CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN

TỔNG QUAN VỀ PENICILLIN  Giới thiệu về penicillin  Penicillin là đại diện tiêu biểu cho các kháng sinh có nguồn gốc từ nấm mốc , là loạikháng sinh phổ rộng, được ứng dụng rộng rãi tron

Mục Lục

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN

I. TỔNG QUAN VỀ PENICILLIN

 Giới thiệu về penicillin

 Penicillin là đại diện tiêu biểu cho các kháng sinh có nguồn gốc từ nấm mốc , là loạikháng sinh phổ rộng, được ứng dụng rộng rãi trong điều trị và được sản xuất ra vớilượng lớn nhất trong số các chất kháng sinh đã được biết hiện nay Chúng tác dụnglên hầu hết các vi khuẩn Gram dương và thường được chỉ định điều trị trong cáctrường hợp viêm nhiễm do liên cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn, thí dụ như viêm màng não,viêm tai - mũi - họng, viêm phế quản, viêm phổi, lậu cầu, nhiễm trùng máu…ngăn cảnviệc tổng hợp thành tế bào vi khuẩn

 Phát hiện tình cờ vào năm 1928 do Alexander Fleming, khi nhận thấy một hộp

petri nuôi Staphylococcus bị nhiễm nấm mốc Penicillium notatum có xuất hiện

hiện tượng vòng vi khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm.Mỹ đã triển khai lên

men thành công penicillin theo phương pháp lên men bề mặt (1931).1947 đã sản xuất

lên men chìm ở quy mô công nghiệp

 Công thức cấu tạo của penicillin

 Penicillin gồm nhiều loại, chúng có cấu tạo gần giống nhau, bao gồm một vòngthiazolidine, một vòng β-lactam và chỉ khac nhau ở gốc R của mạch ngang tuy nhiên

có ý nghĩa lớn nhất trong điều trị cũng như thương mại là penicillin dạng G và V

 Giống vi sinh vật

 Những vi sinh vật sinh penicillin thuộc các giống nấm mốc penicillium và Aspergillus lànhững loại nấm mốc có khả năng tiết ra penicilin

Aspergillus

 Nhưng các chủng thuộc nhóm Penicillium notatum, Penicillium

chrysogenum và P.baculatum có hoạt lực cao và được dùng trong công nghiệp khángsinh.Ngày nay trong công nghiệp sử dụng chủng của loài P.chrysogenum do có hoatlực cao nhất Giống nấm mốc penicillin chrysogenum là loại hiếu khí bắt buộc Hơnthế nữa quá trình tổng hợp penicillin xảy ra trong điều kiện hiếu khí mạnh Do đótrong suốt quá trình lên men, việc thổi khí là điều hết sức cần thiết

Penicillium chrysogenum trên môi trường Raistr ik tạo thành hai kiểu khuẩn lạc:

 Kiểu I: khuẩn lạc tròn trặn, các nếp nhăn rõ nét Khuẩn ty khí sinh mọc tốt và có màu xanh;theo rìa khuẩn lạc có đường viền rộng 2-5 mm của những khuẩn ty bạc trắng không có bàotử; các khuẩn ty cơ chất màu nâu; chất màu không hoà vào môi trường

 Kiểu II: khuẩn lạc có những khuẩn ty màu trắng, phát triển yếu; khuẩn ty cơ chất cũng cómàu nâu Khuẩn lạc kiểu I cho hoạt lực cao, kiểu II cho hoạt tính kháng sinh thấp Vì vậy cầnphải tách những khuẩn lạc kiểu I trên môi trường này và thường xuyên kiểm tra để chọnnhững khuẩn lạc có hoạt lực cao, giữ được đặc tính của giống

Sự phát triển hệ sợi và đặc điểm hình thái hệ sợi nấm có quan hệ hữu cơ với hiệu quả sản xuất.

- Sự tăng trưởng về kích thước hệ sợi (tăng độ dài sợi, sự lớn lên về kích thước,mức độ phân nhánh của hệ sợi )

- lượng khóm sợi nấm trong môi trường

- hình thành các khóm sợi nấm(pellet- búi sợi cuộn xoắn):

 Pellet xốp (fluffy loose pellets) là dạng pellet có phần bên trong hệ sợi cuộn thành

khối chắc và mịn, lớp sợi phía bên ngoài cuộn lỏng lẻo tạo thành cấu trúc xốp hơn

 Pellet chắc và mịn (compact smooth pellets) có đặc điểm là phần sợi phía bên

trong pellet cuộn tương đối chặt chẽ ra đến gần sát lớp sợi phía ngoài, lớp sợi phíangoài cùng cũng cuộn đủ chắc thành lớp sợi mịn

 Pellet rỗng (hollow pellets) là dạng pellet có phần sợi bên trong bị tự phân tạo

thành khoảng rỗng, hệ sợi phía bên ngoài cuộn rất chặt thành lớp sợi mịn và chắcchắn

- Hiệu quả chung của quá trình lên men có quan hệ hữu cơ với số lượng, kích thước vàcấu trúc pellet nấm Trong thực tiễn sản xuất công nghiệp, người ta thường điều chỉnh

các thông số công nghệ theo hướng ưu tiên tạo ra dạng pellet đủ nhỏ và mịn, hạn chế

tạo pellet xốp và ngăn ngừa hình thành các pellet rỗng Điều kiện công nghệ tương ứng với mục tiêu trên thường áp dụng là : tỉ lệ cây giống 10%, với mật độ dịch giống (2-10).10 11 bào tử /m 3 ; phối hợp điều chỉnh giữa sục khí và khuấy trộn

để đảm bảo cung cấp oxy hòa tan dư so với nhu cầu tương ứng với thời điểm lên men, và để tạo ra pellet mịn và nhỏ (kích thước pellet thích hợp nhất khoảng 0,2 - 0,5mm), trong điều kiện đã cân đối với nhu cầu tiết kiệm mức tiêu tốn năng lượng do

khuấy trộn

 Cơ chế sinh tổng hợp penicillin của vi sinh vật

Theo quan điểm phổ biến hiện nay, quá trình sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc P.

chrysogenum có thể tóm tắt như sau: từ ba tiền chất ban đầu là α-aminoadipic, cystein và valin sẽ ngưng tụ lại thành tripeptit δ -(α- aminoadipyl) - cysteinyl - valin ; tiếp theo là quá

trình khép mạch tạo vòng β-lactam và vòng thiazolidin để tạo thành izopenicillin-N; rồi traođổi nhóm α-aminoadipyl với phenylacetic (hay phenooxyacetic) tạo thành sản phẩm

penicillin G (hay penicillin V, xem sơ đồ tổng hợp penicillin G

Hình 2.3 Sơ đồ cơ chế sinh tổng hợp penicillin từ axit L-α- aminoadipic, L-cystein và L-valin

 Nguyên liệu sản xuất

Thành phần môi trường dinh dưỡng bao gồm những nguồn chính sau:

Nguồn carbon: glucose hay lactose là nguồn năng lượng chính để nấm phát triển,chúng sử

dụng glucose trong pha phát triển để tăng sinh khối(48 giờ đầu)của quá trình,nấm đồnghóa hầu như toàn bộ glucose.Vì vậy,nên khi chuyển sang pha sinh tổng hợp penicilin thìnguồn năng lượng cạn kiệt dẫn đến giảm hiệu suất sinh tổng hợp Để khắc phục ta cần bổsung lactose trong môi trường lên men Trong pha lên men thứ nhất giống phát triển mạnh,

sử dụng glucoza và axit lactic của cao ngô Sau đó lactoza mới được sử dụng (chủ yếu

trong pha tạo penicillin) Khi trong môi trường cạn lactoza và không bổ sung các chất dinhdưỡng, hệ sợi nấm bắt đầu tự phân, nếu tiếp tục lên men nồng độ penicillin sẽ giảm, trongthực tế sản xuất cần phải kết thúc lên men trước thời điểm này.

 Nguồn nito: nấm mốc có khả năng đồng hóa các muối amoni và nitrat,nguồn nitơ hữu cơ là

nguồn đạm giàu ammino acid để nấm xây dựng nên phân tử penicillin ,do đó môi trường sảnxuất phải có mặt của cao ngô.có thể thay thế 1 phần cao ngô bằng bột đậu tương…P.chysogenum có khả năng tiết proteinase khá mạnh nên hợp chất protein trong cao ngô haybột đậu rất dễ được nấm sử dụng.Tuy nhiên lượng N phải vừa đủ vì nếu thiếu sẽ xảy ra hiệntượng tự phân của sợi,còn nếu thừa thì sợi phát triển nhanh quá làm giảm hiệu suất sinhpenicillin

 Nguồn lưu huỳnh:có ý nghĩa đặc biệt trong quá trình sinh tổng hợp penicillin vì nó tham gia

vào cấu trúc phân tử để tạo nên vòng thiazolidin.Nguồn lưu huỳnh thường dùng là các muốisulfat của kali,natri và amoni.các chất này tham gia vào tổng hợpmethionin,cystin,biotin,thiamin…Hay sử dụng nhất là natri thiosulfat(Na2S2O3) Trong môitrường dinh dưỡng có tiosunfat cùng với cao ngô hiệu suất penicillin có thể tăng hai lần

Sunfat Sunfit Tiosunfit sixtin

 Nguồn kim loại vi lượng: một số kim loại như Mg,Mn,Fe,Zn,Na….thường được bổ

sung dưới dạng muối sulfat hoặc có sẵn trong nước máy hay nguồn nguyên liệu tạomôi trường

 Chất tiền thể tạo nhánh: thêm phenylacetic làm chất tiền thể (cung cấp gốc R) vào môi

trường lên men tạo penicillin G,và phenoxyacetic để tạo penicillinV.Khi bổ sung chất tiềnthể thì hiệu suất sinh tổng hợp penicillin cao hơn(tăng thêm 30-50%)nhưng thực tế chothấy 2 chất này gây độc cho nấm nên người ta thường chọn giải pháp bổ sung liên tục vàkhống chế chặt chẽ nồng độ theo yêu cầu để không làm giảm năng lực lên men củachủng sản xuất

• Chú ý: về nguyên tắc nếu nguồn dinh dưỡng đầy đủ thì sự tích tụ penicillin sẽ xảy ra

mạnh mẽ khi hệ sợi đạt trạng thái cân bằng Nếu thiếu thức ăn sẽ xảy ra hiện tương

tự phân của sợi,còn nếu thừa thì sợi phát triển nhanh quá sẽ không tích tụ penicillin

mà tích tụ nhiều acid gluconic và acid malic

Môi trường nhân giống có thành phần gồm:

KH2PO4 0,5G

MgSO4 0,125g

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN:

1. Điều kiện lên men:

• Nhiệt độ là thông số có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của nấm mốc, khả năng

sinh tổng hợp và năng lực tích tụ penicillin của chúng Nhìn chung nấm mốc pháttriển thuận lợi hơn ở dải nhiệt độ khoảng 300C Tuy nhiên, ở dải nhiệt độ này tốc

độ phân huỷ penicillin cũng xảy ra mạnh mẽ

Trong thực tế, ở giai đoạn nhân giống sản xuất người ta thường nhân ở dảinhiệt độ 300C; sang giai đoạn lên men thường áp dụng chế độ nhiệt độ: Giai đoạnlên men bắt đầu tiến hành ở 300C cho đến khi hệ sợi phát triển đạt yêu cầu về hàmlượng sinh khối thì điều chỉnh nhiệt độ sang chế độ lên men penicillin ở dải nhiệt

độ 22 - 250C (có công nghệ điều chỉnh xuống 22 - 230C, giữ ở nhiệt độ này tiếp haingày rồi chuyển sang lên men tiếp ở 250C cho đến khi kết thúc quá trình lên men).

• pH môi trường thuận lợi cho sự phát triển hệ sợi và cho quá trình sinh tổng hợp

penicillin thường dao động trong khoảng pH = 6,2 - 7,4 Tuy nhiên ở điều kiện pHcao xu hướng phân huỷ penicillin cũng tăng lên Vì vậy, trong sản xuất pH môitrường thường được khống chế chặt chẽ ở giá trị lựa chọn trong khoảng pH = 6,2 -6,8 pH của môi trường có xu hướng giảm nên ta dùng CaCO3 để điều chỉnh

• Nồng độ oxy hoà tan và cường độ khuấy trộn dịch lên men: nồng độ oxy hòa tan

thuận lợi cho quá trình sinh tổng hợp penicillin dao động quanh mức 30% nồng độoxy bão hòa

• Nồng độ CO 2 trong dịch lên men ở mức nhất định cũng cần thiết cho quá trình

nảy mầm của bào tử nấm mốc; tuy nhiên nếu nồng độ CO2 quá cao sẽ làm cản trởquá trình hấp thu và chuyển hoá cơ chất của chủng, nghĩa làm làm cản trở quátrình sinh tổng hợp penicillin

• Thời gian lên men: thường kéo dài trong vòng 6-7 ngày

2. Quy trình sản xuất penicillin tự nhiên:

Có 2 phương pháp lên men penicillin:

- Lên men bề mặt

- Lên men chìm

• QUY TRÌNH LÊN MEN BỀ MẶT:

Áp dụng từ lâu, hiện nay hầu như không còn được triển khai trong sản xuất lớn nữa.Gồm 2 phương pháp:

• Lên men trên nguyên liệu rắn (cám mì, cám ngô có bổ sung đường lactose)

• Lên men trên bề mặt môi trường lỏng tĩnh (phổ biến sử dụng môi trường cơ bảnlactose - nước chiết ngô)

Penicillin chrysogenum

tỉ lệ 5-10%

 Quá trình nhân giống

Quá trình nhân giống bắt đầu từ giống có trong ống nghiệm Trong các nhà máy, mỗilần cấy truyền giống, người ta thường cấy làm 3 ống Một ống dùng kiểm tra trước khi sảnxuất, một ống dùng để sản xuất và một ống dùng để bảo quản

Song song đó, người ta chuẩn bị một bình tam giác dung tích 200 – 250 ml và chuẩn bị

50 g môi trường như phần trình bày ở trên Môi trường đã được thanh trùng và làm nguộiđến 30oC

Đổ 10ml đã thanh trùng và làm nguội vào ống giống, dùng que thủy tinh đánh cho bào

tử hòa trộn với nước Bằng biện pháp vô trùng (thực hiện trong các tủ nuôi cấy vô trùng)chuyển toàn bộ vào bình tam giác trên lắc cho thật đều và chuyển chúng sang tủ ấm 30 –

37oC Nuôi trong điều kiện này chi đến khi bào tử nấm xuất hiện và phát triển đều khắp môitrường

Ta gọi quá trình thực hiện như trên là quá trình nhân giống cấp 1 Cứ lần lượt thực hiệntiếp ta có giống cấp 2, cấp 3…cho đến khi đủ 5 – 10% giống cho sản xuất Mỗi một cấp độnhân giống từ cấp này sang cấp khác, khối lượng môi trường tăng từ 10 – 15 lần

 Quá trình lên men

Đối với phương pháp lên men trên nguyên liệu rắn (cám mì, cám ngô có bổ sungđường lactose), khi môi trường đã được khử trùng và làm nguội đến 30oC, tiến hành trộngiống vào với tỷ lệ từ 5 – 10% Các khay được xếp chồng lên nhau trên những giá đỡ có mộtkhoảng cách nhất định để thoáng khí và thoáng nhiệt Quá trình lên men kéo dài 6 – 7 ngày

ở nhiệt độ 24 – 28oC Ưu điểm của phương pháp này là đường lactose được nấm mốc đồnghóa chậm nên không xảy ra hiện tượng dư thừa đường trong tế bào, còn dịch nước chiếtngô cung cấp cho nấm mốc nguồn thức ăn nitơ, các chất khoáng và các chất sinh trưởng,trong đó phenylalanin khi bị thủy phân sẽ tạo thành phenylacetic cung cấp tiền chất tạo mạchnhánh cho phân tử penicillin

Khi lên men trong môi trường lỏng, áp dụng công nghệ bổ sung liên tục phenylaceticvào môi trường lên men, hàm lượng bổ sung phụ thuộc pH môi trường thường là 0,2-0,8 kgphenylacetic/m3 dịch lên men Dung dịch lên men sau khi được khử trùng sẽ được phân phốivào các khay có kích thước giống các khay nuôi cấy bề mặt với môi trường bán rắn Ở đáycác khay này không được đục lỗ vì phải chứa môi trường lỏng Chiều cao của dung dịch môitrường trong các khay là 3 – 4 cm người ta cũng tiến hành lên men trong khoảng thời gian 6

– 7 ngày ở nhiệt độ lên men là 24 – 28oC Tiến hành lên men trong điều kiện môi trường lỏngnày, lượng penicillin G được tổng hợp tăng rõ rệt còn hàm lượng các penicillin khác cũnggiảm đi Để hạn chế quá trình oxy hóa tiền chất, thường phải bổ sung vào môi trường mộtlượng nhỏ axit axetic Trong kỹ thuật lên men lỏng gián đoạn không điều chỉnh pH môitrường thường tăng nhẹ, sau đó tương đối ổn định và vào cuối quá trình lên men thườngtrong khoảng pH = 6,8 – 7.4 Khi sử dụng cơ chất chính là lactose, người ta đã xác địnhđược penicillin chỉ được tổng hợp và tích tụ mạnh mẽ trong môi trường khi nấm mốc đã sửdụng đường này và khi lactose có dấu hiệu cạn kiệt thì sợi nấm cũng bắt đầu tự phân Vì vậyngười ta thường kết thúc quá trình lên men vào thời điểm sắp hết đường lactose.

• QUY TRÌNH LÊN MEN CHÌM:

a. Chuẩn bị lên men (Chuẩn bị môi trường nhân giống và lên men):

• Nhân giống người ta cũng chuẩn bị như môi trường lên men nhưng chúng

không chứa lactose (nếu có chỉ chứa một lượng rất nhỏ), một số khoáng chất vàtiền khoáng chất Mặt khác thành phần môi trường nhân giống cần được tính

toán để đảm bảo cung cấp đủ nguồn thức ăn C, N, các chất khoáng và cácthành phần khác, đảm bảo cho sự hình thành và phát triển thuận lợi của pellet

• Môi trường lên men:

• Thanh trùng môi trường: môi trường lên men và nhân giống đều được Thanh

trùng gián đoạn ở 1210C ( hay thanh trùng liên tục ở khoảng 140-1460C) trong 30phút

• Khử trùng thiết bị; Phải được vô khuẩn trước khi đưa vào sử dụng Thường

thanh trùng bằng hơi quá nhiệt 2,5 – 3,0 at trong thời gian 3 giờ Đông thời khửkhuẩn nghiêm ngặt tất cả các hệ thống ống dẫn, khớp nối, van, phin lọc và tất cảcác thiết bị phụ trợ khác….Trong quá trình lên men luuôn cố gắng duy trì áp suất

dư trong thiết bị nhằm hạn chế rũi ro do nhiễm tạp Không khí thường được khửkhuẩn sơ bộ bằng nén đoạn nhiệt, sau đó qua màng lọc vô khuẩn hay màng siêulọc

• Nhân giống: Trong quá trình lên men chìm người ta nhân giống trong môi

trường lỏng Mục đích của quá trình nhân giống là thu nhận được số lượng tếbào cao( thường tính tổng lượng tế bào/ml) tỉ lệ cây giống 10%, với mật độ dịchgiống (2-10).1011 bào tử /m3; phối hợp điều chỉnh giữa sục khí và khuấy trộn đểđảm bảo cung cấp oxy hòa tan dư so với nhu cầu tương ứng với thời điểm lênmen, và để tạo ra pellet mịn và nhỏ (kích thước pellet thích hợp nhất khoảng 0,2

- 0,5mm) Người ta thường nhân giống vào các bình lên men dung tích từ 1 lít

cho đến hàng ngàn lít Nhiệt độ trong quá trình nhân giống duy trì ở khoảng 26 ±

1oC và thời gian nhân giống ở mỗi cấp độ khoảng 72 giờ

b. Quá trình lên men:

Quá trình lên men trong môi trường lỏng bằng phương pháp lên men chìm để sản xuấtpenicillin được vận hành theo phương pháp lên men hai pha:

- Pha thứ nhất nuôi thu sinh khối trong khoảng 2 – 3 ngày Trong pha này hệ sợi

phát triển rất mạnh vì các chất dinh dưỡng dễ đồng hóa sẽ được tế bào hấp thụ rấtmạnh, tốc độ sinh sản của nấm xảy ra rất nhanh, sự tạo thành penicillin mới bắtđầu ở pha này penicilium cần được bổ sung lien tục lượng glucose để hệ sợi pháttriển pellet đạt sô lượng và yêu cầu ngoài ra cần bổ sung dầu béo để phá bọt.nhiệt độ trong pha này ta giữ ở 30 độ C

- Pha thứ hai lên men thu sản phẩm thời gian pha này là 144-180 giờ Ở pha này

hệ sợi phát triển chậm lại, pH tăng dần và đạt đến giá trị khoảng 7,5 Trong phanày penicillin được tạo thành với mức độ cực đại để lượng penicillin được tạo ranhiều cần bổ sung đủ lượng lactose cùng các tiền chất kích thích tạo ra penicillin vhay penicillin G(tùy vào mục tiêu sản xuất) nhiệt độ tối ưu trong quá trình này là 22– 25C

Ngoài ra trong suốt quá trình lên men lưu ý:

- Độ thông khí: sục khí(1,2-1.5V/phut) và khuấy trộn

- Nguồn dinh dưỡng N và S: Ngoài nguồn nitơ trong nước chiết ngô, người tathường sử dụng phối hợp (NH4)2SO4 để vừa cung cấp thức ăn N và S, vừa sửdụng để điều chỉnh pH trong quá trình lên men (pH dịch len men ban đầu thườngđược điều chỉnh về khoảng pH = 6,5 – 6,8 bằng dung dịch NaOH hoặc H3PO4);nồng độ NH4 + thường khống chế trong khoảng 0,3 – 0,4 kg/m3 dịch lên men

- pH điểu chỉnh ở điều kiện: 7-7,4

Kết thúc quá trình lên men người ta cố gắng lọc sớm dịch lên men, làm lạnh rồi chuyểnsang công đoạn trích ly và tinh chế thu penicillin