Nghiên cứu cố định tế bào nấm men saccharomyces cerevisiae sinh enzyme invertase có hoạt tính cao bằng alginat để thủy phân sucrose thu đường khử

DANH MụC CáC BảNG 1.1 Một số enzyme chủ yếu trong tế bào nấm men Saccharomyces có tác dụng chuyển hoá glucid đơn giản 9 1.2 Một số ứng dụng của alginat trong cố định tế bào 25 3.1 Một s

Bộ giáo dục và đào tạo trường đại học NHA TRANG

-

TRầN DANH GIANG

nghiên cứu cố định tế bào nấm men saccharomyces cerevisiae

sinh enzyme invertase có hoạt tính cao bằng alginat

để thuỷ phân sucrose thu đường khử

luận án tiến sĩ kỹ thuật

Nha Trang, 2006

Bộ giáo dục và đào tạo trường đại học NHA TRANG

-

Trần Danh Giang

nghiên cứu cố định tế bào nấm men saccharomyces cerevisiae

sinh enzyme invertase có hoạt tính cao bằng alginat

để thuỷ phân sucrose thu đường khử

LêI CAM §OAN

t«i xin cam ®oan ®©y lµ c«ng tr×nh nghiªn cøu cña riªng t«i C¸c sè liÖu vµ kÕt qu¶ nªu trong luËn ¸n lµ trung thùc vµ ch­a tõng ®­îc ai c«ng bè trong bÊt kú c«ng tr×nh nµo kh¸c

T¸c gi¶ luËn ¸n

LờI CảM ƠN

Để hoàn thành luận án

Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Khoa Chế biến, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại học và Sau Đại học – Trường Đại học Nha Trang sự kính trọng, tự hào và biết ơn được học tập, đào tạo và nghiên cứu tại trường trong những năm qua

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với các cô: PGS.TS Trần Thị Luyến - Phó Hiệu trưởng- Trường Đại học Nha Trang và TS Lâm Ngọc Trâm - ủy viên thường

vụ Hội KHKT tỉnh Khánh Hòa đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

Xin chân thành cảm ơn: GS.TS Nguyễn Trọng Cẩn - Khoa Chế biến- Trường

Đại học Nha Trang, GS.TS Nguyễn Thị Hiền - Đại học Bách Khoa Hà Nội, TS Đỗ Văn Ninh- Trưởng khoa Chế biến - Trường Đại học Nha Trang, TS Ngô Đăng Nghĩa, Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường- Trường Đại học Nha Trang, TS Vũ Ngọc Bội - Trưởng bộ môn Quản lý chất lượng và An toàn thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang, TS Trang Sĩ Trung, TS Nguyễn Thị Nga, Ths Nguyễn Minh Trí, KS Lê Đình Đức- Bộ môn Quản lý chất lượng & An toàn thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang cùng các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí giá để luận án được hoàn thành có chất lượng

Cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa chế biến, các cán bộ nghiên cứu Viện CNSH&MT, cán bộ và chuyên viên Phòng Đào tạo Đại học và Sau Đại học - Trường đại học Nha Trang, bạn bè đồng nghiệp và gia đình đã luôn chia sẻ, hỗ trợ nhiều mặt và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu

Mục lục

Trang Danh mục các chữ viết tắt trong luận án i

1.1.2 Các enzyme thuỷ phân glucid đơn giản chủ yếu trong tế bào nấm nen

1.1.3 Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men 10 1.2 Tổng quan về enzyme invertase trong nấm men và điều kiện sinh

1.2.2 Tổng quan về quá trình sinh tổng hợp enzyme từ vi sinh vật 14 1.2.3 Cơ sở và điều kiện sinh tổng hợp enzyme cảm ứng 15

1.3.1 Đặc điểm, lợi ích và ứng dụng của tế bào cố định 16

1.4 Tổng quan về chất mang alginat cố định tế bào 21

1.6 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến luận án 34

1.6.2 Nghiên cứu về cố định tế bào nấm men S cerevisiae và ứng dụng 35

1.6.3 Nghiên cứu sử dụng invertase và tế bào nấm men S cerevisiae

có hoạt tính invertase được cố định để thủy phân sucrose 36

2.6.1 Đánh giá hiệu quả tạo gel của chất mang alginat nghiên cứu

2.6.2 xác định nồng độ alginat và CaCl2 đến tạo gel và khả năng sống

2.6.3 Xác định kích thước hạt gel đến khả năng sống của tế bào nấm men 44 2.6.4 Xác định thời gian ngâm gel đến khả năng sống của tế bào 44 2.6.5 Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân sucrose 45 2.6.6 Xác định khả năng tái sử dụng tế bào nấm men cố định 45 2.6.7 Xác định khả năng hoạt hoá tế bào nấm men cố định 46 2.6.8 Động học của quá trình thủy phân sucrose bằng tế bào cố định 46 2.6.9 Xác định ảnh hưởng nồng độ sucrose đến hiệu suất thủy phân

3.1 Kết quả xác định một số đặc tính, hình thái và lựa chọn chủng nấm men sinh

3.1.1 Đặc tính khuẩn lạc của các chủng nấm men 49 3.1.2 Chọn nguồn cacbon thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của các

3.1.3 Lựa chọn chủng nấm men có khả năng sinh invertase cao 56 3.1.4 Xác định thời gian nuôi và chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp

3.2 Nghiên cứu cố định tế bào S cerevisiae S12 trong gel alginat CaNXI 61 3.2.1 Đánh giá hiệu qủa tạo gel và cấu trúc gel alginat- Ca cố định tế bào 61 3.2.2 ảnh hưởng của nồng độ alginat natri và CaCl2 đến tế bào cố định 68 3.2.3 ảnh hưởng của kích thước hạt gel đến tế bào cố định 71 3.2.4 ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt gel trong dung dịch CaCl2 73

3.3 Xúc tác thủy phân sucrose bằng tế bào nấm men S cerevisiae có

hoạt tính invertase được cố định trong gel alginat CaNXI 75 3.3.1 ảnh hưởng của lượng tế bào nấm men đến hạt gel và hiệu suất

3.3.2 ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến hiệu suất thủy phân 77

3.3.3 ảnh hưởng của pH môi trường đến hiệu suất thủy phân 81 3.3.4 ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân của tế bào cố định 84 3.3.5 ảnh hưởng của chế độ cung cấp oxy đến hiệu suất thủy phân 86 3.3.6 Khả năng tái sử dụng tế bào cố định để thủy phân sucrose 88 3.3.7 Hoạt hóa khôi phục hoạt tính invertase của tế bào nấm men cố định 90 3.3.8 Động học phản ứng thủy phân sucrose dùng xúc tác tế bào nấm men

S cerevisiae có hoạt tính invertase cố định trong gel alginat-Ca 94 3.3.9 ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến hiệu suất thủy phân của tế bào

3.5 Đánh giá chất lượng dịch đường khử thu được khi thủy phân sucrose

bằng tế bào nấm men S cerevisiae có hoạt tính invertase cao 101

danh môc ch÷ viÕt t¾t trong luËn ¸n

DANH MụC CáC BảNG

1.1 Một số enzyme chủ yếu trong tế bào nấm men Saccharomyces có

tác dụng chuyển hoá glucid đơn giản

9

1.2 Một số ứng dụng của alginat trong cố định tế bào 25 3.1 Một số đặc điểm và hình thái của khuẩn lạc các chủng nấm men 50 3.2 Một số đặc điểm hình thái tế bào của các chủng nấm men 51 3.3 Hiệu quả tạo gel của alginat natri trong dung dịch CaCl2 62 3.4 Hiệu suất thủy phân của tế bào cố định trước và sau hoạt hoá 91

DANH MụC CáC HìNH

1.5 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất alginat natri 23 1.6 Cấu hình của hai gốc monome trong phân tử acid alginic 26 1.7 Cấu trúc các block polyG, polyM và poly GM trong phân tử

alginat

26

1.8 Sự tạo gel của block polyG mô hình “vỉ trứng” 28 1.9 Liên kết glucosid giữa glucose và fructose của sucrose 30 1.10 Sơ đồ quá trình thủy phân tinh bột bằng acid và enzyme 31 1.11 Qui trình thủy phân sucrose bằng enzyme invertase 31 1.12 Qui trình thủy phân sucrose bằng chế phẩm enzyme invertase 32 1.13 Phương pháp thủy phân sucrose bằng tế bào nấm men cố định 33

2.1 Cố định tế bào bằng phương pháp bẫy gel 41

3.8 Kết quả sinh khối và sinh tổng hợp enzyme invertase của các

chủng nấm men trong nuôi cấy chìm bước 1

3.12 Mặt cặt ngang vùng tâm của hạt gel alginat-Ca cố định tế bào

nấm men S cerevisiae

tế bào nấm men cố định

69

3.18 ảnh hưởng kích thước hạt gel đến khả năng sống của tế bào cố

định

72

3.19 ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt gel trong dung dịch tạo gel

CaCl2 đến khả năng sống của tế bào nấm men

74

3.20 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của lượng tế bào nấm men cố định

đến hiệu suất thuỷ phân và tỷ lệ hạt gel còn nguyên vẹn

76

3.21 ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến hiệu suất thuỷ phân 78 3.22 Mô tả cơ chế thuỷ phân sucrose bằng xúc tác enzyme invertase 79 3.23 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thuỷ phân 82 3.24 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thuỷ phân 85 3.25 ảnh hưởng của chế độ cung cấp oxy đến hiệu suất thuỷ phân 88 3.26 Đồ thị biểu diễn hiệu suất thuỷ phân qua các chu kỳ tái sử dụng tế

bào nấm men cố định để thuỷ phân dung dịch sucrose

89

3.27 Sự nảy chồi của tế bào nấm men khi được cố định trong gel

alginat-Ca sau khi được hoạt hoá

91

3.28 Đồ thị biểu diễn hiệu suất thuỷ phân ở chu kỳ tái sử dụng tế bào

cố định sau hoạt hoá

93

3.29 Đồ thị biểu diễn sự biến đổi nồng độ sucrose và nồng độ đường

khử tạo thành theo thời gian thuỷ phân

94

3.30 Sự biến đổi của tốc độ phản ứng thủy phân theo nồng độ cơ chất

của tế bào Saccharomyces cerevisiae cố định trong gel alginat-Ca

3.33 Đồ thị biểu diễn hiệu suất thuỷ phân của tế bào tự do và cố định

khi thay đổi nồng độ cơ chất

98

3.34 Đồ thị biểu diễn hiệu suất thuỷ phân của tế bào tự do và cố định

khi thay đổi nhiệt độ của dung dịch thuỷ phân

100

3.35 Đề xuất quy trình công nghệ thuỷ phân sucrose ở phòng thí

nghiệm dùng xúc tác tế bào nấm men S cerevisiae S12 có hoạt

tính enzyme invertase cố định trong gel alginat-Ca

102

3.36 Sơ đồ bố trí thiết bị cố định tế bào nấm men S cerevisiae có hoạt

tính enzyme invertase cao bằng alginat natri

103

3.37 Sơ đồ bố trí thiết bị thuỷ phân gián đoạn sucrose bằng tế bào nấm

men S cerevisiae có hoạt tính enzyme invertase cao cố định trong

gel alginat - Ca

104

do sự kết tinh lại của sucrose Mặt khác, hỗn hợp đường khử còn có khả năng giữ nước nên có tác dụng ổn định, tránh hiện tượng khô cứng sản phẩm Do những ưu

điểm trên, nhu cầu sử dụng hỗn hợp glucose- fructose tăng hàng năm 20 - 30%, đưa sản lượng tiêu thụ trên thế giới lên gần 10 triệu tấn/năm

Hỗn hợp đường khử glucose-fructose được sản xuất bằng nhiều phương pháp khác nhau như dùng acid hoặc enzyme amilase để thủy phân tinh bột các loại như ngô, sắn hoặc khoai tây để thu glucose, sau đó dùng enzyme glucose isomerase để

đồng phân hóa glucose thành hỗn hợp glucose- fructose với tỷ lệ tương ứng là 60:40 Phương pháp tỏ ra có nhiều ưu thế là dùng enzyme invertase xúc tác thủy phân sucrose thành glucose và fructose với tỷ lệ 50:50 Enzyme invertase có thể

được thu nhận từ động vật, thực vật hoặc vi sinh vật đặc biệt là từ tế bào nấm men Tuy vậy việc thu nhận enzyme và sử dụng enzyme invertase tự do cũng có nhiều nhược điểm như giá thành cao và nhất là không thể tái sử dụng lại enzyme nhiều lần Vì thế làm tăng giá thành của sản phẩm Để khắc phục những nhược điểm này

luận án tiến hành “Nghiên cứu cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae

sinh enzyme invertase có hoạt tính cao bằng alginat để thuỷ phân sucrose thu đường khử” với mục đích tạo ra tế bào nấm men cố định có hoạt tính invertase cao để có thể tái sử dụng lại nhiều lần

Nội dung nghiên cứu của luận án:

- Nghiên cứu chọn lựa giống nấm men Saccharomyces cerevisiae thuần chủng

và phương pháp nuôi cấy để sinh tổng hợp enzyme invertase có hoạt tính cao

- Nghiên cứu cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có hoạt tính

enzyme invertase cao bằng phương pháp bao bọc trong gel alginate canxi

- Nghiên cứu sử dụng tế bào nấm men cố định trong gel alginat canxi để thủy phân sucrose tạo ra hỗn hợp đường khử

ý nghĩa khoa học, thực tiễn của luận án:

Lần đầu tiên nghiên cứu một cách có hệ thống từ giai đoạn lựa chọn chủng

nấm men S cerevisiae thuần chủng và phương pháp nuôi cấy nấm men để sinh tổng

hợp enzyme invertase hoạt tính cao, đến nghiên cứu sử dụng chất mang alginat natri một polyme thủy sản được chiết rút từ một loại rong mơ, khai thác tại vùng biển địa

phương nơi nghiên cứu và phương pháp cố định tế bào nấm men S cerevisiae có

hoạt tính enzyme invertase cao để xúc tác thủy phân sucrose sản xuất hỗn hợp

đường khử Các kết quả nghiên cứu của luận án sẽ làm tăng thêm những hiểu biết

về lĩnh vực nghiên cứu nuôi cấy tế bào VSV sinh tổng hợp enzyme và ứng dụng công nghệ cố định tế bào bằng polyme thủy sản trong sản xuất thực phẩm Kết quả nghiên cứu còn là cơ sở thực tiễn cho những hướng nghiên cứu khác có liên quan

đến công nghệ vi sinh vật, enzyme và cố định tế bào

Kết quả nghiên cứu của luận án bước đầu làm cơ sở để triển khai ứng dụng tế bào nấm men cố định vào thực tiễn sản xuất hỗn hợp đường khử dùng trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm và đồ uống Góp phần từng bước hạn chế nhập khẩu chế phẩm enzyme invertase hoặc đường khử, cũng như mở rộng thêm ứng dụng của alginat Do đó thúc đẩy công nghệ chế biến rong biển và sản phẩm sau công nghệ sản xuất mía đường phát triển, đó là những nguyên liệu hiện có và đầy tiềm năng của Việt Nam trong tương lai

Chương 1 TổNG QUAN

1.1 Tổng quan về nấm men Saccharomyces cerevisiae

1.1.1 Tổng quan về thành phần cấu tạo, dinh dưỡng và trao đổi chất của

tế bào nấm men

Nấm men S cerevisiae thường có hình ôvan, hình bầu dục hay hình tròn Kích

thước của tế bào nấm men thay đổi tùy thuộc vào giống, loài, tuổi và điều kiện nuôi

cấy Chiều rộng trung bình của nấm men từ 2,5  10m và chiều dài từ 4,5  21m,

tối đa có chủng đạt được chiều dài đến 30m Nấm men có xu hướng dài ra trong

điều kiện nuôi cấy có hàm lượng nitơ (N) thấp Nói chung thể tích của tế bào nấm

men hầu như không bị biến đổi trong toàn bộ chu trình sống Khi tế bào nảy chồi,

chồi phát triển lớn lên nhưng thể tích tế bào mẹ lại giảm đi Lord và Wheals (1981)

đã quan sát và nhận thấy: sau khi phân chia, thể tích tế bào con luôn nhỏ hơn tế bào

mẹ và trong cùng một môi trường dinh dưỡng thì các thế hệ tiếp sau luôn nhỏ hơn

thế hệ trước khi sinh ra từ cùng một tế bào mẹ Để quan sát và đo kích thước của tế

bào nấm men ta thường nhuộm màu tiêu bản nấm men bằng dung dịch lugol hoặc

các thuốc nhuộm thông thường như fuchsin, xanh metylen

Cấu tạo của tế bào nấm men S cerevisiae (hình 1.1.) gồm có: vỏ tế bào, màng

nguyên sinh chất, nguyên sinh chất, ty lạp thể, nhân tế bào, không bào, bộ máy

golgi, hạt volutin, ribosome, hạt chất béo và bầu mô [12], [14], 21, [27]

Vỏ tế bào bao bọc xung quanh tế bào, có độ bền chắc cao, có chiều dày từ

15002500nm Vỏ tế bào được cấu tạo bởi các hợp chất mano-protein, lớp trong

cùng phần lớn là glucan Lớp vỏ tế bào có những lỗ nhỏ li ti có đường kính khoảng

3,6nm để nước, đường các chất dinh dưỡng cần thiết cho tế bào có thể đi qua được

Nhiệm vụ của vỏ tế bào là bảo vệ tế bào trước các tác động bên ngoài, khống chế

các quá trình trao đổi chất và áp suất thẩm thấu ở trong tế bào, chính vỏ này tạo nên

hình dáng tế bào Với tế bào trẻ màng có độ đàn hồi cao, mỏng, trong suốt và khó

khăn lắm mới nhìn thấy được dưới kính hiển vi Càng phát triển thì vỏ tế bào càng

dày và càng dễ nhìn thấy dưới kính hiển vi Đặc biệt, vỏ tế bào rất dày nếu bị tác

động xấu ở bên ngoài như: nhiệt độ bên ngoài tăng cao quá mức mà nấm men có

thể chịu đựng được, các chất dinh dưỡng bị thiếu, độ acid hay nồng độ các chất độc

trong môi trường cao Khi tế bào già, vỏ có độ đàn hồi kém, dòn, dễ vỡ, vỏ thường

chiếm 20  30% trọng lượng tế bào Thành phần hoá học của vỏ tế bào gồm:

mannan và glucan 70%, protein 6,0  14%, chất béo 4,0  8,0%, chất tro 4,0  7,0%, xitin 0,5  1% Vỏ tế bào rất dễ bị phá huỷ bởi các tác nhân cơ học (teo

nguyên sinh chất), lý học (nhiệt độ cao, tia Rơnghen, tia tử ngoại, tia cực tím ), hoá học (môi trường quá acid hoặc quá kiềm sẽ phá vỡ hoặc ăn mòn vỏ tế bào), sinh

lý học (nhiễm vi sinh vật lạ, nhiễm vi sinh vật trong quá trình nuôi cấy, các vi sinh vật này tiết ra các enzyme có khả năng phân huỷ tế bào)

Màng nguyên sinh chất (màng bán thấm) nằm sát ngay vỏ tế bào, cấu tạo chính là lipoprotein, chiếm 10% trọng lượng tế bào Chức năng chính của màng nguyên sinh chất là điều chỉnh sự thấm qua màng tế bào của các chất dinh dưỡng Màng có tính chất thẩm thấu chọn lọc: chỉ cho qua những chất cần thiết và có lợi cho tế bào (như các loại đường đơn giản, N, phospho và các chất vi lượng khác),

đồng thời thải ra ngoài những chất cặn bã (CO2, rượu, acid )

Nguyên sinh chất được phân bố đều khắp trong tế bào, được cấu tạo chủ yếu

từ protein với một lượng nước lớn, ở dạng dung dịch keo Tất cả các hoạt động sống của tế bào đều xảy ra trong nguyên sinh chất Nguyên sinh chất là môi trường cần thiết để tế bào hoà tan các chất dinh dưỡng, là nơi thực hiện các phản ứng sinh hoá

và liên kết chặt chẽ các thành phần trong tế bào Quá trình phân huỷ glucose và lên men xảy ra trong tế bào chất, còn các phản ứng của chu kỳ Krebs thì xảy ra trong ty lạp thể

Ty lạp thể có cấu tạo đa hình (dạng sợi, dạng hạt, dạng phân nhánh) với số lượng từ 2  24 phân bố đều trong tế bào Chức năng chính của chúng là thực hiện các quá trình liên quan tới cung cấp năng lượng cho tế bào Các phản ứng oxy hoá xảy ra trong ty lạp thể, năng lượng giải phóng ra được chuyển đến ATP là chất thu năng lượng Bên cạnh quá trình này, trong ty lạp thể còn xảy ra quá trình tổng hợp các chất cần thiết cho tế bào

Nhân tế bào có hình dạng giống tế bào (cầu, ovan ) và được bao bọc bởi các hạch Kính thước của nhân tế bào thường bằng 1  3m Trên bề mặt của màng nhân có các hạt ribosome Trong nhân có chứa ADN, ARN- nucleoprotein và các gen, do đó nhân đóng vai trò quan trọng trong sinh sản di truyền lại dấu hiệu cho các đời sau ở tế bào trẻ nhân to tròn, càng già nhân càng teo đi Trong thời gian sinh sản, nhân thường nằm giữa chồi và không bào Sau khi phân chia bằng cách kéo dài ra và thắt lại ở giữa, nhân của tế bào mẹ sẽ di chuyển về phía đối diện với tế bào mới

Không bào có dạng hình tròn, được bao bọc bởi một vỏ rất mỏng và chứa trong đó các dịch bào Trừ các chất điện phân trong nước (như Na+ K+, Ca2+, Cl-,

SO42-, PO43- ) trong không bào còn chứa protein, hạt mỡ, cacbon ở dạng keo và hệ thống enzyme Trong không bào xảy ra các quá trình oxy hoá khử rất mạnh và các

quá trình thuỷ phân được thực hiện nhờ các enzyme có trong đó Điểm đặc biệt nhất của không bào trong tế bào nấm men là có volutin Không bào nhìn thấy rõ hơn ở các tế bào già

Hạt volutin tích tụ trong không bào dưới dạng keo hay hạt Nó là nơi dự trữ N, phospho, sản xuất acid nucleic Số lượng hạt volutin phụ thuộc vào sự có mặt phospho trong môi trường dinh dưỡng và có liên quan đến quá trình phát triển, sinh sản cũng như tích luỹ năng lượng của tế bào Tế bào khoẻ thường có 15 hạt volutin, tế bào yếu thì lượng này giảm đi rất nhiều Nhiều nhà khoa học đã chứng minh được rằng volutin là nguồn thức ăn giàu có và là nơi dự trữ năng lượng đặc biệt của tế bào

Hạt ribosome thường tồn tại dưới dạng hạt nhỏ, phân bố đều trên bề mặt của nhân hoặc trong ty lạp thể Số lượng ribosome của tế bào phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy và giai đoạn phát triển của tế bào nấm men Trong hạt ribosome thường xảy ra các quá trình tổng hợp protein, Hạt này giống như “nhà máy đạm” của tế bào Hạt ribosome được cấu tạo từ 58% protein và từ ARN

Hạt chất béo được tích tụ do chuyển hóa các saccharide hoặc được tổng hợp trong môi trường giàu lipid ở trong môi trường nguyên chất, các hạt chất béo nằm ở dạng các hạt nhỏ li ti Tế bào càng già thì các hạt lipid càng to Thông thường, tỷ lệ hạt chất béo chiếm 1  2% trọng lượng khô của tế bào Tuy nhiên, một số chủng có khả năng tích luỹ chất béo từ các acid béo có trong môi trường và đạt tới 40

 50% trọng lượng khô của tế bào

Bầu mô là vị trí tạo ra các tế bào mới Khi các tế bào phát triển đến mức nhất

định, bầu mô cũng lớn dần và phát triển thành chồi Các chất dinh dưỡng chuyển vào bầu mô, chồi phát triển đầy đủ tạo thành tế bào con có kích thước, thành phần hoàn toàn giống tế bào mẹ Chồi có thể tách ra để tạo thành tế bào mới hoặc nối tiếp tạo thành chồi Trong nấm men, bên cạnh các cấu tử cố định như đã nêu ở trên, ta còn gặp một số các hạt dự trữ như hạt glycogen Trong nấm men, khi nuôi cấy ở

điều kiện hiếu khí, glycogen không được tạo thành hoặc ở dạng rất nhỏ Nếu nấm men được nuôi cấy ở điều kiện yếm khí thì nó là tổ hợp cuả các hạt

Bộ máy Golgi là nơi xảy ra quá trình tiêu hoá chính của tế bào nấm men

Hình 1.1 Mặt cắt ngang của tế bào nấm men [12]

Trong quá trình sống, tế bào nấm men thực hiện quá trình trao đổi chất liên tục với môi trường xung quanh với cường độ lớn Chúng hấp thu các chất dinh dưỡng qua màng tế bào và chuyển hóa thành những chất cần thiết cho việc xây dựng tế bào Nhờ đó tế bào sinh trưởng, phát triển tăng sinh khối, đồng thời sinh ra các sản phẩm trao đổi chất Các chất dinh dưỡng cho nấm men cũng giống như các VSV khác được chia làm 3 loại [19], [26]:

- Các chất dinh dưỡng làm nhiệm vụ cung cấp nguyên liệu để xây dựng các thành phần cơ bản của tế bào, như muối khoáng, N, cacbon và các nhân tố sinh trưởng (chất kích thích sinh học)

- Các chất dinh dưỡng đóng vai trò cung cấp năng lượng như H2, H2S và SO3, một số chất vô cơ và hữu cơ dùng làm chất trao đổi điện tử

- Các chất dinh dưỡng làm nhiệm vụ cung cấp cho cơ thể nguyên liệu vừa để xây dựng vừa để làm nguyên liệu cung cấp năng lượng như glucid, protein, NH3, nitrat, muối sắt 2 và các chất khoáng khác

Nấm men cũng như VSV khác dùng trong sản xuất lên men là các cơ thể dị hóa, do đó chúng sống phải có các chất hữu cơ làm chất dinh dưỡng như cacbonhydrat, protein Khi trong môi trường có chất dinh dưỡng thích hợp với đời sống của nấm men thì tế bào sẽ tiết ra enzyme cảm ứng để thủy giải cơ chất thành các sản phẩm có thể hấp thụ qua màng tế bào và tiếp tục tham gia vào quá trình dị hóa cũng như đồng hóa Chất dinh dưỡng chủ yếu lấy từ môi trường xung quanh, nếu môi trường dinh dưỡng cung cấp đầy đủ năng lượng, nguyên liệu xây dựng tế bào thì sẽ bảo đảm hiệu suất sinh tổng hợp cao Môi trường dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm men phải chứa đầy đủ các nguyên tố vi lượng như Fe, Cu, Mg, Zn, Ca, K, Cl Ngoài ra phải kể đến các chất không thể thiếu như nước, cacbon, N bởi vì:

Nước rất cần cho mọi hoạt động sống của tế bào nấm men Không có nước không thể có qúa trình đồng hóa thức ăn và qúa trình trao đổi chất bên trong tế bào Cacbon có giá trị rất lớn đối với các loại nấm men vì nó cần cho sự sinh tổng hợp các thành phần của tế bào như glucid, lipid, protein và các acid nucleic cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, các phân tử enzyme, acid nucleic và các sản phẩm trao đổi chất, cacbon chiếm khoảng một nửa chất khô tế bào Cacbon dùng cho nấm men được cung cấp bởi hai nguồn sau:

Các chất hữu cơ có nguồn gốc glucid như các loại đường và tinh bột Nấm men có khả năng đồng hóa hoàn toàn glucose, fructose và maltose, có chủng còn

đồng hóa được cả galactose Trong các loại disaccharide thì nấm men đồng hóa và lên men tốt maltose, sucrose, các loại trisaccharide như rafinose thì chỉ nấm men chìm có khả năng đồng hóa hoàn toàn còn nấm men nổi chỉ đồng hóa được 1/3 nguồn cacbon đường này

Các polysaccharides (C6H1206)n: các chất này cần được thủy phân hoàn toàn bằng acid hoặc enzyme thì nấm men mới sử dụng được Trong điều kiện giàu oxy,

sự hô hấp xảy ra mạnh thì nấm men có thể sử dụng các acid hữu cơ, rượu etylic, aldehyt nấm men sẽ dễ dàng đồng hoá hơn khi môi trường dinh dưỡng chứa sẵn nguyên tử C bán oxy như -CH2OH-, CHOH-, =COH- Các acid hữu cơ R-COOH chỉ có một liên kết hóa trị của cacbon là có thể oxy hóa được, còn lại là bị bão hòa bởi oxy do dó tế bào nấm men đồng hóa sẽ kém hơn đường và rượu

Nấm men cần N ở nhiều dạng khác nhau trong qúa trình sống để xây dựng tế bào Trên thực tế đa số các chủng nấm men đều có thể sử dụng muối amonium dưới dạng sunphat với điều kiện phải cung cấp đồng thời các vitamin cần thiết Khi nuôi nấm men bằng các dạng muối amon thì nấm men đồng hóa NH4+, còn lại các nhóm

SO42-, Cl-, HPO42- sẽ làm pH của môi trường giảm xuống, cần phải điều chỉnh pH để giữ pH môi trường luôn tối ưu Hợp chất N được nấm men đồng hóa tốt nhất là ure

Ngược lại một số loài nấm men không sử dụng được các nitrat như Saccharomyces, Pichia Một số loài có thể đồng hóa N từ không khí nhưng rất ít, do đó phải cung

cấp N từ bên ngoài vào môi trường nuôi dưới dạng acid amin, nấm men dễ dàng hấp thụ, do vậy đây là nguồn N thích hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của chúng Còn nguồn N dưới dạng protein nấm men không hấp thụ vào tế bào mà chúng phải sản sinh ra các protease ngoại bào để thuỷ phân protein thành acid amin và các peptid mạch ngắn, ở dạng này nấm men mới có thể hấp thu được

Các chất khoáng trong môi trường dinh dưỡng cần phải có một lượng nhất

định để đảm bảo cho tế bào phát triển Nếu trong môi trường tổng hợp thì các loại khoáng sau đây cần thiết cho nấm men: K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, MgSO4.4H2O, FeSO4.7H2O, ZnSO4.7H2O, CuSO4.5H2O, CaCl2

Các chất kích thích sinh trưởng thường là các acid amin và vitamin, tế bào nấm men sử dụng các chất này để tạo nguyên sinh chất Nồng độ các vitamin có thể

ảnh hưởng đến qúa trình sinh trưởng và phát triển là 0,01  0,1mg/l Các vitamin quan trọng như B3, B6, B7

Qúa trình dinh dưỡng tế bào nấm men cũng chưa được nghiên cứu rõ Phần lớn đều cho rằng chất dinh dưỡng đi vào trong màng tế bào nấm men theo định luật thẩm thấu (bằng cách khuếch tán) Hướng di chuyển của các chất dinh dưỡng hoà tan trong nước được xác định theo từng chất, phụ thuộc sự chênh lệch nồng độ của chất đó giữa môi trường và tế bào Hiện nay mới biết rằng chất dinh dưỡng đi vào tới nguyên sinh chất phải qua hai vùng là vỏ tế bào và màng nguyên sinh chất, trong

đó vật chắn cơ bản nhất là màng nguyên sinh chất Nhiều nghiên cứu đã chỉ rõ vỏ tế bào có các lỗ nhỏ li ti, chỉ có các chất kích thước phân tử lượng không lớn mới đi qua được, chất có phân tử lượng lớn được enzyme nằm ngay trong thành tế bào trợ giúp Nhiều qúa trình thực hiện trực tiếp ngay trong thành tế bào như quá trình thủy phân sucrose thành glucose và fructose bằng enzyme invertase Các chất không tích

điện như sucrose, acid hữu cơ, acid amin xâm nhập qua màng tế bào bằng cách khuếch tán hay vận chuyển thụ động do sự chênh lệch về nồng độ các chất này giữa

trong và ngoài tế bào Còn các chất dẫn điện như các loại muối khi hoà tan trong nước tạo thành ion và thấm vào tế bào

Quá trình khuếch tán được coi là thụ động, quá trình vận chuyển thụ động thực hiện với sự trợ giúp của hệ thống bơm sinh học trong tế bào để chống lại sự phá vỡ tế bào Khi nồng độ các chất trong tế bào cao làm áp suất thẩm thấu trong tế bào cao hơn môi trường thì nước sẽ liên tục đi vào để làm cân bằng nồng độ đó Nhưng nếu cứ để nước liên tục thấm vào như vậy sẽ dẫn đến phá vỡ tế bào Để chống lại điều đó tế bào phải bơm ion natri ra ngoài Ion natri là chất duy nhất di chuyển vào tế bào bằng cả hai cơ chế thụ động và chủ động Khi ion natri thâm nhập vào tế bào nấm men, nó kéo theo cả sucrose, các acid amin ngay cả khi không

có sự chênh lệch nồng độ các chất này trong tế bào và môi trường Như vậy chỉ có thức ăn được vận chuyển vào trong tế bào mới tham gia vào quá trình trao đổi chất

1.1.2 Các enzyme thuỷ phân glucid đơn giản chủ yếu trong tế bào nấm

nen Saccharomyces cerevisiae

Trong tế bào nấm men có chứa một số enzyme quan trọng có tác dụng xúc tác chuyển hoá các glucid đơn giản được thể hiện trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số enzyme chủ yếu trong tế bào nấm men Saccharomyces có tác

dụng chuyển hoá glucid đơn giản

Glucoamylase (amyloglucosidase) Tinh bột, dextrin, -glucosid

Maltase (-glucosidase) Maltose, sucrose, maltotriose,

p-nitrophenyl- glucosid, melezittose Izomaltase (Oligo 1,6- glucosidase) Isomaltose, sucrose, -methyl glucosid,

p- nitrophenyl- glucosid Invertase (-fructofuranase) Sucrose, rafinose

Melibiase ( -galactosidase) Melibiose, rafibose, p- nitrophenyl-

galactosid

thành ethanol

Do đó tuỳ theo loại nấm men thuộc chi Saccharomyces dùng để nghiên cứu

nuôi cấy sinh tổng hợp loại enzyme nào, thì nên sử dụng cơ chất chuyển hoá tương ứng làm chất cảm ứng Luận án sử dụng tế bào nấm men thuần chủng thuộc chi

Saccharomyces loài cerevisiae để nghiên cứu nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme

invertase có hoạt tính cao Trong trường hợp này ta lợi dụng tính chất quan trọng của enzyme invertase có trong hệ enzyme của tế bào nấm men có khả năng thủy phân sucrose Do đó sẽ chọn sucrose làm chất cảm ứng trong môi trường nuôi sinh tổng hợp enzyme cảm ứng invertase

1.1.3 Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men

Quá trình sinh trưởng và phát triển là đặc tính của nấm men, tế bào nấm men

sẽ tăng kích thước và tăng nhanh khối lượng tế bào, người ta gọi chung là sinh khối Tuy nhiên sinh trưởng và phát triển không phải lúc nào cũng diễn ra đồng thời, nghĩa là số lượng tế bào không phải lúc nào cũng tỷ lệ với sinh khối tạo thành Nhất

là trong môi trường nghèo dinh dưỡng tế bào nấm men vẫn có khả năng sinh sản nhưng kích thước tế bào nhỏ hơn nhiều so với điều kiện đầy đủ dinh dưỡng

Sự sinh trưởng của tế bào nấm men: trong môi trường sống đủ chất dinh dưỡng

và điều kiện nuôi cấy thích hợp thì nấm men vừa tăng nhanh về kích thước, đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều

Nấm men sinh sản chủ yếu bằng cách nảy chồi, nên trong dịch nuôi cấy luôn

có tế bào già Khi chồi non tách ra khỏi tế bào mẹ sống độc lập thì nơi đó để lại vết sẹo mà ở đó không có khả năng tạo chồi mới nữa, cứ như thế tế bào mẹ chuyển thành già

Khi tiến hành nuôi cấy nấm men theo phương pháp tĩnh (nghĩa là trong quá trình nuôi, chất dinh dưỡng được giữ nguyên từ khi bắt đầu nuôi đến khi kết thúc không có sự bổ sung chất dinh dưỡng) tế bào thường phát triển qua 5 giai đoạn:

- Giai đoạn tiềm phát là khoảng thời gian tế bào làm quen với môi trường và

điều kiện mới, chưa sinh sản mà chỉ tăng dần kích thước Pha này được tính từ khi nuôi đến khi tế bào bắt đầu sinh trưởng và phát triển Pha này thời gian dài hay ngắn tùy thuộc tuổi sinh lý nấm men đưa vào nuôi và chất lượng môi trường

Hình 1.2a Tế bào nấm men nảy chồi

để lại sẹo chồi

Hình1.2b Hình dạng tế bào nấm men

- Giai đoạn logarit là khoảng thời gian tế bào phát triển rất nhanh, sinh khối tăng ào ạt kèm theo sự thay đổi mạnh mẽ thành phần dung dịch nuôi Hầu hết tế bào ở trạng thái trẻ, có hoạt tính sinh học cao

- Giai đoạn chậm dần là khoảng thời gian tốc độ sinh trưởng riêng cũng như tốc độ sinh sản của tế bào bị giảm xuống, lượng sinh khối có tăng nhưng ít cho đến khi bước vào thời kỳ sinh trưởng cân bằng của tế bào nấm men

- Giai đoạn ổn định là khoảng thời gian được đánh giá bằng chỉ số về số lượng tuyệt đối của tế bào trong dịch nuôi sinh ra gần bằng số tế bào chết đi, tuy nhiên vẫn có tế bào nảy chồi, tế bào chết nhưng rất ít Chất dinh dưỡng trong môi trường giảm đi rõ rệt, các chất tạo ra do qúa trình trao đổi chất lớn nhất, lượng sinh khối nói chung đạt cao nhất

- Giai đoạn chết hay pha tử vong là khoảng thời gian tốc độ chết của tế bào cao hơn tốc độ sinh sản do số lượng tế bào chết tăng nhanh, tế bào sống giảm dần

và tổng lượng sinh khối cũng giảm do hiện tượng tự phân của tế bào Nguyên nhân của hiện tượng này là do nguồn dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, tế bào bắt

đầu giai đoạn già và sản phẩm trao đổi chất nhiều gây ức chế quá trình trao đổi chất của tế bào

* Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm men

- Nồng độ các chất và áp suất thẩm thấu của môi trường: áp suất thẩm thấu của môi trường phụ thuộc vào hàm lượng đường và các chất hòa tan khác Hàm lượng các chất này trong môi trường nuôi cao hơn trong tế bào Sự chênh lệch này làm cho chất dinh dưỡng hoà tan hơn trong môi trường dễ thấm vào tế bào qua màng Độ chênh lệch càng lớn thì sự tích tụ sinh khối nấm men càng nhanh Tuy nhiên, nếu áp suất môi trường qúa cao sẽ xảy ra hiện tượng làm co nguyên sinh chất của tế bào Vì vậy phải nghiên cứu thành phần môi trường nuôi thích hợp để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm men được tốt nhất

- Nhiệt độ: các phản ứng sinh hoá diễn ra trong tế bào nấm men đều chịu sự chi phối của nhiệt độ Nhiệt độ tối ưu của sự sinh trưởng và phát triển của nấm men trong khoảng 25  300C Khi nhiệt độ giảm, tốc độ phát triển sinh khối của nấm men giảm dần và hoàn toàn bị ức chế ở nhiệt độ 2  50C Khi nhiệt độ tăng quá cao,

sự sinh trưởng của nấm men cũng bị ức chế, ở nhiệt độ  400C các enzyme trong nấm men bị giảm 50% hoạt tính làm sự sinh trưởng phát triển của nấm men ngừng lại, khi đó nấm men bắt đầu chết Khi nhiệt độ khoảng 60  640C nấm men sẽ chết

- Oxy: đối với nấm men, nhu cầu về oxy trong từng giai đoạn sinh trưởng là khác nhau, thời kỳ đầu sinh khối còn ít mà hàm lượng oxy hoà tan còn lớn thì không cần thông khí nhiều Mức độ thông khí sẽ tăng dần theo sự tích lũy sinh khối trong môi trường nuôi Oxy tham gia trực tiếp vào quá trình tổng hợp protein của tế bào, tạo sinh khối và là yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình nuôi Sinh sản của nấm men mạnh nếu môi trường đủ oxy, làm tăng các phản ứng tổng hợp protein của tế bào Lượng oxy cho vào đều và nhanh thì sinh khối tế bào lớn, ít tổn thất đường do quá trình lên men rượu hay sản phẩm phụ khác tạo thành

- pH môi trường: trong quá trình nuôi cấy nếu pH thay đổi thì sinh trưởng, phát triển của tế bào nấm men cũng biến đổi theo Vì vây khi nuôi cấy nấm men phải có sự điều chỉnh pH cho phù hợp Nói chung pH thích hợp cho nấm men phát triển trong khoảng 4  5, pH  2 hoặc  7,5, thì nấm men bị ức chế và ngừng phát triển

- áp suất bên ngoài: nấm men tương đối bền vững với sự thay đổi áp suất bên ngoài nhưng nếu áp suất thay đổi đột ngột đều ảnh hưởng đến trạng thái sinh lý và sinh hóa tế bào

- Tia bức xạ và các chất kích thích: các tia bức xạ cũng có ảnh hưởng lớn đến

sự sinh trưởng và phát triển của nấm men ánh sáng mặt trời làm chậm quá trình phát triển, tia tử ngoại chiếu trực tiếp sẽ tiêu diệt nấm men Tia bức xạ, tia Rơnghen, tia tử ngoại ở mức độ thấp có thể gây đột biến và kích thích tế bào

- Các chất kích thích sinh trưởng như vitamin, nucleotid được nấm men sử dụng để tạo nguyên sinh chất Người ta bổ sung vitamin dưới dạng nước chiết malt, nước chiết giá đậu, nước chiết cao ngô, dịch thủy phân nấm men, rỉ đường

- Các chất độc: những chất độc là chất ức chế hay phá hoại hoạt động sống

của tế bào nấm men, có một số chất độc như toluen, các hợp chất thơm, các dẫn

xuất của paraphin, este, một số acid hữu cơ như acid butylic và các acid khác

1.2 Tổng quan về enzyme invertase trong nấm men và điều kiện sinh tổng hợp enzyme cảm ứng

1.2.1 Giới thiệu về enzyme invertase

Invertase là enzyme cảm ứng, xúc tác thủy phân sucrose thành glucose và fructose Ngoài ra invertase còn có khả năng thuỷ phân một số trisccharid và tetrasaccharid khác, tạo ra các phân tử glucose và fructose Khi trong môi trường có chứa sucrose, ngay lập tức invertase sẽ xúc tác thủy phân ở liên kết glucosid của sucrose

Invertase là một enzyme phổ biến trong nhiều động vật, thực vật và vi sinh vật Nấm men và nấm mốc có khả năng tạo ra invertase hoạt động So với nấm mốc thì nấm men chứa lượng invertase nhiều hơn Vì vậy người ta thường dùng nấm men làm nguồn nguyên liệu sản xuất chế phẩm enzyme này Invertase của nấm mốc và nấm men đều thủy phân sucrose, nhưng cơ chế của chúng hoàn toàn khác nhau Vì vậy trong sản xuất tùy theo yêu cầu mà người sản xuất lựa chọn enzyme invertase sinh ra từ nấm men hay nấm mốc Nếu cho invertase của nấm men vào trong dịch

đường rafinose, trisaccharid, tetrasaccharid thì chúng thủy phân nhưng dùng inveratse của nấm mốc thì không có hiện tượng gì xảy ra

Trong sản xuất invertase từ nấm men, có thể tách nấm men từ bã thải của nhà máy bia là kinh tế hơn cả, do tận dụng được bã thải của sản xuất bia và lượng invertase trong đó cũng lớn hơn nhiều loại nấm men khác 26 Ngoài ra có thể khai thác ở một số nguồn sinh enzyme invertase khác như ở thực vật có trong gạo, khoai lang, củ cải đường, nho, rau diếp, dưa chuột, cây mía, khoai tây Nấm men có

enzyme invertase gồm các chủng Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces uvarum, Schizosaccharomyces pombe, Candida utilis ở nấm mốc có chủng Thermomyces lanuginosus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulan ở vi khuẩn có các chủng Lactobacillus amylovorus, Bifidobacterium

Invertase là enzyme nội bào, enzyme này chỉ thoát ra ngoài môi trường khi màng tế bào bị phá vỡ hoặc tính thấm của màng tế bào bị thay đổi Invertase là enzyme được sinh tổng hợp theo cơ chế cảm ứng, do đó các loại đường đơn có tác dụng kìm hãm quá trình sinh tổng hợp enzyme này ở VSV Vì vậy trong quá trình nuôi nấm men để sản xuất invertase chỉ cần bổ sung một lượng đường đơn vừa phải

để cho nấm men phát triển ban đầu [12], [13]

Enzyme invertase bền trong khoảng pH = 3,5  5,5, hoạt động tốt ở pH = 4,5 Nồng độ đường trong dung dịch có ảnh hưởng lớn tới tính ổn định của invertase Khi nồng độ đường thấp nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của invertase khoảng

550C và enzyme này sẽ bị phá hủy nhanh chóng ở 590C 15 Khi nồng độ dịch

đường lớn thì nhiệt độ thích hợp cho invertase có thể lên tới 65  700C

ảnh hưởng của nồng độ sucrose lên hoạt tính enzyme invertase được thể hiện: hoạt độ tối thích cho sự thủy phân sucrose khi dung dịch có nồng độ 2  10% Hoạt

độ của invertase chỉ còn 1/4 khi nồng độ sucrose tăng lên 70  80% dù trong điều kiện pH tối ưu (pH = 4,5)

Invertase của nấm men rất nhạy cảm với các ion kim loại đặc biệt là ion Ag+,

nó hoàn toàn mất hoạt tính khi có 7  8mgAg+/mol invertase Mipbec giải thích sự mất hoạt tính của invertase là do ion Ag+ liên kết với histidin trong của enzyme Ngoài ra các ion như Cu2+, Cd2+, Hg2+ cũng ảnh hưởng đến hoạt lực invertase nhưng mức độ yếu hơn 28

1.2.2 Tổng quan về quá trình sinh tổng hợp enzyme từ vi sinh vật [21]

Trong tế bào vi sinh vật thường xuyên xảy ra quá trình sinh tổng hợp enzyme cũng như protein, theo một cơ chế phức tạp Trong quá trình này, ngoài các acid amin là nguyên liệu để tổng hợp enzyme còn có acid nucleic, các hợp chất giàu năng lượng, các protein khác tham gia Quá trình tổng hợp enzyme xảy ra ở ribosome do hai dòng hòa lại với nhau là dòng ARNt (ARN thông tin) tới từ nhân tế bào, dòng các acid amin đã được hoạt hóa và nhờ ARNv (ARN vận chuyển) chuyển

đến từ tế bào chất Cơ chế của quá trình sinh tổng hợp được mô tả gồm các giai

đoạn chính sau:

- Hoạt hóa acid amin và truyền thông tin di truyền từ ADN đến ARNt

- Giai đoạn bắt đầu

- Tạo thành liên kết protein

- Kết thúc quá trình tổng hợp

Quá trình sinh tổng hợp enzyme trong tế bào (hình 1.3), phân tử enzyme mới

được tổng hợp, có số lượng và thứ tự sắp xếp các acid amin giống như phân tử protein đặc trưng của tế bào Trong quá trình đó ADN có vai trò rất quan trọng trong việc truyền thông tin từ protein đặc hiệu sang protein mới sinh tổng hợp ADN

là một polynucleotide bao gồm nhiều mononucleotide gắn với nhau theo một trình

tự nhất định Protein là một polypeptide, gồm nhiều acid amin gắn với nhau theo một trình tự nhất định ADN muốn truyền thông tin về trình tự sắp xếp các acid amin trên phân tử protein thì phải có một sự sắp xếp tương ứng nào đó giữa các mononucleotide trên ADN và các acid amin trên protein Sự tương ứng được gọi là

sự mã hóa Các nhà nghiên cứu cho thấy trên ADN có sự hình thành các bộ 3 mã hóa, một tổ hợp gồm 3 nuleotide ứng với 3 bazonitơ cụ thể nào đó Một bộ 3 mã hóa trên ADN qui định trật tự một acid amin trên protein

Mononucleotide Cấu trúc phân tử ADN ATP + acid amin + enzyme

adenin ATP, xác định cấu trúc protein

uridin UTP được tổng hợp ở ribosome

guanin GTP

xitidin XTP ADN Acid amin  AMP

ARNt Truyền thông tin Acid amin  ARNv

Protein enzyme

Hình 1.3 Sơ đồ tổng hợp protein enzyme [22], [23]

1.2.3 Cơ sở và điều kiện sinh tổng hợp enzyme cảm ứng

Không phải tất cả nấm men đều có khả năng sinh enzyme như nhau, ngay cả những chủng cùng một giống cũng không cùng khả năng sinh tổng hợp enzyme Vì vậy phải tiến hành phân lập, tuyển chọn những giống nấm men có khả năng sinh tổng hợp enzyme có hoạt lực cao

Ngày nay dựa vào thành tựu của sinh học phân tử, người ta đã hiểu biết về cơ chế quá trình sinh tổng hợp protein enzyme và cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzyme Người ta có thể làm tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme của nấm men bằng nhiều cách khác nhau và đạt được những hiệu quả nhất định Có thể áp dụng một trong vài phương pháp chính sau 4:

- Thêm chất cảm ứng vào môi trường nuôi nấm men Biện pháp này đã được

sử dụng và có hiệu quả lớn trong kỹ nghệ sản xuất chế phẩm enzyme từ nấm men

- Loại trừ nguồn cacbon trấn áp quá trình sinh tổng hợp enzyme cảm ứng Nhiều tác giả nhận thấy rằng quá trình sinh tổng hợp enzyme cảm ứng có thể bị kìm hãm khi thay nguồn cacbon trong môi trường bằng glucose hoặc một số mono và oligosaccharid khác Sự kìm hãm này cũng thể hiện rõ ngay cả khi đồng thời có chất cảm ứng Hiểu biết cơ chế này có ý nghĩa quan trọng trong kỹ nghệ sản xuất enzyme Định được nguồn cacbon có tác dụng kìm hãm để loại trừ khỏi môi trường,

sẽ làm tăng đáng kể lượng enzyme được tổng hợp

Ribosome

Pyro photsphat vô cơ

- Gây đột biến, tạo ra những biến chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme với số lượng lớn, bằng cách này Kawasaki đã tạo được một biến chủng nấm men có khả năng tổng hợp một lượng lớn invertase, chiếm 2% tổng lượng protein của tế bào

- Gây đột biến ở gen điều hòa làm tăng ái lực của ARN  polymerase với nhiễm sắc thể, do đó làm tăng tốc độ sao chép mã

Loại enzyme được tổng hợp ở tế bào nấm men không chỉ phụ thuộc vào đặc tính sinh lý của nấm men, mà còn phụ thuộc vào thành phần và điều kiện nuôi cấy

Ví dụ: khi nuôi cấy nấm mốc Asp oryzae trên môi trường cám mì theo

phương pháp bề mặt có hàng chục enzyme được tạo thành, trong đó có amylase, proteinase, maltase, pectinase, invertase, ribonuclease… Nếu nuôi nấm mốc này trên môi trường Czapek với tinh bột và nitrat thì chỉ có - amylase được tạo thành, còn các enzyme khác chỉ có dạng vết

Hiện tượng này có thể được giải thích bằng lý thuyết sinh tổng hợp cảm ứng enzyme Hiện tượng này chỉ xảy ra trong môi trường nuôi cấy VSV mà không thấy

ở động vật và thực vật Những enzyme thủy phân của nấm men đa số được tổng hợp theo cơ chế sinh tổng hợp cảm ứng Khi trong môi trường nuôi cấy có một chất khó

đồng hóa, nấm men phải tiết vào môi trường một hoặc một số enzyme tương ứng để phân giải nó thành những chất đồng hóa được

Như vậy muốn sinh tổng hợp được enzyme cảm ứng cần phải có 4 điều kiện:

- Có gen tương ứng trong nhiễm sắc thể của tế bào

- Có đầy đủ cơ chất tương ứng để xây dựng các phân tử enzyme đó

- Năng lượng cần thiết dùng cho việc tổng hợp enzyme

- Chất cảm ứng Nếu không có chất cảm ứng thì dù có đủ 3 điều kiện trên cũng không thể sinh tổng hợp được enzyme

Có thể khẳng định chất cảm ứng là điều kiện cần thiết để thu được enzyme mong muốn Tùy mục đích nghiên cứu cũng như công nghệ sản xuất enzyme, cần phải lựa chọn những chất cảm ứng thích hợp và xác định nồng độ tối ưu của nó trong môi trường nuôi để có hiệu suất sinh tổng hợp enzyme cao nhất

1.3 Tổng quan về cố định tế bào vi sinh vật

1.3.1 Đặc điểm, lợi ích và ứng dụng của tế bào cố định

Cố định tế bào được hiểu là sự giam giữ hoặc định vị các tế bào trong một không gian phản ứng sao cho chúng bảo toàn được đặc tính xúc tác sinh học và giữ cho được khả năng sống của chúng để các tế bào đó có thể tái sử dụng nhiều lần hoặc liên tục để sản xuất sản phẩm mong muốn 77

Tế bào VSV là nguồn dự trữ tự nhiên và sinh tổng hợp mạnh mẽ các chất có hoạt tính sinh học như: enzyme, vitamin, acid amin và các chất hormon sinh trưởng Việc cố định tế bào có ý nghĩa quan trọng, đặc biệt khi enzyme cần nghiên cứu có

độ ổn định thấp, khi mà việc tách và tinh chế enzyme là không cần thiết và tốn kém, khi mà hoạt động của enzyme được tách ra thấp hơn so với enzyme nội bào hoặc khi cần thực hiện các quá trình gồm nhiều phản ứng enzyme kế tiếp nhau hoặc có thể thực hiện từng phản ứng xúc tác riêng biệt

Tế bào VSV cố định có phổ hoạt động rộng hơn so với phổ hoạt động của enzyme cố định Các quá trình hóa học do tế bào cố định thực hiện dễ hơn so với enzyme cố định thực hiện Người ta cho rằng tế bào VSV được cố định sẽ giúp giải quyết nhiều qui trình công nghệ mới chưa có tiền lệ và có ý nghĩa về kinh tế ở qui mô sản xuất công nghiệp

Đặc điểm của tế bào cố định

Khi sử dụng enzyme trong tế bào cố định để xúc tác cho phản ứng sinh học, sẽ

có những mặt tích cực rất có ý nghĩa về mặt kỹ thuật, công nghệ cũng như hiệu suất

được biểu hiện qua những ưu thế và hạn chế sau:

Enzyme trong tế bào cố định sẽ ổn định hơn enzyme tự do khi tế bào được gắn trên chất mang polyme tự nhiên Bởi lẽ chất mang đã góp phần hạn chế và bảo vệ tế bào khỏi bị tác động của các yếu tố cơ học, hoá học, ánh sáng và đó cũng chính là hạn chế các yếu tố ảnh hưởng không có lợi đến enzyme

Không đòi hỏi công đoạn tách chiết và tinh chế enzyme ra khỏi tế bào Đây là lợi thế rất quan trọng, bởi lẽ quá trình tách chiết và tinh chế enzyme phải trải qua nhiều công đoạn cơ bản phá vỡ vỏ tế bào, dung dịch huyền phù được ly tâm tách hết phần cặn rắn trong dịch, tiếp theo kết tủa enzyme và tinh chế enzyme Đó là những công đoạn công nghệ cao, đòi hỏi thiết bị và hoá chất tinh khiết Trải qua hàng loạt công đoạn tách và tinh chế phần nào đã làm giảm hoạt độ enzyme, giá thành chế phẩm cao Nhưng chỉ khi công nghệ cố định enzyme và tế bào được tìm ra, đã tạo ra giải pháp kỹ thuật rất lớn trong công nghệ enzyme, đó là sử dụng enzyme xúc tác

đúng mục đích công nghệ song không cần phải tách chiết enzyme

Có khả năng thực hiện các quá trình gồm nhiều phản ứng enzyme kế tiếp nhau Bởi vì tế bào VSV có chứa rất nhiều enzyme, vấn đề đặt ra là cần khai thác loại enzyme nào có trong VSV để chủ động điều khiển các điều kiện tối ưu trong quá trình nuôi cấy Với biện pháp đó sẽ chủ động tạo ra được tế bào của nhiều VSV, thậm chí trong cùng một chủng có hoạt tính enzyme khác nhau, đem tiến hành cố

định chúng riêng rẽ, mỗi loại xúc tác cho một phản ứng kế tiếp nhau trong quá trình sản xuất sản phẩm mong muốn

Có khả năng sử dụng liên tục hoặc nhiều lần theo chu kỳ, tăng hiệu suất của các lò phản ứng sinh học Bởi lẽ các phản ứng hoá học được thực hiện trong tế bào

là thực hiện trong cơ thể sống, do đó nó có đặc điểm rất tuyệt vời đó là enzyme nội bào trong quá trình thực hiện xúc tác phản ứng không bị phân hủy Khi phản ứng xúc tác kết thúc, chúng được tự do và tiếp tục tiếp xúc với phân tử cơ chất mới Khi hoạt lực enzyme bị suy giảm ta có thể phục hồi lại hoạt động sống cho tế bào, theo

đó hoạt lực enzyme được khôi phục lại để tiếp tục sử dụng Điều đó ắt sẽ dẫn đến tăng hiệu suất phản ứng sinh học

Ngoài những ưu thế cơ bản nói trên, tuy nhiên tế bào cố định cũng có những hạn chế như: protease có mặt trong tế bào có thể gây ra hiện tượng thủy giải đối với enzyme mà ta quan tâm Tế bào cố định có khả năng xảy ra phản ứng phụ không

đặc hiệu do tác động của hoạt động sinh lý và sinh hoá tế bào, có thể gây cản trở quá trình khuếch tán của cơ chất và cản trở này khó đánh giá về mặt định lượng và

có sự giảm hoạt độ riêng của enzyme

Lợi ích của tế bào cố định 35

Tế bào cố định cho phép thay thế quá trình lên men gián đoạn bằng lên men liên tục, cho phép thiết bị lên men gián đoạn hoạt động theo nguyên tắc tháo khô và

đổ đầy Tế bào cố định tạo ra mật độ tế bào lớn trong thiết bị lên men, rút ngắn thời gian lên men, làm tăng năng suất Dùng tế bào cố định sẽ tạo điều kiện cho việc tách tế bào ra khỏi môi trường lên men một cách dễ dàng và chủ động thu hồi để tái

sử dụng lại sinh khối tế bào

Tế bào cố định tạo ra một gradien nồng độ cơ chất, nồng độ các sản phẩm, nồng độ oxy hòa tan và pH ở ngay trong một tập hợp tế bào, do đó có thể tạo ra các môi trường khác nhau cho sự hoạt động của tế bào VSV Tế bào cố định cho phép

sử dụng tế bào ở một pha riêng biệt với môi trường lên men, có thể bảo vệ quá trình lên men chống lại sự nhiễm tạp và tạo điều kiện cho việc phân vùng số lượng tế bào trong từng bộ phận của thiết bị đối với các chủng VSV khác nhau Tế bào cố định cho phép điều khiển tốc độ sinh trưởng của VSV trong các hệ thống hoạt động liên

tục mà không phụ thuộc vào tốc độ pha loãng và quan trọng là cho phép hoạt hóa và bảo quản tế bào dùng để lên men tiếp

Một số ứng dụng của tế bào cố định 29, [79], 97, 106

Tế bào cố định được ứng dụng tập trung chủ yếu trong một số lĩnh vực như: Trong sản xuất dược phẩm tế bào cố định được dùng để chuyển hóa steroid, sản xuất các kháng nguyên dòng vô tính, sản xuất vacxin phòng chữa bệnh

Trong công nghiệp thực phẩm tế bào cố định được dùng để biến đổi sucrose thành glucose và fructose, Thủy phân tinh bột thành glucose, Tổng hợp các acid amin tự do, sản xuất cồn, rượu, bia trong lĩnh vực lên men, sản xuất enzyme làm chế phẩm trong sản xuất thực phẩm

Trong ngành sản xuất hóa chất tinh khiết tế bào cố định được dùng để sản xuất các - ketoacid dùng trong công nghiệp, thực hiện các phản ứng khử nhờ kỹ thuật cố định tế bào, sản xuất aceton, butanol

Trong ngành hóa phân tích, tế bào cố định được dùng để sản xuất tế bào cảm ứng sinh học, phân tích hormon và các chất có ảnh hưởng tới sự trao đổi chất của tế bào, phân tích một số chất hóa học đặc trưng, đếm nhanh tế bào, phân tích sắc ký hấp phụ

Trong các ngành khác tế bào cố định được dùng trong công nghệ môi trường

để xử lý nước thải hữu cơ, trong y học để nuôi cấy invitro

Trong hóa sinh học tế bào cố định được dùng để phân cắt chọn lọc các polyme sinh học, nuôi cấy và nghiên cứu đặc tính sinh lý của tế bào

1.3.2 Phương pháp cố định tế bào

- Phương pháp gắn tế bào vào bề mặt chất mang không tan 37, [70]

Gắn tế bào vào chất mang không tan bằng: liên kết hấp phụ được coi là phương pháp cổ điển nhất và đơn giản nhất làm cho tế bào bám vào bề mặt của chất mang không tan trong nước Qúa trình hấp phụ của tế bào lên bề mặt chất mang là quá trình vật lý có sự tham gia của một số lực liên kết Đó là tác dụng qua lại của các lực liên kết ưa nước, liên kết hydro và liên kết ion khác cực Phương pháp này

có thể sử dụng chất mang có cấu trúc xốp như: PVC, mạt cưa, gạch… Phương pháp này có ưu điểm đơn giản, ít ảnh hưởng tới cấu hình của chất xúc tác sinh học của tế bào Tuy nhiên lại có một vài nhược điểm như liên kết hấp phụ tương đối yếu, tế bào dễ bị phản hấp phụ khi có sự thay đổi về nhiệt độ, pH, đặc biệt là sự thay đổi về nồng độ ion hay nồng độ cơ chất Vì vậy khi áp dụng phương pháp này cần chú ý

đến điều kiện phản ứng

Gắn tế bào vào chất mang không tan bằng: liên kết đồng hóa trị, được biểu hiện qua những đôi điện tử góp chung tạo nên mối liên kết tương đối bền giữa chất mang và tế bào Mối liên kết ở đây có thể được thực hiện qua liên kết trực tiếp giữa chất mang và nhóm thành phần có trong tế bào Phương pháp được thực hiện bằng cách cho chất mang vào dịch huyền phù tế bào và khuấy một thời gian để tạo điều kiện cho việc hình thành liên kết giữa chất mang và tế bào Nhược điểm của phương pháp này là chất xúc tác sinh học phải chịu sự tác động cơ học dẫn đến dễ thay đổi hình dạng, cấu trúc và hoạt lực sinh học

Gắn tế bào vào chất mang không tan bằng: liên kết ion, phương pháp dựa vào nguyên lý lực hút tĩnh điện giữa các nhóm tích điện trái dấu nhau của chất mang và

tế bào Phương pháp được áp dụng từ lâu do kỹ thuật đơn giản, chỉ cần cho chất mang vào dung dịch hoặc dịch huyền phù tế bào và khuấy một thời gian, hoặc cho dịch tế bào chảy qua chảy lại chất mang Chất mang được sử dụng cho phương pháp này là chất trao đổi ion DEAE cellulose, DEAE - sephadex, CM- cellulose, CM- sephadexs Sau khi dùng một thời gian nếu lực hấp thụ giảm thì có thể phục hồi bằng cách tái sinh Phương pháp này có ưu điểm dễ thực hiện và có thể tái sử dụng lại chất mang nhiều lần

- Phương pháp liên kết chéo dòng 16

Là phương pháp sử dụng các chất có khả năng tạo cầu nối đôi để nối giữa tế bào và chất mang hoặc nối các tế bào với nhau tạo ra những đại phân tử không tan trong nước Chất tạo cầu nối đôi được dùng phổ biến hiện nay là glutaraldehyd Phương pháp này có ưu điểm là dễ tiến hành nhưng có nhược điểm là do tế bào nằm sâu trong chất mang nên cản trở việc hấp thụ cơ chất trong trường hợp cơ chất có phân tử lượng lớn hay trong trường hợp dung dịch có nồng độ thấp dễ dẫn đến sự thay đổi hình dạng tế bào làm giảm hoạt lực enzyme của chúng

- Phương pháp bao bọc trong lỗ xốp 37, 87, 111

Phương pháp bao bọc trong lỗ xốp được thực hiện bằng cách sử dụng các chất polyme tự nhiên hay tổng hợp có khả năng tạo gel để bao bọc tế bào Phương pháp này đòi hỏi chất mang sau khi trùng hợp phải có cấu trúc mạng lưới đủ nhỏ để giữ

tế bào ở bên trong và có kích thước đủ lớn để cơ chất và sản phẩm có thể khuếch tán qua Phương pháp này rất thích hợp cho việc cố định tế bào sống hoặc mô tế bào hoạt động của động vật và thực vật Đây là phương pháp đang được áp dụng phổ biến hơn cả do có những ưu điểm như tạo được mật độ tế bào cao, nên có thể đưa vận tốc phản ứng tăng nhanh Độ bền cơ học tương đối cao, cho phép thiết bị lên

men hoạt động liên tục với năng suất cao, cho phép tế bào vẫn phân chia trong chất mang, khả năng giữ tế bào lớn Có thể cố định tế bào một cách chủ động, có khả năng định vị trí và mật độ tế bào VSV một cách dễ dàng Có thể áp dụng một qui trình cố định cho nhiều loại VSV khác nhau

Các phương pháp cố định tế bào được minh hoạ trên hình 1.4

Hình 1.4 Minh hoạ các phương pháp cố định tế bào [8]

1.4 Tổng quan về chất mang alginat cố định tế bào

Yêu cầu đối với chất mang

Chất mang có tính quyết định đến chất lượng của quá trình cố định tế bào VSV Do vậy tùy thuộc mục đích sử dụng tế bào cố định vào từng lĩnh vực công nghệ, đòi hỏi những yêu cầu ở mức độ khác nhau đối với chất mang Song chung nhất chất mang được sử dụng để cố định tế bào phải thỏa mãn một số yêu cầu sau: Chất mang phải tạo điều kiện tốt cho tế bào phát triển, bảo vệ tế bào khỏi bị tác động của các yếu tố cơ học và ánh sáng Chất mang có tính tan trong nước, hoặc không tan nhưng khi đã trở thành chất cố định tế bào thì không được tan, để không

làm rửa trôi, thất thoát tế bào vào môi trường, vì đa số các phản ứng sử dụng tế bào

cố định đều xảy ra trong môi trường có sự tham gia của nước Chất mang ít bị thay

đổi về tính chất cơ lý khi môi trường và công nghệ thay đổi và phải trơ về mặt hóa học đối với các chất tham gia phản ứng và sản phẩm tạo thành khi vai trò xúc tác của tế bào tạo ra Chất mang phải có diện tích bề mặt rộng (hoặc diện tích bề mặt riêng lớn) tính trên một đơn vị thể tích hay khối lượng Rẻ tiền, dễ kiếm, dễ sản xuất và không độc hại

Để tiến hành cố định tế bào VSV nhất là ứng dụng trong sản xuất thực phẩm, người ta sử dụng nhiều loại chất mang là các polyme nguồn gốc tự nhiên, tổng hợp không độc, đa điện tích Trong đó phải kể đến loại chất mang có nguồn gốc thủy sản được sử dụng khá phổ biến hiện nay đó là alginat

- Xuất sứ và công dụng của alginat

Năm 1881 lần đầu tiên Nhà hóa học người Anh E C Stanford tách chiết được

alginat từ rong nâu (Laminaria stenophyllum) Năm 1927 Thornley sản xuất alginat

thương mại phục vụ cho sản xuất đồ hộp tại San Diego Hoa Kỳ ở Anh, alginat được sản xuất lần đầu vào năm 1934 tại công ty Alginat Industries Ltd Đến năm 1979, công ty Alginat Industries Ltd của Anh sáp nhập vào chi nhánh Kelco Division của công ty Merk ở Hoa Kỳ và trở thành công ty hàng đầu về sản xuất alginat, chiếm

70% sản lượng alginat thế giới 55, [86] Năm 1995, công ty Merk bán công ty

Kelco cho Monsanto [24], [95] Ngoài ra còn phải kể đến các công ty như Protan A/S của Nauy, rồi của Pháp, Nhật Bản và Trung Quốc Tổng cộng có khoảng 17 nhà máy ở 9 quốc gia trên thế giới sản xuất alginat cung cấp cho thị trường

Tuỳ theo mỗi nước, alginat được sản xuất từ các loại rong nâu khác nhau 32 Song nhìn chung, có hai qui trình chính để sản xuất alginat: đó là qui trình acid hóa

và qui trình canxi hóa, được minh họa trên hình 1.5 Tuỳ theo điều kiện sản xuất cụ thể người ta chọn qui trình phù hợp

Rong nâu

Xử lý sơ bộ Rửa Nấu chiết trong kiềm Dịch chiết alginat Pha loãng Lọc thô

Sục bọt Lọc tinh

A Quy trình canxi hóa B Qui trình acid hóa

(Ethanol, NaOH, NaOCl)

Hình 1.5 Sơ đồ qui trình công nghệ sản xuất alginat natri [89]

Alginat ở trong rong nâu phần lớn dưới dạng muối của các cation hóa trị hai không hoà tan như Ca2+, Mg2+ Vì vậy cần phải xử lý acid để chuyển alginat sang dạng acid alginic [36], [38], [39], [68] Sau đó nấu chiết trong dung dịch kiềm

Na2CO3, acid alginic sẽ trao đổi ion và trở thành dạng alginat natri hoà tan vào dung dịch Sau đó lọc sạch cặn bã rong không tan, ta sẽ thu được dịch chứa alginat natri Sau đó là tách nước ra khỏi dung dịch để thu được alginat natri Do vậy có hai qui trình tách nước khác nhau: một qui trình tách alginat ở dạng muối alginat canxi không tan, một qui trình tách alginat ở dạng gel acid alginic kết tủa Nhưng sau đó qui trình canxi hóa vẫn phải chuyển alginat canxi sang dạng acid alginic Như vậy hai qui trình chỉ khác nhau ở khâu canxi hóa Sở dĩ phải dùng thêm khâu canxi hóa

là vì alginat canxi dễ ép tách nước hơn acid alginic

Tuỳ theo từng lĩnh vực mà alginat được ứng dụng với vai trò làm chất gây

đông đặc dung dịch, chất làm bền huyền dịch và nhũ dịch, chất làm tăng tính tạo gel hay tăng tính tạo màng Do sự đa dạng về tính chất, dẫn đến ứng dụng của alginat rất phong phú [34], [40], [48], [71], [74], [78], [85], [92] ứng dụng được quan tâm và đáng chú ý nhất hiện nay, cũng là phần ứng dụng của luận án là sử dụng alginat làm chất mang để cố định tế bào, một xu hướng đang được các nhà công nghệ sinh học trên thế giới cũng như trong nước hết sức quan tâm Trong lĩnh vực công nghệ sinh học alginat canxi được sử dụng để cố định nhiều loại tế bào sống khác nhau như nấm men, tế bào động vật có vú [41], [48], [49], [56], [58], [65], [76], [80] Một số ứng dụng điển hình của chất mang alginat trong cố định tế bào được trình bày trên bảng 1.2

Mặc dù việc ứng dụng của alginat khá đa dạng, nhưng kỹ thuật chuẩn bị lại khá đơn giản Qui trình chung là trộn dung dịch alginat natri với dịch huyền phù chứa tế bào cần cố định Nhỏ từng giọt hỗn dịch này xuống dung dịch tạo gel như CaCl2 Các hạt gel alginat canxi sẽ hình thành có dạng hình cầu Trong mỗi hạt gel, tạo thành một mạng lưới bao quanh tế bào Cấu trúc hạt gel như vậy sẽ tạo thành các lỗ xốp, thuận tiện cho việc khuếch tán cơ chất đi vào vào sản phẩm ra khỏi hạt gel Bằng cách này người ta có thể dễ dàng khống chế các phản ứng, tách sản phẩm

ra khỏi thiết bị phản ứng và sản xuất liên tục [102]

Alginat được sử dụng khá rộng rãi vì chuẩn bị dung dịch cho việc cố định, không độc hại với tế bào, độ bền cơ học khá tốt, độ xốp thuận lợi cho việc khuếch tán Chính vì vậy luận án chọn alginat natri làm chất mang để cố định tế bào nấm

men S cerevisiae có hoạt tính invertase

Bảng1.2 Một số ứng dụng của alginat trong cố định tế bào [103]

Loại tế bào được cố định Sản phẩm/mục đích

Amonia

Nấm (Fungi)

Kluyveromyces bulgaricus Hydrolysis of whey

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces bajanus

Ethanol Champagne

Tảo (Algae)

Tế bào thực vật (Plant cells)

Ceel kandinling, microscopy

Tế bào động vật có vú (Mammalian cells)

Interfron - 

- Cấu trúc và tính chất hoá học của alginat

Alginat là tên gọi chung họ các muối của acid alginic, đó là một polyme mạch thẳng được tạo từ 2 gốc monome là acid -D-mannuronic (M) và acid -L-guluronic (G) liên kết với nhau bằng liên kết 1-4 glucosid (Hình 1.6) Theo quan niệm hiện đại, hai gốc uronic đó có cấu tạo dạng ghế nhưng cấu hình khác nhau, acid mannuronic có cấu hình 4C1, còn acid guluronic có cấu hình 1C4. Như vậy trong cả hai cấu hình, nhóm carboxyl đều gắn vào vòng pyranose ở vị trí xích đạo [93]

Hình 1.6 Cấu hình của hai gốc monome trong phân tử acid alginic

Nhưng sự kết hợp này không phải ngẫu nhiên mà thành 3 block như sau [60], [61], [63]:

- Block homopolymannuronic gồm các gốc acid mannuronic: M-M-M-M-M

- Block homopolyguluronic gồm các gốc acid guluronic: G-G-G-G-G

- Block luân hợp hai acid mannuronic và guluronic: M-G-M-G-M-G

Chuỗi polyG có dạng gấp nếp còn chuỗi polyM có dạng phẳng (Hình 1.7)

Hình 1.7 Cấu trúc các block polyG, polyM và polyGM

trong phân tử alginat [116]

Như vậy, alginat được xem như là một copolyme block Độ dài trung bình của mạch phân tử, độ dài của mỗi block, tỷ lệ và trình tự kết hợp của chúng với nhau là khác nhau tuỳ theo nguồn gốc của alginat [59], [63], [67], [88] Chính cấu trúc đặc thù này qui định tính chất khác nhau của alginat khi kết hợp với các cation đa hóa trị [54], [62] Nếu chiết rút cẩn thận có thể thu được alginat có độ polyme hóa đến 10.000 đơn vị [105]

- Một số tính chất quan trọng của alginat

Acid alginic không tan trong nước nhưng nó có khả năng hấp thụ một lượng nước lớn, trương nở và tạo thành bột nhão Ngược lại, alginat natri và các muối K+,

NH4+, (CH2OH)3NH4 của alginat tan trong nước tạo thành dung dịch có độ nhớt cao Alginat có khối lượng phân tử trung bình càng lớn thì độ nhớt dung dịch của nó càng lớn Độ nhớt dung dịch alginat còn phụ thuộc vào nhiệt độ Khi nhiệt độ tăng

độ nhớt của alginat giảm khoảng 2,5%/10C, khi làm nguội, độ nhớt quay về giá trị thấp hơn ban đầu một ít Tuy nhiên, nếu giữ ở nhiệt độ 500C trong nhiều giờ thì sẽ làm alginat bị cắt mạch và giảm độ nhớt Ngược lại, khi hạ nhiệt độ đến khi đông

đặc và sau đó rã băng sẽ không làm alginat bị giảm độ nhớt Độ nhớt của dung dịch alginat không bị ảnh hưởng trong khoảng pH = 5 11 ở pH < 5, các ion -COO- bắt

đầu bị proton hóa tạo thành -COOH, do đó lực đẩy tĩnh điện giữa các chuỗi bị giảm,

chúng trở nên gần nhau hơn và tạo liên kết hydro, làm tăng độ nhớt [68], [86] Khi

pH bị giảm từ 3 đến 4 sẽ tạo thành gel Nếu alginat có chứa một ít ion Ca2+, sự tạo gel còn sớm hơn nữa ở pH = 5 Nếu pH giảm nhanh từ 6 xuống 2, sẽ tạo thành kết tủa của acid alginic Khi pH trên 11, alginat sẽ bị depolyme hóa từ từ và làm giảm

độ nhớt Liên kết glycosid rất nhạy cảm bởi cả acid và kiềm, do đó dưới các điều kiện thuận tiện cho thủy phân, alginat sẽ bị cắt mạch nhanh chóng Ngoài ra, tác dụng oxy hóa bởi các gốc tự do cũng làm dung dịch alginat bị giảm độ nhớt [104] Bột alginat natri khô, ở nhiệt độ thường cũng sẽ bị cắt mạch và giảm khối lượng phân tử chỉ sau vài tháng Nếu bảo quản alginat ở nhiệt độ thấp và nơi tối thì

độ dài mạch sẽ duy trì được lâu hơn Nếu làm đông có thể bảo quản alginat được vài năm mà không làm giảm đáng kể khối lượng phân tử

Một tính chất quan trọng của alginat là có khả năng tạo gel khi phản ứng với các cation hoá trị 2 và 3 Các gel này được hình thành trong khoảng nhiệt độ phòng cho đến 1000C và gel không tan chảy khi đun nóng Gel cation alginat đặc biệt là gel alginat canxi được ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp khác nhau, [40], [47], [81], [82], [96], [99], [100], [114] Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về

sự tạo gel alginat canxi, mô hình được chấp nhận rộng rãi hiện nay là mô hình tạo gel dạng vỉ trứng (egg-box model) được minh họa trên hình 1.8 [73], [86]

Do cấu hình đặc biệt của đoạn mạch GGG, tạo thành dạng gấp nếp như một cái vỉ trứng Khoảng không gian tạo thành giữa các vỉ khi xếp lên nhau tương tự như chỗ đặt quả trứng, đặc điểm đặc sắc ở đây là kích thước của khoảng trống này khá phù hợp với kích thước của ion Ca2+ Ion strontium có kích thước lớn hơn nên có liên kết mạnh hơn, còn ion magnesium có kích thước bé hơn nên không tạo gel [72], [86] Aí lực của các ion đối với alginat theo thứ tự như sau:

Pb2+>Cu2+>Cd2+>Ba2+>Sr2+>Ca2+>Co2+ [103]

Hình 1.8 Sự tạo gel của block polyG mô hình “vỉ trứng” [25], [73], [86]

Sự liên kết của ion canxi với nhóm chức của alginat cụ thể như thế nào đến nay còn nhiều tranh luận Trước đây, người ta cho rằng ion canxi chỉ liên kết với hai nhóm carboxyl của hai gốc guluronic nằm trên hai đoạn mạch khác nhau nhưng gần

đây, một số công trình nghiên cứu sâu hơn cho thấy còn có cả liên kết của Ca2+ với các nhóm hydroxyl [107], [113] Một cách tổng quát, có thể nói độ đàn hồi của gel alginat canxi phụ thuộc vào số lượng và độ bền của các liên kết ngang, vào chiều dài và độ bền của các chuỗi tham gia liên kết Khi khối lượng phân tử lớn, độ đàn hồi của alginat canxi không phụ thuộc vào khối lượng phân tử [83], [84] Khi nghiên cứu gel alginat canxi, người ta nhận thấy mô đun đàn hồi phụ thuộc mạnh vào thành phần và trình tự sắp xếp của các gốc uronat Alginat có block G nhiều hơn và dài sẽ cho gel bền hơn [53] Mô đun đàn hồi còn phụ thuộc vào loại ion tạo liên kết ngang, ái lực giữa cation liên kết ngang và polyme càng lớn thì gel càng bền Độ bền gel alginat canxi còn phụ thuộc vào thời gian và các yếu tố môi trường [91]

1.5 Giới thiệu về hỗn hợp đường khử

Hỗn hợp glucose – fructose còn được gọi là đường nghịch đảo hay isosyrup

16, [17], 31 Glucose và fructose trong dung dịch tồn tại chủ yếu ở dạng vòng

Glucose là monosaccharid phổ biến trong cơ thể động, thực vật, vốn có nhiều trong quả nho chín nên còn gọi là đường nho Dung dịch làm quay mặt phẳng phân cực sang phải nên glucose còn có tên là dextrose Glucose trong dung dịch tồn tại chủ yếu ở dạng pyranose D-glucose là thành phần cấu tạo của nhiều loại polysaccharid quan trọng như tinh bột, cellulose, glycogen, maltose, lactose Trong cơ thể người và động vật, glucose là thành phần của máu Đưa glucose vào máu người bệnh sẽ làm phục hồi sức khỏe nhanh chóng vì glucose là monosaccharid

được cơ thể hấp thụ dễ dàng nhất

Fructose là một dạng đồng phân của glucose, có nhiều trong quả, mật hoa, mật ong Nó làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực sang trái nên còn có tên là levulose D-fructose là thành phần disaccharid sucrose và các polyfructosid thường gặp trong thực vật Fructose thường tồn tại dưới dạng furanose và dễ dàng bị lên men bởi nấm men

Trong các loại glucid thì glucose và fructose dễ tiêu hóa nhất vì chúng có thể hấp thụ trực tiếp qua màng ruột, không chuyển hóa trong cơ thể qua con đường insulin, do đó không gây bệnh tiểu đường, có mùi thơm ngon hơn, không có hiện tượng kết tinh trở lại, nguyên liệu sản xuất phong phú và rẻ tiền

Các loại đường đều có vị ngọt, trong thành phần của chúng đều có các nhóm gây ngọt: – CH2OH, - CO, - CHOH Sucrose được coi là chất ngọt tiêu chuẩn, so với độ ngọt của sucrose 100%, thì các đường khác có độ ngọt như sau: glucose 75%, fructose 173%, hỗn hợp glucose/fructose tỷ lệ 55/45 độ ngọt 100%, còn tỷ lệ 45/55 độ ngọt 120%, tỷ lệ 50/50 độ ngọt 132%

Hiện nay, sản lượng hỗn hợp glucose – fructose trên thị trường thế giới khoảng trên 8 triệu tấn/năm (1986) và hàng năm tăng khoảng 20  30% Chúng

được sử dụng phổ biến trong sản xuất thực phẩm đặc biệt trong sản xuất nước giải khát (hãng Coca Cola và Pepsi sử dụng 100% hỗn hợp glucose – fructose trong sản xuất các loại nước giải khát) Dùng glucose – fructose trong sản xuất bánh kẹo (đặc biệt bánh kẹo mềm), kem, đồ hộp sẽ làm tăng chất lượng sản phẩm Ngày nay hỗn