Bệnh gumboro và các kỹ thuật sinh học phân tử

Trong dịch tể học, kỹ thuật kháng thể huỳnh quang dùng để phát hiện nhanh chóng và phân biệt rõ ràng các tác nhân gây bệnh.. Nguyên lý và cơ sở phát huỳnh quang Nguyên lý: Dùng một chất

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện: Giáo viên hướng dẩn

Trương Minh Dũng TS Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Hồng Phong

Nguyễn Thị Minh Thư

Ngô Thị Thu Ngân

11/2006

I LỜI MỞ ĐẦU

Sinh học phân tử là một môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật ở mức

độ phân tử Phạm vi nghiên cứu của môn này có phần trùng lặp với các ngành khác trong sinh học đặc biệt là di truyền học và hóa sinh Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA và protein và tìm hiểu cách thức điều hòa các mối tương tác này

Sinh học phân tử là một bộ môn khoa học còn rất non trẻ nhưng đã có nhiều bước tiến vượt bậc và tác động toàn diện đến nhiều ngành khoa học, tới sản xuất và đời sống

Ngành kinh tế nông nghiệp gia cầm hiện nay đang gặp nhiều nguy cơ đe dọa quá trình phát triển Trong đó, dịch bệnh đã ảnh hưởng rất lớn về lợi nhuận, quá trình sản xuất, tình hình chăn nuôi gia cầm trên thế giới

Vì vậy, việc ứng dụng những kỹ thuật sinh học phân tử vào việc chẩn đoán, điều trị bệnh trên gia cầm hiện nay là một tất yếu

Ngày 30 tháng 11 năm 2006

Nhóm báo cáo

II MỤC LỤC

I LỜI MỞ ĐẦU 1U

III TỔNG QUAN 4

III.1 Bệnh Gumboro 4

III.1.1 Khái niệm 4

III.1.2 Sơ lược về túi Fabricius 4

III.1.3 IBDV 4

III.1.4 Lịch sử phát hiện 6

III.1.5 Cơ chế 7

III.1.6 Triệu chứng 8

III.1.7 Bệnh tích 9

IV PHƯƠNG PHÁP-VẬT LIỆU 12U IV.1 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang 12

IV.1.1 Nguyên lý và cơ sở phát huỳnh quang 12

IV.1.2 Các phương pháp kháng thể huỳnh quang 12

IV.2 Phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch (Agar gel precipitation test, AGP) 17

IV.3 RT-PCR 19

IV.3.1 Nguyên tắc 19

IV.4 RFLP 23

IV.5 Phản ứng trung hòa virus(Virus neutralization=VN) 26

IV.6 ELISA 26

IV.6.1 Enzyme linked immuno Sorbent assay (Elisa) phát hiện kháng thể: 26

IV.6.2 Elisa phát hiện kháng nguyên: antigen capture (AC)-elisa 29

IV.7 Vaccine 30

V KẾT LUẬN 32

VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

III TỔNG QUAN

III.1 Bệnh Gumboro

III.1.1 Khái niệm

Infectious bursal disease (IBD) là một căn bệnh có khả năng lây lan cao trong đàn gà con Bệnh được gây ra bởi Infectious bursal disease virus (IBDV) Bệnh làm suy giảm hệ thống miễn dịch và gây tử vong đối với gà từ 3-6 tuần tuổi Một mặt, nó làm gia tăng tính nhạy cảm đối với các bệnh khác; mặt khác,

nó trơ với việc chủng ngừa có hiệu quả Trong những năm gần đây, nhiều dòng chủng IBDV (vvIBDV), nguyên nhân chính gây ra sự tử vong đồng loạt trên

gà, đã xuất hiện ở châu Âu, Mỹ Latin, Đông Nam Á, châu Phi và Trung Đông

III.1.2 Sơ lược về túi Fabricius

Túi Fabricius là cơ quan dạng lympho, nằm gần hậu môn

Trong quá trình phát triển của bào thai, nó xuất hiện sau tuyến ức và giống như tuyến ức, túi Fabricius có cấu trúc lympho biểu mô

Túi Fabricius là cơ quan dạng lympho trung ương, quá trình biệt hóa trong túi diễn ra không bị ảnh hưởng bởi kích thích kháng nguyên từ bên ngoài

Túi Fabricius nhỏ đi rất sớm: gà khoảng tháng thứ 4 (tuổi dậy thì), nó bắt đầu teo và tới tháng 11-12 thì mất hẳn

Chia túi ra thành các đơn vị cấu trúc gọi là các nang (Foliculum) Mỗi nang gồm có một vùng vỏ giàu lympho bào và một vùng tủy ít tế bào hơn nhưng có chứa tương bào

Đây còn là nơi biệt hóa dòng lympho B

III.1.3 IBDV

IBDV có dạng hình khối, nhiều gốc cạnh, khích thước: 55-65 nm, phân

IBDV là virus dạng trần, không có vỏ bọc ngoài

IBDV có cấu trúc mạch đôi RNA cuộn tròn và được phân thành 2 đoạn

riêng biệt, nó thuộc loài Avibirnavirus của họ Birnaviridae (Leong et al.,

2000) Quanh nhân là vỏ protein (vỏ capsid) Lớp capsid này được hợp thành bởi 32 capsomer (đơn vị hình thái) Mỗi capsomer được tạo bởi 5 loại protein cấu trúc khác nhau: VP1, VP2, VP3, VP4 và VP5 (Viral Protein-VP)

IBDV genome chứa hai mạch, A và B Mạch B (2.9kb) mã hóa cho VP1 (VP1: 95kDa), người ta vẫn cho nó là một enzyme RNA polimerase phụ thuộc RNA (RNA dependent RNA polimerase-RdRp) (Bruenn, 1991; Macreadie &

Azad, 1993; Spies et al., 1987) Polipeptide này hiện diện dưới dạng virus nghỉ

ở ngoài tế bào chủ (virion), mang bản chất của một protein tự do và của một protein liên kết genome (còn được gọi là VPg) VPg được cố định vào đuôi 5’ của sợi dương của 2 mạch trong genome (Dobos, 1993; Spies & Muller, 1990) Mạch A lớn hơn (3.2kb) chứa hai khung đọc mở thành phần (overlapping open reading frame-ORF) ORF nhỏ sẽ mã hóa cho protein không cấu trúc VP5,

không cần thiết cho quá trình sao chép virus in vitro nhưng lại quan trọng đối với khả năng gây bệnh của virus (Mundt et al., 1997; Yao et al., 1998) ORF

lớn hơn mã hóa cho 1 polyprotein 110 kDa, tự xác tác phân cắt hình thành 3 loại polipeptide: pVP2 (48 kDa), VP3 (32 kDa) và VP4 (28 kDa) VP4, một

loại enzyme protease phân cắt serine-lysine (Birghan et al., 2000), nó còn tham gia quá trình tự tách RNA dư thừa (Lejal et al., 2000; Sanchez & Rodriguez,

1999) pVP2 sẽ được tách thêm những RNA dư thừa tại những Carbon cuối

cùng để trở thành VP2 (40 kDa) (Da Costa et al., 2002; Lejal et al., 2000) VP2

và VP3 là những protein cấu trúc Trong đó, VP2 chứa những vị trí kháng nguyên quan trọng và hệ thống đáp ứng miễn dịch (Heine and Boyle, 1993)

Về miễn dịch: IBDV có hai serotype khác biệt rõ ràng, nhưng chỉ có loại

serotype 1 mới có khả năng gây bệnh trên gia cầm

Serotype 1: gồm nhiều chủng gây bệnh cho gà Có ít nhất khoảng 6 loại kháng nguyên phụ của serotype 1 được xác định bằng các thử nghiệm trung hòa trong ống nghiệm Những virus thuộc một trong những loại kháng nguyên phụ này thường được biết dưới dạng những biến thể, nguyên nhân gây tỉ lệ tử vong trên gà từ 60-100% Có sự khác nhau về kháng nguyên giữa các chủng cổ điển và biến thể Miễn dịch chéo giữa những biến chủng rất nhỏ (Mc Ferran và

Cs 1980)

Serotype 2: gồm có chủng virus gây bệnh cho gà tây Về phương diện miễn dịch, giữa hai serotype không có khả năng miễn dịch chéo với nhau Tuy nhiên gà và gà tây có thể bị nhiễm các chủng virus của nhau mà không phát bệnh

Sức đề kháng:

IBDV có sức đề kháng cao với các tác nhân lý hóa và môi trường Chịu

giảm (Landgraf và cs, 1967)

Trong chất thải, phân, nước tiểu, IBDV vẫn giữ nguyên tính gây nhiễm và gây bệnh trong vòng ít nhất là 52 ngày

IBDV đề kháng hoàn toàn với ether, chloroform Trong phenol 0.5% và

trong 10 phút Các hợp chất như: dẫn suất phenol, phức hợp iode, formol nồng

độ cao, có thể diệt được IBDV

Chất chứa mầm bệnh: thận và túi Fabricius, nơi chứa nhiều virus nhất

Ngoài ra, trong các chất tiết, thức ăn, nước uống, chất độn chuồng cũng chứa virus

Đường xâm nhiễm: trong tự nhiên, lay truyền qua đường tiêu hóa là phổ

biến nhất, việc lây nhiễm qua không khí ít quan trọng Trong phòng thí nghiệm,

Lúc đầu, người ta cho rằng, bệnh là biến thể của bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis, IB) vì bệnh tích ở thận tương đối giống nhau

Sau này, Winterfield và Hitchner đã chứng minh rằng những con gà đã miễn dịch với IB rồi vẫn nhiễm bệnh viêm túi Fabricius

Cuối năm 1962, Winterfield đã phân lập được từ phôi trứng tác nhân gây bệnh truyền nhiễm ở gà (bệnh tích ở túi Fabricius và thận)

Năm 1986-1987, lần đầu tiên những dòng biến thể của IBDV được công

III.1.5 Cơ chế

IBDV tấn công chủ yếu vào mô lympho Tế bào lympho B của túi Fabricius bị phá hủy Tế bào lympho T của tuyến Thymus bị tổn thương Sau 2 ngày xâm nhập vào cơ thể, thấy xuất hiện những biến đổi viêm túi Fabricius Đặc biệt đến ngày 3-4 ở túi Fabricius, thấy xung huyết, xuất huyết, phù thủng

và sự thâm nhiễm của các tế bào viêm đạt ở độ cực đại Cùng với sự phóng virus, thân nhiệt cũng tăng đột ngột; sau đó, gây hoại tử tiến triển ở các nang (Foliculu) của túi, phá hủy tất cả các mô lympho và cuối cùng sau 5-7 ngày túi teo nhanh Những thay đổi suy thoái phát triển ở những nơi tế bào lympho B hay tụ tập

III.1.6 Triệu chứng

Thể lâm sàng: ở gà từ 3-6 tuần tuổi và có thể trên 10 tuần tuổi Biểu hiện

đầu tiên là cơ vòng hậu môn luôn co bóp, sốt cao, bỏ ăn và khát nước, sau ỉa chảy Phân loãng và có màu trắng, lẫn máu; gà ủ rũ, lông xù, xã cánh, nằm quẹo rồi chết

Thể ẩn: thường xảy ra dưới 3 tuần tuổi gây suy giảm miễn dịch Vì thể

hiện lâm sàng không rõ nên dễ nhầm với các bệnh khác, nhất là bệnh Newcatle

III.1.7 Bệnh tích

Bệnh tích đại thể:

-Lách sưng

-Thận sưng, biến đổi màu, ống niệu quản đầy muối urat

-Xuất huyết từng đám ở cơ ngực, cơ đùi

-Da chân khô tóp lại (cơ thể bị mất nước do tiêu chảy)

-Dịch niêm mạc tăng

-Túi Fabricius không ngừng bị biến đổi: Sau 3 ngày nhiễm túi Fabricius

tăng kích thước và trọng lượng do thủy thủng các nang túi Đến ngày thứ 4

trọng lượng tăng gấp 2-3 lần bình thường, các nang viêm không đều Dịch nhày

vàng lẫn hồng giữa các nang, có thể có từng đám xuất huyết trong các nang dẫn

đến dịch này chuyển màu vàng đục sánh, đôi khi có kèm bã đậu (fibrin) Có

trường hớp dịch nhày bao quanh cả bên ngoài túi Đến ngày thứ 5 trọng lượng

túi Fabricius bắt đầu giảm và teo dần, nhưng các nang túi vẫn không đồng đều

kích thước và trọng lượng

thước và trọng lượng

Bị phù, chất tiết sền sệt màu vàng Màu sắc biến đổi từ màu trắng sang màu kem Những đốm xuất huyết xuất hiện

Bệnh tích vi thể:

Có hoại tử của các thành phần tế bào lympho như: ở túi Fabricius, ở van hồi manh tràng, lách Các thành phần của tế bào lympho bị phá hủy, nhân tế bào bị teo rỗng

Trong trường hợp nhẹ: Trong nang có những đám thâm nhiễm lớn của tế bào viêm ở mô giữa các nang Ở các nang có những tế bào rỗng tạo thành các không bào (Vacuolas) hoặc thấy hiện tượng hoại tử của các tế bào cùng những mảnh vụn của tế bào bị phá hủy, làm thành một khối Phản ứng viêm nhiễm không phân biệt rõ Việc các tế bào bị phá hủy sẽ dẫn đến việc biến mất hoàn toàn các nang lympho Tại chỗ của chúng phát triển các tế bào biểu mô ít phân biệt

Trong trường hợp cấp tính: Ở tại các mô đệm của các nang thường thấy đầy hồng cầu trên bề mặt Ở giữa lớp tế bào thấy xuất hiện những thành phần tế bào hoàn toàn bị lệch vị trí, do có những mảnh tế bào và dịch nhày màu hồng

Tóm lại: toàn bộ quá trình là sự nhiễm có mủ và hoại tử với sự xuất hiện của các không bào

IV PHƯƠNG PHÁP-VẬT LIỆU

IV.1 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang

Một trong những kỹ thuật đánh dấu được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu miễn dịch học là kỹ thuật kháng thể huỳnh quang do Coons đề xướng năm 1942

Trong dịch tể học, kỹ thuật kháng thể huỳnh quang dùng để phát hiện nhanh chóng và phân biệt rõ ràng các tác nhân gây bệnh

IV.1.1 Nguyên lý và cơ sở phát huỳnh quang

Nguyên lý: Dùng một chất đánh dấu (chất màu huỳnh quang) gắn vào kháng thể hoặc kháng nguyên để phát hiện ra kháng nguyên hoặc kháng thể tương ứng chưa biết ở mức vi thể dưới KHV huỳnh quang

Cơ sở phát quang: Các nguyên tử của một số chất khi hấp thu các dạng năng lượng khác nhau (trong đó có ánh sáng) thì thay đổi vị trí, tức bị hưng phấn, khi trở về trạng thái ban đầu của mình nó tỏ phát ra năng lượng dưới dạng ánh sáng gọi là sự phát quang Thời gian phát quang sau khi ngừng tác dụng của yếu tố hưng phấn không quá 1.10-3s gọi là sự phát huỳnh quang

Sự phát huỳnh quang của chất được chiếu sáng bởi tia cực tím gọi là hiện tượng huỳnh quang tiêu phát

Sự phát sáng xuất hiện trong những chất đặc biệt (chất màu huỳnh quang), những chất này dùng để đánh dấu vào kháng thể hoặc kháng nguyên gọi là hiện tượng huỳnh quang thứ phát

IV.1.2 Các phương pháp kháng thể huỳnh quang

Phương pháp trực tiếp:

-Nguyên tắc: Kháng thể hoặc kháng nguyên đã được gắn chất huỳnh quang phản ứng trực tiếp với kháng nguyên hoặc kháng thể đặc biệt trên tiêu bản

-Kỹ thuật:

+Gắn kháng nguyên lên lame

+Cố định kháng nguyên bằng Aceton (ngâm lame trong Aceton đặt ở

-20oC/ 20’ hoặc 4oC/ 20’)

+Rửa lame bằng dung dịch PBS, để khô

+Rửa lame bằng dung dịch PBS, để khô-xem kính

-Kiểm tra sự phát huỳnh quang bằng KHV huỳnh quang:

Chất huỳnh quang được sử dụng là Flourescein Isothyocianate

+Nếu kháng nguyên và kháng thể tương đồng thì phức hợp không bị rữa trôi, sẽ phát sáng dưới KHV huỳnh quang-mẫu dương tính

+Nếu kháng nguyên và kháng thể không tương đồng thì Conjugate sẽ bị rữa trôi và do đó không phát sáng dưới KHV huỳnh quamh-mẫu âm tính

-Ưu điểm: Chẩn đoán nhanh, độ chính xác cao Đơn giản hơn các phương pháp khác

-Nhược điểm: Trang thiết bị đắt tiền, tốn kém Muốn kiểm tra loại kháng nguyên nào thì phải có loại kháng thể huỳnh quang tương ứng đó mà việc sản xuất các kháng thể huỳnh quang đòi hỏi nhiều thời gian

Phương pháp gián tiếp:

-Nguyên tắc: Kháng kháng thể gắn huỳnh quang (Conjugate) phản ứng với kháng nguyên hoặc kháng thể định tìm qua một khâu trung gian là kháng thể hoặc kháng nguyên tương ứng

-Các bước tiến hành:

+Gắn kháng nguyên lên lame

+Cố định kháng nguyên bằng Aceton (ngâm lame trong Aceton đặt ở

-20oC/ 20’ hoặc 4oC/ 20’)

+Rửa lame bằng dung dịch PBS, để khô

+ Rửa lame bằng dung dịch PBS, để khô

+Rửa lame bằng dung dịch PBS, để khô-xem kính

-Kiểm tra sự phát huỳnh quang bằng KHV huỳnh quang:

+Nếu kháng nguyên và kháng thể tương đồng thì phức hợp không bị rữa trôi và gắn với Conjugate sẽ phát sáng dưới KHV huỳnh quang-mẫu dương tính

+Nếu kháng nguyên và kháng thể không tương đồng thì kháng thể sẽ bị rửa trôi và do đó không gắn được với Conjugate, không phát sáng dưới KHV huỳnh quang-mẫu âm tính

-Ưu điểm: Chẩn đoán nhanh, độ chính xác cao và rất nhạy Theo Pressman (1958) thì phương pháp gián tiếp nhạy hơn phương pháp trực tiếp 4-

-Conjugate: Sử dụng Conjugate ở hiệu giá 1/40 (đã được thử hiệu giá phát quang năm 1992 để vừa đảm bào phản ứng có kết quả vừa đảm bảo tiết kiệm Conjugate)

-Huyết thanh: Sử dụng huyết thanh chuẩn do Proconco cung cấp và huyết thanh dương tính tự chế

Mỗi mẫu gà bệnh được làm 3 tiêu bản Mỗi tiêu bản chia làm 3 ô, ô thứ nhất gắn kháng nguyên chuẩn, ô thứ 2 gắn kháng nguyên nghi, ô thứ 3 gắn kháng nguyên âm tính (-)

Tiêu bản thứ 1 nhỏ huyết thanh chuẩn do hãng Proconco cung cấp Để làm đối chứng dương

Tiêu bản thứ hai nhỏ huyết thanh dương tính tự chế

Tiêu bản thứ ba nhỏ huyết thanh âm tính tự chế Để làm đối chứng âm -Sơ đồ thí nghiệm:

Huyết thanh chuẩn Huyết thanh dương tính tự chế

Huyết thanh âm tính

Ghi chú:

1 Kháng nguyên dương tính

2 Kháng nguyên nghi

3 Kháng nguyên âm tính

IV.2 Phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch (Agar gel precipitation test, AGP)

2.1 Nguyên lý: Sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên hòa tan và kháng thể tương ứng xảy ra hình thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể, phức hợp kháng nguyên-kháng thể đạt được mức độ nhất định thì có sự bảo hòa, lúc này

sẽ xảy ra hiện tượng kết tủa

Nếu thiếu hoặc thừa 2 thành phần này thì sự kết tủa khó xảy ra Sự kết tủa này biểu hiện bằng chất cặn màu trắng xám trông rất rõ Sự kết tủa này đòi hỏi điều kiện nhiệt độ, pH thích hợp, có chất điện giải

2.2 Các phản ứng kết tủa trong môi trường thạch agar

a Phản ứng kết tủa khuếch tán trong ống nghiệm

-Nguyên tắc: Đây là phản ứng lợi dụng tính khuếch tán của kháng nguyên và kháng thể, để chúng gặp nhau và kết hợp với nhau, chổ nào có sự đồng đều tương ứng giữa kháng nguyên–kháng thể thì sẽ có sự kết tủa

-Ứng dụng: Phản ứng kết tủa khuếch tán trong ống nghiệm chủ yếu để phát hiện kháng nguyên và định lượng kháng nguyên

- Có 2 phương pháp thực hiện:

+Phương pháp kết tủa khuếch tán trên thạch đơn giản của Oudin

Cho thạch và kháng thể trộn lẩn với nha, rồi cho vào ông nghiệm Sau

đó cho kháng nguyên vào trên mặt thạch, kháng nguyên sẽ khuếch tán xuống dưới gặp kháng thể tương ứng, kết tủa sẽ xuất hiện ở vùng mà kháng nguyên-kháng thể có tỷ lệ tương ứng

+Phương pháp kết tủa khuếch tán kép của Oúkeyfulthor:

Cho kháng thể vào ống nghiệm, rồi cho thạch vào, sau đó cho kháng nguyên lên trên thạch Sẽ có sự khuếch tán lên của kháng thể và khuếch tán xuống của kháng nguyên, vùng kết tủa sẽ xuất hiện ở chổ kháng nguyên-kháng thể có tỷ lệ đồng đều tương ứng

Có thể làm ngược lài là cho kháng nguyên vào trước, rồi đến thạch và sau cùng là kháng thể Kết quả tương tự như trên

b Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thach trên phiến kính (phương