căn nguyên nấm gõy viờm loột giác mạc phân lập được tại Viện Mắt Trung ương

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Viờm loét giác mạc bệnh phổ biến nước phát triển, dẫn đến mờ đục giác mạc, giảm thị lực trầm trọng, nguyên nhân nguyên nhân gõy mự lòa bệnh lý giác mạc [24], [37],[43] Viờm loét giác mạc nhiều nguyên nhân gây nên như: vi khuẩn, nấm, virus, ký sinh trùng, nguyên nhân chưa rõ ràng [30] Theo báo cáo gần đây, tỉ lệ viờm loột giác mạc nấm ngày tăng, chiếm tới 16% đến 37% trường hợp viờm loột giác mạc [12],[16], [18],[35], [24] Viờm loét giác mạc nấm bệnh lý nặng nề mắt, điều trị chẩn đoán sớm kịp thời Việc chẩn đoán xác định sớm nguyên nấm gõy viờm loột giác mạc có ý nghĩa quan trọng giúp cho việc sử dụng thuốc chống nấm thực từ đầu, làm tăng hiệu thuốc chống nấm, giảm thời gian chi phí điều trị, giảm thiểu tối đa hình thành sẹo đục gây giảm thị lực Hiện nay, chẩn đoán nguyên nấm gõy viờm loột giác mạc chủ yếu dựa vào hình ảnh tổn thương lâm sàng kết nhuộm soi, nuôi cấy phân lập nấm, chủ yếu dựa hình thái học để định danh nguyên nấm Tuy nhiên, thực tế có nhiều loại nấm gây bệnh cảnh lâm sàng không điển hình không dễ cho việc chẩn đoán Kỹ thuật nhuộm soi có độ nhạy thấp [11], kỹ thuật nuôi cấy phân lập nấm có thất bại loài nấm khó nuụi cấy chưa nuôi cấy Do mà bỏ sút khụng chẩn đoán tỉ lệ lớn trường hợp bị bệnh Trong trường hợp nuôi cấy nấm để định danh tính chất sinh vật hóa học không đơn giản sẵn có, thời gian lâu vài ngày đến vài tuần làm chậm tốc độ trình điều trị Vì vậy, việc định danh xác nguyên nấm gõy viờm loột giác mạc Việt Nam chưa thực đầy đủ Các nghiên cứu loài nấm gõy viờm loột giác mạc Việt Nam có chủ yếu dựa tiêu chuẩn hình thái học Định danh xác loại nấm gõy viờm loột giác mạc, mô tả mối liên quan nguyên nấm với số yếu tố dịch tễ học, nhận định nguyên lưu hành giúp ích cho việc điều trị tốt bệnh nhân Từ đó, số trường hợp cỏc bỏc sỹ lâm sàng dựa vào nguyên thường gặp,đang lưu hành mà có hướng điều trị ban đầu chưa có kết định danh Kỹ thuật giải trình tự gen định danh nguyên nấm gõy viờm loột giác mạc có tính ưu việt nhiều so với phương pháp định danh kinh điển nhuộm soi nuôi cấy [23],[24],[28][29],[30] Kỹ thuật cho phép định danh xác nguyờn gõy viờm loột giác mạc mức độ chi Tại Việt Nam cú số nghiên cứu nguyên nấm gõy viờm loột giác mạc báo cáo Tuy vậy, chưa có nghiên cứu đầy đủ, xác nguyên nấm gây VLGM Chính mà tiến hành nghiên cứu với mục tiêu: Định danh nguyên nấm gõy viờm loột giác mạc phân lậpđược Viện Mắt Trung ương Mô tả số đặc điểm dịch tễ học liên quan tới nguyên nấm gõy viờm loột giác mạc CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Viờm loét giác mạc Giác mạc mảnh mô suốt nằm phía trước ngươi, độ dày giác mạc không đồng Giác mạc bình thường mạch máu, dinh dưỡng chủ yếu nhờ thẩm thấu từ vựng rỡa vào hai cung mạch nông sâu, nhờ thủy dịch nước mắt Giác mạc cấu tạo gồm năm lớp từ trước sau: biểu mô, màng Bowman, nhu mô, màng Descemet, nội mô Biểu mô giác mạc thuộc loại biểu mụ lỏt tầng, chiếm khoảng 1/10 chiều dày giác mạc, chia thành ba phần: màng đáy, lớp tế bào phim nước mắt Viờm loét giác mạc tình trạng lớp biểu mô giác mạc kèm theo nhiễm vi khuẩn, nấm, virus, ký sinh trùng vào lớp nhu mô biểu mô giác mạc Viờm loột giác mạc bệnh thường gặp tỷ lệ dẫn đến mù lòa cao Bệnh thường xảy sau bị dị vật giác mạc bụi, mạt sắt, hạt thóc sau bị chấn thương vào giác mạc cành cây, cây, lỏ lỳa, xuất tự nhiên Khi bị bệnh, bệnh nhân thấy cộm chói, chảy nước mắt, đỏ mắt nhìn mờ Viờm loét giác mạc bệnh nguy hiểm vỡ nú để lại di chứng vĩnh viễn sẹo giác mạc, teo nhãn, lồi mắt cua làm phần toàn thị lực Viờm loét giác mạc xuất tự nhiên đa số có yếu tố khởi phát tổn thương lớp biểu mô nguyên nhân ngoại lai Có nhiều yếu tố nguy gõy viờm loột giác mạc nấm, thường gặp chấn thương (lỏ lỳa quệt vào,hạt bụi, mạt sắt,…) Ngoài ra, việc sử dụng kính tiếp xúc, can thiệp phẫu thuật vào bề mặt giác mạc (mổ mộng, mổ thể thủy tinh, ), bệnh mạn tính bề mặt nhãn cầu, khô mắt, … nguy gõy viờm loột giác mạc nấm 1.2 Căn nguyên gõy viờm loột giác mạc Các nguyên gõy viờm loột giác mạc thường gặp là: vi khuẩn, nấm, virus Cơ cấu nguyên nhân gây VLGM có thay đổi theo thời gian vùng địa lý khác Tại Việt Nam, theo Phạm Ngọc Đụng,Hoàng Thị Minh Châu (2007), tỷ lệ VLGM nấm 59,8%, vi khuẩn 29,4%, virus 9,1%, amip 1,8% [3] Theo Hoàng Năng Trọng, tỷ lệ VLGM vi khuẩn 30,1%, nấm 23,3%, không phát amip[18] 1.2.1.Vi khuẩn Nhiều vi khuẩn gõy viờm loột giác mạc Tỷ lệ loài vi khuẩn khác thay đổi theo thời gian vùng địa lý Theo số tác giả, vi khuẩn gây bệnh gặp là: Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas spp, Enterobacteriaceae,Moraxella spp, Streptococcus pyogenes, Enterobacteriacea…[12],[13],[42],[47] 1.2.2 Nấm Có 70 loại nấm khác gây viờm loét giác mạc [30], [34], [40] Nấm thường gây bệnh giác mạc bị tổn thương sau sang chấn [24] Nấm phân lập từ mi mắt túi kết mạc người bình thường, đặc biệt người làm việc trời [38] Nấm có cấu trúc giống thực vật, thô sơ, không di động, không chứa chất diệp lục, sống cộng sinh, ký sinh hay hoại sinh Nấm phát triển nhiệt độ từ 0-37oC, tốt từ 20-30oC Màng tế bào nấm chứa nhiều sterol Nấm phân biệt với vi khuẩn có mặt hạt nhân, ty thể, ribosom 80-S, tiêu thể trung tâm ưa thích môi trường acid[] Có nhiều cách phân loại nấm, người ta thường phân thành nhóm: nấm sợi nấm men để tiện cho xét nghiệm chẩn đoán lựa chọn thuốc điều trị Nấm sợi vi sinh vật đa bào, gồm sợi có nhánh dài, rõ rệt Nấm men bao gồm chủ yếu loài Candida, sinh vật đơn bào có hình tròn ô- van Cả nấm sợi nấm men có khả gõy viờm loột giác mạc Lần Leber (1879) phát nấm gây bệnh giác mạc Viờm loột giác mạc nấm phổ biến nước nhiệt đới Theo Dunlop, tỷ lệ viờm loột giác mạc nấm Bangladesh 35,9% [27] Theo Srinivasan cộng sự, miền Nam Ấn Độ tỷ lệ VLGM nấm 44% [42] Việt Nam , trường hợp nhiễm nấm giác mạc phát vào năm 1965 [18] Từ tới số bệnh nhân nhiễm nấm giác mạc ngày tăng Các loại nấm gây bệnh giác mạc là: Fusarium, Aspergillus, Acremonium, Penicillium, Curvularia, Candida, , [34], [40], [41] Theo Maurin Cornand [36], nước nhiệt đới thường gặp Aspergillus Fusarium Ở nước ôn đới thường gặp nấm Candida Đối với viờm loột giác mạc nấm, tỉ lệ gây bệnh chủng có thay đổi theo năm Theo số nhà khoa học Ấn Độ, 623 bệnh nhân viờm loột giác mạc nấm có nuôi cấy dương tính miền Đông Ấn Độ từ tháng 1/ 2001 – 12/2003 có 373 trường hợp nhiễm Aspergillus spp (59,8 %), 132 trường hợp nhiễm Fusarium spp (21,2%) [24],[25] Theo nghiên cứu bệnh viện Mắt Bắc Kinh từ năm 1989 đến năm 2000, có 58,7% nhiễm Fusarium spp, 16,8% nhiễm Aspergillus spp, 6,3% nhiễm Mycelia sterilia 5,7% nhiễm Alternaria spp[43] Fusarium Fusarium solani tác nhân gây nhiễm nấm giác mạc báo cáo có mặt tất cỏc vựng trờn giới, đặc biệt vựng cú khí hậu nóng [40] Aspergillus hay gặp Aspergillus Fumigatus (90%) tác nhân phổ biến gây VLGM nấm sợi trường hợp báo cáo Ấn Độ [24] Ở Florida cỏc vựng miền nam nước Mỹ, Aspergillus gặp loài nấm khỏc gõy viờm loột giác mạc [34], [39], [40] Candida albicans loại nấm chớnh gõy viờm loột giác mạc miền Bắc nước Mỹ Trước năm 1990, Nguyễn Hiền Nguyễn Duy Tân, nghiên cứu Viện Mắt Trung ương cho biết nấm gõy viờm loột giác mạc đứng hàng đầu Aspergillus [4] Theo Trần Thu Phương (1994-1995) Aspergillus đứng đầu.Theo Thỏi Lờ Na (2006) nấm Fusarium chiếm tỷ lệ cao (43,3%), tiếp đến Aspergillus (17,9%) [7] 1.2.3 Virus Các loại virus gây VLGM :Herpes simplex, herpes Zoster Thường gặp Herpes simplex virus Virus Herpes nằm họ Herpesvirinae Bệnh Herpes giác mạc thường gặp lứa tuổi trẻ Sauk hi vào thể, virus tiềm tàng hạch thần kinh không gây bệnh, song gặp điều kiện thuận lợi như: thể bị sốt bị nhiễm trựng, cỏc vi chấn thương mắt,… virus tái hoạt gõy viờm tái phát 1.2.4 Căn nguyên khác Ngoài ra, gặp viờm loột giác mạc Acanthamoeba Nhiễm Acanthamoeba giác mạc thường gặp sau chấn thương giác mạc mà tác nhân cành cây, côn trùng, nước, mùn cưa, chất bẩn, bụi bặm [33] 1.3 Phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm nguyên nấm gõy viờm loột giác mạc Hiện nay, có nhiều phương pháp dùng để chẩn đoán nguyên nấm 1.3.1 Soi tươi Kỹ thuật đơn giản, cho kết nhanh ,nhận định nhanh tác nhân gây bệnh, độ nhạy thấp nên bỏ sót tỷ lệ lớn trường hợp bị bệnh Xét nghiệm nhận biết bệnh phẩm có vi khuẩn hay nấm, không xác định loài nấm 1.3.2.Nhuộm soi Cho phép nhận định nhanh tác nhân gây bệnh, độ nhạy thấp nên bỏ sót nguyên gây bệnh Có nhiều kỹ thuật nhuộm để tìm nấm nhuộm Gram, Giờmsa, KOH 10%, Lactophenol Nhuộm Gram Giờmsa khụng nhuộm vách tế bào vách ngăn sợi nấm chất nguyên sinh nấm sợi hấp thụ thuốc nhuộm [24] Nhuộm soi cho phép phân biệt nấm sợi hay nấm men, giúp sơ cho chẩn đoán hướng điều trị Cũng không định danh loại nấm 1.3.3.Nuôi cấy phân lập Thạch Sabouraud cho thêm Gentamycin nhiệt độ phòng môi trường nhạy cảm cho việc phân lập nấm Hình thái kính hiển vi ,đặc điểm môi trường nuôi cấy, màu sắc, tốc độ phát triển sắc tố phía đặc điểm để nhận định sơ loài nấm Bệnh phẩm lấy đem cấy vào môi trường Sabouraud Nếu có nấm mọc sau 2-3 ngày Nhưng có trường hợp thời gian lâu hơn, 5-7 ngày ,thậm chí tới tuần [6] Có nhiều loại nấm khó nuôi cấy chưa nuôi cấy Để định danh xác loại nấm cần phải qua nuôi cấy sau làm thử nghiệm tính chất sinh vật hóa học( thử nghiệm đồng hóa đường,phân giải ure,…) Nhưng nay, thực tế tính chất sinh vật hóa học để định danh nấm phức tạp, không sẵn có nờn làm được.Bờn cạnh đú, trờn thị trường có giá đường để giúp định danh nấm giá thành đắt tính chất không đủ Trong xét nghiệm vi sinh định danh vi nấm có lẽ trở ngại lớn Vì sử dụng phương pháp kinh điển không phân tích hình thái đại thể vi thể, phức tạp công phu, mà phải làm cho khảo sát sinh vật hóa học khác đồng hóa đường, phân tích chất biến dưỡng,…Chớnh thông thường có phòng xét nghiệm vi sinh làm xét nghiệm định danh vi nấm PCR công cụ giúp hoàn thiện mở rộng phổ áp dụng kỹ thuật giải trình tự Giải trình tự gen nấm dựa vào ngân hàng gen nấm đối chiếu cho phép định danh xác nguyên nấm Tách chiết DNA Những mẫu bệnh phẩm giữ ống eppendorf lấy tách chiết DNA DNA tách chiết kít MasterPure TM DNA purification kit (USA) Quy trình thực theo hướng dẫn nhà sản xuất PCR sử dụng cặp mồi ITS1 ITS4 (AlphaDNA, Canada) [29] khuếch đại đoạn gen ITS (intergenic transcribed spacer) nằm đoạn gen mã hóa cho tiểu phần 18S 28S RNA ribosom Mỗi ống PCR chứa 25ml thành phần với nồng độ sau: MgCL2 2mM; dNTPs, 200mM loại, AmpliTaq polymerase, 0,025UI; cặp mồi, 5ml DNA khuôn mẫu Sản phẩm 550bp -Giải trình tự gene : PCR dựa giải trình tự gen nhằm vào vùng ITS thực ABI Prism 3100 AVANT (Applied Biosystems, Foster City, USA) Giải trình tự nấm dựa vào phân tích BLAST để xác định chi / loài nấm Từ kết giải trình tự dựa vào ngân hàng gen nấm để định danh nấm 10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng Các chủng nấm gõy viờm loột giác mạc phân lập Viện Mắt Trung ương năm 2008, kèm theo hồ sơ thông tin bệnh nhân Các chủng giữ môn Vi sinh Trường Đại học Y Hà nội 2.2 Vật liệu nghiên cứu -Sổ sách, giấy tờ ghi chép -Vật liệu giữ chủng: nước cất, ống eppendorff, que cấy, đèn cồn,… -Sinh phẩm dùng cho tách chiết DNA: Bộ kít MasterPureTMDNA Purification Kit (Mỹ) -Sinh phẩm, hóa chất, cụng cụ, máy móc dùng PCR, giải trình tự gen + Sinh phẩm: Cặp mồi ITS1 (5’ – TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) ITS4 (5’GCATATCAATAAGCGGAGGA -3’) (AlphaDNA, Canada) [29] khuếch đại đoạn gen ITS nằm đoạn gen mã hóa cho tiểu phần 18S 28S RNA ribosom Mỗi ống PCR chứa 25ml thành phần với nồng độ sau: MgCl2, 2mM; dNTPs, 200mM loại, Ampli Taq Polymerase, 0,25UI; cặp mồi 5ml DNA khuôn mẫu Kít tinh sản phẩm PCR: Big DyeTM Purification kit (Mỹ) Kít giải trình tự gen: Big Dyeđ XTerminator (Mỹ) 21 Biểu đồ 3.1.2 Phân bố nấm sợi nấm tế bào 3.2.Một số đặc diểm dịch tễ học liên quan đến nguyên nấm gây VLGM 3.2.1.Phân bố nguyên theo mùa Biểu đồ3 2.1.Căn nguyên nấm gây VLGM theo mùa 22 3.2.2.Phân bố nguyên theo yếu tố nguy Bảng3 2.2 Phân bố nguyên nấm theo yếu tố nguy Căn nguyên nấm Aspergillus Fusarium Candida … Tổng số Tác nhân Chấn thương Các bệnh mắt mạn tính Các bệnh suy giảm miễn dịch Kính tiếp xúc Tỷ lệ % 3.2.3.Phân bố nguyên theo nghề nghiệp Bảng3.2 3.Phân bố nguyên theo nghề nghiệp Căn nguyên Aspergillus Fusarium Candida … Tổng số Số lượng Nông dân Công nhân Học sinh … % 23 CHƯƠNG DỰ KIẾN BÀN LUẬN Các loài nấm định danh xác nhanh PCR-giải trình tự gen Tỉ lệ loài nấm gây VLGM nghiên cứu là: … Có thay đổi so với nghiên cứu khác … Loại nấm gây VLGM có liên quan đến yếu tố nguy bệnh: mùa, nghề nghiệp,chấn thương,… 24 DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ Nên có nhiều nghiên cứu cụ thể nguyên nấm gõy viờm loột giác mạc Nếu định danh làm kháng sinh đồ để giúp điều trị tốt hơn, nghiên cứu tình hình kháng thuốc,… KINH PHÍ -Chi phí cho giữ chủng: -Sinh phẩm, hóa chất: -Chi phí khác: triệu 50 triệu 15 triệu ( Lấy từ nguồn vốn đầu tư đề tài cấp bộ) TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt Nguyễn Duy Anh Nhiễm nấm giác mạc tác dụng thuốc điều trị Luận văn thạc sỹ y học.1996 Trường Đại Học Y Hà nội Hoàng Thị Minh Châu Viờm loột giác mạc Nhãn khoa giản yếu 2004 (1): 153-161 Phạm Ngọc Đông, Hoàng Thị Minh Châu Đặc điểm viờm loột giác mạc nhiễm khuẩn Viện Mắt Trung ương.Tạp chí nghiên cứu y học 2007(50):92-97 Nguyễn Hiền, Nguyễn Duy Tân, Võ Thế Sao, Nguyễn Quý Phi.Nghiờn cứu cỏc loột giác mạc nấm Tạp chí y học Việt Nam 1997 Đoàn Thỳy Hũa, Phạm văn Tần Nhận xét tình hình viờm loột giác mạc nấm điều trị Viện Mắt Trung ương năm 2004 Kỷ yếu hội nghị nhãn khoa toàn quốc 2005 Vũ Thị Tuệ Khanh, Lê thị ngọc Lan, Hoàng thị minh Châu Đặc điểm lâm sàng bệnh VLGM nấm khoa kết giác mạc Bệnh viện Mắt Trung ương Tạp chí nghiên cứu y học 2006 (41,2): 54-57 Thỏi Lê Na Đánh giá hiệu điều trị viờm loột giác mạc nấm phối hợp Amphotericin B chỗ Itraconazole toàn thân Luận văn thạc sỹ y học Trường Đại học Y Hà nội 2006 Lê Hồng Nga cộng Kết nuôi cấy vi khuẩn nấm Viện Mắt từ năm 1991-1996 Nội san nhãn khoa 1996 (2): 39-43 Nguyễn Đỡnh Ngõn Nghiên cứu ghép màng ối điều trị loét Mooren Luận văn thạc sỹ y học Học viện Quân y 2006 10 Đỗ Thu Nhàn, Nguyễn Thị Ngân Hà Điều trị 80 ca viờm loột giác mạc nấm tháng cuối năm 1990 Kỷ yếu hội nghị khoa học kỹ thuật nghành Mắt 1991: 55-59 11 Phạm Hồng Nhung, Nguyễn Vũ Trung, Lê Hồng Ngọc, Phạm thị thu Lan, Trần Anh Thư Chẩn đoán nhanh viờm loột giác mạc nấm kỹ thuật Semi-nested PCR Tạp chí nghiên cứu y học.2008 (56): 46-50 12 Lê Anh Tâm Nghiên cứu tình hình VLGM Bệnh viện Mắt Trung ương 10 năm (1998-2007) Luận văn thạc sỹ y học Trường Đại học Y Hà nội 2008 13 Nguyễn Duy Tân cộng Nhiễm nấm giác mạc- Nhận định nguyên nhân, lâm sàng, giải phẫu điều trị qua 15 năm Kỷ yếu hội nghị khoa học kỹ thuật nghành Mắt.1991 14 Trần Tất Thắng Đánh giá hiệu điều trị bệnh loét giác mạc vi khuẩn nhóm kháng sinh Fluoroquinolon Luận văn thạc sỹ y học Trường Đại học Y Hà nội 1999 15 Hoàng Năng Trọng, Lê Quang Hoành Chấn thương mắt nông nghiệp điều trị sở Nhãn khoa Thái Bình năm 1996 Kỷ yếu hội nghị khoa học nghiên cứu sinh lần thứ Trường Đại học Y Hà nội 1997 16 Hoàng Năng Trọng, Hoàng Thị Phúc, Đinh Thị Khánh Tình hình viờm loột giác mạc chấn thương mắt nông nghiệp Nội san nhãn khoa 1998 (1): 52-55 17 Hoàng Năng Trọng Nghiên cứu hậu mù lòa chấn thương mắt nông nghiệp Thái Bình hiệu bước đầu biện pháp can thiệp cộng đồng Luận án Tiến sỹ y học Trường Đại học Y Hà nội 2002 18 Hoàng Năng Trọng Nghiên cứu tác nhân vi sinh vật gây bệnh kết phòng chống viờm loột giác mạc vùng Đồng Bắc Đề tài cấp , Trường Đại học Y Thái Bình 2007 19 Lê Thị Tuyết Tình hình nhiễm nấm bệnh nhân bị viêm giác mạc mắt đến xét nghiệm phòng ký sinh trùng- Bệnh viện Đại học Y Thái Bình Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét bệnh ký sinh trùng 2007 (3) 20 Phạm Thị Khỏnh Võn, Nguyễn Phương Mai Nhận xét tình hình viờm loột giác mạc điều trị khoa Mắt hột- Giác mạc Viện Mắt Trung ương năm 1999 Kỷ yếu hội nghị nhãn khoa toàn quốc Vũng Tàu.12/ 2000 Tài liệu tham khảo tiêng Anh 21 Anderson Kl, Mitras Fungal keratitis caused by Paecilomyces Lilacinous associated witha retained intraocular hair Cornea 2004 (23) 22 Appakkudal R Anand Et al Use of PCR in the Diagnosis of Fungal Endophthalmitis By the American Academy of Ophthalmology Published by Elsevier Science Inc 2001: 326-330 23 Bagyalakshmi R et al Newer Emerging pathogen of ocular non-Sporulating Molds Identified by PCR-based DNA Sequencing Technique Targeting ITS Region L and T Microbiology Chennai, India 2007: 139-147 24 Basak S K, Basak S., Mohanta A., et al Epidemiological and Microbiological diagnosis of supperative keratitis in Gangetic West Bengal, Eastern India Indian J Ophthalmol.2005 (53): 17-22 25 Basak S.K, Mohanta A, Bhowmick A Intracameral amphotericin B in deep keratomycosis with hypopyon :a randomized controlled clinical trial Final program, American Academy of Ophthalmology 2004: 176 26 Chowdhary A, SinghK Spectrum of fungal keratitis in North India Cornea 2005 (24): 8-15 27 Dunlop AAS,Wright ED, Howlader SA Suppurative corneal ulceration in Banglades Aust,NZJ.Ophthal.1994, 22(2): 105-110 28 Embong Z, et al Specific detection of Fungal pathogens by 18S rRNA gene PCR in microbial keratitis BMC Ophthalmol.2008 In press 29 Ferrer C, Colom F, Frasels, Mulet E, Abad JL, Alio JL Detection and identification of fungal pathogens by PCR and by ITS2 and 5,8S ribosomal DNA typing in ocular infection J.clin Microbiol 2001(39): 2873-2879 30 Ghosh A, et al Evaluation of PCR- based ribosomal DNA sequencing, technique for the diagnosis of mycotic keratitis Am J Ophthalmol 2007(144): 396-403 31 Gopinathan U, Garq P Fernandes M, et al The epidemiological results of fungal keratitis: a 10- year review at a referral eye care center in South India Cornea 2002, 21(6): 555-559 32 Janure M.A, CohenE.J, Sudesh S,et al Spectrum of fungal keretitis at Wills eye Hospital, Philadenphia, Pennsylvania 2000 Cornea,19(3): 307-312 33 Juan- Carlos Abad Parasitic and Ricketsial Ocular infections: Protozoa: Acanthamoeba Ophthalmology 2000 (1, 14): 137-140 34 Liesegang T J., Foster R F Spectrum of microbial keratitis in South Florida Am J Ophthalmol 1980 (90): 38-47 35 Mancini N, Perotti M, et al Rapid molecular identification of Fungal pathogens in corneal samples from Suspected Keratomycosis case J Med Microbiol 2006 (55): 1505-1509 36 Maurin JF, Cornand G Corneal blindness in tropical envirement Rev Int Trach Pathol Ocul Trop Subtrop Santz Publique 1990 (67): 23-138 37 Miller D Ocular infection 2007: 1072-1103 38 Oliver D Schein, et al Microbial keratitis Associated with contaminated Ocular Medication A JO, Apr15 1998 (105): 361-364 39 Polack F M, et al Keratomycosis: Medical and Surgical treatment Arch Ophthalmol 1971 (85): 410-416 40 Rosa R H, et al The changing Spectrum of fungal keratitis in South Florida Ophthalmology 1994 (101): 1005-1013 41 Sharmas, et al The current Status of fusarium speaes in mycotic keratitis in South India J Med Microbial 1993 (11): 140-147 42 Srinivasan M, et al Epidemiology and aetiological diagnosis of corneal ulceration in Madurai, South India Br J Ophthalmol 1997 (81): 965-971 43 Sun S J., et al Etiological analysis on ocular fungal infection in the period of 1989-2000 Chin Med J 2004 (117): 598-600 44 Suman Saha, et al Epidemiological profile of fungal keratitis in urban population of West Bengal, India 2009: 1-10 45 Thomas E, et al Microbial keratitis in children A J O Jan 1994 (177): 65-70 46 Thomas PA Fungal infections of the cornea Eye 2003 (17): 852-862 47 Wright E, Foster A Suppurative keratitis: a blinding corneal infection Comm.Eye health 1998 (2): 5-7 CÁC TỪ VIẾT TẮT DNA : Deoxy Nucleotide Acid PCR : Polymerase Chain Reaction VLGM : Viờm loét giác mạc ITS : Intergenic Transcribed Spacer MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1.Viờm loét giác mạc .3 1.2 Căn nguyên gõy viờm loột giác mạc 1.2.1.Vi khuẩn .4 1.2.2 Nấm 1.2.3 Virus 1.2.4 Căn nguyên khác 1.3 Phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm nguyên nấm gõy viờm loột giác mạc 1.3.1 Soi tươi .7 1.3.2.Nhuộm soi 1.3.3.Nuôi cấy phân lập CHƯƠNG 10 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1 Đối tượng 10 Các chủng nấm gõy viờm loột giác mạc phân lập Viện Mắt Trung ương năm 2008, kèm theo hồ sơ thông tin bệnh nhân Các chủng giữ môn Vi sinh Trường Đại học Y Hà nội .10 2.2 Vật liệu nghiên cứu 10 -Sổ sách, giấy tờ ghi chép .10 -Vật liệu giữ chủng: nước cất, ống eppendorff, que cấy, đèn cồn,… .10 -Sinh phẩm dùng cho tách chiết DNA: Bộ kít MasterPureTMDNA Purification Kit (Mỹ) 10 -Sinh phẩm, hóa chất, cụng cụ, máy móc dùng PCR, giải trình tự gen 10 + Sinh phẩm: 10 Cặp mồi ITS1 (5’ – TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) ITS4 (5’- GCATATCAATAAGCGGAGGA -3’) (AlphaDNA, Canada) [29] khuếch đại đoạn gen ITS nằm đoạn gen mã hóa cho tiểu phần 18S 28S RNA ribosom Mỗi ống PCR chứa 25ml thành phần với nồng độ sau: MgCl2, 2mM; dNTPs, 200mM loại, Ampli Taq Polymerase, 0,25UI; cặp mồi 5ml DNA khuôn mẫu .10 Kít tinh sản phẩm PCR: Big DyeTM Purification kit (Mỹ) 10 Kít giải trình tự gen: Big Dyeđ XTerminator (Mỹ) 10 Kít làm chứng chuẩn để kiểm tra trình giải trình tự gen mẫu nghiên cứu: Big DyeTM Terminator v1 1/ Matrix Standard Kit 11 + Hóa chất 11 Thạch Agarose dùng điện di gen 11 Ethidium bromide dùng để nhuộm gen .11 TAE (Tris Acetate EDTA) 11 PBS (Phosphate buffer Saline) .11 2.3 Dụng cụ máy móc 11 - Máy điều nhiệt tự động GeneAmp PCR System 9700 AB (Applied Biosystem, Mỹ) .11 - Máy ly tâm lạnh 11 - Bộ điện din gang Horizonđ 58 (Gibco-BRL) 11 - Máy soi gen Wealtec Corp Model MD-20 (Mỹ) 11 - Máy chụp ảnh gen .11 - Máy đo nồng độ DNA Bio photometer (Đức) 11 -Máy giải trình tự gen ABI 3130 (Mỹ) .11 2.4 Phương pháp nghiên cứu 11 2.4.1.Thiết kế nghiên cứu 11 2.4.2.Cỡ mẫu nghiên cứu 11 2.4.3.Quy trình nghiên cứu 12 2.4.4 Kỹ thuật 13 2.5 Phân tích số liệu .17 2.6 Thời gian, địa điểm nghiên cứu .17 2.7 Tiến độ thực .17 2.8.Đạo đức nghiên cứu 18 CHƯƠNG 19 DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 19 3.1.Các loại nấm định danh 19 3.1.1 Danh sách tỉ lệ phân bố loài nấm định danh 19 3.1.2.Tỷ lệ phân bố nấm tế bào nấm sợi 20 3.2.Một số đặc diểm dịch tễ học liên quan đến nguyên nấm gây VLGM 21 3.2.1.Phân bố nguyên theo mùa 21 3.2.2.Phân bố nguyên theo yếu tố nguy 22 3.2.3.Phân bố nguyên theo nghề nghiệp .22 CHƯƠNG 23 DỰ KIẾN BÀN LUẬN 23 23 DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ 24 KINH PHÍ 24 24 -Chi phí cho giữ chủng: triệu 24 -Sinh phẩm, hóa chất: 50 triệu 24 -Chi phí khác: 15 triệu 24 ( Lấy từ nguồn vốn đầu tư đề tài cấp bộ) 24 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO .25 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y KHOA HÀ NỘI ĐINH THỊ THANH HUYỀN ĐỊNH DANH CĂN NGUYÊN NẤM GÂY VIÊM LOÉT GIÁC MẠC PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI BỆNH VIỆN MẮT TRUNG ƯƠNG NĂM 2008 BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ GEN Chuyên ngành : Vi Sinh Mã số : 60.72.68 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS PHẠM HỒNG NHUNG HÀ NỘI -2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y KHOA HÀ NỘI ĐINH THỊ THANH HUYỀN ĐỊNH DANH CĂN NGUYÊN NẤM GÂY VIÊM LOÉT GIÁC MẠC PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI BỆNH VIỆN MẮT TRUNG ƯƠNG NĂM 2008 BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ GEN ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC HÀ NỘI -2011 [...]... 3.1.1 Tỉ lệ các căn nguyên nấm định danh được 3.1.2.Tỷ lệ phân bố nấm tế bào và nấm sợi Bảng 3.1.2 .Phân bố nấm sợi và nấm tế bào Nấm sợi Nấm tế bào Tổng số Số chủng nấm % 21 Biểu đồ 3.1.2 Phân bố nấm sợi và nấm tế bào 3.2.Một số đặc diểm dịch tễ học liên quan đến căn nguyên nấm gây VLGM 3.2.1 .Phân bố căn nguyên theo mùa Biểu đồ3 2.1 .Căn nguyên nấm gây VLGM theo mùa 22 3.2.2 .Phân bố căn nguyên theo các... nghiệm căn nguyên nấm gõy viờm loột giác mạc 7 1.3.1 Soi tươi .7 1.3.2.Nhuộm soi 7 1.3.3.Nuôi cấy phân lập 7 CHƯƠNG 2 10 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1 Đối tượng 10 Các chủng nấm gõy viờm loột giác mạc phân lập được tại Viện Mắt Trung ương năm 2008, kèm theo hồ sơ và thông tin bệnh nhân Các chủng này được giữ tại bộ... CĂN NGUYÊN NẤM GÂY VIÊM LOÉT GIÁC MẠC PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI BỆNH VIỆN MẮT TRUNG ƯƠNG NĂM 2008 BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ GEN Chuyên ngành : Vi Sinh Mã số : 60.72.68 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS PHẠM HỒNG NHUNG HÀ NỘI -2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y KHOA HÀ NỘI ĐINH THỊ THANH HUYỀN ĐỊNH DANH CĂN NGUYÊN NẤM GÂY VIÊM LOÉT GIÁC MẠC PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI BỆNH VIỆN MẮT... Quý Phi.Nghiờn cứu về cỏc loột giác mạc do nấm Tạp chí y học Việt Nam 1997 5 Đoàn Thỳy Hũa, Phạm văn Tần Nhận xét tình hình viờm loột giác mạc do nấm điều trị tại Viện Mắt Trung ương năm 2004 Kỷ yếu hội nghị nhãn khoa toàn quốc 2005 6 Vũ Thị Tuệ Khanh, Lê thị ngọc Lan, Hoàng thị minh Châu Đặc điểm lâm sàng của bệnh VLGM do nấm tại khoa kết giác mạc Bệnh viện Mắt Trung ương Tạp chí nghiên cứu y học 2006... 19 3.1.Các loại nấm định danh được 19 3.1.1 Danh sách và tỉ lệ phân bố các loài nấm định danh được 19 3.1.2.Tỷ lệ phân bố nấm tế bào và nấm sợi 20 3.2.Một số đặc diểm dịch tễ học liên quan đến căn nguyên nấm gây VLGM 21 3.2.1 .Phân bố căn nguyên theo mùa 21 3.2.2 .Phân bố căn nguyên theo các yếu tố nguy cơ 22 3.2.3 .Phân bố căn nguyên theo nghề nghiệp... Viờm loét giác mạc ITS : Intergenic Transcribed Spacer MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1 3 TỔNG QUAN .3 1.1 .Viờm loét giác mạc .3 1.2 Căn nguyên gõy viờm loột giác mạc 4 1.2.1.Vi khuẩn .4 1.2.2 Nấm 4 1.2.3 Virus 6 1.2.4 Căn nguyên khác 6 1.3 Phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm căn. .. Y Thái Bình 2007 19 Lê Thị Tuyết Tình hình nhiễm nấm ở bệnh nhân bị viêm giác mạc mắt đến xét nghiệm tại phòng ký sinh trùng- Bệnh viện Đại học Y Thái Bình Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng 2007 (3) 20 Phạm Thị Khỏnh Võn, Nguyễn Phương Mai Nhận xét tình hình viờm loột giác mạc điều trị tại khoa Mắt hột- Giác mạc Viện Mắt Trung ương năm 1999 Kỷ yếu hội nghị nhãn khoa toàn quốc... quy được phép tiến hành tại bệnh viện Mắt Trung ương, được tiến hành bởi các nhân viên y tế đã được đào tạo Xét nghiệm được tiến hành với sự đồng ý của bệnh nhõn,chỳng tụi không tham gia vào quá trình lấy bệnh phẩm và không can thiệp bệnh nhân 19 CHƯƠNG 3 DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1.Các loại nấm định danh được 3.1.1 Danh sách và tỉ lệ phân bố các loài nấm định danh được Từ các chủng đã phân lập được. .. cơ Bảng3 2.2 Phân bố căn nguyên nấm theo các yếu tố nguy cơ Căn nguyên nấm Aspergillus Fusarium Candida … Tổng số Tác nhân Chấn thương Các bệnh mắt mạn tính Các bệnh suy giảm miễn dịch Kính tiếp xúc Tỷ lệ % 3.2.3 .Phân bố căn nguyên theo nghề nghiệp Bảng3.2 3 .Phân bố căn nguyên theo nghề nghiệp Căn nguyên Aspergillus Fusarium Candida … Tổng số Số lượng Nông dân Công nhân Học sinh … % 23 CHƯƠNG 4 DỰ KIẾN... Điều trị 80 ca viờm loột giác mạc do nấm trong 7 tháng cuối năm 1990 Kỷ yếu hội nghị khoa học kỹ thuật nghành Mắt 1991: 55-59 11 Phạm Hồng Nhung, Nguyễn Vũ Trung, Lê Hồng Ngọc, Phạm thị thu Lan, Trần Anh Thư Chẩn đoán nhanh viờm loột giác mạc do nấm bằng kỹ thuật Semi-nested PCR Tạp chí nghiên cứu y học.2008 (56): 46-50 12 Lê Anh Tâm Nghiên cứu tình hình VLGM tại Bệnh viện Mắt Trung ương trong 10 năm