Công nghệ sản xuất chất kháng sinh Erythomycin

Giống xạ khuẩn này có khả năng sinh ra nhiều loại chất kháng sinh: Tetracylin, Vancomycin...., trong đó có Erythromycin.. Từ những năm 1940 đến năm 1960, nhiều kháng sinh mới được phát

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC&CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TIỂU LUẬN

Đề tài:

Công nghệ sản xuất chất kháng sinh Erythomycin

GVHD: TS Phạm Tuấn Anh

MỞ ĐẦU

Sự hiểu biết và nghiên cứu của con người về vi sinh vật là còn rất hạn chế Các nhà khoa học nói rằng những gì chúng ta biết về vi sinh vật hiện nay chỉ là một phần rất nhỏ trong thế giới vi sinh vật Đó là các sinh vật có kích thước rất nhỏ bé nhưng lại có những ảnh hưởng hết sức to lớn Các bệnh đại dịch gây nguy hiểm đến tính mạng con người hiện nay như: HIV, cúm H5N1 đều là do virus gây ra Bên cạnh gây hại cho con người, còn có rất nhiều loài vi sinh vật có ích,có những ứng dụng quan trọng trong đời sống Một trong số đó

là xạ khuẩn Streptomyces Giống xạ khuẩn này có khả năng sinh ra nhiều loại chất kháng

sinh: Tetracylin, Vancomycin , trong đó có Erythromycin

Erythromycin là loại kháng sinh được dùng phổ biến hiện nay, có khả năng chữa nhiều bệnh liên quan đến nhiễm khuẩn Chính vì Erythromycin đóng vai trò rât quan trọng trong điều trị nên nhóm chúng em chọn tìm hiểu đề tài “ Công nghệ sản xuất chất kháng sinh Erythromycin”

NỘI DUNG

1.Giới thiệu chung về chất kháng sinh Erythrmycin

1.1 Lịch sử:

Các bệnh truyền nhiễm chiếm phần lớn trong các bệnh ở người và động vật Từ đầu thế

kỷ 19 tỷ lệ tử vong do nhiễm trùng rất cao, đặc biệt là trong chiến tranh Cho đến nửa sau thế kỷ 19, người ta phát hiện ra rằng chinhsvi sinh vật là thủ phạm gây ra hàng loạt các bệnh truyền nhiễm Con người bắt đầu tập trung tìm hiểu về các loài vi sinh vật và phương pháp điều trị các bệnh do vi sinh vật gây ra

Vào năm 1928, Fleming phát hiện ra chất kháng sinh Penicillin và kháng sinh này đã được dùng điều trị trong những năm 1940 Penicillin đã mở ra kỷ nguyên mới trong điều trị các bệnh do vi sinh vật gây ra

Từ những năm 1940 đến năm 1960, nhiều kháng sinh mới được phát hiện hầu hết từ

xạ khuẩn, và đó trở thành thời kỳ vàng son cho quá trình tổng hợp cũng như điều trị bằng chất kháng sinh

Năm 1952, chất kháng sinh Erythromycin được phát hiện Erythromycin là chất kháng sinh tiểu biểu của nhóm macrolide

- Cho tới những nǎm 1990, erythromycin và một macrolid dùng không thường xuyên là troleandomycin là 2 đại diện của nhóm này Nǎm 1991, azithromycin và clarithromycin được tổng hợp và đưa ra thị trường Nǎm 1995 dirithromycin có mặt trên thị trường

1.2 Đặc điểm:

- Nhóm Macrolide là nhóm kháng sinh có cấu trúc aglycon, nhân lacton, vòng gồm 12-19 carbon Đều chiết ra từ môi trường nuôi cấy nấm streptomyces có cơ chế tác dụng và phổ tác dụng giống nhau

Trong nhóm có 3 phân nhóm:

- Macrolide thực thụ có: erythromycin, oleandomycin, spiramycin, midecamycin, josamycin…

- Macrolide dùng nhiều đường nối đôi, có 4 vòng lacton, thường không có nhánh metyl, chứa ít nhất 4 nối đôi liên hợp, nhóm này thường là các kháng sinh chống nấm: nystatin, amphotericin B, grycefulvin…

- Macrolide trong phân tử có vòng lớn chứa nhân trơn: rifamycin…

Eythromycin Côngthức phân tử R1 R2 AC37H67NO13OHCH3

BC37H67NO12HCH3

CC36H65NO13OHH

C37H67NO13

Erythromycin base là hỗn hợp của 3 Erythromycin A, B, C, chủ yếu là erythromycin A Erythromycin base là dạng bột tinh thể màu trắng hoặc hơi ánh vàng, dễ hút ẩm, tan ít

trog nước (độ tan giảm khi nhiệt độ tăng), tan nhiều trong dung môi hữu cơ: ethanol, methanol, tan trong acid loãng

Cấu trúc hoá học và cấu trúc không gian của Erythromycin

1.3 Phổ tác dụng:

Erythromycin có phổ tác dụng rộng với các vi khuẩn gây bệnh bao gồm các cầu khuẩn

Gram dương, các Streptococcus như Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes Nhiều chủng Staphylococcus aureus vẫn còn nhạy cảm, tuy sự đề kháng tăng lên nhanh Các số liệu trong báo cáo ASTS cho thấy trong những năm gần đây, các Staphylococcus,

Pneumococcus, Streptococcus tan huyết nhóm A kháng erythromycin tăng lên nhiều, tỉ lệ

đề kháng tăng đến 40% (Streptococcus pneumoniae), 55% (Enterococcus faecalis), 51%

(Streptococcus viridans) và 59% (Staphylococcus aureus) Sự kháng erythromycin tăng dần

qua từng năm ở Việt Nam do sự lạm dụng các macrolid Các macrolid nói chung và erythromycin nói riêng phải được hạn chế sử dụng, chỉ dùng khi cần, như vậy mới có cơ may giảm được sự kháng thuốc

Nhiều vi khuẩn Gram dương khác còn nhạy cảm với erythromycin trong đó có: Bacillus

anthracis, Corynebacterium diphteria, Erysipelothris rhusioparthiae; Listeria Listeria

Thuốc có tác dụng trung bình với các vi khuẩn yếm khí như Clostridium spp., các chủng loại Nocardia thay đổi nhạy cảm nhưng Erythromycin vẫn còn tác dụng với

Propionibacterium acnes

Erythromycin có tác dụng với các cầu khuẩn Gram âm như Neisseria meningitidis,

Nesseria gonorrheae và Moraxella (Branhamella) catarrhalis

Các vi khuẩn Gram âm khác có độ nhạy cảm thay đổi nhưng thuốc vẫn còn tác dụng hữu

hiệu là: Bordetella spp., vài chủng Brucella, Flavobacterium, Legionella spp và

Pasteurella, Haemophilus ducreyi được ghi nhận còn nhạy cảm, nhưng Haemophilus influenzae lại ít nhạy cảm Các Enterobacteriaceae nói chung không nhạy cảm, tuy vậy một

vài chủng nhạy cảm với thuốc ở pH kiềm

Trong các khuẩn yếm khí Gram âm có Helicobacter pyloridis và nhiều chủng

Campylobacter jejuni là nhạy cảm (khoảng 10% chủng sau đã kháng) Hơn một nửa các

chủng Bacteroides fragilis và nhiều chủng Fusobacterium đều kháng Erythromycin.

Các vi khuẩn khác nhạy cảm với thuốc bao gồm Actinomyces, Chlamydia, Rickettsia

spp., Spirochete như Treponema pallidum và Borrelia burgdorferi, một số Mycoplasma (nhất là Mycoplasma pneumoniae) và một số Mycobacteria cơ hội như M scrofulaceum và

M kansasii, nhưng Mycoplasma trong tế bào lại thường kháng, kể cả M fortuitum.

Các nấm, nấm men và virus đều kháng Erythromycin

Nồng độ ức chế tối thiểu của erythromycin có thể thấp hơn 0,001 microgam/ml đối với

Mycoplasma pneumoniae và nồng độ ức chế tối thiểu từ 0,01 - 0,25 microgam/ml đối với Listeria, Neisseria gonorrheae và Corynebacterium diphteria, Moraxella catarrhalis và Bordetella pertussis Các vi khuẩn có nồng độ ức chế tối thiểu đến 0,5 microgam/ml được

coi là nhạy cảm với kháng sinh và những khuẩn có độ ức chế tối thiểu từ 0,5 - 2 microgam/ml có độ nhạy cảm trung bình

2 Đặc điểm về cơ chế tác dụng, dược động học, tính kháng thuốc của nhóm

Macrolide.

2.1 Cơ chế tác dụng

Hình 1: Cơ chế tác dụng của thuốc kháng sinh

(http://www.impeqn.org.vn/impeqn/vn/portal/InfoDetail.jsp?

area=58&cat=1092&ID=2810)

Với nhóm Macrolide thực thụ: có tác dụng kìm khuẩn, diệt khuẩn với các chủng cầu

khuẩn gram(+) như: Mycoplasma pneumoniae, Helicobacter influenzae…

Thuốc ức chế tổng hợp protein, gắn vào tiểu phần 50s của ribosom của vi sinh vật ức chế peptidyl – transferase trong quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn, không ức chế tế bào vật chủ

Nhóm Macrolide có tác dụng đối kháng với Cloramphenicol, Lincosamide, ngoài ra còn đối kháng với nhóm β – lactamin Nhưng lại có tác dụng hiệp đồng với nhóm Tetracycllin (trong điều trị tụ cầu và liên cầu khuẩn), Rifampicin (trong điều trị bệnh lao)

Macrolide còn tạo ra “thời kỳ nghỉ của vi khuẩn” – có nghĩa là sau khi tiếp xúc vài giờ với thuốc macrolide sẽ tích luỹ trong vi khuân Lúc này vi khuẩn sẽ không tiếp tục phát triển được, mất khả năng gây bệnh, dễ bị thực bào bởi khả năng phòng vệ của vật chủ

2.2 Kháng thuốc

Kháng tự nhiên gồm phần lớn các vi khuẩn gram (-) hiếu khí

Kháng thu được

+ Do thay đổi sinh hoá ở tiểu phần 50s Bản chất của thể kháng này là do đột biến một gen có cấu trúc tương ứng với một hay nhiều protein của 50s, từ đó vi khuẩn đột biến trở nên kháng thuốc

+ Kháng do mắc phải có nguồn gốc ngoài thể nhiễm sắc là phổ biến, gồm tụ cầu, liên

cầu nhóm D, Clostridium perfringens Cơ chế kháng ở đây là methylase có từ trước hay

được cảm ứng(induction) bởi Macrolide làm xúc tác cho phản ứng dimethyl hoá của

adenin(xảy ra ở đoạn 23s của tiểu phần 50s ở ribosom), làm cho ribosom giảm ái lực với Macrolide túc là làm giảm tác dụng của nhóm Macrolide

2.3 Dược động học

Tác dụng kìm khuẩn ,hấp thu đường tiêu hóa không đều Phân bố các tổ chức (ngoài trừ não, dịch não tủy và nước tiểu), thải trừ chủ yếu qua dịch mật

Thuốc tác dụng đối cầu khuẩn và gram âm, một vài trực khuẩn gram âm, kỵ khí

Đề kháng tự nhiên với vi khuẩn ruột (Pseudomonas, Mycoplasma hominis) Đề kháng chéo với Haemophilus influenzae (60%), cầu khuẩn ruột (50 - 70%), tụ cầu (15 - 30%),

phế cầu (22%), lậu cầu, trực khuẩn

3.Công nghệ sản xuất Erythromycin

3.1.Chủng vi sinh vật

Bảng một số chất kháng sinh được sinh tổng hợp bởi một số chủng vi sinh vật

Erythromycin được tổng hợp từ xạ khuẩn Streptomyces erythreus

Xạ khuẩn Stretomyces erythreus sinh sản vô tính bằng bào tử Trên đầu sợi khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử

Xạ khuẩn Streptomyces erythromycin có cấu tạo giống vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ Loài này có khả năng sinh ra chất kháng sinh Erythromycin

Quá trình sinh tổng hợp cùa Erythromycin trong tế bào:

Con đường sinh tổng hợp Erythromycin trong tế bào

3.2 Quá trình lên men

* Giai đoạn chuẩn bị dịch lên men:

- Giống: Giống công nghiệp S.erythreus được bảo quản lâu dài ở dạng đông khô, bảo quản

siêu lạnh ở -700C hoặc bảo quản trong nitơ lỏng

- Nhân giống : Giống từ môi trường bảo quản được cấy chuyền ra trên môi trường thạch hộp để hoạt hoá và nuôi thu bào tử Dịch huyền phù bào tử thu từ hộp petri được cấy

chuyển tiếp sang môi trường bình tam giác, rồi sang thiết bị phân giống nhỏ, qua thiết bị nhân giống trung gian và cuối cùng là trên thiết bị nhân giống sản xuất Yêu cầu quan trọng của của công đoạn nhân giống là phải đảm bảo cung cấp đủ lượng giống cần thiết, với hoạt lực cao, chất lượng đảm bảo đúng thời điểm hco các công đoạn nhân giống kế tiếp và cuối cùng là cung cấp đủ lượng giống đạt các yêu cầu kỹ thuật cho lên men sản xuất Trong thực tế, để đảm bảo quá trình lên men tốt, người ta tính toán lượng giống cấp với mật

độ giống trong dịch lên men đầu khoảng 2.106 bào tử/ml

- Môi trường lên men:

Thành phần môi trường lên men:

Glucose : 5%

Bột đậu : 3,0

(NH4)2SO4 :0,3

NaCl : 0,5

Môi trường lên men sau khi pha xong phải được thanh trùng hoặc lọc rồi mới được bơm lên thùng lên men

- Thiết bị lên men: Phải được vô khuẩn trước khi đưa vào sử dụng Thường thanh

trùng bằng hơi quá nhiệt 2,5 – 3,0 at trong thời gian 3 giờ Đồng thời khử khuẩn nghiêm ngặt tất cả các hệ thống ống dẫn, khớp nối, van, phin lọc và tất cả các thiết bị phụ trợ khác….Trong quá trình lên men luôn cố gắng duy trì áp suất dư trong thiết bị nhằm hạn chế rủi ro do nhiễm tạp

- Không khí được lọc bằng máy lọc khí để tránh nhiễm tạp rồi mới được bơm vào thùng lên men

Giai đoạn lên men:

Quy trình lên men ( của công ty Mountaineer Biocorp, Inc.,)

E-702: thiết bị trao đổi nhiệt F-702: Thiết bị lọc thùng quay

E-701: thiết bị làm lạnh không khí R-701: thiết bị lên men

V-701: thùng điều chỉnh pH T-701,T-702: thiết bị trích ly

Phương pháp lên men: Kỹ thuật lên men được sử dụng là kĩ thuật lên men chìm vì

nó nhiều ưu điểm vượt trội so với kĩ thuật lên men bề mặt Như có khả năng cơ giới hoá, hiện đại hoá, quá trình xảy ra 1 cách liên tục, có thể kiểm soát được các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình lên men Diện tích sử dụng ít, cho hiệu suất sao

Sơ đồ cấu tạo thùng lên men

Lên men theo phương thức lên men gián đoạn (batch) Quá trình lên men tiến hành trong 72 giờ

Phương thức lên men gián đoạn: tiến hành lên men từng mẻ, tính toán pha trộn

nguyên liệu theo từng mẻ cấp vào thùng lên men, sau khi lên men xong thì lấy dịch theo từng mẻ

Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện, nguyên liệu cung cấp chỉ tính toán cho 1 mẻ

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men:

-Nhiệt độ: có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của xạ khuẩn Đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở ở nhiệt độ 28- 30oC nhưng nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng tổng hợp chất kháng sinh nằm trong khoảng từ 18-28oC

Do ở nhiệt độ cao thì chất kháng sinh dễ bị phân hủy nên tiến hành lên men ở nhiệt độ

thấp hơn để xạ khuẩn vẫn phát triển tốt và khả sinh tổng hợp chất kháng sinh cao Nhiệt

độ cho quá trình lên men Erythromycin là 28oC

- pH: Sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc rất nhiểu vào pH môi trường pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, hoạt lực của các enzym pH kiềm hay acid đều ức chế quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh pH tối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường là pH trung tính Trong lên men Erythromycin, pH =7,5

- Oxy: Xạ khuẩn là loại vi sinh vật có nhu cầu oxy cao hơn các vi sinh vật khác, nhất

là giai đoạn nhân giống Thế tích khí cấp cho lên men Erythromycin là 0,4V khí/ V dịch.phút

3.3 Tách và tinh chế sản phẩm

Dịch lên men

Kiềm hóa

Lọc

Trích ly trong butyl acetat

Trích ly trong nước

Kết tinh

Sấy

Erythromycin tinh khiết

Quy trình :

Sau khi lên men, dịch lên men được bơm vào thùng V-701 chứa dung dịch NaOH để điều chỉnh pH từ 7,5 lên 10,7 Sau đó, dịch được đem lọc bằng thiết bị lọc thùng quay

F-702, do Erythromycin là sản phẩm ngoại bào nên hòa tan ở trong dịch lên men, khi lọc ở thiết bị này xác tế bào nằm ở phía ngoài lưới lọc, được cạo bỏ, thu hồi dịch lọc chứa

Erythromycin Dịch lọc được bơm vào thiết bị trích ly sử dụng dung môi butylacetat T-701,

để loại bỏ các chất tan trong dung môi, sau đó tiến hành trích ly trong nước ở pH = 5 ở

702 để loại các chất tan trong nước Butyl acetat thu hồi ở T702 được tuần hoàn lại sang

T-701 để tránh lãng phí và tránh thải butyl acetat ra ngoài gây ô nhiễm môi trường Nước sau thu được ở T-701 được tải sử dụng trong V-701

Dịch chứa Erythromycin được đưa vào thiết bị V-702, tại đây dịch được trộn với dung dịch NaOH, pH được điều chỉnh lên 9,5, bằng cách đó sẽ làm giảm khả năng hòa tan của erythromycin vào trong dịch và kết tinh dễ dàng hơn Tách các tinh thể erythromycin bằng cách lọc trong thiết bị F-703, nước sau khi lọc được sử lý bằng tia UV và được deion hóa

để tái sử dụng

Các tinh thể Erythromycin thô được trộn với dung dịch aceton trong thiết bị CR-701, thêm một lượng nước thích hợp rồi thêm chất mầm kết tinh hydroxyl methyl cellulose

Erythromycin dưới dạng dihydrat được lọc lại ở F-704 và được sấy trong

D-701

4.Ứng dụng trong y học:

Erythromycin là thuốc kháng sinh phổ biến trên thị trường Erythromycin được sử dụng dưới dạng viên nén, dạng cốm hoặc đóng trong chai

- Erythromycin dùng để điều trị nhiều bệnh nhiễm khuẩn như viêm phế quản, viêm ruột do Campylobacter, hạ cam, bạch hầu, viêm phổi và các nhiễm khuẩn do Legionella, viêm kết mạc trẻ sơ sinh và viêm kết mạc do Chlamydia, ho gà, viêm phổi (do Mycoplasma, Chlamydia, các loại viêm phổi không điển hình và cả do Streptococcus), viêm xoang; phối hợp với neomycin để phòng nhiễm khuẩn khi tiến hành phẫu thuật ruột

- Erythromycin có thuận lợi hơn tetracyclin là có thể dùng cho người mang thai và các cháu nhỏ, vì vậy rất có ích để trị các bệnh viêm phổi không điển hình do Chlamydia hoặc do Haemophilus influenzae

- Erythromycin có thể dùng cho các người bệnh dị ứng với kháng sinh beta-lactam và nên dành riêng cho người bệnh dị ứng penicilin, nếu không thì sự kháng thuốc sẽ tăng đến mức không kiểm soát được

- Dùng thay thế penicilin trong dự phòng dài hạn thấp khớp cấp