tiểu luận sự ổn định và biến động của ADN

Các hình thức tái bản ADN Ở tế bào prokaryote có 3 kiểu tái bản điển hình • Tái bản bảo thủ: Là hình thức tái bản mà từ ADN mẹ cho hai ADN con, trong đó một phân tử được tổng hợp mới ho

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TIỂU LUẬN

MÔN: SINH HỌC PHÂN TỬ

NHỮNG BIẾN ĐỘNG CỦA ADN

Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc Học viên thực hiện: Lê Thị Ngọc Trâm Lớp: Lý luận và Phương pháp K24 (2015-2017)

Huế, tháng 12 năm 2015

MỤC LỤC

PHẦN I: MỞ ĐẦU Trang

I Lý do chọn đề tài: -4

II Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: -5

III Phương pháp nghiên cứu: -5

PHẦN II: NỘI DUNG CHƯƠNG I: TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA ADN -6

1.1 Quá trình tái bản ADN -6

1.1.1 Các hình thức tái bản ADN: -6

1.1.2 Tái bản bán bảo thủ ở Prokaryote: -7

1.1.3 Tái bản bảo thủ ở Eukariote: -12

1.1.4 Vai trò tái bản: -13

1.2 Các cơ chế sửa sai của tế bào -14

1.2.1 Cơ chế phòng ngừa -14

1.2.2 Cơ chế sửa sai -15

1.2.2.1 Quang tái hoạt hóa -15

1.2.2.2.Sửa chữa ghép đôi lệch -17

1.2.2.3.Sửa chữa cắt bỏ -17

1.2.2.4.Đọc sửa đối với base bắt cặp sai -19

1.2.2.5 Các hệ thống sửa chữa tái tổ hợp -19

1.2.2.6 Hệ thống SOS -20

1.3 Bảo vệ ADN -23

CHƯƠNG II: CÁC BẾN ĐỔI CỦA ADN 2.1 Đột biến gen -28

2.1.1 Các kiểu đột biến điểm -29

2.1.2 Hậu quả của đột biến điểm -30

2.1.3 Các tác nhân gây ra đột biến gen -35

2.1.4 Cơ chế phân tử của đột biến gen -36

2.2 Tái tổ hợp -37

2.3 Các yếu tố di truyền vận động -41

2.3.1 Các yếu tố di truyền vận động ở prokariote -41

2.3.2 Các yếu tố di truyền vận động ở eukariote -44

PHẦN 3: KẾT LUẬN -48

TÀI LIỆU THAM KHẢO -49

PHẦN I: MỞ ĐẦU

I Lý do chọn đề tài:

Phân tử ADN là vật chất mang thông tin di truyền và thông tin di truyền trong ADN được truyền chính xác từ thế hệ tế bào này sang thế

hệ tế bào khác nhờ quá trình tái bản ADN

Nhưng trong điều kiện môi trường sống luôn thay đổi, ADN liên tục

bị tấn công bởi các tác động xấu của môi trường xung quanh như tia cực tím (UV) từ ánh nắng mặt trời hoặc các hóa chất độc hại, dẫn đến sự suy thoái và sai sót trong mật mã ADN May mắn thay, hầu hết những sai sót đó đã được sửa chữa lại trước khi chúng trở thành đột biến gen Ở nhóm prokariote và nhóm eukariote đều có những cơ chế chuyên biệt để phát hiện và sửa chữa các đột biến Các cơ chế này giữ cho khuyết điểm sao chép ở mức thấp nhất

Tuy nhiên, thông tin di truyền không phải lúc nào cũng được truyền đạt một cách bất di bất dịch mà bên cạnh tính ổn định, phân tử ADN cũng chịu nhiều biến động vượt ra ngoài tầm kiểm soát của hệ thống sửa sai Các biến động này chủ yếu là kết quả của hiện tượng đột biến, tái tổ hợp và hoạt động của các yếu tố di truyền vận động Những quá trình đó tạo ra nguồn biến dị di truyền cung cấp cho quá trình tiến hóa của sinh giới

Vậy thông tin di truyền trên ADN được truyền qua các thế hệ tế bào như thế nào? những sai sót trên ADN được sửa chữa ra sao? phân tử ADN có những biến động nào? Để hiểu sâu hơn về vấn đề trên tôi

quyết định chọn đề tài “Tìm hiểu về tính ổn định và biến động của

ADN”

II Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

Đối tượng nghiên cứu: Tính ổn định và những biến đổi của ADNPhạm vi nghiên cứu: chỉ tập trung nghiên cứu:

- Quá trình sao chép ADN

- Các cơ chế sửa sai của tế bào

- Đột biến gen

- Tái tổ hợp ADN

- Các yếu tố di truyền vận động

III Phương pháp nghiên cứu:

Phương pháp nghiên cứu đề tài là phương pháp tổng hợp các tài liệu được lấy từ các nguồn thông tin như thư viện, báo đài, internet Dựa vào sự phân tích, tổng hợp, so sánh, đối chiếu các tài liệu để thực hiện

đề tài

PHẦN II: NỘI DUNG CHƯƠNG I: TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA ADN

Tính ổn định của ADN là kết quả của hai quá trình sao chép và sửa sai, trong chương này sẽ tập trung vào quá trình tái bản ADN và các cơ chế sửa sai ADN của tế bào

1.1 Quá trình tái bản ADN

Tái bản (replication) là một đặc tính quan trọng nhất của vật chất

di truyền, nhờ đó sự sống duy trì liên tục, giúp các loài bảo tồn được tính chất đặc trưng của mình

1.1.1 Các hình thức tái bản ADN

Ở tế bào prokaryote có 3 kiểu tái bản điển hình

• Tái bản bảo thủ: Là hình thức tái bản mà từ ADN mẹ cho hai

ADN con, trong đó một phân tử được tổng hợp mới hoàn toàn, còn một phân tử được bảo toàn từ ADN

•Tái bản bán bảo thủ: Là hình thức tái bản mà từ ADN mẹ cho hai

ADN con, trong mỗi ADN con có một chuỗi mới được tổng hợp còn một chuỗi là của phân tử ADN mẹ truyền cho

•Tái bản gián đoạn: Là hình thức tái bản mà phân tử ADN khuôn

cắt ra tạo đoạn ngắn Trên mỗi đoạn tiến hành tái bản theo kiểu bảo thủ, hay kiểu bán bảo thủ, sau đó các đoạn mới được tổng hợp nối lại với nhau cho hai phân tử ADN con

Trong các hình thức trên thì hình thức tái bản bán bảo thủ là phổ biến và được nghiên cứu đầy đủ nhất

1.1.2 Tái bản bán bảo thủ ở Prokaryote:

a Vai trò các yếu tố tham gia tái bản ADN

- ADN khuôn: vai trò vừa làm khuôn đồng thời nó cũng là thành phần của sản phẩm của quá trình tái bản Sản phẩm của quá trình tái bản

là các phân tử ADN con mà trong đó có một mạch chính của ADN khuôn

- Nguyên liệu: Là các dezoxi ribonucleotide- Tri phosphat (dNTP) gồm: dATP, d GTP, dCTP, dTTP

+ Cung cấp năng lượng cho quá trình

+ Cung cấp nguyên liệu cho quá trình (dAMP, dGMP, dCMP, dTMP)

Tái bản

bảo thủ

Tái bản bán bảo thủ

Chuỗi ADN ban đầu

•ADN-polymeraza II: Chức năng chưa rõ, người ta cho rằng có thể enzyme này tham gia vào quá trình sữa chữa (thay một đoạn ADN này bằng một đoạn ADN khác).

•ADN-polymeraza III: làm nhiệm vụ tổng hợp chuỗi polynucleotide bổ sung chuỗi khuôn theo chiều 5’-3’ Đây là loại enzyme được nghiên cứu kỷ nhất Cấu trúc của ADN- Polimeraza khá phức tạp, gồm nhiều tiểu đơn vị

Tiểu

đơn vị

Các tiểu đơn vị có chức năng khác nhau:

- Tiểu đơn vị β làm nhiệm vụ nhận biết và gắn chuỗi ADN mới với chuỗi ADN khuôn

- Các tiểu đơn vị α, ε, θ tạo nên lõi enzyme làm nhiệm vụ kéo dài chuỗi polinucleotid

Đặc điểm hoạt động của ADN-polymeraza là cần có mồi vì nó không thể gắn một nucleotid mà không có gốc C3’- OH Mồi cung cấp gốc C3’- OH để ADN-polymeraza xúc tác phản ứng gắn nucleotid mới vào ADN-polymeraza xúc tác quá trình kéo dài chuỗi theo chiều 5’-3’.+ Topoiizomeraza: tháo xoắn sơ cấp

+ ARN polymeraza: tổng hợp đoạn ARN mồi

+ Ligaza: nối các đoạn Okazaki với nhau

+ Helicaza: mở xoắn kép ADN thành hai chuỗi đơn bằng cách cắt các liên kết hydro, phản ứng này có sự tham gia của ATP cung cấp năng lượng

- Protein:

+ SSB: làm nhiêm vụ bám sợi đơn của ADN sau khi đã được tháo xoắn để ổn định trạng thái tháo xoắn Nhờ protein SSB mà hai sợi đơn sau khi tháo xoắn không tái liên kết với nhau và cũng không gấp khúc lại tạo nên các cấu trúc vòng do hình thành sự bổ sung.

+Ngoài protein SSB còn có nhiều loại protein khác tham gia vào quá trình tổng hợp ADN

Protein DnaA Mở xoắn kép ở vị trí đặc biệt

Protein DnaB Xúc tác sự khởi đầu của primaza

Protein DnaG (primaza) Xúc tác sự tổng hợp ARN mới

b Cơ chế:

*Giai đoạn mở đầu:

- Đối với E.coli sự tái bản bắt đầu tại một khởi điểm đặc thù gọi

là OriC

- Protein DnaA gắn đặc hiệu lên OriC (có khoảng 20 phân tử DnaA gắn vào OriC) phản ứng này cần có ATP và Protein HU Tiếp theo là Protein DnaB và Protein DnaC gắn và OriC

- Enzim helicaza mở xoắn ADN, phân hủy các liên kết hydro giữa hai sợi đơn để tách rời hai sợi đơn ở vùng tái sinh tạo nên chạc tái sinh

- Các protein SSB đến gắn vào chạc tái sinh, ngăn không cho hai mạch tái xoắn lại với nhau, gyraza mở xoắn theo chiều xoắn trái

- Primaza xúc tác sự tạo ARN mồi bổ sung với mạch khuôn 3’-5’

*Giai đoạn kéo dài:

- Tổng hợp chuỗi sớm:

Trên mạch khuôn 3’-5’, sau khi primaza tổng hợp đoạn mồi, các nucleotid tiếp tục đến gắn vào đầu 3’-OH của chuỗi theo nguyên tắc bổ sung với chuỗi làm khuôn (chuỗi 3’-5’) nhờ ADN-polymeraza III.

Chuỗi sớm được tổng hợp liên tục, tháo xoắn đến đâu thì các nucleotid tự do trong môi trường nội bào tương ứng bổ sung với các nucleotid trên mạch khuôn lần lượt đến gắn vào đầu 3’-OH bằng cách tạo liên kết photphodiester với nucleotid liền trước đó

Có trường hợp không cần tổng hợp đoạn ARN mồi mà chuỗi khuôn của ADN tự xoắn lại tạo đoạn mồi do đầu 3’-OH quay ngược

1800 Trường hợp này xảy ra trên ADN khuôn có hiện tượng palinarone.+ Tổng hợp chuỗi muộn:

Trên mạch khuôn 5’-3’ của ADN chiều tháo xoắn và chiều tổng hợp ngược nhau nên quá trình tổng hợp không diễn ra liên tục mà tạo ra các đoạn okazaki ngược chiều với chiều phát triển của chạc tái sinh.Mỗi đoạn okazaki có ARN mồi riêng được tổng hợp nhờ primaza Mồi được tổng hợp bổ sung với chuỗi khuôn 5’-3’ và ngược chiều tháo xoắn, tức là tháo xoắn một đoạn mới tổng hợp theo chiều ngược lại Xúc tác cho sự tổng hợp chuỗi muộn là phức hợp protein có tên là primosom Primosom gồm 7 protein khác nhau trong đó quan trọng nhất có DnaB, DnaC và primaza Primosom di chuyển trên chuỗi khuôn 5’- 3’

Trong quá trình di chuyển, primosom tiến hành tổng hợp các đoạn ARN mồi nhờ pimaza, sau đó chuỗi bổ sung của ADN được kéo dài nhờ ADN-polymeraza tạo ra đoạn okazaki

Khi đoạn okazaki mới được hoàn chỉnh, ARN mồi tách ra nhờ ADN –polymeraza I, sau đó đoạn ARN mồi được thay thể bằng đoạn ADN tương ứng nhờ ADN-polymeraza I Tiếp theo ligaza hàn khe hở giữa hai đoạn okazaki lại

* Tổng hợp đồng thời hai chuỗi

Cũng có trường hợp hai chuỗi được tổng hợp đồng thời và cùng chiều Trong trường hợp này ADN-polymeraza III gồm hai tiểu thể: Một tiểu thể xúc tác tổng hợp chuỗi sớm, một tiểu thể xúc tác tổng hợp chuỗi muộn Trên chuỗi ADN mẹ làm khuôn chuỗi muộn xảy ra sự quấn một vòng quanh tiểu đơn vị phụ trách chuỗi muộn làm đảo ngược chiều của chuỗi khuôn này Do vậy, chiều chuỗi khuôn đoạn quấn quanh ADN-polymeraza III là chiều 3’-5’, sự tổng hợp chuỗi bổ sung cho nó đúng theo chiều thóa xoắn, cùng chiều với sự tổng hợp chuỗi sớm ADN-polymeraza di chuyển đến đâu thì đảo ngược chiều chuỗi khuôn đến đó

và quá trình tổng hợp sẽ xảy ra Quá trình tổng hợp này vẫn tạo ra các

helicaza

Hình 1.2 Sự tái bản trên một chạc chữ Y

(Nguồn

http://ppdhsinhhoc12.weebly.com/bagravei-1-gen-matilde-di-truy7873n-vagrave-quaacute-trigravenh-nhacircn-273ocirci-c7911a-adn.html

)

đoạn okazaki vì sau khi tổng hợp từng đoạn bổ sung, các đoạn này cũng được quay ngược chiều trở lại theo sự quay của chuỗi khuôn.

- Giai đoạn kết thúc:

Quá trình kéo dài cứ tiếp diễn cho hết vòng ADN, hai chạc tái bản gặp nhau ở phía đối diện của ADN vòng của E.coli

1.1.3 Tái bản bán bảo thủ ở Eukariote:

Tuy phức tạp hơn ở Prokariote nhưng về cơ bản giống ở Prokariote:

- Tái bản theo hai hướng ngược chiều

- Tổng hợp bổ sung đối song chỉ xảy ra theo chiều 5’ – 3’

- Xảy ra trên hai chuỗi với cơ chế khác nhau:

+ Chuỗi sớm tổng hợp liên tục

+ Chuỗi muộn tổng hợp thành từng đoạn okazaki

- Cần có ARN mồi hay ADN mồi (tự mồi)

Tuy nhiên tái bản ADN ở Eukariote cũng có những đặc điểm riêng:

Hình 1.3 Tổng hợp cùng một lúc chuỗi sớm và chuỗi muộn nhờ ADN

polimeraza III dime ( Nguồn http://www.bioinfo.org.cn/book/biochemistry/chapt24/sim3.htm )

- Trên một phân tử ADN khuôn quá trình tổng hợp ADN xảy ra

đồng thời ở nhiều điểm, trên ADN khuôn có nhiều điểm khởi đầu và

điểm kết thúc

- Vận tốc tổng hợp ADN ở Eukariote chậm hơn ở Prokariote

- Ở Eukariote có bốn loại enzim tham gia: ADN-polymeraza α, β,

γ, δ (ở Prokariote chỉ có ba loại: I, II, III)

Trên ADN của Eukariote quá trình tổng hợp được tái sinh trên

từng đơn vị sao chép Mỗi đơn vị sao chép có điểm khởi đầu, điểm kết

thúc Tại mỗi điểm khởi đầu quá trình tái bản phát triển theo hai hướng,

tạo ra hai chạc tái bản đối diện nhau Các đơn vị tái bản phát triển theo

hai hướng cho đến khi gặp nhau tạo thành hai phân tử ADN con

1.1.4 Vai trò tái bản:

Nhờ có quá trình tái bản làm cho ADN nhân đôi, tạo điều kiện cho

nhiễm sắc thể nhân đôi, đảm bảo cho sự ổn định bộ nhiễm sắc thể của

Hình 1.4 Tái bản ở Eukariote

( Nguồn http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/D/DNAReplication.html )

Bóng tái bảnKhởi điểm tái bản

các thế hệ tế bào và các thế hệ của loài Tái bản ADN đảm bảo truyền đạt thông tin chính xác.

1.2 Sửa chữa ADN

Các tế bào bất cứ lúc nào cũng chịu sự tấn công của nhiều tác nhân

lí, hóa của môi trường Các tác nhân này có thể làm biến đổi các phân tử khác nhau bên trong tế bào kể cả ADN nhưng nếu ADN bị biến đổi thì

có thể gây ra những hậu quả nghiêm trọng Do đó tế bào có nhiều cơ chế đảm bảo sự toàn vẹn của ADN

Có nhiều hệ thống sữa sai trong tế bào: cơ chế phòng ngừa, đọc sữa trong lúc tái bản nhờ một số ADN-polymeraza, quang phục hoạt, cắt

bỏ bazơ hoặc nucleotid Nhờ có sữa chữa mà tỷ lệ đột biến đã thấp hơn rất nhiều (từ 10-5 chỉ còn 10-9)

1.2.2 Cơ chế sửa sai

Hầu hết các đột biến trên phân tử ADN thường được khắc phục bởi hai phương thức chính:

- Sửa chữa phục hồi trực tiếp (direct reversal repair)

- Cắt bỏ sai hỏng và sửa chữa lại bằng cách dùng trình tự bổ sung(damage exision and repair using complemantary sequence)

Sửa chữa trực tiếp thường liên quan đến hai loại sai hỏng trên phân tử ADN

do tia tử ngoại gây ra là: cylobutane- pyrimidine dimer (CPDs) và pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4PPs) Hai dạng sai hỏng này đều làm thay đổi dạng cấu trúc xoắn của ADN CPDs và 6-4PPs được nhận biết

và sửa chữa nhờ enzyme photolyase Enzim này sử dụng năng lượng ánh sáng để thực hiện phản ứng lầm thay đổi các liên kết hóa học để nucleotide trở lại dạng bình thường Phản ứng sửa chữa ADN bằng photolyase xảy ra trong nhiều sinh vật prokatiote và eukariote Tuy nhiên, quá trình này không thấy ở động vật có vú Ở người cũng chưa phát hiện được loại photolyase nào

Đa số sai hỏng của ADN được sửa chữa bằng phương thức thứ hai Cơ chế này phải sử dụng thông tin di truyền chứa ở một trong hai sợi đơn ADN Khi trình tự nucleotide trên một sợi bị thay đổi thì sợi thứ hai ( liên kết bổ sung với sợi thứ nhất) được dùng làm khuôn mẫu để sửa chữa những sai hỏng đó Một số cơ chế sửa chữa như sau:

- Hệ thống sửa chữa nhận biết các trình tự ADN không thích hợp với các cặp base chuẩn và thay thế chúng

- Hệ thống sửa chữa- cắt bỏ (excision repair system) loại đi một đoạn ADN ở vị trí sai hỏng sau đó thay thế nó

- Hệ thống sửa chữa tái tổ hợp ( recombinant repair system) sử dụng phương thức tái tổ hợp để thay thế một vùng sợi đôi bị sai hỏng.Các hệ thống sửa chữa cũng phức tạp như bộ máy tái bản của nó, điều này cho thấy tầm quan trọng của chúng đối với sự sống của tế bào Các kiểu sửa sai ADN trong tế bào bao gồm:

1.2.2 1 Quang tái hoạt hóa

Sửa chữa trực tiếp bằng quang hoạt hóa ( photoreactivation) ít khi gặp, nó bao gồm sự phục hồi hoặc loại bo đơn giản các sai hỏng và quá trình này xảy ra ngoài sáng Quang tái hoạt hóa của các pyrimidine dimers, trong đó tạo cơ hội cho các liên kết cộng hóa trị được phục hồi nhờ enzyme phụ thuộc ánh sáng (light- dependent enzyme), là một ví dụ

điển hình( hình 1.5) Hệ thống sửa chữa này phổ biến trong tự nhiên, và

đặc biệt quang trọng ở thực vật Trong vi khuẩn E.coli , nó còn phụ

thuộc vào sản phẩm của một gen đơn (phr) mã hóa cho một enzyme

được gọi là photolyase

Sau khi xử lí tia tử ngoại gây đột biến, nếu đưa ánh sáng thì phần lớn sai hỏng được phục hồi Hiện tượng này được gọi là quang tái hoạt hóa Năng lượng của ánh sáng khả kiến (từ 300-600nm) hoạt hóa

photolyase (gen phr ở E.coli) cắt các vòng cyclobutyl pyrimidine dimer

( thường là thymine dimer)

Enzyme này thường hoạt động trong các tế bào ở nhiều loài khác nhau Vào ban ngày, các sinh vật thường chịu tác động của ánh sáng, nên cơ chế quang tái hoạt hóa (quang phục hồi) có vai trò quang trọng

trong sửa sai ADN Ví dụ như Mycoplasma, sinhh vật đơn giản nhất

hiện nay, chỉ có vài trăm gen nhưng một trong số đó đã được dùng cho quang tái hoạt hóa

Hình 1.5 Quang Tái hoạt hóa

(Nguồn http://trishul.sci.gu.edu.au/courses/ss12bmi/repair.html )

Ánh sáng (>300nm)Tia UV

1.2.2.2 Sửa chữa ghép đôi lệch

Sửa chữa ghép đôi lệch (mismatch- repair) giữa các sợi ADN là một trong những mục tiêu chính của hệ thống sửa sai Sửa chữa ghép đôi lệch được tiến hành khi phát hiện trên ADN các base nằm cạnh nhau

mà không bắt cặp thích hợp Các ghép đôi lệch tăng lên trong suốt quá trình tái bản được sửa chữa bằng cách phân biệt giữa sợi cũ và mới và được ưu tiên sửa chữa trình tự của các sợi được tổng hợp mới.(hình 1.6) Ghép đôi lệch được tạo ra bởi các biến đổi base, là một quá trình khử amine ( deamination)

Ghép đôi lệch thường được sửa sai bằng phương thức sửa chữa cắt

bỏ, được khởi đầu bằng một enzyme nhận biết một base sai hỏng thực

sự hoặc có sự thay đổi chiều hướng không gian của ADN

Sự nhận biết và sửa chữa các sai lệch do bắt cặp sai trên ADN

được phát hiện ỏ E coli, nấm men và tế bào động vật có vú Ở vi khuẩn

E.coli, có ba hệ thống enzyme khác nhau được sử dụng để sửa chữa các

sai lệch bằng cách:

- Loại bỏ chỗ sai trong tái bản (errors in replication)

- Loại bỏ ghép đôi lệch bên trong các đoạn trung gian của tái tổ hợp (mismatch wihin recombinant intermediates)

- Loại bỏ thymine của cặp G-T trong trường hợp 5- methylcytosine

bị mất nhóm amine (-NH2) thành thymine

1.2.2.3 Sửa chữa cắt bỏ:

Có hai hệ thống sửa chữa cắt bỏ, đó là:

- Hệ thống sửa chữa cắt bỏ base (base excision repair) loại bỏ trực tiếp base sai hỏng và thay thế nó trong ADN

- Hệ thống sửa chữa cắt bỏ nuleotide (nuleotide excision repair) cắt

bỏ một trình tự bao gồm các base sai hỏng, sau đó một đoạn ADN mới

được tổng hợp thay thế cho nguyên liệu bị cắt bỏ Hệ thống này phổ biến ở hầu hết các sinh vật.

* Hệ thống sửa chữa cắt bỏ base:

Việc loại bỏ chỗ sai được thực hiện nhờ một hoặc vài enzyme glycosylase N-glycosylase nhận biết base biến đổi hay mất gốc amine hoặc biến dạng cấu trúc xoắn do sai lệch tạo ra và thủy phân liên kết N-

N-glycosylic giữa base với đường với pentose Lỗ hổng vừa được tạo ra do cắt bỏ được ADN-polymerase làm đầy lại dựa vào khuôn mẫu bổ sung đối diện và ligase nối liền chúng

* Hệ thống sửa chữa cắt bỏ nuleotide:

Việc cắt bỏ một vùng có nhiều thymine dimer (do UV) hoặc vùng liên kết chéo giữa các sợi, được thực hiện nhờ incision nuclease

(nuclease tạo khấc trên ADN) như phức hợp Uvr ABC của E.coli phức

hợp này cắt các đoạn 12-13 nucleotide từ một sợi ADN Sự thủy phân được thực hiện ở liên kết phosphodieste thứ tám ở đầu 5’ đến chỗ hỏng

và ở phía 3’là liên kết thứ tư hay năm.(hình 1.6)

Cấu trúc sợi kép bổ sung cho nhau của ADN cho phép, nếu thông tin bị mất do cắt bỏ sai hỏng trên một sợi có thể chép lại nhờ dựa vào sợi

bổ sung kia Tuy nhiên, một số sai hỏng liên quan cùng lúc cả hai sợi cũng có thể được sửa chữa nhờ vào một đoạn nucleotide tương đồng tồn tại đâu đó trong gennom Sự mất đoạn hay xen đoạn nucleotide, hay liên kết chéo giữa các sợi ADN cũng có thể được phục hồi nhờ sự thay thế đoạn tương ứng bằng tái tổ hợp Thậm chí sự đứt đôi cả hai sợi cùng chỗ, được coi là nặng nhất trong các sai hỏng, có thể được gắn liền lại nhờ ligase hay tái tổ hợp

1.2.2.4 Đọc sửa đối với các base bắt cặp sai.

Cơ chế đọc sửa đối với các base bắt cặp sai (proofreading for pair matching) được thực hiện trong tái bản ADN Sự bắt cặp cẩn thận của các ADN- polimerase đảm bảo cho sự chính xác trong tái bản

base-+ Ở tế bào prokariote: ADN- polimerase III có tỉ lệ nhầm là 10-4 trong khi tỉ lệ nhầm trên các mạch mới tổng hợp chỉ khoảng 10-8 Sai khác này do các ADN-polimerase có khả năng nhận biết các sai lầm của mình và tức thời sửa sai Khả năng sửa sai của các enzyme này dựa trên hoạt tính polymerase và hoạt tính exonuclease, chúng loại bỏ ngay nucleotide bị gắn nhầm và thay bằng nucleotide phù hợp

+ Ở tế bào eukariote : ADN- polimerase β và εlà những enzyme của hệ thống sửa sai ADN trong nhân.[1]

Hoạt tính đọc sửa đối với các base bắt cặp sai là đặc tính của các ADN- polimerase đảm bảo cho sự kéo dài chính xác của sợi đang được tổng hợp Tuy nhiên, trong trường hợp cần thiết, ADN polimerase có thể

bỏ qua chỗ sai và tiếp tục sao chép tiếp nhờ cơ chế tái bản “error prone”

1.2.2.5 Các hệ thống sửa chữa tái tổ hợp

Các vị trí có sự sai hỏng, xảy ra trong một phân tử con sẽ được phục hồi nhờ sự tái tổ hợp để thu được một bản sao khác của trình tự từ một nguồn không bị sai hỏng Bản sao này sau đó được dùng để sửa chữa lỗ hổng trên sợi bị hỏng

Khi ADN-polimerase gặp thymine dimer hay một số sai lệch khác trên sợi ADN khuôn mẫu, có hai khả năng xảy ra:

- ADN-polimerase lấp đầy lỗ hổng bằng tái bản không theo khuôn mẫu do tái tổ hợp và vượt qua chỗ sai

- ADN-polimerase dừng lại và huy động khoảng 1000 nucleotide phía dưới, chỗ trống được lấp đầy với sợi bổ sung từ sợi đôi chị em (sister duplex) do tái tổ hợp

Trong cả hai trường hợp, chỗ sai lệch vẫn còn và được cắt bỏ sau

đó bởi sửa sai trực tiếp hay cắt bỏ

1.2.2.6 Hệ thống SOS

Hệ thống SOS (chứa khoảng 30 gen không liên kết và thường bị ức chế bởi protein LexA) sẽ hoạt động khi tế bào bị các tác nhân gây đột biến tạo nhiều sai hỏng trên ADN Trong trường hợp ADN bị hỏng ngừng tái bản, phản ứng SOS sẽ phục hồi tái bản bằng phương thức tái bản “error prone”

Hình 1.6 Một số phương thức sửa chữa ADN

(Nguồn:

Ở vi khuẩn E coli người ta đã quan sát thấy sự phá hủy ADN làm

mở ra khoảng 20 gen của hệ thống SOS, được kiểm soát âm bởi chất ức chế LexA ( LexA repressor)

Trong trường hợp có nhiều sai hỏng cần cấp cứu, LexA bị kích thích, thay đổi cấu hình, tự cắt và mất hoạt tính ức chế Lúc đó các gen của hệ thống SOS được mở ra Nếu quá trình sửa sai thực hiện không kịp thì tế bào phải chấp nhận hoặc bị đột biến hoặc chết

Protein RecA khởi động hệ thống SOS như sau:

- Hộp SOS là trình tự ADN (operator) dài khoảng 20bp được nhận biết bởi protein của chất ức chế LexA

- Sai hỏng của ADN làm cho RecA khởi động phản ứng SOS, chứa các gen mã hóa cho nhiều enzyme sửa chữa

- RecA hoạt hóa hoạt tính tự phân giải LexA

- LexA ngăn chặn hệ thống SOS, nhưng phản ứng tự phân giải của

nó đã hoạt hóa các gen của hệ thống này

* Sửa chữa theo cơ chế “error prone”

Phân tử ADN có thể bị sai hỏng nặng nề khi bị chiếu tia tử ngoại hoặc khi chịu tác động của các tác nhân gây ung thư Lúc đó không phải chỉ một sợi đơn ADN bị hỏng mà cả hai sợi đều bị đứt gảy và mất đi một số nucleotide Thông tin di truyền của đoạn hỏng bị mất hoàn toàn nên không có sợi khuôn mẫu để sửa chữa theo các cơ chế thông thường Trong trường hợp này, tế bào còn lại một giải pháp duy nhất để tăng khả năng sống sót đó là sửa chữa ADN một cách ngẫu nhiên với tỉ lệ sai sót (đột biến) cao nhưng dù sao vẫn duy trì được sự sống Đây chính là cơ chế sửa chữa ADN “ error prone”

Khi phân tử ADN bị đột biến, một số protein đặc biệt sẽ làm nhiệm

vụ dừng quá trình tổng hợp ADN để sửa chữa theo các cơ chế khác nhau Một số trường hợp sai hỏng được sửa chữa bằng cơ chế “error-

- Trường hợp thứ nhất là các base bắt cặp sai.

- Trường hợp thứ hai ADN bị sai hỏng không được sửa chữa do ADN- polimerase III bị giữ lại trong suốt quá trình tái bản

ADN- polimerase V (được mã hóa bởi gen umuD và umuC của

E.coli ) được cảm ứng trong hệ thống SOS, để tổng hợp một đoạn bổ

sung cho sợi ADN bị hỏng ADN polimerase V là một phức hợp chứa

hai protein tiểu đơn vị umuD và một protein tiểu đơn vị umuC ( trong

quá trình sửa chữa “error prone”, protein RecA hoạt động như một

co-protease gián tiếp tự xúc tác cắt protein umuD thành một đoạn có hoạt tính umuD’)

Các protein tiểu đơn vị umuD ( thực tế là umuD’) và umuC có

khả năng gắn các nucleotide vào sợi ADN bất chấp không tồn tại khuôn mẫu Như vậy chúng có thể ức chế hoạt tính tự sửa exonulease 3’- 5’ của ADN - polimerase hoặc chính chúng cũng là một loại ADN - polimerase đặc biệt (ADN - polimerase V) Khi đột biến xảy ra trên gen

mã hóa cho umuD và umuC các tế bào vi khuẩn sẽ sống sót ít hơn các tế

bào bình thường dưới tác động của tia tử ngoại Một vài plasmid mang

gen mucA và mucB, tương đồng với gen umuD và umuC khi được đưa

vào trong vi khuẩn sẽ làm tăng tính kháng với tia tử ngoại Ngoài ra , khi cả hai sợi đơn của ADN đều bị đột biến nhưng nếu trong genome còn có ít nhất một bản sao giống hệt đoạn bị hỏng, lúc đó đoạn bị hỏng

có thể được phục hồi nhờ cơ chế trao đổi chéo dùng bản sao làm khuôn mẫu

* Protein LexA

Hoạt tính của RecA gây ra sự phân giải sản phẩm protein của gen

lexA LexA là một protein nhỏ (22kDa) khá ổn định trong các tế bào

không bị xử lí, nơi nó có chức năng như một chất ức chế ở nhiều operon Phản ứng phân giải là không thường xuyên LexA có hoạt tính protease muộn được hoạt hóa bởi RecA Khi RecA được hoạt hóa, nó sẽ

gây ra phản ứng tự phân giải của LexA làm bất hoạt chức năng ức chế của LexA và cảm ứng phối hợp tất cả operon mà nó được liên kết

Các gen đích của protein ức chế LexA có nhiều chức năng sửa chữa Một số gen SOS này chỉ hoạt động ở các tế bào bị xử lí Những gen khác hoạt động ở các tế bào không bị xử lí, nhưng mức độ biểu hiện được tăng lên nhờ sự phân giải của LexA Sau khi phân giải LexA, gen

có thể được biểu hiện từ promoter thứ hai giống như promoter đầu tiên

Protein LexA ức chế các gen đích của nó bằng cách liên kết với một đoạn ADN dài khoảng 20 bp được gọi là hộp SOS, bao gồm một trình tự liên ứng( consensus sequence: 5’-CTGTN8ACAG-3’) với 8 vị trí bảo toàn tuyệt đối giống như các operator khác, các hộp SOS xếp

chồng lên các promoter tương ứng Ở locus lexA, đối tượng của sự ức

chế tự sinh, có hai hộp SOS cạnh nhau [3]

* Protein RecA

Sự cuộn lại trực tiếp của protein RecA trong sửa chữa tái tổ hợp chỉ là một trong những hoạt tính của nó Nó có thể được hoạt hóa bởi

các xử lí làm sai hỏng ADN hoặc ức chế tái bản trong E.coli Điều này

giúp nó khởi động một chuỗi phức tạp những thay đổi kiể hình được gọi

là phản ứng SOS, yếu tố cần thiết cho sự biểu hiện của nhiều gen mà các sản phẩm của chúng có các chức năng sửa chữa Các hoạt tính kép này của protein RecA làm cho người ta không biết rõ sự thiếu hụt trong sửa

chữa các tế bào đột biến RecA là do mất chức năng trao đổi sợi ADN

của RecA hay là do một vài chức năng khác mà sự cảm ứng của nó phụ thuộc vào hoạt tính protease

Đầu tiên là hoạt hóa RecA bằng xử lí sai hỏng Chúng ta không biết nhiều về mối quan hệ giữa sự sai hỏng và sự thay đổi đột ngột trong hoạt tính RecA Một biến động của các trường hợp sai hỏng có thể cảm ứng phản ứng SOS Hiện nay, người ta thiên về ý kiến cho rằng RecA

được hoạt hóa bởi một số chất trung gian trong chuyển hóa ADN Tín hiệu cảm ứng có thể chứa một phân tử nhỏ được phóng thích từ ADN; hoặc nó có thể là một vài cấu trúc được tạo thành trong chính ADN Ở

điều kiện in vitro, hoạt tính của RecA đòi hỏi sự có mặt của ADN sợi

đơn và ATP Vì thế một vài tín hiệu có thể hiện diện ở vùng sợi đơn ở một vị trí sai hỏng Sự tương tác của nó với RecA là nhanh: Phản ứng SOS xảy ra trong một vài phút xử lí sai hỏng

Tóm lại, RecA và LexA là các mục tiêu chung trong hộp SOS;

RecA khởi động sự phân giải của LexA, nhân tố ức chế recA và chính

nó Vì thế phản ứng SOS tạo ra sự khuếch đại của cả hai protein RecA

và chất ức chế LexA Kết quả là không còn mâu thuẩn như lúc đầu nữa.Việc tăng mức độ biểu hiện của protein RecA cần thiết cho vai trò trực tiếp của nó trong các phương thức sửa chữa tái tổ hợp Về sự cảm ứng, nồng độ của RecA được tăng lên 50 lần so với nồng độ ban đầu của

nó khoảng 1200 phân tử/ tế bào Nồng độ cao ở các tế bào được cảm ứng có nghĩa là có đủ RecA để đảm bảo rằng tất cả protein LexA bị phân giải

1.3 Bảo vệ ADN: Hệ thống cắt hạn chế (R)- biến đổi (M)

Ngoài hệ thống sửa sai, tế bào còn có hệ thống bảo vệ ADN Các

vi khuẩn có hệ thống miễn nhiễm hiệu quả ADN lạ, đó là: hệ thống cắt hạn chế- biến đổi (restriction modification system) hiện diện trong nhiều loài vi khuẩn, trong đó ADN được hiện diện bởi các enzyme đặc hiệu

Sự biến đổi xảy ra nhằm mục đích bảo vệ ADN chống lại sự phân hủy enzyme (cắt hạn chế) bởi các endonuclease của chính chúng Sự biến đổi bao gồm một kiểu đặc trưng của phản ứng methyl hóa các gốc nucleotide trong ADN Bằng cách dùng S-adenosylmethionine như là một chất cho, các enzyme methyl hóa (methylase) sẽ hoạt động trên ADN sợi đôi (dsADN) Các vị trí mà ở đó có sự biến đổi cũng được nhận biết bởi enzyme hạn chế ( restriction enzyme,RE) tương ứng, tuy

nhiên các enzyme hạn chế không thể cắt ADN trong các vị trí đã được biến đổi này ở một hoặc cả hai sợi ADN.

Các vi sinh vật prokariote và eukariote đều có các enzyme methyl hóa gắn nhóm CH3 ở những điểm nhất định trên phân tử ADN Các enzyme này có tính đặc hiệu cao chuyên hóa cho từng nhóm vi khuẩn,

vì thế ADN của mỗi dòng vi khuẩn chỉ được methyl hóa ở những vị trí đặc biệt nhất định Nhờ đó, mỗi vi khuẩn dễ dàng phân biệt ADN của bản thân với ADN ngoại lai xâm nhập vào tế bào Các enzyme cắt hạn chế là một loại endonuclease của mỗi dòng vi khuẩn không cắt ADN của chúng vì đã được methyl hóa ở những điểm cần thiết mà chỉ cắt ADN ngọai lai do chúng không được methyl hóa ở những vị trí nhất định

Hệ thống R-M có hai tính chất cơ bản:

- Hoạt tính restriction (cắt hạn chế) đặc hiệu chống sự xâm nhập của ADN ngoại lai

- Hoạt tính bảo vệ ADN của bản thân nó

Hệ thống R-M lần đầu tiên được phát hiện khi nghiên cứu hiện

tượng nhiễm bacteriophage vào E.coli Sự biến đổi thường là Metyl hóa

nhóm 6- NH2 của adenine ở những trình tự nucleotide đặc hiệu trong hệ thống kiểu II, C5 của cytosine được methyl hóa Cắt hạn chế được thực hiện do hệ thống endonuclease Chúng nhận biết các điểm đặc hiệu ít nhất ở một sợi ADN không biến đổi Endonuclease cắt đứt sợi ở nhiều điểm nhận biết và sau đó các đoạn ngắn được cắt bằng các nucleotide khác Phần lớn các ADN bị biến đổi có các đặc tính di truyền không ổn định Sự methyl hóa thường mất đi qua tái bản trong tế bào chủ

Các nghiên cứu cho thấy ở chủng E.coli B có ba gen liên kết chặt

với nhau mã hóa cho ba sản phẩm khuếch tán: các polypeptide phục vụ cho sự cắt hạn chế, cho sự biến đổi và tạo sự đặc biệt của điểm nhận biết