Bài thực hành lí sinh

• Phản ứng của tế bào trong các môi trường trên • Vai trò của sợi spectin trong việc thay đổi hình dạng của tế bào hồng cầu II Cơ sở lí thuyết:  Mọi tế bào hay màng sinh chất là nơi d

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN

KHOA Y DƯỢC

- -Giảng viên hướng dẫn:Thạc sĩ Hoàng Văn Huệ

Sinh viên thực tập: Hồ Thị Lệ Hằng

Y Đưnh

Đăk Lăk,ngày 11 tháng 5 năm 2009 Trang 1

Trang 2

Ka Hải Lớp:Ykhoa K08

Nhóm:2 Bài thực hành lí sinh số 1:

XÁC ĐỊNH ĐỘ BỀN CỦA TẾ BÀO HỒNG CẦU

I

Yêu cầu:

• Phân biệt được môi trường đẳng trương, ưu trương, nhược trương.

• Phản ứng của tế bào trong các môi trường trên

• Vai trò của sợi spectin trong việc thay đổi hình dạng của tế bào hồng cầu

II

Cơ sở lí thuyết:

 Mọi tế bào hay màng sinh chất là nơi diễn ra mọi hoạt động sống của tế bào.Nó có chức năng ngăn cách nội bộ của tế bào với môi trường ngoài,trao đổi vật chất giữa môi trường bên ngoài và bên trong tế bào nhằm cung cấp nguyên liệu và thoát đi những chất thải.Màng còn là nơi thu nhận những tín hiệu từ bên ngoài,cho phép tế bào biến đổi để đáp lại tương ứng với môi trường xung quanh

 Để thực hiện những chức năng như vậy,màng phải có một cấu trúc đặc biệt.Theo mô hình của

Davson-Danielli thì màng sinh chất cấu trúc theo mô hình khảm động,gồm hai lớp lipit nhưng

protein có thể ở ngoài,trong hoặc xen kẽ với lớp lipit đôi.Ngoài ra,còn có gluxit.Cấu trúc căn bản của màng sinh chất là lipit nhưng hầu hết các chức năng đặc biệt của màng đều liên quan đến protein màng

 Lipit:gồm 3 loại lưỡng tính,một đầu kị nước hướng vào trong, đầu còn lại ưa nước hướng ra

ngoài tế bào.Cụ thể:

 Photpholipit: chiếm 55% có thể di động tự do được

linh động

 Glycolipit chiếm 18% và axit béo kị nước 2%.

 Protein:dạng cầu hay sợi,phân bố thành đốm ,không đồng nhất tạo dạng khảm,gồm:

 Protein ngoại vi gắn trên bề mặt màng

 Protein nội vi gắn một phần hay toàn bộ vào giữa lớp lipit

 Cấu trúc màng tế bào hồng cầu cũng tương tự như vậy,chỉ có một điểm khác biệt cơ bản là trên

bề mặt màng tồn tại một mạng lưới vật chất có nguồn gốc từ các protein dạng sợi(lưới

spectin,chiếm 30% tổng số protein có trên bề mặt màng),được cấu tạo từ hai chuỗi polipeptit xoắn

vào nhau trọng lượng 20000-22000 deltol, có thể ngắn lại hoặc duỗi dài ra nên tế bào hồng cầu thay đổi hình dạng của mình giúp nó có thể len lỏi qua các mao mạch nhỏ li ti trên khắp cơ thể.Có

Trang 3

khoảng từ 4.000.000-6.000.000 tế bào hồng cầu trong 1 3

mm máu.Chức năng của hồng cầu chủ yếu vận chuyểnO CO2, 2,đệm pH

 Những tế bào hồng cầu già hoặc những tế bào hồng cầu bị thoái hoá chức năng thì khả năng co dãn của các sợi speckin bị suy giảm khi đó chúng bị tiêu huỷ bởi các đại thực bào,chủ yếu ở gan,lách và tuỷ xương

 Ở trạng thái lí sinh bình thường, thể tích của tế bào hồng cầu ít bị thay đổi, nồng độ các chất trong tế bào khá ổn định.Ngoài ra,lượng các ion của các muối hoà tan trong tế bào là một hằng

số Vì vậy việc thay đổi thể tích tế bào là do môi trường bên ngoài quyết định Có 3 loại môi trường:

ngoài gây ra hiện tượng mất nước ở bên trong do nước đi ra môi trường ngoài

phồng lên do chịu áp suất thẩm thấu.Tuỳ theo nồng độ nhược trương mà lượng nước đi vào trong tế bào nhiều hay ít.Tới một giá trị nhược trương xác định, màng tế bào hồng cầu bị phá vỡ,giải phóng các chất nội bào ra môi trường ngoài Đó là hiện tượng huyết tiêu

III Thực hành:

1 Mục tiêu, nội dung:

Xác định nồng độ nhược trương nhỏ nhất mà ở đó không gây ra hiện tượng huyết tiêu Nồng độ

đó sẽ tương đương với độ bền của tế bào hồng cầu

 Dung dịch sinh lí NaCl(1%)

 10 ống nghiệm đánh số từ 0 đến 9

 Nước cất

 Máu

 Máy li tâm

 Các pipet

b Cách tiến hành:

 Ta nhỏ vào 10 ống nghiệm dung dịch NaCl và nước cất sao cho 10 ống nghiệm có nồng độ từ 0%0,9% theo bản sau:

Dung dịch 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

NaCl 1%(ml) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

H2O(ml) 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

V(ml) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

C% 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

 Sau đó nhỏ mỗi ống nghiệm một giọt máu

 Dùng hai ngón tay bịt ở hai đầu ống nghiệm,đảo nhẹ hai lần

 Để yên trong 40 phút rồi cho máy quay li tâm 5 phút với tốc độ 2500 vòng/phút

2 Kết quả:

Trang 4

 Các ống có màu sắc khác nhau.Từ ống số 09 màu sắc nhạt dần Các ống từ số 06 có hiện tượng nước trong ống có màu đỏ còn các ống còn lại số 7, số 8, số 9 có hiện tượng máu

và dung dịch bị tách riêng ra, máu ở dưới ống tách riêng với nước nằm trên

 Ở ống số 9 có nồng độ 0,9 %, đây là nồng độ đẳng trương của dung dịch NaCl đối với tế bào hồng cầu, đây là môi trường mà tế bào hồng cầu khá bền vững Ở ống số 7 có nồng độ 0,7% và ống số 8 có nồng độ 0,8% là môi trường nhược trương làm tế bào hồng cầu bị phồng lên nhưng chưa tới mức bị phá vỡ.Hồng cầu nặng hơn nên sẽ chìm ở phía dưới đáy ống tạo thành những vệt đỏ

 Ở ống số 06 có nồng độ 00,6% đây là môi trường quá nhược trương nên sự chênh lệch nồng độ là rất lớn, dẫn đến áp suất thaåm thấu tăng cao làm cho nước đi vào tế bào quá nhiều, làm tế bào bị vỡ ra nên các chất nội bào ra ngoài môi trường trong đó có hêmoglobin làm cho dung dịch có màu đỏ

 Tế bào hồng cầu có tuổi thọ tối đa là từ 90 đến 120 ngày.Các tế bào khác nhau có tuổi thọ khác nhau.Các tế bào non thì kém bền hơn các tế bào già.Do đó chúng dễ vỡ hơn

 0,7 % là nồng độ tối thiểu giữ nguyên thành tế bào không bị vỡ, nếu giảm quá nồng độ này thì tế bào bị vỡ.Vì vậy nồng độ 0.7 % là độ bền của tế bào hồng cầu

Bài thực hành lí sinh số 2:

QUAN SÁT TẾ BÀO HỒNG CẦU

VÀ XÁC ĐỊNH KÍCH THƯỚC CỦA CHÚNG BẰNG KÍNH HIỂN VI

I

Yêu cầu:Xác định hình dạng,kích thước của tế bào hồng cầu

II Dụng cụ:

 Kính hiển vi

 Tiêu bản tế bào hồng cầu

 Thước trắc vi vật kính và thước trắc vi thị kính

III Cách tiến hành:

 Quan sát tế bào hồng cầu trên thước trắc vi thị kính,ta thấy đường kính của tế bào lớn nhất tương ứng với 4 vạch nhỏ của trắc vi thị kính

 Thay tiêu bản tế bào hồng cầu bằng trắc vi vật kính,quan sát ở vật kính 100,điêù chỉnh sao cho

2 vạch của trắc vi thị kính và trắc vi vật kính trùng nhau,xác định vạch trùng nhau tiếp theo.Đếm

số vạch tương ứng Giả sử a vạch của trắc vi thị kính tương ứng với b vạch của trắc vi vật kính.Biết rằng một vạch của trắc vi vật kính có kích thước là10 mµ ,áp dụng công thức sau để xác định kích thước L của một vạch trắc vi thị kính:

10

b

=  Thay L vào công thức :d = 4L để tính kích thước d của tế bào hồng cầu

Trang 5

IV Kết quả:

Hồng cầu có dạng hình đĩa lõm hai mặt.Hình dạng này giúp cho tế bào hồng cầu có thể hút nước

và trương lên,làm cân bằng nồng độ các chất hoà tan giữa bên trong và bên ngoài tế bào mà không phải kéo giãn tế bào quá mức.Hình dạng này cũng tạo cho hồng cầu có một diện tích bề mặt rất rộng so với thể tích của nó và góp phần làm cho sự trao đổi chất qua màng tế bào diễn ra nhanh hơn

Bài thực hành số 3:

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN TỔNG SỐ ;ALBULIN,GLUBULIN TRONG HUYẾT THANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHÚC XẠ KẾ

I Cơ sở lí thuyết:

• Khúc xạ kế là một hệ thống các thấu kính mà bộ phận chủ yếu là hai lăng kình tam giác.Khi ánh sáng qua lăng kính có hiện tượng khúc xạ.Nếu điều chỉnh góc khúc xạ sẽ thu được hiện tượng phản xạ toàn phần.Dựa vào góc phản xạ toàn phần ta có thể đo được chiếc xuất.Từ đo suy ra được hàm lượng phần trăm các chất có trong môi trường

• Ngoài ra khúc xạ kế còn được cấu tạo từ hai thị kính:một dùng để quan sát hiện tượng phản xạ toàn phần,một dùng để đọc giá trị chiếc xuất

• Trong thị trường quan sát có vạch hình chữ thập.Khi có hiện tượng phản xạ toàn phần sẽ thấy hai vùng sáng tối rõ nét.Dùng ốc vi cấp điều chỉnh ranh giới hai vùng sáng tối cho rõ nét

và đúng điểm giữa hình chữ thập.Đọc kết quả chiếc xuất trên thị kính thứ hai

• Có hai thanh đọc kết quả nhưng chỉ có thanh phía trong dùng để đo chiếc xuất

xuất.Sau đó khoá lại,chất lỏng sẽ dàn thành màng mỏng

Ví dụ:chiếc xuất của nước tinh khiết n=4

3 ≈1.33

II Thực hành:

1) Dụng cụ,hoá chất:

o Dung dịch sunphat amol (NH4)2SO4 bão hoà

o Dung dịch Acid acetic 0,04 N

o Nước cất

o Huyết thanh nguyên chất

o Máy li tâm

2) Cách tiến hành:

 Lấy 4 ống nghiệm từ 1-4:

•Ống 1 :lấy 1ml acid acetic 0,04 N+1ml huyết thanh.Sau đó lắc đều,rồi đem đun cách thuỷ

trong 35s Lấy ra làm nguội rồi đem li tâm trong 10 phút với tốc độ 3000 vòng/phút,ta thu

Trang 6

được dung dịch phía trên trong suốt,không có chứa protein vì acid acetic làm cho protein kết tủa dưới đáy.Đo chiếc suất dung dịch trong suốt phía trên,lí hiệu là n1

•Ống 2 :lấy 1ml huyết thanh+1ml dung dịch sunphat amol (NH4)2SO4 bão hoà.Sau đó lắc đều thấy kết tủa.Đem li tâm trong 30 phút với tốc độ 3000 vòng /phút thu được dung dịch phía trên trong suốt không chứa Globulin vì sunphat amol làm Globulin kết tủa dưới đáy.Đo chiếc suất dung dịch trong suốt phía trên,kí hiệu là n2

•Ống 3 :lấy 1ml acid acetic 0,04 N+1ml nước cất,lắc đều ta thu được dung dịch acid acetic 0.02

N.Đo chiếc suất dung dịch,kí hiệu n3

•Ống 4 :lấy 1ml dung dịch sunphat amol (NH4)2SO4 bão hoà+1ml nược cất ,lắc đều ta thu được dung dịch sunphat amol nửa bão hoà Đo chiếc suất dung dịch,kí hiệu n4

 Đo chiếc suất nước cất( )n5 ,huyết thanh nguyên chất( )n6

 Mỗi dung dịch cần đo từ 3-4 lần,sau đó lấy giá trị trung bình Ở huyết thanh chiết xuất chủ yếu phụ thuộc vào hàm lượng protein Vì vậy, việc đo chiết xuất của huyết thanh phản ánh khá chính xác hàm lượng protein có trong huyết thanh

* Công thức để xác định hàm lượng Albumin:

A(%) = 2( 1 3) 2( 2 4)

0,00177

* Công thức tính hàm lượng Globulin:

G(%) = 6 [ 5 2( 2 4)]

0,00229

Trong đó: 0.00177 là chiếc suất của dung dịch Albulin 1%

0.00229 là chiếc suất của dung dịch Glubulin 1%

* Tính hệ số tương quan:

K = (%)

(%)

G A

Đối với người K = 1,2 → 2 tùy theo chức năng sinh lý của cơ thể.

3)

Kết quả:

Lần

1

2

3

4

5

Trang 7

Từ n6=1.348protein chiếm 7.1% huyết tương

Thay các giá tri đo được vào công thức ta được:

Hàm lượng Albumin :

A(%) = 2( 1 3) 2( 2 4) 2(1.3455 1.3329) 2(1.3746 1.3888)

30.2825

Hàm lượng Globulin :

G(%) = 6 [ 5 2( 2 4)] 1.348 1.3328 2(1.3746 1.3888)[ ]

19.0393

Hệ số tương quan:

K =

(%) 30.2825

1.59 (%) 19.0393

A

06

XÁC ĐỊNH ÁP SUẤT THẨM THẤU BẰNG

PHƯƠNG PHÁP BAGIERAST

I Yêu cầu:

- Nắm được vai trò và ý nghĩa của áp suất thẩm thấu đối với cơ thể sinh vật

- Nắm được bản chất của áp suất thẩm thấu

- Nắm được phương pháp Bagierast

- Xác định được giá trị áp suất thẩm thấu của huyết thanh.

II Cơ sở lí thuyết:

- Đối với đời sống ,khuếch tán và thẩm thấu đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất.Đặc biệt

áp suất thẩm thấu cao đóng vai trò quan trọng trong việc điều hoà nước trong máu.Ngoài ra áp suất thẩm thấu còn có vai trò trong việc điều tiết các chất cặn bã và là nguyên nhân gây ra lực hoá thẩm để thúc đẩy quá trình tổng hợp ATP

- Đối với các loài sinh vật khác nhau ,giá trị áp suất thẩm thấu khác nhau.Ở động vật bậc thấp ,giá trịáp suất thẩm thấu thay đổi trong một phạm vi khá rộng,ngược lại ở động vật bậc cao và ở người,giá trị áp suất thẩm thay thay đổi trong khoảng nhỏ

Ví dụ:Áp suất thẩm thấu của huyết thanh trong máu người ở điều kiện sinh lí bình thường có giá trị khoảng 7,4 atm,thay đổi từ 7,35-7,45 atm.Bản chất của áp suất thẩm thấu là do nồng độ

Trang 8

phân tử của các chất hoà tan gây nên.Do đó,áp suất thẩm thấu phụ thuộc vào nồng độ,nhiệt độ tuyệt đối của môi trường:

Ptt = α CRT (*)

Trong đó:

C là nồng độ các chất hoà tan

R là hằng số khí (R=8,31 3

10 J/kmol.K= 8,31J/mol.K)

T là nhiệt độ tuyệt đối

α là hệ số phân ly

⇒Áp suất thẩm thấu phụ thuộc vào số lượng các tiểu phân.

Ví dụ:Đối với NaCl,α =2 NaCl→Na++Cl−

- Để quan sát hiện tượng thẩm thấu phải có hai dung dịch với nồng độ khác nhau,được ngăn cách bởi màng bán thấm.Nếu thẩm thấu xảy ra thì dung dịch sẽ đi từ nơi có nồng độ cao sang nơi có nồng độ thấp.Tuy nhiên màng bán thấm lí tưởng là rất khó.Vì vậy,để xác định áp suất thẩm thấu thường dùng phương pháp gián tiếp là phương pháp Bagierast Phương pháp này dựa trên cơ sở:đối với mỗi loại dung dịch có nồng độ khác nhau thì bao giờ cũng tạo ra trên bề mặt áp suất hơi bão hoà khác nhau.Đối với những dung dịch có nồng độ càng cao thì áp suất hơi bão hoà càng lớn.Nếu như đưa hai dung dịch có nồng độ khác nhau vào ống thuỷ tinh ngăn cách nhau bởi bọt khí thì bọt khí sẽ dịch chuyển đến nơi có nồng độ thấp hơn.Do vậy,nếu biết được nồng độ của một dung dịch thì sẽ biết nồng độ của dung dịch kia

Mục đích:xác định áp suất thẩm thấu của huyết thanh dựa vào nồng độ NaCl đã biết trước.

III Cách tiến hành:

Pha 5 dung dịch khác nhau từ dung dịch NaCl 1% vào 5 ống nghiệm có nồng độ từ 0.4%-0.8% ,mỗi ống có thể tích 5ml

Dụng cụ:

-2 đĩa đồng hồ

-Các ống mao dẫn

-Kính hiển vi

-Lam kính

-La men

B1:Tạo tiêu bản

- Đĩa đồng hồ 1,lấy 2ml dung dịch kiểm tra có nồng độ lần lượt từ 0.4%-0.8%

- Đĩa đồng hồ 2,lấy 2ml huyết thanh

- Lấy một ống mao dẫn đặt nghiêng vào dung dịch kiểm tra Khi dung dịch dâng lên đến nửa ống thì lấy ra dốc ngược đầu để dung dịch kiểm tra chảy xuống phiá dưới Khi cách đầu ngoài cùng 1mm thì đưa ngay vào dung dịch nghiên cứu(huyết thanh).Lúc đó huyết thanh sẽ đẩy dung dịch kiểm tra quay ngược lại.Khi đó sẽ tạo được tiêu bản hai dung dịch khác nhau,cách nhau bởi một bọt khí.Đặt tiêu bản lên la men.Dùng Paraphin đốt nóng,thả một giọt vào đầu tiêu bản để bịt kín.Đưa tiêu bản lên kính hiển vi để xác định chiều chuyển động của bọt khí,kiểm tra đến nồng độ

Trang 9

nào,bọt khí không di chuyển,ghi lại giá trị đó rồi thế vào công thức (*) để xác định áp suất thẩm thấu của huyết thanh

Kết quả: Tại nhiệt độ phòng là 29o C

Dung dịch NaCl

Chiều dịch chuyển Dung dịch

NaCl

Huyết thanh

0.4%

0.5%

0.6%

0.7%

0.8%

Từ nồng độ % của dung dịch NaCl,ta có thể tính được nồng độ mol của dung dịch NaCl.Nồng

độ mol của dung dịch NaCl cũng chính là nồng độ mol của huyết thanh là:

3

100.58,5

ddNaCl M

NaCl

C D

M

−

Thay kết quả vào biểu thức (*),ta được:

3

2.1,0256.10 8,31.(29 273) 5,13( ) 5,198( )

tt

Với 1atm=0,987Bar

Ta thấy rằng áp suất thẩm thấu của huyết thanh thấp hơn so với lí thuyết vì ở điều kiện sinh lí bình thường,cơ thể luôn ở 37o C nên nhiệt độ tuyệt đối sẽ có giá trị lớn hơn.Do đó áp suất thẩm thấu của huyết thanh sẽ lớn hơn

XÁC ĐỊNH DẪN XUẤT CỦA HEMOGLOBIN

I Cơ sở lí thuyết:

 Thành phần cơ bản của tế bào hồng cầu là Hemoglobin(Hb).Trong một tế bào hồng cầu có khoảng 200 triệu phân tử Hb.Hemoglobin được cấu tạo từ 2 thành phần chính là protein Glubin

và nhóm Hem

Hemoglobin‡ ˆ ˆˆ ˆ † Protein Globin + Hem

 Nhóm Hem được cấu tạo từ 4 vòng phenol với nguyên tử Fe++nằm trung tâm Nhờ nguyên

tử Fe++trung tâm nên nó dễ cung cấp oxi cho các tế bào và mô ở trên khắp cơ thể

 Protein Globin được cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptit.Trong đó có 2 chuỗi α và 2 chuỗiβ

.Mỗi một chuỗi được gắn kết với một gốc Hem.Vậy trong một phân tử Hb chứa 4 gốc Hem nên 1

phân tử Hb kết hợp được với 4 phân tử O2

Trang 10

 Chuỗi β khi kết hợp với O2 hình dạng bị co cuộn lại,khi giải phóng O2 thì nó duỗi ra.

 Chuỗi α dù kết hợp hay giải phóng O2 thì nó vẫn giữ nguyên hình dạng.

 Khi Hb kết hợp với O2 có tên là oxyhemoglobin,có 4 dạng:

+ + + +

ˆ ˆ †

‡ ˆ ˆ

ˆ ˆ †

‡ ˆ ˆ

ˆ ˆ †

‡ ˆ ˆ

ˆ ˆ †

‡ ˆ ˆ

Dạng Hb4O8(thường được kí hiệu là HbO2) là dạng bão hoà O2.Chỉ có dạng này mới dễ kết hợp và giải phóng O2

Ngoài ra còn có một dẫn xuất khác là metHb(methernoglobin).Khi Fe++ →Fe+++thì lúc đó

Hb biến thành metHb.MetHb kết hợp với O2 nhưng không có khả năng giải phóng O2.Vì vậy,khi trong cơ thể chứa một lượng lớn metHb thì nó sẽ cản trở quá trình cung cấp khí cho các cơ quan

tổ chức,dẫn đến tình trạng cơ thể bị thiếu O2, gây tình trạng ngộ độc O2

II Thực hành:

1) Mục tiêu:Xác định được HbO2 , metHb , Hb

2) Dụng cụ,hoá chất:

- Kalipheryxianua K3Fe CN( )6

- Natrithiosunphat Na2S2O3

- Heparin(hoặc Citratnatri):dung dịch chống đông máu

- Máy li tâm,ống nghiệm

3) Cách tiến hành:

B 1 : Thu nhận tế bào hồng cầu

Bỏ máu đã chống đông vào li tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút thu được hồng cầu lắng ở phía dưới bắng cách loại bỏ huyết tương ở trên

B 2 :Rửa tế bào hồng cầu bằng dung dịch PBS độ pH=7,2 ,đem li tâm 5 phút với tốc độ 3000

vòng/phút để loại bỏ Heparin

B 3 :Làm huyết tiêu bằng cách cho tế bào vào nước cất,đem li tâm 3 phút với tốc độ 3000

vòng/phút để bỏ màng tế bào,ta thu nhận một dung dịch đỏ tươi,màu trong suốt là HbO2

Để thu được metHb,lấy 3-4 ml dung dịch HbO2 cho thêm vào vài giọt K3Fe CN( )6thu được

metHb màu nâu sẫm

Muốn thu nhận Hb,lấy một vài giọt Na2S2O3cho vào ống nghiệm,ta thu được Hb có màu xanh sẫm

Bài thực hành số 6&7:

XÁC ĐỊNH NĂNG LƯỢNG HOẠT HOÁ CỦA QUÁ TRÌNH CO BÓP

TIM ẾCH - XÁC ĐỊNH TÍNH THẤM CỦA DA ẾCH

Định dạng
Số trang	13
Dung lượng	313,5 KB