Nghiên cứu quá trình sản xuất chất kháng sinh penicillin từ vi sinh vật

Đồ án chuyên môn PHẦN I - MỞ ĐẦU Các kháng sinh nhóm thuốc thiết yếu y học đại Nhờ thuốc kháng sinh mà y học loại bỏ dịch bệnh nguy hiểm dịch hạch, tả, thương hàn điều trị hiệu nhiều loại bệnh gây vi khuẩn Đối với nước nghèo, thuốc kháng sinh lại giữ vị trí quan trọng nước điều kiện vệ sinh yếu mức sống thấp nên thường xẩy vụ dịch ỉa chảy, kiết lỵ, nhiễm khuẩn hô hấp Hiện giới người ta phát 8000 chất kháng sinh năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh phát Trong tương lai chắn có nhiều chất kháng sinh khác tìm đa số vi sinh vật có khả tạo thành chất kháng sinh nghiên cứu thuộc chi Streptomyces Bacillus Kể từ Penicillin Alexander Fleming phát (1929), chứng minh có tác dụng chữa bệnh (1941), kỷ qua, kháng sinh trở thành dược phẩm thần kỳ sớm chiếm vị trí hàng đầu lĩnh vực thuốc men giới, với kết ngày lạ, với nhu cầu ngày tăng với lượng sản xuất ngày lớn Hơn nữa, cạnh bên chất Penicillin đầu đàn, có thêm nhiều loại kháng sinh chiết xuất từ nấm, loại kháng sinh tổng hợp với danh mục ngày dài làm cho kho tàng kháng sinh thêm phong phú Xuất phát từ thực tế đó, thực đề tài “Nghiên cứu trình sản xuất chất kháng sinh penicillin từ vi sinh vật” nhằm giúp cho tìm hiểu quy trình sản xuất penicillin giai đoạn Mặt khác trao đổi để tìm ưu, khuyết điểm quy trình sản xuất với hi vọng tương lai Việt Nam có nhà máy sản xuất penicillin với quy mô công nghiệp Đồ án chuyên môn PHẦN II - NỘI DUNG I GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHẤT KHÁNG SINH 1.1.Lịch sử phát chất kháng sinh Sự phát triển vi sinh vật học nói chung, vi sinh vật công nghiệp nói riêng, với bước ngoặt lịch sử phát minh vĩ đại chất kháng sinh Alexander Fleming (1982) mở kỷ nguyên y học: khai sinh ngành công nghệ sản xuất chất kháng sinh ứng dụng thuốc kháng sinh vào điều trị cho người Thuật ngữ" chất kháng sinh" lần Pasteur Joubert (1877) sử dụng để mô tả tượng kìm hãm khả gây bệnh vi khuẩn Bacillus anthracis động vật nhiễm bệnh tiêm vào động vật số loại vi khuẩn hiếu khí lành tính khác Liên tiếp sau phát khác của: Babes (1885) nêu định nghĩa hoạt tính kháng khuẩn chủng đặc tính tổng hợp hợp chất hoá học có hoạt tính kìm hãm chủng đối kháng Nicolle (1907) người phát hoạt tính kháng khuẩn Bacillus subtilis có liên quan đến trình hình thành bào tử loại trực khuẩn Gratia đồng nghiệp (1925) tách từ nấm mốc chế phẩm sử dụng để điều trị hiệu bệnh truyền nhiễm da cầu khuẩn Mặc dù vậy, thực tế tới năm 1929 thuật ngữ "Chất kháng sinh" Alexander Fleming mô tả cách đầy đủ thức báo cáo chi tiết penicillin 1.2 Định nghĩa kháng sinh: Chất kháng sinh hiểu chất hoá học xác định, chất enzym, có nguồn gốc sinh học (trong phổ biến từ vi sinh vật), với đặc tính nồng độ thấp (hoặc thấp) có khả ức chế mạnh mẽ tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh mà đảm bảo an toàn cho người hay động vật điều trị Đồ án chuyên môn 1.3 Cơ chế tác dụng: Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh ( hay đối tượng gây bệnh khác - gọi tắt mầm bệnh) chất kháng sinh thường mang đặc điểm riêng, tùy thuộc vào chất kháng sinh đó; đó, kiểu tác động thường gặp làm rối loạn cấu trúc thành tế bào, rối loạn chức điều tiết trình vận chuyển vật chất màng tế bào chất, làm rối loạn hay kiềm toả trình sinh tổng hợp protein, rối loạn trình tái ADN, tương tác đặc hiệu với giai đoạn định chuyển hóa trao đổi chất Hình Vị trí tác dụng số chất kháng sinh 1.4 Đơn vị kháng sinh: Năng lực tích tụ kháng sinh chủng hay nồng độ chất kháng sinh thường biểu thị đơn vị : mg/ml, µg/ml, hay đơn vị kháng sinh UI/ml (hay UI/g, International Unit Đồ án chuyên môn II CHẤT KHÁNG SINH PENICILLIN 2.1 Lịch sử phát sản xuất penicillin Penicillin phát tình cờ vào năm 1928 Alexander Fleming, nhận thấy hộp petri nuôi Staphylococcus bị nhiễm nấm mốc Penicillium notatum có xuất hiện tượng vòng vi khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm Ông sử dụng tên giống nấm Penicillin để đặt tên cho chất kháng sinh (1929) Sau đó, Mỹ triển khai lên men thành công penicillin theo phương pháp lên men bề mặt (1931) Tuy nhiên, khoảng thời gian nỗ lực nhằm tách tinh chế penicillin từ dịch lên men thất bại không bảo vệ hoạt tính kháng sinh chế phẩm tinh chế vấn đề penicillin tạm thời bị lãng quên Năm 1938 Oxford, tìm lại tài liệu khoa học công bố, Ernst Boris Chain quan tâm đến phát minh Fleming ông đề nghị Howara Walter Florey cho tiếp tục triển khai nghiên cứu Ngày 25/05/1940 penicillin thử nghiệm thành công chuột Năm 1942, tuyển chọn chủng công nghiệp Penicillium chrysogenum NRRL 1951 (1943) sau biến chủng P chrysogenum Wis Q - 176 (chủng xem chủng gốc hầu hết chủng công nghiệp sử dụng toàn giới ); thành công việc điều chỉnh đường hướng trình lên men để lên men sản xuất penicillin G (bằng sử dụng tiền chất Phenylacetic, 1944) Đồ án chuyên môn Hình Các tác giả giải thưởng Nobel y học năm 1945 công trình penicillin Penicillin xem loại kháng sinh phổ rộng, ứng dụng rộng rãi điều trị sản xuất với lượng lớn số chất kháng sinh biết Chúng tác dụng lên hầu hết vi khuẩn Gram dương thường định điều trị trường hợp viêm nhiễm liên cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn, thí dụ viêm màng não, viêm tai - mũi - họng, viêm phế quản, viêm phổi, lậu cầu, nhiễm trùng máu Thời gian đầu penicillin ứng dụng điều trị hiệu Tuy nhiên, vài năm sau xuất trường hợp kháng thuốc tượng ngày phổ biến Vì 1959, Batchelor đồng nghiệp tách axit 6aminopenicillanic Đây nguyên liệu để sản xuất hàng loạt chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác Đối với Việt Nam, năm 1946, giáo sư Đặng Văn Ngữ thành công việc sản xuất nước lọc penicillin môi trường nước ngô góp phần đáng kể vào việc cứu chữa thương bệnh binh Bác Hồ thưởng Huân chương Lao động hạng ba cho thành tựu kỳ diệu chưa làm 2.2 Công thức cấu tạo penicillin Penicillin gồm nhiều loại, chúng có cấu tạo gần giống nhau, bao gồm vòng thiazolidine, vòng β-lactam, nhóm amino có gắn với CO2 mạch bên (R) Tất penicillin dẫn suất acid 6-aminopenicillanic Đồ án chuyên môn Sự thay R tạo nhiều acid amin khác hầu hết penicillin phân phối dạng muối natrii muối kali Hình Cấu tạo chung phân tử penicillin Ngày giới sản xuất 500 chế phẩm penicillin ( lên men trực tiếp hai sản phẩm penicillin V penicillin G) tiếp tục triển khai để sản xuất chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác Đồ án chuyên môn Hình 2: Sản phẩm penicillin lên men tự nhiên nhờ P.chrysogenum Đồ án chuyên môn 2.3 Cơ sở công nghệ sinh tổng hợp penicillin từ nấm mốc 2.3.1 Lịch sử tuyển chọn chủng công nghiệp P chrysogenum Vào năm đầu, việc nghiên cứu sản xuất penicillin thường sử dụng chủng có hoạt lực cao thuộc loài P notatum P baculatum Nhưng từ trường đại học Wisconsin (Mỹ) phân lập chủng P.chrysogenum có hoạt tính cao chủng thay từ khoảng sau năm 50 kỷ XX đến tất công ty sản xuất penicillin giới sử dụng biến chủng P.chrysogenum công nghiệp Việc tuyển chọn chủng công nghiệp để lên men sản xuất penicillin nguyên tắc trải qua sáu giai đoạn mô tả mục 1.3.1, giải pháp kỹ thuật áp dụng hiệu để thu nhận biến chủng "siêu tổng hợp" penicillin lại kỹ thuật gây đột biến thường như: xử lý tia Rơn - ghen, xử lý tia cực tím tạo đột biến hoá chất, thí dụ Metylbis - amin (metyl -2-β-clo- etylamin), N-mustar (tris - β-clo- etylamin), Sarcrolyzin, HNO2, Dimetylsulfat, 1,2,3,4 -diepoxybutan 2.3.2 Cơ chế sinh tổng hợp penicillin nấm mốc P chrysogenum : Theo quan điểm phổ biến nay, trình sinh tổng hợp penicillin nấm mốc P chrysogenum tóm tắt sau: từ ba tiền chất ban đầu αaminoadipic, cystein valin ngưng tụ lại thành tripeptit δ -(α- aminoadipyl) - cysteinyl - valin ; trình khép mạch tạo vòng β-lactam vòng thiazolidin để tạo thành izopenicillin-N; trao đổi nhóm α-aminoadipyl với phenylacetic (hay phenooxyacetic) tạo thành sản phẩm penicillin G (hay penicillin V, xem sơ đồ tổng hợp penicillin G hình Đồ án chuyên môn Hình Sơ đồ chế sinh tổng hợp penicillin từ axit L- α- aminoadipic, Lcystein L-valin Tuy nhiên, giải phóng tích tụ môi trường (vì trình lên men sản xuất penicillin V phát thấy dịch lên men lượng lớn α- aminoadipic dạng vòng) Như vậy, trình sinh tổng hợp penicillin, phụ thuộc vào điều kiện lên men cụ thể định, xảy theo sáu đường hướng khác Do đó, hiệu suất chuyển hoá chất - sản phẩm biến đổi phụ thuộc vào đường hướng sinh tổng hợp tương ứng Theo lý thuyết hiệu suất lên men khoảng 683 - 1544 UI penicillin/g glucoza; song, thực tế, với chủng có hoạt tính sinh tổng hợp cao đạt khoảng 200 UI/g glucoza 2.3.3 Tác động thông số công nghệ đến trình sinh tổng hợp penicillin 2.3.3.1 Sự phát triển hệ sợi đặc điểm hình thái hệ sợi nấm: Sự phát triển hệ sợi nấm trình lên men bao gồm: - Sự tăng trưởng kích thước hệ sợi (tăng độ dài sợi, lớn lên kích thước, mức độ phân nhánh hệ sợi ) Đồ án chuyên môn - Sự biến thiên số lượng khóm sợi nấm môi trường: Thông thường, phát triển đánh giá qua hai tiêu là: hàm lượng sinh khối tốc độ biến thiên hàm lượng sinh khối môi trường Hai tiêu xác định nhiều phương pháp khác như: hàm lượng sinh khối (Sinh khối tươi sinh khối khô), mật độ quang dịch lên men, trở lực lọc dịch lên men, hàm lượng nitơ, hàm lượng hydratcacbon, hàm lượng axit nucleic Trong phương pháp trên, áp dụng phổ biến sản xuất công nghiệp phương pháp xác định qua hàm lượng sinh khối Tốc độ phát triển hệ sợi nấm phụ thuộc hàng loạt yếu tố khác trình lên men tích tụ penicillin thường xảy mạnh mẽ hệ sợi phát triển đạt trạng thái cân Trạng thái xác lập cung cấp vừa đủ liên tục lượng thức ăn tối thiểu cho nấm mốc Thiếu thức ăn, hệ sợi nấm tự phân, cung cấp nhu cầu trên, hệ sợi phát triển, không tích tụ mạnh penicillin mà tích tụ nhiều axit gluconic axit malic - Đặc điểm hình thái cấu trúc hệ sợi nấm: Trong trình lên men, nhiều nguyên nhân khác nhau, số lượng khóm sợi nấm có xu hướng tăng lên, trình lên men tĩnh Trong điều kiện lên men có sục khí khuấy trộn, tác dụng va đập học với cánh khuấy chuyển động dòng xoáy môi trường, mặt đứt gãy hệ sợi nấm xảy nhiều hệ sợi nấm có xu hướng vón cuộn lại thành cấu trúc búi sợi cuộn xoắn, gọi pellet  Pellet xốp (fluffy loose pellets) dạng pellet có phần bên hệ sợi cuộn thành khối mịn, lớp sợi phía bên cuộn lỏng lẻo tạo thành cấu trúc xốp  Pellet mịn (compact smooth pellets) có đặc điểm phần sợi phía bên pellet cuộn tương đối chặt chẽ đến gần sát lớp sợi phía ngoài, lớp sợi phía cuộn đủ thành lớp sợi mịn  Pellet rỗng (hollow pellets) dạng pellet có phần sợi bên bị tự phân tạo thành khoảng rỗng, hệ sợi phía bên cuộn chặt thành lớp sợi mịn chắn Đồ án chuyên môn Nồng độ oxy hoà tan cường độ khuấy trộn dịch lên men: Với nhiều chủng nấm mốc, nồng độ oxy hòa tan thuận lợi cho trình sinh tổng hợp penicillin dao động quanh mức 30% nồng độ oxy bão hòa Nồng độ CO2 dịch lên men mức định cần thiết cho trình nảy mầm bào tử nấm mốc; nhiên nồng độ CO cao làm cản trở trình hấp thu chuyển hoá chất chủng, nghĩa làm làm cản trở trình sinh tổng hợp penicillin 2.3.3.5 Sự tích tụ phân huỷ penicillin: Trong trình lên men, nhiều nguyên nhân khác nhau, có ảnh hưởng nồng độ penicillin tích tụ môi trường ngày tăng, làm cho lực sinh tổng hợp penicillin chủng có xu hướng giảm dần theo thời gian lên men Đồng thời, phụ thuộc vào nhiệt pH môi trường, phần lượng penicillin tích tụ bị phân huỷ theo thời gian Nhằm giảm tổn thất trên, sau kết thúc trình lên men cần xử lý thu sản phẩm sớm có giải pháp hạ thấp nhanh nhiệt độ dịch lên men III QUY TRÌNH SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT 3.1 Đặc điểm chung: Công nghệ lên men sản xuất penicillin mang nét đặc thù riêng sở sản xuất thông tin hạn chế cung cấp công khai, sáng chế thường giới hạn công đoạn định; khó đưa công nghệ tổng quát chung Theo công nghệ lên men hãng GistBrocades (Hà Lan), toàn dây chuyển sản xuất thuốc kháng sinh penicillin phân chia làm bốn công đoạn sau (xem sơ đồ hình 2.8)  Lên men sản xuất penicillin tự nhiên (thường thu penicillin V penicillin G)  Xử lý dịch lên men tinh chế thu bán thành phẩm penicillin tự nhiên  Sản xuất penicillin bán tổng hợp (từ nguyên liệu penicillin tự nhiên)  Pha chế loại thuốc kháng sinh penicillin thương mại Đồ án chuyên môn Hình Sơ đồ dây chuyền sản xuất penicillin (theo Gist-Brocades Copr (Hà Lan)) 3.2 Chuẩn bị lên men - Giống, bảo quản nhân giống cho sản xuất: Giống dùng để lên men penicillin P.chrysogenum, loại nấm sợi bào tử hở Khi phát môi trường đặc, chúng tạo hai dạng khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh khuẩn ty dinh dưỡng màu trắng Sau nuôi cấy ngày, khuẩn ty bắt đầu chuyển sang màu xanh xám đính bào tử bắt đầu xuất Thời gian xuất bào tử trần từ tiền bào tử nằm đính bào tử Các bào tử tạo thành theo thời gian nuôi cấy cuối màu nấm penicillium sẫm Đồ án chuyên môn Giống công nghiệp P.chrysogenum bảo quản lâu dài dạng đông khô, bảo quản siêu llạnh bảo quản nitơ lỏng Giống từ môi trường bảo quản cấy chuyền môi trường thạch hộp để hoạt hoá nuôi thu bào tử Dịch huyền phù bào tử thu từ hộp petri cấy chuyển tiếp sang môi trường bình tam giác, sang thiết bị phân giống nhỏ, qua thiết bị nhân giống trung gian cuối thiết bị nhân giống sản xuất Yêu cầu quan trọng của công đoạn nhân giống phải đảm bảo cung cấp đủ lượng giống cần thiết, với hoạt lực cao, chất lượng đảm bảo thời điểm cho công đoạn nhân giống cuối cung cấp đủ lượng giống đạt yêu cầu kỹ thuật cho lên men sản xuất Trong thực tiễn, để đảm bảo cho trình lên men thuận lợi người ta thường tính toán lượng giống cấp cho mật độ giống dịch lên men ban đầu khoảng - 5.109 bào tử / m3 - Chuẩn bị môi trường lên men thiết bị: •Chuẩn bị môi trường lên men: Cân đong, pha chế riêng rẽ thành phần môi trường lên men thùng chứa phù hợp Thanh trùng gián đoạn 1210C ( hay trùng liên tục khoảng 1401460C) lọc qua vật liệu siêu lọc bơm vào thùng lên men Nếu đặc tính công nghệ thiết bị lên men cho phép, pha chế trùng đồng thời dịch lên men thiết bị Tất cấu tử bổ sung vào môi trường lên men phải xử lý khử khuẩn trước sau bổ sung theo chế độ vận hành vô khuẩn •Thiết bị lên men: Phải vô khuẩn trước đưa vào sử dụng Thường trùng nhiệt 2,5 – 3,0 at thời gian Đông thời khử khuẩn nghiêm ngặt tất hệ thống ống dẫn, khớp nối, van, phin lọc tất thiết bị phụ trợ khác….Trong trình lên men luuôn cố gắng trì áp suất dư thiết bị nhằm hạn chế rũi ro nhiễm tạp Không khí thường khử khuẩn sơ nén đoạn nhiệt, sau qua màng lọc vô khuẩn hay màng siêu lọc Đồ án chuyên môn - Chuẩn bị môi trường nhân giống • Chuẩn bị môi trường nhân giống: Để làm môi trường nhân giống người ta chuẩn bị môi trường lên men chúng không chứa lactose (nếu có chứa lượng nhỏ), số khoáng chất tiền khoáng chất Mặt khác thành phần môi trường nhân giống cần tính toán để đảm bảo cung cấp đủ nguồn thức ăn C, N, chất khoáng thành phần khác, đảm bảo cho hình thành phát triển thuận lợi pellet Sau làm ẩm môi trường đến độ ẩm định, người ta phân phối vào chúng vào dụng cụ thủy tinh (chai thủy tinh hay bình tam giác) với khối lượng 1/5 hay 1/6 dung tích dụng cụ, đậy nút đem trùng 121oC (0,5 at) 30 phút 3.3 Kỹ thuật lên men: 3.3.1 Kỹ thuật lên men bề mặt: Áp dụng từ lâu, không triển khai sản xuất lớn Gồm phương pháp: * Lên men nguyên liệu rắn (cám mì, cám ngô có bổ sung đường lactose) * Lên men bề mặt môi trường lỏng tĩnh (phổ biến sử dụng môi trường lactose - nước chiết ngô) • Quá trình nhân giống Quá trình nhân giống giống có ống nghiệm Trong nhà máy, lần cấy truyền giống, người ta thường cấy làm ống Một ống dùng kiểm tra trước sản xuất, ống dùng để sản xuất ống dùng để bảo quản Song song đó, người ta chuẩn bị bình tam giác dung tích 200 – 250 ml chuẩn bị 50 g môi trường phần trình bày Môi trường trùng làm nguội đến 30oC Đổ 10ml trùng làm nguội vào ống giống, dùng que thủy tinh đánh cho bào tử hòa trộn với nước Bằng biện pháp vô trùng (thực tủ nuôi cấy vô trùng) chuyển toàn vào bình tam giác lắc cho thật Đồ án chuyên môn chuyển chúng sang tủ ấm 30 – 37 oC Nuôi điều kiện chi đến bào tử nấm xuất phát triển khắp môi trường Ta gọi trình thực trình nhân giống cấp Cứ thực tiếp ta có giống cấp 2, cấp 3…cho đến đủ – 10% giống cho sản xuất Mỗi cấp độ nhân giống từ cấp sang cấp khác, khối lượng môi trường tăng từ 10 – 15 lần • Quá trình lên men Đối với phương pháp lên men nguyên liệu rắn (cám mì, cám ngô có bổ sung đường lactose), môi trường khử trùng làm nguội đến 30 oC, tiến hành trộn giống vào với tỷ lệ từ – 10% Các khay xếp chồng lên giá đỡ có khoảng cách định để thoáng khí thoáng nhiệt Quá trình lên men kéo dài – ngày nhiệt độ 24 – 28 oC Ưu điểm phương pháp đường lactose nấm mốc đồng hóa chậm nên không xảy tượng dư thừa đường tế bào, dịch nước chiết ngô cung cấp cho nấm mốc nguồn thức ăn nitơ, chất khoáng chất sinh trưởng, phenylalanin bị thủy phân tạo thành phenylacetic cung cấp tiền chất tạo mạch nhánh cho phân tử penicillin Khi lên men môi trường lỏng, áp dụng công nghệ bổ sung liên tục phenylacetic vào môi trường lên men, hàm lượng bổ sung phụ thuộc pH môi trường thường 0,2-0,8 kg phenylacetic/m3 dịch lên men Dung dịch lên men sau khử trùng phân phối vào khay có kích thước giống khay nuôi cấy bề mặt với môi trường bán rắn Ở đáy khay không đục lỗ phải chứa môi trường lỏng Chiều cao dung dịch môi trường khay – cm người ta tiến hành lên men khoảng thời gian – ngày nhiệt độ lên men 24 – 28 oC Tiến hành lên men điều kiện môi trường lỏng này, lượng penicillin G tổng hợp tăng rõ rệt hàm lượng penicillin khác giảm Để hạn chế trình oxy hóa tiền chất, thường phải bổ sung vào môi trường lượng nhỏ axit axetic Trong kỹ thuật lên men lỏng gián đoạn không điều chỉnh pH môi trường thường tăng nhẹ, sau tương đối ổn định vào cuối trình lên men thường khoảng pH = Đồ án chuyên môn 6,8 – 7.4 Khi sử dụng chất lactose, người ta xác định penicillin tổng hợp tích tụ mạnh mẽ môi trường nấm mốc sử dụng đường lactose có dấu hiệu cạn kiệt sợi nấm bắt đầu tự phân Vì người ta thường kết thúc trình lên men vào thời điểm hết đường lactose 3.3.2 Kỹ thuật lên men chìm: Kỹ thuật len men chìm kỹ thuật áp dụng hầu hết cở sản xuất penicillin công nghiệp hiên thường vận hành theo phương pháp lên men bán liên tục, gồm phương án lên men gián đoạn theo mẻ có bổ sung liên tục (hay bán liên tục) hay vài cấu tử kết hợp với phương án tuần hoàn lại phần hệ sợi mẻ lên men trước (hoặc không) • Quá trình nhân giống Trong trình lên men chìm người ta nhân giống môi trường lỏng Mục đích trình nhân giống thu nhận số lượng tế bào cao( thường tính tổng lượng tế bào/ml) Quá trình nhân giống bắt đầu việc chuyển giống từ ống nghiệm sang bình tam giác chứa sẵn môi trường nhân giống Người ta thường nhân giống vào bình lên men dung tích từ lít hàng ngàn lít Nhiệt độ trình nhân giống trì khoảng 26 ± oC thời gian nhân giống cấp độ khoảng 72 • Quá trình lên men Quá trình lên men môi trường lỏng phương pháp lên men chìm để sản xuất penicillin vận hành theo phương pháp lên men hai pha: - Pha thứ nuôi thu sinh khối khoảng – ngày Trong pha hệ sợi phát triển mạnh chất dinh dưỡng dễ đồng hóa tế bào hấp thụ mạnh, tốc độ sinh sản nấm xảy nhanh, tạo thành penicillin bắt đầu - Pha thứ hai lên mên thu sản phẩm Ở pha hệ sợi phát triển chậm lại, pH tăng dần đạt đến giá trị khoảng – 7,5 Trong pha penicillin tạo thành với mức độ cực đại Đồ án chuyên môn Trong hầu hết trường hợp, lên men, người ta thay phần lớn (hoặc hoàn toàn) đường lactose đường glucose Lượng glucose bổ sung liên tục hay bán liên tục phải giám sát chặt chẽ nồng độ glucose suốt trình vận hành pha để trì nồng độ glucose mức thích hợp nhằm vừa giữ khối lượng hệ sợi ổn định, vừa đảm bảo sinh tổng hợp nhiều penicillin Trong thực tiễn, để tránh xảy thiếu hụt thời glucose , người ta kết hợp bổ sung lượng nhỏ đường lactose (khi đó, chưa bổ sung kịp glucose nấm mốc tự điều chỉnh để sử dụng đường lactose nên không xảy tượng tự phân hệ sợi) Ngoài nguồn nitơ nước chiết ngô, người ta thường sử dụng phối hợp (NH4)2SO4 để vừa cung cấp thức ăn N S, vừa sử dụng để điều chỉnh pH trình lên men (pH dịch len men ban đầu thường điều chỉnh khoảng pH = 6,5 – 6,8 dung dịch NaOH H3PO4); nồng độ NH4 + thường khống chế khoảng 0,3 – 0,4 kg/m dịch lên men Chất phá bọt thường sử dụng loại dầu béo như: mỡ lợn, dầu đậu tương, dầu vừng, dầu cám…Tiền chất tạo nhánh phenylacetic lên men sản xuất penicillin G (hoặc phenooxyacetic lên men sản xuất penicillin V) bổ sung liên tục (hoặc bổ sung gián đoạn làm nhiều lần) suốt thời gian pha lên men penicillin, để trì nồng độ khoảng 0,1 – 1,0 kg/m dịch (nếu nấm mốc tổng hợp đồng thời nhiều penicillin khác, nhiều gây độc cho nấm tăng cường thúc đẩy trình hydroxyl hóa sản phẩm penicillin) Nhiệt độ lên men pha đầu khống chế 30 oC, sau sang pha sau giữ 22 – 25oC Tốc độ sục khí khuấy trộn điều chỉnh để trì nồng độ oxy hòa tan dịch khoảng 30% Trong điều kiện thời gian lên men mẻ thường kéo dài khoảng 144 – 180 Kết thúc trình lên men người ta cố gắng lọc sớm dịch lên men, làm lạnh chuyển sang công đoạn trích ly tinh chế thu penicillin Đồ án chuyên môn * Đặc điểm thiết bị lên men chìm: Quá trình lên men sản xuất penicillin ngày chủ yếu tiến hành thiết bị lên men chìm chế tạo nhóm thép chịu ăn mòn CT2 với khuấy trộn kiểu tuốc-bin (gồm nhiều tầng cánh khuấy), kết hợp bố trí hệ vách dẫn dòng thùng) Công suất khuấy trộn tiêu hao thiết kế khoảng 3kW/m 3/h Không khí nén vô khuẩn cấp vào qua hệ ống phân phối kiểu vòng xoáy hay kiểu rẻ quạt đục lỗ lắp đặt sát đáy (hay phía cánh tuốc-bin) Bên thiết bị lắp đặt nhiều tầng ống trao đổi nhiệt kiểu vòng xoắn kết hợp đồng thời với trao đổi nhiệt qua thành thiết bị hai lớp vỏ, đảm bảo điều nhiệt hiệu suốt trình lên men Dung tích thiết bị phổ biến khoảng 150 – 300m3, hệ số đổ đầy thường chọn khoảng 80%V (phụ thuộc vào kỹ thuật thiết bị phá bọt) Thiết bị nhân sản xuất giống có dung tích khoảng 10%V thiết bị len men, thiết kế tương tự thường ghép cứng với thiết bị lên men Toàn thiết bị lên men sản xuất, thiết bị nhân giống lớn hệ thống trang thiết bị phụ trợ thiết kế lắp đặt đảm bảo vệ sinh thao tác vận hành theo chế độ vô khuẩn cao (tốt nên bố trí cho có thểíap dụng chế độ trùng đồng thời cho toàn hệ thiết bị này) Các thông số kiểm tra trình lên men bao gồm: pH môi trường, nồng độ oxy hòa tan, nhiệt độ, hàm lượng sinh khối tốc độ biến thiên lượng sinh khối, số lượng, kích thước cấu trúc pellet, nồng độ cấu tử chất, nồng độ penicillin, thành phần khí thải tiêu kiểm tra vi sinh vật Việc giám sát điều chỉnh trình lên men xây dựng sở khai thác hai kiểu tương tác trực tuyến (online control) tương tác không phản hồi theo quy luật (offline control), phụ thuộc vào khả đáp ứng hệ thiết bị có Đồng thời xu hướng máy tính hóa kiểm tra giám sát trình lên men dần chiếm ưu sản xuất công nghiệp Đồ án chuyên môn Hình Sơ đồ hệ lên men dùng cho sản xuất penicillin * Hiệu kinh tế chung trình lên men chìm Năng lực sinh tổng hợp tích tụ penicillin dịch lên men kết mối tương tác đồng thời hàng loạt yếu tố công nghệ như: hoạt tính sinh tổng hợp chúng, công nghệ lên men áp dụng, chất lượng nguyên liệu, đặc tính thiết bị lực đáp ứng yêu cầu công nghệ thiết bị, chế độ giám sát điều chỉnh thông số công nghệ, lực kỹ vận hành công nhân Với nguồn chất glucoza lên men theo phương pháp chìm, hệ số phân bổ nguyên liệu dự tính khoảng 25% glucoza nấm mốc sử dụng để tổng hợp hệ sợi, 65% đường sử dụng để trì sống sót hệ sợi, lại khoảng 10% nấm mốc sử dụng để tổng hợp penicillin Hệ số sử dụng thức ăn nitơ lưu huỳnh để tổng hợp penicillin tương ứng 20% 80% Nồng độ penicillin G dịch lên men năm 80 - 90 kỷ XX đạt khoảng 80.000 UI/ml (tương ứng suất khoảng 40 - 50 kg penicillin G/ m3 dịch lên men ) 3.4 Xử lý dịch lên men tinh chế thu penicillin tự nhiên Có ba phương pháp thu nhận tinh chế penicillin từ môi trường nuôi cấy, là: • Trích ly dung môi hữu • Hấp phụ • Trao đổi ion Đồ án chuyên môn Trong ba phương pháp phương pháp trích ly dung môi hữu sử dụng nhiều phương pháp dựa ưu điểm sau: • • Muối penicillin dễ tan nước Acid penicillic dễ tan dung môi hữu Công đoạn xử lý dịch lên men tinh chế thu penicillin tự nhiên tóm tắt sơ đồ hình 2.9 , bao gồm công đoạn sau đây: Hình Sơ đồ tóm tắt công đoạn xử lý dịch lên men thu penicillin tự nhiên 3.4.1 Lọc dịch lên men : Mục đích: Penicillin sản phẩm lên men ngoại bào Vì vậy, sau kết thúc trình lên men người ta thường tiến hành lọc để giảm tổn hao phân huỷ penicillin giảm bớt khó khăn tinh chế, tạp chất tạo hệ sợi nấm tự phân Thiết bị lọc: phổ biến thiết bị lọc hút kiểu băng tải kiểu thùng quay Thông thường, người ta cần lọc lần làm lạnh dịch để chuyển sang công đoạn Chỉ trường hợp đặc biệt cần phải xử lý kết tủa phần protein lọc lại dịch lần thứ hai Hiện tượng tự phân hệ sợi nấm thường kéo theo hậu làm cho dịch khó lọc Đồ án chuyên môn Thu hồi sinh khối nấm: Phần sinh khối nấm rửa sạch, sấy khô sử dụng để chế biến thức ăn gia súc 3.4.2 Trích ly : Penicillin thường trích ly dạng axít khỏi dịch lọc dung môi amylacetat butylacetat pH = 2,0 - 2,5, nhiệt độ - 0C Nhằm hạn chế lượng penicillin bị phân huỷ, trình trích ly thực thời gian ngắn thiết bị trích ly ngược dòng liên tục kiểu ly tâm nhiều tầng cánh Đồng thời, thời gian trích ly cần giám sát chặt chẽ thông số công nghệ như: nhiệt độ pH, độ vô khuẩn để hạn chế tổn thất phân huỷ penicillin Dịch lên men sau lọc bơm trộn đồng thời với dung dịch H 2SO4 H3PO4 loãng có bổ sung thêm chất chống tạo nhũ bơm song song với dung môi trích ly vào thiết bị Tỉ lệ dịch lọc: dung môi thường chọn khoảng - 10V dịch lọc /1V dung môi Trong số công nghệ, nhằm cải thiện chất lượng sản phẩm, người ta áp dụng phương pháp trích ly hai lần dung môi, với lần đầu trích ly penicillin amylacetat butylacetat; penicillin lại trích ly ngược sang dung dịch đệm pH = 7,2 - 7,5, thường dung dịch KOH loãng dung dịch NaHCO 3; sau penicillin lại trích ly sang dung môi lần thứ 2, với lượng dung môi Hình Sơ đồ công nghệ trích ly lần dung môi tinh chế penicillin Đồ án chuyên môn 3.4.3 Tẩy màu : Để tẩy màu loại bỏ số tạp chất khác, người ta thường bổ sung trực tiếp chất hấp phụ vào dung môi chứa penicillin sau trích ly, sử dụng phổ biến than hoạt tính Sau than hoạt tính tách rửa lại sử dụng thiết bị lọc hút băng tải thiết bị lọc hút kiểu thùng quay Phần than sau lọc đưa chưng thu hồi dung môi xử lý hoàn nguyên, phục vụ cho mẻ sau 3.4.4 Kết tinh, lọc, rửa sấy thu penicillin tự nhiên: Việc kết tinh penicillin V hay penicillin G dạng muối thực đơn giản, cách bổ sung trực tiếp vào dung môi sau tẩy màu lượng nhỏ kali acetat (hay natri acetat) người ta trích ly lại sang dung dịch KOH loãng (hay NaOH loãng), tiến hành cô chân không nhiệt độ thấp, sau bổ sung BuOH để penicillin tự kết tinh Các thông số công nghệ có ảnh hưởng lớn đến hiệu qủa kết tinh : nồng độ penicillin, nồng độ muối acetat, pH dung môi hay pH dung dịch cô đặc, nhiệt độ kết tinh Sau kết tinh, tinh thể penicillin lọc tách máy lọc hút thùng quay Để đảm bảo độ tinh khiết cao hơn, tiến hành hòa tan kết tinh lại penicillin Khi sản phẩm đạt độ tinh theo yêu cầu, thường độ tinh khiết không 99,5%, chúng lọc tánh tinh thể; rửa làm khô sơ dung môi kỵ nước izopropanol hay butylalcohl; hút chân không tách dung môi máy lọc băng tải sấy không khí nóng đến dạng sản phẩm bột muối penicillin Sản phẩm này, phần sử dụng trực tiếp để pha chế thuốc kháng sinh penicillin; lại, phần lớn sử dụng làm nguyên liệu phục vụ cho việc sản xuất sản phẩm penicillin cephalosporin bán tổng hợp khác Ngoài ra, để sản xuất sản phẩm penicillin có độ tinh khiết cao, người ta cần phải sử dụng phối hợp thêm số giải pháp công nghệ khác phương pháp phân tán tĩnh điện nguyên tắc phương pháp sử dụng hiệu điện cao (lên đến 25 kV) để tạo vi giọt dung dịch chứa penicillin Đồ án chuyên môn PHẦN - KẾT LUẬN Penicillin lọai kháng sinh dùng để điều viêm nhiễm người Khám phá penicillin từ phát tình cờ có ý nghĩa to lớn nhân lọai Penicillin thông thường sản xuất phương pháp lên men ưa khí chìm chiết xuất độ pH thấp từ dịch lên men sử dụng butyl axetat kerosen Do tính không ổn định penicillin độ pH thấp, quy trình chiết xuất cần thực nhiệt độ thấp, song có tới 10-15% sản phẩm bị thất thoát sử dụng quy trình công nghiệp Ngoài suất tương đối thấp, phương pháp sản xuất truyền thống có chi phí cao, tiêu thụ nhiều lượng để thu hồi butyl axetat từ chất – quy trình đòi hỏi nhiều công đoạn Với vấn đề nêu trên, hi vọng đem đến cho bạn kiến thức công nghệ sản xuất penicillin quy mô công nghiệp Vì kiến thức hạn hẹp nên có nhiều sai sót mong cô bạn đóng góp ý kiến để tiểu luận hoàn chỉnh Qua xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Lâm Đoàn giúp đỡ hoàn thành tiểu luận Đồ án chuyên môn MỤC LỤC PHẦN I - MỞ ĐẦU PHẦN II - NỘI DUNG I GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHẤT KHÁNG SINH 1.1.Lịch sử phát chất kháng sinh 1.2 Định nghĩa kháng sinh: 1.3 Cơ chế tác dụng: 1.4 Đơn vị kháng sinh: II CHẤT KHÁNG SINH PENICILLIN 2.1 Lịch sử phát sản xuất penicillin 2.2 Công thức cấu tạo penicillin 2.3 Cơ sở công nghệ sinh tổng hợp penicillin từ nấm mốc III QUY TRÌNH SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT 3.1 Đặc điểm chung: 3.2 Chuẩn bị lên men 3.3 Kỹ thuật lên men: 3.3.1 Kỹ thuật lên men bề mặt: 3.3.2 Kỹ thuật lên men chìm: 3.4 Xử lý dịch lên men tinh chế thu penicillin tự nhiên PHẦN - KẾT LUẬN Đồ án chuyên môn [...]... THIỆU CHUNG VỀ CHẤT KHÁNG SINH 1.1.Lịch sử phát hiện chất kháng sinh 1.2 Định nghĩa kháng sinh: 1.3 Cơ chế tác dụng: 1.4 Đơn vị kháng sinh: II CHẤT KHÁNG SINH PENICILLIN 2.1 Lịch sử phát hiện và sản xuất penicillin 2.2 Công thức cấu tạo của penicillin 2.3 Cơ sở công nghệ sinh tổng hợp penicillin từ nấm mốc III QUY TRÌNH SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT 3.1 Đặc điểm chung: 3.2 Chuẩn bị lên men 3.3 Kỹ... bộ dây chuyển sản xuất thuốc kháng sinh penicillin có thể phân chia làm bốn công đoạn chính như sau (xem sơ đồ hình 2.8)  Lên men sản xuất penicillin tự nhiên (thường thu penicillin V hoặc penicillin G)  Xử lý dịch lên men tinh chế thu bán thành phẩm penicillin tự nhiên  Sản xuất các penicillin bán tổng hợp (từ nguyên liệu penicillin tự nhiên)  Pha chế các loại thuốc kháng sinh penicillin thương... cho quá trình sinh tổng hợp penicillin dao động quanh mức 30% nồng độ oxy bão hòa Nồng độ CO2 trong dịch lên men ở mức nhất định cũng cần thiết cho quá trình nảy mầm của bào tử nấm mốc; tuy nhiên nếu nồng độ CO 2 quá cao sẽ làm cản trở quá trình hấp thu và chuyển hoá cơ chất của chủng, nghĩa làm làm cản trở quá trình sinh tổng hợp penicillin 2.3.3.5 Sự tích tụ và phân huỷ penicillin: Trong quá trình. .. trên máy lọc băng tải rồi sấy bằng không khí nóng đến dạng sản phẩm bột muối penicillin Sản phẩm này, một phần được sử dụng trực tiếp để pha chế thuốc kháng sinh penicillin; còn lại, phần lớn được sử dụng làm nguyên liệu phục vụ cho vi c sản xuất các sản phẩm penicillin và cephalosporin bán tổng hợp khác Ngoài ra, để sản xuất ra các sản phẩm penicillin có độ tinh khiết rất cao, người ta cần phải sử... thấp nhanh nhiệt độ dịch lên men III QUY TRÌNH SẢN XUẤT PENICILLIN TỪ VI SINH VẬT 3.1 Đặc điểm chung: Công nghệ lên men sản xuất penicillin mang nét đặc thù riêng của từng cơ sở sản xuất và các thông tin này rất hạn chế cung cấp công khai, ngay mỗi bằng sáng chế thường cũng chỉ giới hạn ở những công đoạn nhất định; vì vậy rất khó đưa ra được công nghệ tổng quát chung Theo công nghệ lên men của hãng... đến 25 kV) để tạo những vi giọt của dung dịch chứa penicillin Đồ án chuyên môn 2 PHẦN 3 - KẾT LUẬN Penicillin là lọai kháng sinh đầu tiên được dùng để điều vi m nhiễm ở người Khám phá về penicillin từ một phát hiện tình cờ nhưng có ý nghĩa cực kỳ to lớn đối với nhân lọai Penicillin thông thường được sản xuất bằng phương pháp lên men ưa khí chìm và được chiết xuất ở độ pH thấp từ dịch lên men sử dụng... suốt quá trình lên men được giám sát chặt chẽ và điều chỉnh theo yêu cầu công nghệ Nồng độ tiền chất tạo nhánh:Trong quá trình sinh tổng hợp penicillin, vi c kết gắn mạch nhánh của phân tử penicillin không mang tính đặc hiệu chặt chẽ Nhờ vậy, nếu duy trì nồng độ tiền chất tạo nhánh cần thiết phenylacetat (hoặc phenooxyacetat) sẽ cho phép thu nhận chủ yếu một loại penicillin G trong dịch lên men (hoặc penicillin. .. Nuôi trong điều kiện này chi đến khi bào tử nấm xuất hiện và phát triển đều khắp môi trường Ta gọi quá trình thực hiện như trên là quá trình nhân giống cấp 1 Cứ lần lượt thực hiện tiếp ta có giống cấp 2, cấp 3…cho đến khi đủ 5 – 10% giống cho sản xuất Mỗi một cấp độ nhân giống từ cấp này sang cấp khác, khối lượng môi trường tăng từ 10 – 15 lần • Quá trình lên men Đối với phương pháp lên men trên nguyên... không) • Quá trình nhân giống Trong quá trình lên men chìm người ta nhân giống trong môi trường lỏng Mục đích của quá trình nhân giống là thu nhận được số lượng tế bào cao( thường tính tổng lượng tế bào/ml) Quá trình nhân giống được bắt đầu bằng vi c chuyển giống từ ống nghiệm sang những bình tam giác đã chứa sẵn môi trường nhân giống Người ta thường nhân giống vào các bình lên men dung tích từ 1 lít... lít Nhiệt độ trong quá trình nhân giống duy trì ở khoảng 26 ± 1 oC và thời gian nhân giống ở mỗi cấp độ khoảng 72 giờ • Quá trình lên men Quá trình lên men trong môi trường lỏng bằng phương pháp lên men chìm để sản xuất penicillin được vận hành theo phương pháp lên men hai pha: - Pha thứ nhất nuôi thu sinh khối trong khoảng 2 – 3 ngày Trong pha này hệ sợi phát triển rất mạnh vì các chất dinh dưỡng dễ