BÁO CÁO TIỂU LUẬN TỔNG QUAN VÀ ĐỀ CƯƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, luận án tập trung vào nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh đái tháo đường type 1 bằng liệu pháp tế bào gốc, sử dụng tế bào gốc từ mô mỡ và phương phá

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẶNG THỊ TÙNG LOAN

BÁO CÁO TIỂU LUẬN TỔNG QUAN

VÀ ĐỀ CƯƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Chuyên ngành: Sinh lí học Người và Động vật

Mã số chuyên ngành: 62420104

Khóa học năm: 2013

Người hướng dẫn khoa học: GS TS Trương Đình Kiệt

Tp HCM, năm 2015

Phần 1: Tiểu luận tổng quan

Đái tháo đường là bệnh do sự tổn thương hay suy giảm chức năng của tế bào tụy đảo và sản phẩm của nó (insulin), biểu hiện bởi nồng độ đường trong máu cao Bệnh có lượng bệnh nhân gia tăng rất nhanh trong thời gian gần đây, cả ở Việt Nam

và trên thế giới Hơn nữa, đái tháo đường gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm như suy thận, xuất huyết võng mạc, đục thủy tinh thể, mù lòa, bệnh cơ tim, bệnh thần kinh, bệnh động mạch vành, bệnh mạch ngoại vi, … (Harris et al., 2009) Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và Liên đoàn đái tháo đường thế giới (IDF), Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ gia tăng bệnh đái tháo đường nhanh nhất thế giới (khoảng 8 - 10%/năm); vì vậy, đái tháo đường được đánh giá ngang với bệnh dịch Năm 2012, theo công bố của Bệnh viện nội tiết Trung ương, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường là 5,7% và số bệnh nhân có khả năng sẽ tăng gấp đôi vào năm 2020 (Hội Nội tiết và Đái tháo đường Việt Nam)

Trên thế giới, các nghiên cứu về đái tháo đường đã được thực hiện từ những năm cuối thế kỉ 19 và nghiên cứu điều trị đã có từ những năm đầu thế kỉ 20 Tuy nhiên, cho đến nay, các nhà khoa học vẫn tiếp tục công cuộc nghiên cứu nhằm hướng đến một phương pháp điều trị hiệu quả lâu dài Các phương pháp điều trị hiện nay đều có những hạn chế như: (1) tiêm insulin : phụ thuộc lâu dài, tốn kém, khó điều chỉnh lượng insulin ngoại sinh phù hợp với từng thể trạng, tình trạng kháng insulin khi sử dụng trong thời gian dài; (2) ghép tụy, ghép đảo tụy, ghép tế bào đảo tụy: nguồn mô, tế bào hiến tặng không sẵn có và khan hiếm, sự thải ghép; khả năng duy trì và phát triển của mô ghép không cao Vì vậy, phương pháp điều trị đái tháo đường không phụ thuộc insulin và nguồn mô hiến tặng có ý nghĩa rất lớn,

cả về khoa học và ứng dụng thực tiễn

Hiện nay, liệu pháp tế bào gốc đóng vai trò chủ lực cho y học tái tạo và phục hồi Liệu pháp này sử dụng các tế bào gốc và tế bào tiền thân như một công cụ hiệu quả trong việc ngăn ngừa, điều trị bệnh hay sửa chữa, thay thế các cơ quan bị hư hại Kết quả của các nghiên cứu trên thế giới cho thấy triển vọng của việc ứng dụng liệu pháp tế bào gốc trong điều trị thành công đái tháo đường từ cận lâm sàng cho đến lâm sàng (Voltarelli et al., 2007; Xiao et al., 2008; Dong et al., 2008; Zhu et al., 2009; Ito et al., 2010; Chandra et al., 2011; Iskovich et al., 2012; Karaoz et al., 2013); theo đó, liệu pháp tế bào gốc thể hiện sự khả dụng đặc biệt đối với bệnh đái

tháo đường type 1 Tuy nhiên, việc điều trị bằng liệu pháp này vẫn còn tồn tại nhiều vấn đề chưa được làm rõ nên việc tiếp tục đầu tư nghiên cứu cải thiện những hạn chế, phát huy những thành tựu của những nghiên cứu trước là rất cần thiết, hướng đến việc tối ưu hóa phương pháp điều trị, từ đó có thể ứng dụng trên người

Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, luận án tập trung vào nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh đái tháo đường type 1 bằng liệu pháp tế bào gốc, sử dụng tế bào gốc từ mô mỡ và phương pháp ghép thay thế tế bào

Tình hình nghiên cứu trong nước

Các nước Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam, có tốc độ mắc hàng năm tăng cao (9.2%) cùng với các biến chứng nguy hiểm, bệnh đái tháo đường thu hút sự quan tâm của cộng đồng xã hội và giới y – khoa học Các y, bác sĩ và nhà nghiên cứu Việt Nam đã có những nỗ lực nhằm điều trị hiệu quả, an toàn Tuy nhiên, cho đến nay, các nghiên cứu về điều trị đái tháo đường ở nước ta chủ yếu là các nghiên cứu điều trị hoặc hỗ trợ điều trị đái tháo đường bằng dược chất tự nhiên hoặc tổng hợp như: thực phẩm chức năng, tác dụng của nụ vối (Trương Tuyết Mai et al., 2010, 2013), metformin (Nguyễn Thiện Hải, 2012), polyphenol từ trà xanh (Nguyễn Thị

Hà et al., 2005), mướp đắng (Đoàn Thị Nhu et al., 2004), nấm dược liệu (Nguyễn Thị Chính et al., 2011) …(Cục Thông tin Khoa học và Công nghệ Quốc gia) Các nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào việc khảo sát đường huyết và một số chỉ tiêu sinh hóa máu như chuyển hóa lipid, chống oxi hóa Ngoài ra, một số nghiên cứu về sản xuất insulin tái tổng hợp đã được tiến hành ở Việt Nam nhằm hướng đến có thể

tự sản xuất và cung cấp insulin cho người dân Việt Nam với giá thành phù hợp với điều kiện kinh tế của phần đông người dân Tiêu biểu là nghiên cứu của tiến sĩ Lê Văn Phủng và cộng sự (2010); hay nghiên cứu của phó giáo sư Phạm Thành Hổ và các đồng nghiệp ở trường Đại học Khoa học Tự nhiên (2010) Tuy nhiên, các phương pháp điều trị hay hỗ trợ điều trị này chỉ mang tính chất điều trị triệu chứng (đường huyết cao) và không mang lại hiệu quả tốt và lâu dài như ghép tạng Vì nguồn tạng rất ít nên một hướng tiếp cận mới được các nhà nghiên cứu cập nhật trong điều trị đái tháo đường là liệu pháp thay thế tế bào, đặc biệt là tế bào gốc

Ở Việt Nam, hiện nay, các nghiên cứu về tế bào gốc đã có nhiều bước tiến quan trọng Cụ thể, trong 5 năm gần đây, nghiên cứu về tế bào gốc gặt hái được nhiều thành tựu ở nhiều đơn vị như Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế

bào gốc, Đại học Y – Dược TP HCM, Đại học Y Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện

108, Bệnh viện Bạch Mai Một số nghiên cứu đã được đánh giá theo kịp trình độ của thế giới (Phuc et al., 2011, Ngoc et al., 2011; Toai et al., 2010…) Bên cạnh đó,

từ năm 1997 đến nay, việc ứng dụng liệu pháp tế bào gốc cũng đã mang lại các kết quả khả quan trong điều trị một số bệnh như: ghép tế bào gốc điều trị bệnh ung thư máu (Bệnh viện Truyền máu - Huyết học, 2004), ghép thành công tế bào gốc tự thân điều trị bệnh xương (Bệnh viện 108, 2010), ghép tế bào gốc điều trị bệnh động mạch vành (Viện Tim mạch, 2011), ghép tế bào gốc điều trị bệnh nhồi máu cơ tim,

hỗ trợ điều trị ung thư và điều trị bệnh về thị giác (Đại học Y Hà Nội, 2007) … Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc được thành lập vào năm

2007, là một trong những đơn vị nghiên cứu chuyên môn về tế bào gốc đầu tiên của nước ta Từ khi thành lập đến nay, đơn vị này đã đạt được những thành tựu như: tạo vật liệu sinh học điều trị tổn thương mất da, trị bỏng (Trần Lê Bảo Hà et al., 2009); ghép tế bào gốc chữa bệnh mắt (Phan Kim Ngoc et al., 2011); biệt hóa tế bào gốc trung mô máu cuống rốn thành tế bào tiết insulin (Phạm Văn Phúc et al, 2011); nâng cao hiệu quả điều trị đái tháo đường bằng ghép tế bào tiết insulin được cô lập miễn dịch (Phan Kim Ngọc et al., 2011), điều trị tổn thương sụn khớp bằng ghép SVF (stromal vascular fraction) từ mô mỡ (Phạm Văn Phúc et al., 2013), … Các thành tựu này là tiền đề cho một nghiên cứu về điều trị đái tháo đường bằng liệu pháp tế bào gốc ở Việt Nam

Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Liệu pháp thay thế tế bào gốc trong điều trị đái tháo đường hướng đến việc tạo mới, bổ sung những tế bào beta hay tế bào tiết insulin cho cơ thể Ghép tế bào gốc khắc phục được những hạn chế của phương pháp ghép mô/tế bào tiểu đảo trước đây như: (i) không phụ thuộc nguồn mô/tế bào hiến tặng, (ii) có thể có số lượng lớn

đủ để ghép hiệu quả, điều này thật sự quan trọng trong trường hợp đái tháo đường type 1, khi mà lượng tế bào ghép phải nhiều và sự phát triển của tế bào beta phải nhanh hơn sự phá hủy của hệ thống miễn dịch (Moorefield, 2012)

Nhiều loại tế bào gốc có thể được sử dụng để biệt hóa thành tế bào tiết insulin (Insulin producing cell_IPC) và có thể sử dụng cho liệu pháp thay thế tế bào Cấy ghép tế bào gốc/ IPCs để điều trị tiểu đường đã được kiểm tra trong những năm

gần đây sử dụng mô hình chuột và người Nhiều loại tế bào gốc khác nhau đã được kiểm tra với nhiều phương pháp khác nhau

a Tế bào gốc trung mô

Việc cấy ghép tế bào gốc từ tủy xương hoặc máu cuống rốn giúp cải thiện đáng cải tình trạng của các con chuột đái tháo đường (Dong et al., 2008; Li et al., 2010; Jurewicz et al., 2010; Ho et al., 2012; Iskovich et al., 2012) Trong khi một phần nhỏ (1-3%) các tế bào ghép có khả năng tiết insulin, thì vấn đề quan trọng hơn được các nhà khoa học quan tâm trên các con chuột được cấy tế bào gốc đó là khả năng kích thích các sự tăng sinh tế bào β của cơ thể chủ Điều này được cho là lí do chính giúp phục hồi nhanh chóng số lượng tế bào β và cải thiện tình trạng bệnh (Hess et al 2003)

Các tế bào tiền thân từ mô mỡ được nghiên cứu từ những năm đầu 1990 (Kirkland, 1993) nhưng cho đến đầu 2000, các tế bào gốc từ mô mỡ mới được phân lập và định danh (Gimble, 2003) Gần 10 năm sau đó, nguồn tế bào gốc này được

sử dụng nhiều và phổ biến do chúng có khả năng điều biến miễn dịch (immunomodulatory) cao hơn cả tế bào gốc tủy xương (Melief et al., 2013) Việc điều trị đái tháo đường bằng tế bào gốc trung mô từ mô mỡ được thực hiện ở nhiều nghiên cứu và cho kết quả khả quan khi nhu cầu insulin giảm, đường huyết giảm và

ổn định trong nhiều tháng (Trivedi et al., 2008; Cramer et al., 2010; Yang et al., 2010; Bassi, 2012; Li et al 2012; Dave et al., 2013) Nghiên cứu gần đây còn chỉ ra rằng các tế bào gốc mô mỡ có khả năng cận tiết để bảo vệ chống lại sự tăng đường huyết do Streptozotocin (Kono et al., 2014)

b Tế bào gốc phôi (Embryonic Stem cell_ESC)

Tế bào gốc phôi là tế bào gốc toàn năng Chúng có thể biệt hóa thành tất cả các tế bào có chức năng từ 3 lớp mầm, các lớp này cũng tạo nên các tế bào beta hoặc tế bào tiết insulin Nhiều nghiên cứu đã biệt hóa ESC thành IPC bằng cách mô phỏng con đường tín hiệu của sự phát triển tụy ở giai đoạn phôi (D’Amour et al.,

2006, Jiang et al., 2007) Quá trình biệt hóa nhiều giai đoạn có bổ sung các yếu tố tăng trưởng và các phân tử nhỏ tái hiện lại các giai đoạn biệt hóa tế bào beta như sự hình thành nội mô, biệt hóa thành tụy và phát triển chức năng nội tiết, cuối cùng là

sự trưởng thành của tế bào beta Mặc dù cơ chế biến dưỡng glucose có thể kiểm soát, nhưng hiệu quả biệt hóa thành công ESC thành tế bào β khá thấp (khoảng

10%) và khả năng hình thành khối của ESC khá cao Bên cạnh đó, việc sử dụng ESC gặp rất nhiều khó khăn vì tính nhạy cảm xã hội có liên quan đến y đức và đạo

lí sinh học; do vậy các nhà nghiên cứu còn quan ngại khi đưa ESC vào ứng dụng lâm sàng

c Tế bào gốc đa tiềm năng do cảm ứng (Induced pluripotent stem cell_IPSC)

Bước tiến quan trọng trong lĩnh vực tế bào gốc là sự phát triển của dòng tế bào đa tiềm năng được tạo ra từ nguyên bào sợi da IPSC có đặc điểm giống ESC và

vì vậy, IPSCs có thể biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào khác nhau như tế bào thần kinh (Dimos et al., 2008; Chambers et al., 2008), tế bào cơ tim (Zhang et al., 2009)

và tế bào tiết insulin (Tateishi et al., 2008; Zhang et al., 2009) Đồng thời, tương tự ESC, IPSC cũng có khả năng sinh ung thư Vì vậy, việc ứng dụng IPSC vẫn còn phải được nghiên cứu kĩ càng

d Cấy ghép IPC biệt hóa từ tế bào gốc trung mô từ tủy xương và mô mỡ

Tế bào gốc trung mô đã biệt hoá thành công in vitro thành tế bào tiết insulin

và có thể làm giảm đường huyết ở động vật và người sau khi cấy ghép (Chandra et al., 2011) Tương tự như việc cấy ghép tế bào gốc, các IPC được nghiên cứu với nhiều phương pháp ghép vào mô hình chuột ví dụ: tĩnh mạch cửa, trong màng bụng, gan, tĩnh mạch đuôi và vỏ thận

Các IPC biệt hóa từ MSC thu nhận từ tủy xương đã được dị ghép cùng loài vào tĩnh mạch cửa của chuột cống để điều trị cho các con chuột rat bị đái tháo đường Sau khi ghép, các IPC có thể di cư vào gan, biểu hiện các hormone của tiểu đảo và hàm lượng glucose thấp trong các con chuột rat bị đái tháo đường vào các ngày thứ 6 đến ngày thứ 20 (Wu et al., 2007) Gần đây, tế bào gốc trung mô tủy xương được thu nhận từ bệnh nhân đái tháo đường type 2 và được biệt hóa thành IPCs, sau đó các IPCs được ghép vào vỏ thận của chuột nude mắc đái tháo đường Kết quả bệnh được kiểm soát trong 3 tháng và kiểm tra huyết thanh của chuột phát hiện có insulin và C-peptide người và lượng nhỏ insulin chuột (Gabr et al., 2012) Nghiên cứu của Tsai và cộng sự (2013) cũng cho kết quả tương tự

IPCs còn được biệt hóa từ MSCs thu nhận từ mô mỡ Các tế bào sau biệt hóa

biểu hiện các đặc điểm của lớp nội mô (Hnf3β, TCF2 và Sox17) và đặc điểm của tế bào tụy (PDX1, Ngn3, NeuroD, Pax4) và có thể tiết insulin Các tế bào sau biệt hóa

được ghép vào chuột đái tháo đường cho kết quả đường huyết được giữ ở mức gần

bình thường trong 3-4 tuần Đồng thời, trong máu chuột phát hiện có insulin có nguồn gốc từ tế bào người được ghép vào (Chandra et al., 2011) Nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2011) cho rằng việc ghép tế bào IPC có nguồn gốc từ MSC mô

mỡ và kết hợp với việc blocking con đường truyền tín hiện Fas và TNF sẽ giúp duy trì sự tồn tại của tế bào ghép trong thời gian dài

Hiệu quả điều trị đái tháo đường được ghi nhận tốt hơn khi đồng ghép tế bào gốc trung mô với tiểu đảo hay các cụm tế bào giống tiểu đảo được biệt hóa từ tế bào gốc trung mô (Figliuzzi et al., 2009; Ito et al., 2010; Rackham et al., 2011;Okcu et al., 2013)

Phần 2: Đề cương luận án

1 Tên đề tài luận án

“Nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh đái tháo đường type 1 bằng liệu pháp tế bào gốc”

2 Mục đích nghiên cứu

 Tối ưu hóa xây dựng mô hình chuột đái tháo đường type 1 ;

 Xây dựng thành công quy trình phân lập, biệt hóa tế bào gốc trung mô từ mô

mỡ thành tế bào tiết insulin ;

 Đánh giá được tính an toàn và khả năng di cư của tế bào ghép ;

 Xây dựng thành công quy trình điều trị bệnh đái tháo đường type 1 bằng liệu

pháp tế bào gốc từ mô mỡ trên mô hình động vật thực nghiệm ;

3 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Chuột được sử dụng để xây dựng mô hình bệnh đái tháo đường type 1 và các thí nghiệm liên quan Chuột được cung cấp và đạt các tiêu chuẩn của Viện Pasteur Tp HCM dành cho động vật thí nghiệm Các thao tác trên động vật thí nghiệm phù hợp với các quy định, hướng dẫn của Phòng thí nghiệm Nghiên cứu

 Kĩ thuật: thông qua quá trình nghiên cứu, tìm hiểu; thông qua các khóa huấn luyện (training) kĩ thuật, …

3.2.2 Giản đồ thí nghiệm

3.2.3 Phương pháp thu nhận, nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột 3.2.3.1 Phương pháp thu nhận, nuôi cấy tế bào gốc ứng viên từ mô mỡ chuột

 Chuột sau khi được gây mê bằng ketamin (5 mg/0,1 ml/con), việc thu nhận

mỡ được tiến hành bằng cách giải phẫu Vị trí thu nhận mỡ cách lỗ sinh dục

1 cm hướng về phía bụng; mỡ được lấy ra từ vết cắt mở ngang khoảng 1 cm Sau đó, vết mổ được khâu và xử lí lại cẩn thận và mô mỡ thu nhận được bảo quản trong PBS lạnh có bổ sung kháng sinh 5X

 Mỡ chuột (dạng khối) được rửa sạch nhiều lần bằng PBS-kháng sinh và vortex kĩ để loại bỏ hồng cầu và làm cho mô mỡ trở nên lỏng lẻo hơn Sau

đó, mỡ được xử lí với với hỗn hợp super extract và li tâm hai giai đoạn: li tâm ở tốc độ 500g trong 5 phút, lấy dịch nổi, sau đó li tâm dịch nổi 1000 g trong 10 phút thu cặn Cặn tế bào được huyền phù trong môi trường DMEM/F12 10% FBS và tế bào được nuôi ở điều kiện 370C, 5% CO2 Môi

Mô hình chuột đái tháo đường TYPE 1

NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ

MÔ MỠ

Tế bào gốc trung mô

Tế bào tiết insulin

ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN

VÀ SỰ DI CƯ

trường được thay mới mỗi 3 ngày đến khi tế bào phát triển 70% bề mặt flask

và việc cấy chuyền dùng trypsin 0,25%

3.2.3.2 Định danh tế bào gốc ứng viên được phân lập từ mô mỡ chuột

Tế bào gốc ứng viên phân lập từ mô mỡ được định danh là tế bào gốc trung

mô phải đạt các tiêu chuẩn của ISCT (International Society for Cellular Therapy) (Dominici et al., 2006) như sau:

i) Hình thái giống nguyên bào sợi;

ii) Có khả năng tự làm mới;

iii) Có khả năng biệt hóa thành tế bào xương, tế bào mỡ;

iv) Biểu hiện một số marker đặc trưng của tế bào gốc trung mô như: CD13, CD44, CD90, CD133, CD105 và không biểu hiện các marker của tế bào gốc tạo máu như CD14, CD34, CD45 Việc phân tích được tiến hành bằng kĩ thuật flow cytometry

3.2.4 Biệt hóa tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thành tế bào tiết insulin in vitro

i) Sự hình thành tiểu đảo: các tế bào trong môi trường biệt hóa sẽ kết cụm lại,

hình thành các cụm tế bào giống tiểu đảo (islet-like cluster) Sau khi nhuộm với Dithizone, các cụm tế bào có sản xuất Zn như tiểu đảo sẽ bắt màu với

thuốc nhuộm