mà s có virus hòan ch nh máu, s có HBV- DNA [+] Tuy nhiên tr ng h p c a b n, ang c i u tr thu c kháng virus (hi n có nhi u thu c kháng virus dành cho nhi m HBV r t hi u qu ), nên virus 170 ng n ch n không cho nhân b n, v y HBV-DNA bi n m t kh i máu s m h n HbeAg, s bi n m t kh i máu ch n h n Chính HBV-DNA m t d u n r t t t theo dõi c áp ng s m c a i u tr nên hi n nhà y h c th ng nh t s d ng HBV-DNA làm ch s theo dõi áp ng i u tr h n HbeAg Viêm gan siêu vi C Tôi i th máu có k t qu d Anti-HCV kháng th ng tính anti-HCV, v y có b không? c hi u virus viêm gan C (HCV) B n d t c máu c a b n có kháng th ng tính anti-HCV c hi u HCV có ngh a b n có th ang b nhi m virus viêm gan C ã b nhi m virus nh ng ã kh i Nh v ythì làm th M t ng có th bi t c ang b nhi m HCV? i b nhi m virus viêm gan C th c mi n d ch b o v ch ng ng h mi n d ch c a ng i ó t o c virus, v y s xu t hi n kháng th c hi u HCV (anti-HCV) ý ngh a c th Ch có m t s may m n s kh i c a c th lo i tr ã có c mi n d ch b o v lo i tr c nh h th ng ch ng c virus, l i a s tr không i có ang b nhi m HCV, bác s ph i ch c hi u khác ng h p, virus v n t n t i, nhân b n t bào gan phóng thích virus vào náu Do v y ng c virus có th xác nh m t nh làm xét nghi m phát hi n HCV-RNA, t c tìm thành ph n acid nhân c a virus viêm gan C máu N u xét nghi m cho k t qu HCV-RNA d ng tính có ngh a máu c a b nh nhân có hi n di n virus viêm gan C, t c b nh nhân ang b nhi m HCV Xét nghi m HCV-RNA xét nghi m thu c lo i gì, th c hi n M c dù c khoa h c lôi ánh sáng t n m 1985 nh ng cho ch a có nhìn th y c? n ngày hôm v n c virus viêm gan C qua kính hi n vi i n t hay nuôi c y virus Tuy nhiên nh bi t rõ c b gene c a virus nên ng i ta ã có th gi nh c c c u t o c a virus Có th tóm t t ây m t lo i virus có lõi, hay g i nôm na nhân c a virus có c u t o RNA Xét nghi m phát hi n HCV-RNA xét nghi m tìm máu c a b nh nhân s hi n di n RNA c a virus ây m t xét nghi m sinh h c phân t , thông th ng c th c hi n b ng k thu t PCR (polymerase chain reaction) k thu t nhân b n DNA ng nghi m qua chu k nhi t b nh nhân sau l y s c tách huy t hay huy t t 171 làm xét nghi m, máu c a ng sau ó phòng thí nghi m s tách chi t RNA c a virus m u huy t t ng huy t a vào m t ng nghi m Trong ng nghi m này, RNA c a virus s ng c thành DNA b sung, g i cDNA, r i cDNA s b n c nhân b n thành hàng t phát hi n Nh nhân b n lên t m t b n g c thành hàng t b n r i m i phát hi n, nên xét nghi m có nh y c m c c k cao có m u th dù v i s l ng r t th p Ngoài ra, ngày ng cs l c phiên mã ng b n g c RNA c a HCV có t ban k thu t PCR nh l ng, s c phát hi n RNA c a virus i ta có th u m u th d a vào c g i qPCR hay real-time PCR V m t nguyên t c qPCR c ng gi ng nh PCR nh ng có thêm m t tính n ng n a giúp có th cs l ng b n g c ban n ng phát hi n Tôi bi t m nh l ng u có m u th nh m t h th ng quang h c có kh c ph n ng xãy ng nghi m nhân b n xãy c hi n có nhi u n i làm xét nghi m phát hi n nh l ng HCV- RNA nh ng k t qu có l i khác dù th m t b nh nhân!! Do v y làm th tin t ng c m t k t qu xét nghi m HCV-RNA ây m t xét nghi m mà chi phí b nh nhân ph i tr c ng không ph i ít? úng nh v y Xét nghi m HCV-RNA xét nghi m d a k thu t PCR m t k thu t hoàn toàn m nên ng i làm xét nghi m có th t pha thu c th làm xét nghi m mà không ph i b l thu c kit xét nghi m mua t hãng n c r t t ti n Tuy nhiên h th ng m nên mu n k t qu xét nghi m ng i làm xét nghi m ph i th c hi n ch ng c xác ki m soát s sót xãy trình làm xét nghi m ch ng ph i hi n th k t qu xét nghi m V i m t xét nghi m phát hi n HCV-RNA, k t qu ph i hi n th : (1) m t ch ng d ch ng minh khâu khu ch i trình xét nghi m ng nh y c m, (2) m t ch ng âm chúng minh trình thao tác xét nghi m không b ngo i nhi m gây k t qu d tính gi , (3) m t ch ng n i t i ch ng âm m u th t nh y, (4) ch ng minh khâu tách chi t RNA t ng th i m u âm tính ph i có chúng n i t i âm tính th t s âm tính ch không ph i âm tính gi HCV-RNA k t qu ph i hi n th thao tác nh l ng c t chu n thông qua h s t t 0.990 hi u qu ph n ng (E) ph i qu nh l ng ch ng minh i v i xét nghi m ng bi u di n chu n nh l ng ch ng minh ng quan (R) c a m u chu n ph i t 90-105% ng th i ch ng minh k t c tính toán t k t qu c a m u chu n 172 ng c ch y song hành ùng v i m u th ch không ph i c tính toán t m t công th c có s n Ngoài ra, n u mu n k t lu n m t k t qu âm tính k t qu m u ód ng tính c v i ch ng n i t i ng ph i hi n th c m b o âm tính âm tính th t s ch không ph i âm tính gi ph n ng khu ch ib c ch N u k t qu xét nghi m HCV-RNA c a d i u tr nh l c hi u không? Và n u c n ph i ng tính có c n thi t ph i c i u tr c c hi u th i gian ph i i u tr bao lâu? M t ng i sau nhi m virus viêm gan C th m t tri u ch ng không ng tri u ch ng hay ch có c hi u m h Tuy nhiên virus s âm th m xâm nh p nhân b n t bào gan trình di n ti n r t lâu có th hàng ch c n m d n n t bào gan b tàn phá d n gây h u qu viêm gan m n tính r i i th t x gan d n n ung th gan Nguy c c a ng gan m n tính r i x gan r i i u tr i b xác nh ang b viêm gan B m n tính (ALT t ng nh ang nhi m virus viêm gan nên ch không c n ph i i tr , b n ph i nh t thi t genotype HCV c ch nh làm hai xét nghi m: c hi u b n c hi u qu có th xác nh l ng HCV-RNA m t l n n a N u k t qu nh l i 100 l n bác s ph i cân nh c thay c i ph c i u nh nh c c hi u mà bác s cho ch ng cho th y l ph i ng ng i u tr b nh không áp ng v i i u tr th ng hay sinh thi t i u tr c ng nh quy t nh i u tr ng c hi u ng HCV-RNA nh b n có hi u qu , sau tháng i u tr bác s s ph i ch cho th y l c i u tr ng t n t bào gan m i i u tr Tuy nhiên tr bác s có th theo dõi th i gian i u tr ng h p c a b n nên n lúc men gan ALT cao g p ôi bình th ho c fibroscan th y có th hay gi m d c ch c hi u mà không c n ph i có d u hi u ch ng minh gan ã b th t n viêm gan m n tính Do v y tr l n viêm ng t ch c gan phát hi n qua sinh thi t hay fibroscan) m i c n ph i c hi u; m t ng nh i u tr i ang b nhi m HCV d n n ung th gan cao (có th 17-20%) Do v y, khác v i nhi m virus viêm gan B c n ph i xác cao hay có b t th n x gan, có nh xét nghi m nh ng virus không gi m ng th c i u tr hay có th c hi u N u k t qu nh l ng ng virus gi m h n 100 l n (chuyên môn g i gi m h n log) bác s có ánh giá phát i u tr c hi u b n hi u qu Lúc bác s s ph i quy t nh th i gian i u tr cho b n bao lâu, quy t nh r t tu thu c vào genotype HCV mà b n b nhi m lo i nào, thông tin bác s s l y t l n xét nghi m 173 u tiên ã nh tr ch c quy t nh i u tr cho b n N u không may mà b n b nhi m genotype HCV type bác s s ph i i u tr cho b n thêm tháng n a t c t ng th i gian i u tr ph i 12 tháng N u b n b nhi m genotype HCV không ph i 1, mà hay (t i Vi t Nam, r t phát hi n c genotype HCV 3, 4, 5) bác s ch c n i u tr cho b n thêm tháng n a t c t ng th i gian i u tr tháng Tr d t i u tr cho b n bác s s ph i ch c quy t nh ch m nh xét nghi m phát hi n HCV-RNA xem có máu c a b n hay không N u xét nghi m v n cho k t qu d bác s v n ch a th ng ng i u tr mà ph i ti p t c thêm tháng n a cho tr nên âm tính Sau ch m d t i u tr , bác s c ng s th ng tính n k t qu ng xuyên theo dõi xem b n có b tái phát hay tái nhi m không b ng xét nghi m phát hi n HCV-RNA máu c a b n m i tháng m t l n B t c lúc xét nghi m tr nên d xem nh b n b tái phát hay tái nhi m ph i tr l i i u tr Genotype gì? Xét nghi m xác th th c hi n ng tính bác s s ph i c hi u nh ban u nh genotype HCV xét nghi m nh th nào? Làm c giá thành có cao không? Genotype ki u khác bi t c a vi sinh v t loài d a vào s khác bi t d u n b gene c a vi sinh v t ó Cho n hi n y h c ã xác nh HCV có th c phân làm 11 genotype 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11 V i t ng genotype, HCV l i c phân thành d i type nh 1a, 1b, 1c 2a, 2b, 2c 3a, 3b 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 5a, 6a, 7a, 7b, 8a, 8b, 9a, 10a, 11a Xét nghi m xác nh genotype HCV m t lo i xét nghi m sinh h c phân t T i Vi t Nam, công ty Nam Khoa ã phát tri n k thu t v a nh l ng HCV-RNA v a xác nh nh l c b ng k thu t qPCR r i sau ó gi i trình t s n ph m ng HCV-RNA tr qPCR xác nh genotype HCV b ng cách so chu i v i th vi n genotype HCV c a NCBI Nh phát tri n nh l c genotype c a HCV Nguyên t c c a k thu t c k thu t này, v i ch nh v a ng HCV-RNA mà bác s ph i cho b nh nhân tr c hi u, b nh nhân ch ph i tr chi phí cho xét nghi m xác có c k t qu nh l ng HCV-RNA Ngoài ra, k thu t nh genotype HCV, v a c quy t nh genotype HCV mà v n nh genotype công ty Nam Khoa phát tri n có l i th h n k thu t khác hi n ang n c k t qu genotype HCV phân bi t ch có k t qu n type hay không th phân bi t d s xét nghi m n c có tri n khai xét nghi m 174 nd nh i u tr c s d ng i type ch không bao gi i type v i Hi n m t s c nh ki u gene HCV b ng k thu t real-time PCR mà theo báo cáo c a tác gi xét nghi m phân bi t nhi m genotype Tuy nhiên theo nh n thi u lu n c khoa h c c nh th t s v i vàng ng nhi m r t hi m xãy (kinh nghi m c a không cas 1000 cas) ó xét nghi m l i cho k t qu n cas 10 cas th nghi m vàng h ng i u ch ng t k thu t ch a ng nhi m t nh ng ã v i a áp d ng cho ch n oán, nh v y th t nguy hi m s làm l ch ng i u tr c a Bác S Nói tóm l i, t l nhi m virus viêm gan C, qua xét nghi m anti-HCV máu d ng tính, t i Vi t Nam dân s thu c nhóm qu c gia có t l nhi m cao th gi i (2-8%) N u phát hi n anti-HCV b d HCV-RNA nên xem có th t s c i u tr ng tính, b n nên i làm xét nghi m phát hi n ang b nhi m HCV hay không N u d c hi u nguy c d n n x gan r i ung th gan ng HCV cao, h n n a, y h c hi n có th ch a lành ng l thành công t 60% c n ph i c ch n 100% Tuy nhiên tr nh làm xét nghi m c n c vào ó mà bác s có th gian i u tr Tr c ch c hi u qu i nhi m i b nhi m HCV v i t nh i u tr ng HCV-RNA c hi u, b n nh ki u gen HCV i u tr quy t c ch m d t i u tr , b n nh t thi t ph i nghi m phát hi n HCV-RNA c ch nh c th i nh làm xét xem máu ã h t s ch virus không, sau ch m d t i u tr xét nghi m c ng ph i tháng m t l n c nh l ánh giá ng tính, b n c th ng xuyên ch nh th c hi n b n m i theo dõi b nh có tái phát không hay b n có b tái nhi m không 175 [...]... n i làm xét nghi m phát hi n và nh l ng HBV- DNA nh ng k t qu có khi l i khác nhau dù th trên cùng m t b nh nhân!! Do v y làm th nào tin t ng c m t k t qu xét nghi m HBV-DNA vì ây là m t xét nghi m mà chi phí b nh nhân ph i tr c ng không ph i là ít? úng là nh v y Xét nghi m HBV-DNA là xét nghi m d a trên k thu t PCR là m t k thu t hoàn toàn m nên ng i làm xét nghi m có th t pha thu c th làm xét nghi... n i làm xét nghi m phát hi n và nh l ng HCV- RNA nh ng k t qu có khi l i khác nhau dù th trên cùng m t b nh nhân!! Do v y làm th nào tin t ng c m t k t qu xét nghi m HCV-RNA vì ây là m t xét nghi m mà chi phí b nh nhân ph i tr c ng không ph i là ít? úng là nh v y Xét nghi m HCV-RNA là xét nghi m d a trên k thu t PCR là m t k thu t hoàn toàn m nên ng i làm xét nghi m có th t pha thu c th làm xét nghi... kit xét nghi m mua t các hãng n c ngoài r t t ti n Tuy nhiên vì là h th ng m nên mu n k t qu xét nghi m ng i làm xét nghi m ph i th c hi n các ch ng c chính xác thì ki m soát không có các s sót xãy ra trong quá trình làm xét nghi m và các ch ng này ph i hi n th trên k t qu xét nghi m V i m t xét nghi m phát hi n HCV-RNA, k t qu ph i hi n th : (1) m t ch ng d ch ng minh khâu khu ch i trong quá trình xét. .. c th làm xét nghi m mà không ph i b l thu c và các kit xét nghi m mua t các hãng n c ngoài r t 166 ti n Tuy nhiên vì là h th ng m nên mu n k t qu xét nghi m ng i làm xét nghi m ph i th c hi n các ch ng c chính xác thì ki m soát không cho các s sót xãy ra trong quá trình làm xét nghi m và các ch ng này ph i hi n th trên k t qu xét nghi m V i m t xét nghi m phát hi n HBV-DNA, k t qu ph i hi n th : (1)... tính là không b c ch , c ng nh ch ng minh nh y c a PCR mix (4) Xét nghi m và kit RT-PCR phát hi n và nh type virus Dengue (hình 72) hay s t Dengue và s t xu t huy t Dengue Xét nghi m và kit này c ng ch a ch ng d ng, ch ng n i t i y các t các chu n m c c a xét nghi m PCR dùng trong ch n oán nh các xét nghi m và kit mà chúng tôi phát tri n ây là xét nghi m và kit RT-PCR duy nh t hi n nay có kh n ng v a phát... viên gan virus B nh là b viêm gan virus B m n tính mà thôi, và xét nghi m sinh h c phân t r t c n thi t nghi m phát hi n và c i u tr mà c n ch nh trên b nh nhân là xét ng HBV-DNA Khi ã i u tr cho b nh nhân thì ngoài xét ng HBV-DNA theo dõi hi u qu phân t khác c ng r t c n thi t ph i ch i u tr thì các xét nghi m sinh h c nh trên b nh nhân, ví d xét nghi m phát hi n t bi n precore c ng r t c n ph i cho trên... luôn C (9) Xét nghi m và kit RT real-time PCR nh l B ng HIV1-RNA trong huy t thanh b nh nhân nhi m HIV/AIDS dùng trong theo dõi hi u qu i u tr c hi u Xét nghi m d a trên PCR khu ch o n c hi u im t NK Hình 75: K t qu xét nghi m nh genotype HBV v i kit HBV genotype-PCR (A), xét nghi m phát hi n t bi n YMDD NK kháng lamivudine c a HBV v i kit HBVlamiR-PCR (B), NK nh genotype HCV v i kit HCVinoLIPA xét nghi... sao chúng ta l i ng n ng i khi phát tri n và ng d ng xét nghi m PCR và real-time t i các phòng thí nghi m lâm sàng b nh vì cho r ng khó có th th c hi n phát hi n tác nhân vi sinh v t gây c các xét nghi m này m t cách chu n m c? Trong khi xét nghi m PCR và real-time PCR l i d th c hi n chu n m c h n xét nghi m vi sinh r t nhi u vì: (1) Khi không làm xét nghi m ngay thì không c n ph i c gi trong môi tr... s các b xét nghi m PCR và RT-PCR phát hi n các tác nhân virus gây b nh trên tôm Các b xèt nghi m này t y các chu n m c k thu t cho xét nghi m PCR và RT-PCR dành cho ch n oán 105% (10) Ngoài ra, có th cung c p thêm gi i pháp toàn di n v các xét nghi m sinh h c phân t dùng trong ch n oán và theo dõi hi u qu i u tr viêm gan virus B và viêm gan virus C m n tính, chúng tôi c ng ã phát tri n các xét nghi... nguyên v hay kháng nguyên b m t HBsAg) có ch a c ph n lõi HBV-DNA Xét nghi m HBV-DNA t c là xét nghi m tìm xem trong máu c a b nh nhân có mang virus hoàn ch nh hay không ây là xét nghi m sinh h c phân t , thông th ng c th c hi n b ng k thu t PCR (polymerase chain reaction) là k thu t nhân b n DNA trong ng nghi m qua các chu k nhi t Trong xét nghi m này, máu c a b nh nhân sau khi l y s hay huy t t huy