Nghiên cứu cố định tế bào nấm men saccharomyces cerevisiae sinh enzyme invertase có hoạt tính cao bằng alginat để thủy phân sucrose thu đường khử

1 Bộ giáo dục đào tạo trường đại học NHA TRANG TRầN DANH GIANG nghiên cứu cố định tế bào nấm men saccharomyces cerevisiae sinh enzyme invertase có hoạt tính cao alginat để thuỷ phân sucrose thu đường khử luận án tiến sĩ kỹ thuật Nha Trang, 2006 Bộ giáo dục đào tạo trường đại học NHA TRANG -Trần Danh Giang nghiên cứu cố định tế bào nấm men saccharomyces cerevisiae sinh enzyme invertase có hoạt tính cao alginat để thuỷ phân sucrose thu đường khử Chuyên ngành: Công nghệ sản phẩm từ thịt cá Mã số: 2.11.04 luận án tiến sĩ kỹ thuật người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Thị Luyến TS Lâm Ngọc Trâm Nha Trang, 2006 LờI CAM ĐOAN xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu kết nêu luận án trung thực chưa công bố công trình khác Tác giả luận án LờI CảM ƠN Để hoàn thành luận án Trước hết xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Khoa Chế biến, Viện Công nghệ sinh học Môi trường, Phòng Đào tạo Đại học Sau Đại học Trường Đại học Nha Trang kính trọng, tự hào biết ơn học tập, đào tạo nghiên cứu trường năm qua Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc cô: PGS.TS Trần Thị Luyến - Phó Hiệu trưởng- Trường Đại học Nha Trang TS Lâm Ngọc Trâm - ủy viên thường vụ Hội KHKT tỉnh Khánh Hòa tận tình hướng dẫn suốt trình thực luận án Xin chân thành cảm ơn: GS.TS Nguyễn Trọng Cẩn - Khoa Chế biến- Trường Đại học Nha Trang, GS.TS Nguyễn Thị Hiền - Đại học Bách Khoa Hà Nội, TS Đỗ Văn Ninh- Trưởng khoa Chế biến - Trường Đại học Nha Trang, TS Ngô Đăng Nghĩa, Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học Môi trường- Trường Đại học Nha Trang, TS Vũ Ngọc Bội - Trưởng môn Quản lý chất lượng An toàn thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang, TS Trang Sĩ Trung, TS Nguyễn Thị Nga, Ths Nguyễn Minh Trí, KS Lê Đình Đức- Bộ môn Quản lý chất lượng & An toàn thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang thầy cô phản biện cho lời khuyên quí giá để luận án hoàn thành có chất lượng Cảm ơn thầy cô giáo Khoa chế biến, cán nghiên cứu Viện CNSH&MT, cán chuyên viên Phòng Đào tạo Đại học Sau Đại học Trường đại học Nha Trang, bạn bè đồng nghiệp gia đình chia sẻ, hỗ trợ nhiều mặt tạo điều kiện cho trình nghiên cứu Mục lục Trang Danh mục chữ viết tắt luận án DANH MụC CáC HìNH Vẽ, Đồ THị Mở ĐầU Chương TổNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm men Saccharomyces cerevisiae i ii 3 1.1.1 Tổng quan thành phần cấu tạo, dinh dưỡng trao đổi chất tế bào nấm men 1.1.2 Các enzyme thuỷ phân glucid đơn giản chủ yếu tế bào nấm nen S cerevisiae 1.1.3 Quá trình sinh trưởng phát triển nấm men 1.2 Tổng quan enzyme invertase nấm men điều kiện sinh tổng hợp enzyme cảm ứng 1.2.1 Giới thiệu enzyme invertase 1.2.2 Tổng quan trình sinh tổng hợp enzyme từ vi sinh vật 1.2.3 Cơ sở điều kiện sinh tổng hợp enzyme cảm ứng 1.3 Tổng quan cố định tế bào vi sinh vật 1.3.1 Đặc điểm, lợi ích ứng dụng tế bào cố định 1.3.2 Phương pháp cố định tế bào 1.4 Tổng quan chất mang alginat cố định tế bào 1.5 Giới thiệu hỗn hợp đường khử 1.6 Một số nghiên cứu nước liên quan đến luận án 1.6.1 Nghiên cứu enzyme invertase 1.6.2 Nghiên cứu cố định tế bào nấm men S cerevisiae ứng dụng 10 12 12 14 15 16 16 19 21 28 34 34 35 1.6.3 Nghiên cứu sử dụng invertase tế bào nấm men S cerevisiae có hoạt tính invertase cố định để thủy phân sucrose Chương ĐốI TƯợNG Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2 Các phương pháp phân tích hoá học 2.3 Phương pháp nuôi cấy tế bào nấm men 2.4 Phương pháp cố định tế bào nấm men 2.5 Sơ đồ tổng hợp vấn đề nghiên cứu 2.6 Bố trí thí nghiệm 36 38 38 38 39 41 42 43 2.6.1 Đánh giá hiệu tạo gel chất mang alginat nghiên cứu môi trường tạo gel dung dịch CaCl2 43 2.6.2 xác định nồng độ alginat CaCl2 đến tạo gel khả sống tế bào 43 2.6.3 Xác định kích thước hạt gel đến khả sống tế bào nấm men 44 2.6.4 Xác định thời gian ngâm gel đến khả sống tế bào 44 2.6.5 Xác định yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân sucrose 45 2.6.6 Xác định khả tái sử dụng tế bào nấm men cố định 45 2.6.7 Xác định khả hoạt hoá tế bào nấm men cố định 46 2.6.8 Động học trình thủy phân sucrose tế bào cố định 46 2.6.9 Xác định ảnh hưởng nồng độ sucrose đến hiệu suất thủy phân tế bào tự cố định 47 2.6.10 Xác định ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân tế bào tự cố định 47 2.7 Hóa chất thiết bị sử dụng nghiên cứu 48 2.8 Xử lý số liệu 48 Chương KếT QUả NGHIÊN CứU Và THảO LUậN 49 3.1 Kết xác định số đặc tính, hình thái lựa chọn chủng nấm men sinh invertase cao 49 3.1.1 Đặc tính khuẩn lạc chủng nấm men 49 3.1.2 Chọn nguồn cacbon thích hợp cho sinh trưởng phát triển chủng nấm men môi trường nhân giống 52 3.1.3 Lựa chọn chủng nấm men có khả sinh invertase cao 56 3.1.4 Xác định thời gian nuôi chất cảm ứng đến khả sinh tổng hợp invertase chủng S12 nuôi chìm bước 58 3.2 Nghiên cứu cố định tế bào S cerevisiae S12 gel alginat CaNXI 61 3.2.1 Đánh giá hiệu qủa tạo gel cấu trúc gel alginat- Ca cố định tế bào 61 3.2.2 ảnh hưởng nồng độ alginat natri CaCl2 đến tế bào cố định 68 3.2.3 ảnh hưởng kích thước hạt gel đến tế bào cố định 71 3.2.4 ảnh hưởng thời gian ngâm hạt gel dung dịch CaCl2 73 3.3 Xúc tác thủy phân sucrose tế bào nấm men S cerevisiae có hoạt tính invertase cố định gel alginat CaNXI 75 3.3.1 ảnh hưởng lượng tế bào nấm men đến hạt gel hiệu suất thuỷ phân 75 3.3.2 ảnh hưởng nồng độ sucrose đến hiệu suất thủy phân 77 3.3.3 ảnh hưởng pH môi trường đến hiệu suất thủy phân 3.3.4 ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân tế bào cố định 3.3.5 ảnh hưởng chế độ cung cấp oxy đến hiệu suất thủy phân 3.3.6 Khả tái sử dụng tế bào cố định để thủy phân sucrose 3.3.7 Hoạt hóa khôi phục hoạt tính invertase tế bào nấm men cố định 3.3.8 Động học phản ứng thủy phân sucrose dùng xúc tác tế bào nấm men S cerevisiae có hoạt tính invertase cố định gel alginat-Ca 81 84 86 88 90 94 3.3.9 ảnh hưởng nồng độ sucrose đến hiệu suất thủy phân tế bào nấm men tự cố định 97 3.3.10 ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân tế bào tự cố định 99 3.4 Đề xuất quy trình công nghệ thủy phân sucrose phòng thí nghiệm xúc tác tế bào nấm men có hoạt tính enzyme invertase cố định gel alginat CaNXI 100 3.5 Đánh giá chất lượng dịch đường khử thu thủy phân sucrose tế bào nấm men S cerevisiae có hoạt tính invertase cao 101 kết luận kiến nghị 105 CáC công trình công bố LIÊN QUAN ĐếN LUậN áN 107 TàI LIệU THAM KHảO 108 Phần phụ lục 118 i danh mục chữ viết tắt luận án C Cacbon CM Cacboximetyl DEAE Dietilaminoetil GGG Homopolyguluronat E Enzyme MMM Homopolymannuronat MGMG Block luân hợp Mannuronat (M) với Guluronat(G) MT Môi trường MT1 Môi trường MT2 Môi trường MT3 Môi trường MT4 Môi trường N Nitơ NC Nghiên cứu OD Optical density PVC Polyvinyl clorua PTN Phòng thí nghiệm TB Tế bào TBCĐ Tế bào cố định TBTD Tế bào tự TTHD Trung tâm hoạt động VSV Vi sinh vật ii DANH MụC CáC BảNG Bảng Tên bảng 1.1 Một số enzyme chủ yếu tế bào nấm men Saccharomyces có Trang tác dụng chuyển hoá glucid đơn giản 1.2 Một số ứng dụng alginat cố định tế bào 25 3.1 Một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng nấm men 50 3.2 Một số đặc điểm hình thái tế bào chủng nấm men 51 3.3 Hiệu tạo gel alginat natri dung dịch CaCl2 62 3.4 Hiệu suất thủy phân tế bào cố định trước sau hoạt hoá 91 3.5 Một số tiêu hỗn hợp đường khử 101 DANH MụC CáC HìNH Hình Tên hình Trang 1.1 Mặt cắt ngang tế bào nấm men 1.2a Tế bào nấm men nảy chồi để lại sẹo chồi 10 1.2b Hình dạng tế bào nấm men 10 1.3 Sơ đồ tổng hợp protein enzyme 15 1.4 Minh hoạ phương pháp cố định tế bào 21 1.5 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất alginat natri 23 1.6 Cấu hình hai gốc monome phân tử acid alginic 26 1.7 Cấu trúc block polyG, polyM poly GM phân tử 26 alginat 1.8 Sự tạo gel block polyG mô hình vỉ trứng 28 1.9 Liên kết glucosid glucose fructose sucrose 30 1.10 Sơ đồ trình thủy phân tinh bột acid enzyme 31 1.11 Qui trình thủy phân sucrose enzyme invertase 31 1.12 Qui trình thủy phân sucrose chế phẩm enzyme invertase 32 1.13 Phương pháp thủy phân sucrose tế bào nấm men cố định 33 iii 2.1 Cố định tế bào phương pháp bẫy gel 41 2.2 Sơ đồ tổng hợp vấn đề nghiên cứu 42 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc chủng nấm men 49 3.2 Hình ảnh tế bào nấm men chủng S12 50 3.3 Hình ảnh tế bào nấm men chủng S28 51 3.4 Hình ảnh tế bào nấm men chủng Sk 51 3.5 Đường cong sinh trưởng chủng S12 54 3.6 Đường cong sinh trưởng chủng S28 54 3.7 Đường cong sinh trưởng chủng Sk 55 3.8 Kết sinh khối sinh tổng hợp enzyme invertase 57 chủng nấm men nuôi cấy chìm bước 3.9 Kết sinh tổng hợp invertase chủng S12 nuôi chìm bước 59 3.10 Quy trình cố định tế bào phương pháp bẫy gel 62 3.11 Hình dạng hạt gel alginat-Ca cố định tế bào nấm men S 63 cerevisiae 3.12 Mặt cặt ngang vùng tâm hạt gel alginat-Ca cố định tế bào 63 nấm men S cerevisiae 3.13 Sự phân bố tế bào nấm men S cerevisiae vùng biên 64 hạt gel alginat-Ca 3.14 Cơ chế tổng quát trình tạo gel alginat-Ca 65 3.15 Quá trình tạo gel alginat-Ca theo phương pháp khuếch tán 66 3.16 Mô hình vỉ trứng liên kết ion Ca2+ với gốc guluronic 67 3.17 ảnh hưởng nồng độ alginat CaCL2 đến khả sống 69 tế bào nấm men cố định 3.18 ảnh hưởng kích thước hạt gel đến khả sống tế bào cố 72 định 3.19 ảnh hưởng thời gian ngâm hạt gel dung dịch tạo gel 74 CaCl2 đến khả sống tế bào nấm men 3.20 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng lượng tế bào nấm men cố định đến hiệu suất thuỷ phân tỷ lệ hạt gel nguyên vẹn 76 113 61 Hang Arne, Bjorn Larsen and Olav Smidsrod (1996), A study of the constitution of Alginic acid by Partial acid Hydrolysis, Acta chemica scandinavica, Vol 20, No 1, pp 183-190 62 Haug Arne, Sverre Myklestad, Bjorn Larsen and Olav Smidsrod (1967), Correlation between Chemical Structure and Physical Properties of Alginates, Acta Chemica Scandinavica, Vol 21, pp 768-778 63 Hang Arne, Bjorn Larsen, Olav Smidsrod (1974), Uronic acid sequence on Alginates from different sources, Carbonhydrate reseach, Vol 32 pp 217 225 64 Hannoun Betty J M., and Gregory Stephanopoulos (1990), Intrinsiec Growth and Fermentation Rates of Alginate- entrapped Saccharomyces cerevisiae, Biotechnology Progress, Vol 6, No 5, pp 341-348 65 Hannoun Betty J M., and Gregory Sterphanopoulos (1990), Growth and Fermentation Model for Alginate- entrapped Sacchromyces cerevisiae, Biotechnology Progress, Vol 6, No 5, pp 349-356 66 Hebe Rojo, Mataa, Vattuone and Antonio R SampieHro (1994), Invertase from schizophyllum commune, Argentina 67 Heyraud A and C Leonard (1990), Structural Characterization of Alginates by Liquid Chromatographies, Food Hydrocolloids, Vol 4, No 1, pp 59-68 68 Hirota Nozomu and Akiko Kumagai (1990), Pigment Composition of Chlorophyll Protein Complexes and Seasonal Variation of Pigments in the Brown Algae Hizikia fusiformis, Nippon Suisan Gakkasihi, Vol 56, No 6, pp 991-998 69 Huang, Y.H., Picha, D.H., Kilili, A.W., and Jonson, C.E (1999), Changes in invertase activities and reducing sugar content in sweet potato stored at different temperatures, J Agric Food Chem., pp 47, 4927-4931 70 Huguet, M L., Neufeld, R J., and Dellacherie, E (1996), Calcium alginate beads coated with polycationic polymers: Comparison of chitosan and DEAE-dextran Process Biochemistry, pp 31, 4, 347-353 71 Hydrocolloids, Sanofi, Bio-Industries, Paris, 1988 72 Irrgang S., H Baumgrtl, D Schkosser, W Zimelka, and H.P Schmander (1993), Investigation of the Oxygen Supply in Ca-Alginate Beads and 114 Microcapsules loaded with Penicillum raistrickii Using a Microelectrode, J Basic Microbiol, Vol 33, No 5, pp 311-321 73 Jain D and T.K Ghose (1984), Cellobiose Hydrolysis Using Pichia Etchellsii Cells Immobilized in Calcium Alginate, Biotechnology and Bioengineering, Vol 26, pp 340-346 74 James David (1990), Summary of international production and demand for seaweed colloids, Technical resource papers regional wokshop on culture and utilization of seaweed, Philipines, Vol 2, pp 143-147 75 Kaya, V M., and Picard, G., (1996), Stability of chitosan gel as entrapment matrix of viable Scenedesmus Bicellularis cells immobilized on screens for tertiary treatment of wastewater, Bioresource Technology, pp 46, 147-155 76 Kierstand M (1981), These of Calcium alginate for solids separation for biological masteries, Biotechnology Bioeng 24, pp 707-715 77 Klein J; Vorlop K D (1988), Immobilization of Whole cells, Biotechnology Focus 1, Hanser Publishing - New York, pp 325-335 78 Kobayashi Yoshinari and Rzukichi Matsuo (1986), Manufacture and Physical Properties of Alginate Fiber Papers as an Analysis Model of Celluosic Fiber Papers, Journal of Applied Polymer Science, Vol 31, pp 1735-1747 79 Lundberg peter, Susan J Berners-Price, Sushmita Roy and Philip W Kuchel (1992), NMR Studies of Erythrocytes immobilized in Agarose and Alginate gels, Magnetic resonance in Medicine, Vol 25, pp 273-288 80 Mahmound Wafaa M., Abdel Hahim N M El Sayed, and Robert W Coughlin (1990), Production of o phenylacetyl carbinol by immobilized yeast cells: I Batch Fermentation, Biotechnology and Bioengineering, Vol 36, No pp 47-54 81 Marwaha Satwinder S and John F Kennedy (1985), Studies on the Structural Features of Sodium Alginate Entrapped Kluyverromyces marxianus NCYC179 Cells Used for Alcohol Production from Whey Permeate, British Polymer Journal, Vol 17, No 1, pp 46-50 82 Marwaha S.S and J.F Kenedy (1984), Ethanol Production from Whey Permeate by Immobilized Yaest Cells, Enzyme Microbiological Technology, Vol 6, pp 18-22 115 83 Matisen, A., Gudmund Skjak- Braek and Olav Smidrod (1989), Alginate as Immobilization Material: 1.Correlation between Chemical and Properties of Alginate Gel Beads, Biotechnology and Bioengineering, Vol 33, pp 79-89 84 Matisen, A., I Storro and G Skjak Braek (1992), Alginate as immobilization materil:III Diffusional properties, Biotechnol Bioeng, pp 39, 186-194 85 McNeely William H (1973), Algin, Industrial Gums, Academic Press, New York, pp 55-81 86 McHygh Dennis J (1987), Production, Properties, and Uses of Alginat, Production and utilization of products from commercial seaweeds, FAO, Fisheries Technical Paper 288, Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, pp 58-115 87 Meada H (1997), Preparation of immobilized enzymes by radiation, Process Biochemical, pp 9-12 88 Mizuno Haruo, Takahide Saito, Naomichi Iso, Nobuhiko Onda, Kazumitsu Noda, and Katsumi Takada (1983), Mannuronic to Gluronic Acid Ratios of Alginic Acid Prepared from Various Brown Seaweeds, Bullletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries, Vol 49, pp 1591 1593 89 Minghou J I, Processing and Extraction of Phucocolloids (1990), Technical Resource Papers Regional Workshop on the Culture and Utilization of Seaweed, Philippines, Vol 2, pp 85 -96 90 Norton, S.& Vuillemard, J C (1994), Food bioconversions and metabolite production using immobilized cell technology Critical Reviews in Biotechnology, pp 14, 193-224 91 Nussiovitch A and Peleg M (1990), Streng titry serme relationships of Agar and Alginate gels, Journal of Texture studies, Vol 21, No.1, pp 51-60 92 Oliver Barbaroux (1990), Production, Properties, and Uses of Alginate, Carrageenan and Agar, Technical Resource Papers Regional Workshop on the Culture and Utilization of Seaweed, Philipines, Vol 2, pp 97-135 93 Penman A and G R Sanderson A (1972), method for the Determination of Uronic acid sequence in Alginates, Carbohydrate Research, Vol 25, pp 273282 116 94 Ress D.A (1975), Biochemistry serious, Vol Intern Rev of Science, pp 42 95 Richard Searle Kelco in Scotland, A brief outline Kelco, 1995 96 Roca E, N Meinander, and B Jalin-Hagerdal (1996), Xylitol production by immobilized recombinant Saccharomyces cerevisiae in a continuous packed Bed bioreactor, Biotechnology and Bioengineering, Vol 51, No.3, pp 317326 97 Roservear A; Cabral J M S (1987), Immobilized enzyme and cells, Briston IOP Publishing pp 17-20 98 Roukas Triantafyllos (1994), Kinetics of Ethanol Production from Carob Pods Extract by Immobilized Saccharomyces cerevisiae Cell, Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol 44, No 1, pp 49-64 99 Roukas T., (1994), Ethanol Production from Nonsterilized Carob Pod Extract by Free and Immobilizied Saccharomyces cerevisise Cell Using Feed Batch Culture, Biotechnology and Bioengineering, Vol 43, No 3, pp 89-194 100 Roukas Triantafyllos (1994), Kinetics of Ethanol production from carob extract by immobilized Saccharomyces cerevisise cells, Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol 44, No 1, pp 49-64 101 Skjak-Braek Gudmund, Hans Grasdalen, and Olav Smidrod (1989), Inhomogeneous Polysaccharide Ionic Gels, Carbohydrate Polymer, Vol 10, pp 34-54 102 Smidsrot Olav and K.I Draget (1996), Alginate gelation technologies Proc from Food Colloids- protein lipids and Polysaccharides Ystad Sweden, pp 279-293 103 Smidsrod Olav and Gudmund Skjak-Brak (1990), Alginate as Immobilization Matix for Cell, Trends in Biotechnology, Reference Edition, Vol 8, No 3, pp 71-78 104 Smidsrod Olav and K.I Draget (1996), Chemistry and physical properties of alginates, Carbohydrin Europe, No 14, pp 6-13 105 Percial Elizabeth and R.H McDowell (1990), Algal polysaccharides, Methods in plant Biochemistry, Vol 2, Academic Press limited, pp 523-545 117 106 Spettoli P, Bottancin A (1992), Immobilization of leuconotos oenos ML 34 in Ca-Alginate gels and its application to wine technology, Am J Enol Vitie 33, pp 1-5 107 Steginsky Cora A., John M Beale, Heinz G Floss, and Robert M Mayer (1992), Structural determination of alginic acid and the effects of calcium binding as determined by high field N.M.R, Carbohydrate Research, Vol 225, pp 11- 26 108 Tampion J and Tampion M.D (1987), Immobilized cells, Principles and Applications, Cambridge University press 109 Taussig, R and Carlson, M., (1983), Nucleotide sequence of the yeast SUC2 gene for invertase Nucleic Acids Research, 11, pp 1943-1955 110 Tortara, G.J., Funke, B.R and Case, C.L., (1995), Microbiology an introduction, 5th Edition The Benjamin/Cumming 111 Uematsu K (1988), Development of continuous fermentation using immobilized yeast cells for wine, Applied Biochemical and Biotechnology, pp 177-188 112 Vullot, D L., (2003), Biopolymers, Enzyme Activity, and Biotechnology in an Introductory Laboratory Class Experience Biochemistry and molecular biology education, pp 31, 42-45 113 Wang Zheng Yu, Qing-Zhi Zhang, Mikio KonNo, and Shozaburo Saito (1993), Sol-Gel Transition of Alginate Solution by the Addition of Various Divalent Cations 13 C-NMR Spectroscopic Study, Biopolymers Vol 33, No 4, pp 703-711 114 Yadav B S., Usha Rani, S S Dhamiza, Pooman Nigam and Dalel Singh, (1996), Process optimization for continuous ethanol fermentation by alginateimmobilized cells of Saccharomyces cerevisiae, Basic microbiology, Vo 36, No 3, pp 205-210 115 Y.Y.Linko, L Weckstrom and P.Linko (1980), Sucrose Invertase by Immobilized Saccharomyces cerevisiae Yeast cells, Food process engineering, Vol 2, Applieed Science publishers LTD., London 116 Http://www.lsbu.ac.uk/water/hyalg.html 118 Phần phụ lục PHụ LụC KếT QUả NUÔI SINH KHốI Và SINH HOạT TíNH ENZYME INVERTASE CáC CHủNG NấM MEN S CEREVISIAE S12, S28, Sk 1.1 Môi trường 1.1.1 Môi trường nuôi cấy chìm bước Môi trường MT1 - Nuôi cấy chìm bước 1: 15 đầu nuôi MT1 có thành phần dinh dưỡng: Rỉ đường 36 gam (NH4)2HPO4 gam (NH4)SO4 gam MgSO4 gam Dịch chiết nấm men 20 ml (chứa gam chất khô) Nước cất vừa đủ 1000 ml Môi trường MT2 Sau chuyển toàn dịch nuôi nấm men sang bình lên men thứ chứa MT2 có thành phần ding dưỡng: Rỉ đường 90 gam (NH4)2HPO4 30gam (NH4)SO4 50 gam MgSO4 39 gam Dịch chiết nấm men 250 ml (chứa 30 gam chất khô) Nước cất vừa đủ 10 lít Môi trường MT3 Sau nuôi tiến hành bổ sung vào bình lên men MT3 có thành phần dinh dưỡng: Rỉ đường 774 gam (NH4)2HPO4 10gam (NH4)SO4 15gam MgSO4 10 gam Dịch chiết nấm men 100 ml (chứa 15 gam chất khô) Nước cất vừa đủ 2000 ml 1.1.2 Môi trường nuôi cấy chìm bước 119 Tiếp tục nuôi 20 giờ, tiến hành thu sinh khối, rửa tế bào nước cất Chuyển toàn lượng tế bào ướt thu sang bình lên men thứ để nuôi chìm bước MT4 có thành phần dinh dưỡng: Sucrose 20 gam KH2PO4 50 gam (NH4)2SO4 30gam MgSO4 30 gam KNO3 10 gam Dịch chiết nấm men 30 gam Nước cất vừa đủ 10 lít - Nuôi chìm bước 2: bổ sung từ đầu 125 gam sucrose pha 700ml nước cất vào môi trường MT4, sau sau nuôi lại bổ sung lượng sucrose lúc đầu Sau 18 nuôi tiến hành ly tâm thu sinh khối tế bào, rửa nước muối sinh lý rửa lại nước cất Đem sử dụng đông khô bảo quản 1.2 Xác định thời gian nuôi 1.2.1 Xác định thời gian nuôi thích hợp nuôi chìm bước Bảng 1.1 Kết sinh khối sinh tổng hợp enzyme invertase chủng nấm men nuôi chìm bước Chủng nấm men S12 S28 Sk Thời gian nuôi 18 38 46 18 38 46 18 38 46 Hoạt độ enzyme TB (UI) 165 300 305 158 290 288 160 287 292 Lượng sinh khối TB (g) 3,5 6,8 6,85 3,2 6,5 6,53 3,2 6,6 6,65 1.2.2 Xác định thời gian nuôi thích hợp nuôi chìm bước Bảng 1.2 Kết sinh khối sinh tổng hợp enzyme invertase chủng S12 nuôi chìm bước Thời gian nuôi cấy(giờ) 38 44 50 56 62 Lượng sucrose bổ sung(g) 20,0 125 125 125 125 Lượng sinh khối TB (g) 6,80 7,00 7,50 7,80 7,82 Hoạt độ enzyme TB (UI) 300 450 495 520 520 120 PHụ LụC Cố định tế bào nấm men s cerevisiae s12 2.1 ảnh hưởng nồng độ alginat CaCl2 đến cố định tế bào Bảng 2.1 ảnh hưởng nồng độ alginat CaCl2 đến khả sống tế bào nấm men cố định Nồng độ Nồng độ Số TB/ml dịch Số TB/ ml dich Tỷ lệ TB sống alginat(%) CaCl2 (M) trước cố định sau cố định sau cố định 8 (*10 ) (*10 ) (%) 0,05 7,8 6,90 88,46 0,10 7,8 6,95 89,10 0,15 7,8 6,72 86,15 0,05 7,8 6,75 86,53 0,10 7,8 7,25 92,95 0,15 7,8 6,68 85,64 0,05 7,8 6,65 85,25 0,10 7,8 6,82 88,43 0,15 7,8 6,60 84,61 2.2 ảnh hưởng kích thước hạt gel đến tế bào cố định Bảng 2.2 ảnh hưởng kích thước hạt gel đến khả sống tế bào cố định Kích thước hạt Số TB/ml dịch trước Số TB/ml dịch sau gel (mm) cố định (*108) cố định (*108) 2,5 7,8 7, 58 3,0 7,8 7, 70 3,5 7,8 7, 64 4,0 7,8 7, 60 2.3 Xác định đường kính hạt gel cố định tế bào Tỷ lệ TB sống sau cố định (%) 97,17 98,71 97,94 97,43 Hình 2.1 Đo kích thước đường kính hạt gel Balmer 121 2.4 ảnh hưởng thời gian ngâm gel Bảng 2.3 ảnh hưởng thời gian ngâm hạt gel dung dịch tạo gel CaCl2 đến khả sống tế bào nấm men Thời gian ngâm (giờ) Kích thước Hạt gel (mm) Số TB/ ml dịch Số TB/ml dịch Tỷ lệ tế bào trước cố định sau thời gian ngâm (*108) sống sau (*10 ) Trạng thái hạt gel ngâm (%) 0,5 3,0 7,8 7,70 98,70 Mềm, dễ vỡ 1,0 3,0 7,8 7,67 98,32 Cứng 1,5 3,0 7,8 7,61 97,56 Cứng 2,0 3,0 7,8 7,53 96,56 Cứng 2,5 3,0 7,8 7,41 94,94 Cứng PHụ LụC DùNG Tế BàO NấM MEN s cerevisiae có hoạt tính invertase cố định THủY PHÂN SUCROSE 3.1 ảnh hưởng lượng tế bào nấm men đến hạt gel hiệu suất thủy phân Bảng 3.1 ảnh hưởng lượng tế bào nấm men cố định đến hiệu suất thủy phân tỷ lệ hạt gel nguyên vẹn Lượng tế bào cố định (g) 1,0 2,0 3,0 4,0 Lượng đường khử cực đại tạo thành (g/l) 147,65 156,51 160,37 168.50 Hiệu suất thủy phân cực đại (%) 70,36 74,59 76,42 80,30 Tỷ lệ hạt gel nguyên vẹn (%) 100,0 100,0 94,0 87,0 122 3.2 ảnh hưởng nồng độ sucrose đến thủy phân Bảng 3.2 ảnh hưởng nồng độ sucrose thời gian đến hiệu suất thủy phân Nồng Hiệu suất thủy phân (%) độ Suc 0h 2h 4h 6h 8h 10h 12h 14h 100 30,76 67,31 92,91 90,01 80,32 72,02 62,92 150 27,00 52,40 71,70 87,08 83,95 79,53 70,79 200 19,79 42,10 63,3 82,30 81,14 77,10 68,00 250 15,58 32,90 46,03 61,12 68,14 63,84 57,50 300 10,50 23,20 32,49 46,57 52,50 50,83 46,03 (g/l) 3.3 ảnh hưởng pH đến hiệu suất thủy phân Bảng 3.3 ảnh hưởng pH môi trường đến hiệu suất thủy phân pH Lượng đường khử (g/l) Hiệu suất thủy phân 3,5 153,41 73,11 4,5 175,20 83,49 5,5 174,89 83,34 6,5 145,61 69,39 3.4 ảnh hưởng nhiệt độ thủy phân Bảng 3.4 ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân Nhiệt độ (0C) 25 30 35 40 45 50 Lượng đườờng khử (g/l) 150.97 166.96 176.84 175.73 158.82 126.63 Hiệu suất thủy phân (%) 71.95 84.28 83.75 75.69 60.35 79.57 3.5 ảnh hưởng chế độ cung cấp oxy Bảng 3.5 ảnh hưởng chế độ cung cấp oxy đến hiệu suất thuỷ phân Lắc vòng 100 v/phút Lắc vòng 50 v/phút Không lắc Lượng đường khử (g/l) Hiệu suất thuỷ phân (%) Lượng đường khử (g/l) Hiệu suất thuỷ phân (%) Lượng đường khử (g/l) Hiệu suất thuỷ phân (%) 177,25 83,47 151,42 72,15 41,07 19,57 3.6 Xác định số chu kỳ tái sử dụng tế bào cố định xúc tác thủy phân 123 Bảng 3.6 Hiệu suất thủy phân qua chu kỳ tái sử dụng tế bào cố định xúc tác thủy phân dung dịch sucrose Số chu kỳ Hiệu suất 83,65 83,62 83,41 83,25 83,1 82,56 80,95 79,57 77,92 thủy phân (%) Số chu kỳ Hiệu suất 10 11 12 75,38 73,13 70,42 13 67,2 14 62,58 56,51 15 16 52,7 50,04 thủy phân (%) Bảng 3.7 Hiệu suất thủy phân qua chu kỳ tái sử dụng tế bào cố định sau hoạt hoá khôi phục hoạt tính invertase Số chu kỳ 173.24 168.73 162.25 143.89 123.66 112.12 95.54 82.60 80.41 77.32 68.57 58.93 53.43 50.53 Lượng đường khử tạo thành (g/l) Hiệu suất thủy phân (%) 3.7 Xác định động học thủy phân Bảng 3.8 Sự biến đổi nồng độ sucrose nồng độ đường khử taọ thành chu kỳ thuỷ phân Thời gian (h) 10 12 14 200 145,1 91,2 51,5 34,25 26,9 23,5 21,78 0,00 56,0 112 151 177,95 172,15 162,54 150,45 Nồng độ sucrose (g/l) Nồng độ đường khử (g/l) 124 3.8 So sánh tế bào tự tế bào cố định Bảng 3.9 ảnh hưởng nồng độ sucrose đến hiệu suất thủy phân tế bào tự tế bào cố định Hiệu suất thủy phân (%) Nồng độ sucrose (g/l) Tế bào cố định Tế bào tự 100 150 200 250 300 92.90 89.34 85.78 74.26 63.79 94.15 85.54 78.63 60.23 40.54 Bảng 3.10 Hiệu suất thủy phân tế bào tự cố định thay đổi nhiệt độ dung dịch thủy phân Nhiệt độ thủy phân (0C) 25 30 35 40 45 50 Hiệu suất thủy phân (%) Tế bào cố định Tế bào tự 71,15 75,12 78,00 82,44 83,60 88,13 84,28 80,50 75,20 65,40 59,40 39,60 125 Phụ lục Một số thiết bị sử dụng luận án Hình 4.1 Thiết bị điều nhiệt Hình 4.2 Máy quang phổ UV VIS DR 4000 126 Hình 4.3 Máy lắc vòng Hình 4.4 Thiết bị trùng 127 Hình 4.5 Tủ ấm lắc Hình 4.6 Tủ cấy vô trùng [...]... Saccharomyces cerevisiae sinh enzyme invertase có hoạt tính cao bằng alginat để thu phân sucrose thu đường khử với mục đích tạo ra tế bào nấm men cố định có hoạt tính invertase cao để có thể tái sử dụng lại nhiều lần Nội dung nghiên cứu của luận án: - Nghiên cứu chọn lựa giống nấm men Saccharomyces cerevisiae thu n chủng và phương pháp nuôi cấy để sinh tổng hợp enzyme invertase có hoạt tính cao - Nghiên cứu cố. .. dịch thu phân 3.35 Đề xuất quy trình công nghệ thu phân sucrose ở phòng thí 102 nghiệm dùng xúc tác tế bào nấm men S cerevisiae S12 có hoạt tính enzyme invertase cố định trong gel alginat- Ca 3.36 Sơ đồ bố trí thiết bị cố định tế bào nấm men S cerevisiae có hoạt 103 tính enzyme invertase cao bằng alginat natri 3.37 Sơ đồ bố trí thiết bị thu phân gián đoạn sucrose bằng tế bào nấm men S cerevisiae có hoạt. .. của tế bào Saccharomyces cerevisiae cố định trong gel alginat- Ca 3.31 Minh hoạ cơ chế thu phân sucrose bằng tế bào nấm men cố định 97 3.32 Hình ảnh dịch thu phân sucrose bằng tế bào tự do và tế bào cố 98 định khi kết thúc thí nghiệm 3.33 Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu phân của tế bào tự do và cố định 98 khi thay đổi nồng độ cơ chất 3.34 Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu phân của tế bào tự do và cố định. .. Nghiên cứu cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có hoạt tính enzyme invertase cao bằng phương pháp bao bọc trong gel alginate canxi - Nghiên cứu sử dụng tế bào nấm men cố định trong gel alginat canxi để thủy phân sucrose tạo ra hỗn hợp đường khử 2 ý nghĩa khoa học, thực tiễn của luận án: Lần đầu tiên nghiên cứu một cách có hệ thống từ giai đoạn lựa chọn chủng nấm men S cerevisiae thu n chủng... phương pháp nuôi cấy nấm men để sinh tổng hợp enzyme invertase hoạt tính cao, đến nghiên cứu sử dụng chất mang alginat natri một polyme thủy sản được chiết rút từ một loại rong mơ, khai thác tại vùng biển địa phương nơi nghiên cứu và phương pháp cố định tế bào nấm men S cerevisiae có hoạt tính enzyme invertase cao để xúc tác thủy phân sucrose sản xuất hỗn hợp đường khử Các kết quả nghiên cứu của luận án... hiểu biết về lĩnh vực nghiên cứu nuôi cấy tế bào VSV sinh tổng hợp enzyme và ứng dụng công nghệ cố định tế bào bằng polyme thủy sản trong sản xuất thực phẩm Kết quả nghiên cứu còn là cơ sở thực tiễn cho những hướng nghiên cứu khác có liên quan đến công nghệ vi sinh vật, enzyme và cố định tế bào Kết quả nghiên cứu của luận án bước đầu làm cơ sở để triển khai ứng dụng tế bào nấm men cố định vào thực tiễn... cerevisiae để nghiên cứu nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme 10 invertase có hoạt tính cao Trong trường hợp này ta lợi dụng tính chất quan trọng của enzyme invertase có trong hệ enzyme của tế bào nấm men có khả năng thủy phân sucrose Do đó sẽ chọn sucrose làm chất cảm ứng trong môi trường nuôi sinh tổng hợp enzyme cảm ứng invertase 1.1.3 Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men Quá trình sinh trưởng... ngành khác tế bào cố định được dùng trong công nghệ môi trường để xử lý nước thải hữu cơ, trong y học để nuôi cấy invitro Trong hóa sinh học tế bào cố định được dùng để phân cắt chọn lọc các polyme sinh học, nuôi cấy và nghiên cứu đặc tính sinh lý của tế bào 1.3.2 Phương pháp cố định tế bào - Phương pháp gắn tế bào vào bề mặt chất mang không tan 37, [70] Gắn tế bào vào chất mang không tan bằng: liên... tinh khiết tế bào cố định được dùng để sản xuất các - ketoacid dùng trong công nghiệp, thực hiện các phản ứng khử nhờ kỹ thu t cố định tế bào, sản xuất aceton, butanol Trong ngành hóa phân tích, tế bào cố định được dùng để sản xuất tế bào cảm ứng sinh học, phân tích hormon và các chất có ảnh hưởng tới sự trao đổi chất của tế bào, phân tích một số chất hóa học đặc trưng, đếm nhanh tế bào, phân tích sắc... enzyme Lợi ích của tế bào cố định 35 Tế bào cố định cho phép thay thế quá trình lên men gián đoạn bằng lên men liên tục, cho phép thiết bị lên men gián đoạn hoạt động theo nguyên tắc tháo khô và đổ đầy Tế bào cố định tạo ra mật độ tế bào lớn trong thiết bị lên men, rút ngắn thời gian lên men, làm tăng năng suất Dùng tế bào cố định sẽ tạo điều kiện cho việc tách tế bào ra khỏi môi trường lên men một cách ... Nghiên cứu cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae sinh enzyme invertase có hoạt tính cao alginat để thu phân sucrose thu đường khử với mục đích tạo tế bào nấm men cố định có hoạt tính invertase. .. hợp đường khử Tế bào cố định Hình 1.13 Phương pháp thủy phân sucrose tế bào nấm men cố định Sử dụng tế bào nấm men S cerevisiae có hoạt tính invertase cao cố định để thủy phân sucrose thành hỗn... tác tế bào nấm men có hoạt tính enzyme invertase cố định gel alginat CaNXI 100 3.5 Đánh giá chất lượng dịch đường khử thu thủy phân sucrose tế bào nấm men S cerevisiae có hoạt tính invertase cao