Yêu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật

Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật Bởi: Nguyễn Lân Dũng YÊU CẦU DINH DƯỠNG CỦA VI SINH VẬT Thành phần hoá học tế bào vi sinh vật Cơ sở vật chất cấu tạo nên tế bào vi sinh vật nguyên tố hoá học Căn vào mức độ yêu cầu vi sinh vật nguyên tố mà người ta chia thành nguyên tố đa lượng nguyên tố vi lượng Các nguyên tố chủ yếu bao gồm: C, H, O, N, P, S, K, Mg, Ca Fe Trong số có loại chủ yếu (chiếm đến 97% trọng lượng khô tế bào vi sinh vật), C, H, O, N, P S Các nguyên tố vi lượng thường Zn, Mn, Na, Cl, Mo, Se, Co, Cu, W, Br B Tỷ lệ nguyên tố hoá học tham gia cấu tạo tế bào vi sinh vật không giống nhóm vi sinh vật khác Ví dụ nấm men, nấm sợi vi khuẩn có lượng chứa trung bình nguyên tố chủ yếu không giống (bảng 13.1): Bảng 13.1: Lượng chứa trung bình loại nguyên tố chủ yếu tế bào số nhóm vi sinh vật (% trọng lượng khô) 1/20 Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật Theo tài liệu Tempest (1969), Pirt (1975) Herbert (1976) thành phần trung bình nguyên tố tạo nên tế bào vi sinh vật nói chung sau: Bảng 13.2: Thành phần nguyên tố cấu tạo nên sinh khối tế bào *Các tế bào bao gồm 70% trọng lượng nước 30% nguyên liệu khô khác Mức trung bình tính theo sinh trưởng vi khuẩn Gr(-) điều kiện dư thừa chất dinh dưỡng nuôi cấy theo mẻ Vi khuẩn lưu huỳnh (sulfur bacteria), vi khuẩn sắt (iron bacteria) vi khuẩn đại dương (marine bacteria) có lượng chứa nguyên tố S, Fe, Na, Cl nhiều so với nhóm vi khuẩn khác Tảo Silic (diatom) có chứa lượng SiO2 cao thành tế bào Thành phần nguyên tố hoá học thay đổi phạm vi định tuỳ thuộc 2/20 Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật vào tuổi nuôi cấy điều kiện nuôi cấy Khi nuôi cấy môi trường có nguồn N phong phú lượng chứa N tế bào cao so với nuôi cấy môi trường nghèo nguồn N Các nguyên tố hoá học chủ yếu tồn tế bào vi sinh vật dạng chất hữu cơ, chất vô nước Chất hữu thường bao gồm protein, carbon hydrat, lipid, acid nucleic, vitamin sản phẩm phân giải chúng chất trao đổi chất Để phân tích thành phần hữu tế bào thường sử dụng hai phương pháp: là, dùng phương pháp hoá học để trực tiếp chiết rút thành phần hữu tế bào, sau tiến hành phân tích định tính định lượng Hai là, phá thành tế bào, thu nhận thành phần kết cấu hiển vi phân tích thành phần hoá học kết cấu Chất vô thường đứng riêng rẽ dạng muối vô kết hợp với chất hữu Khi phân tích thành phần vô tế bào người ta thường phân tích tro sau nung tế bào nhiệt độ 5500 C, chất vô thu dạng oxit vô gọi thành phần tro Dùng phương pháp phân tích vô định tính hay định lượng nguyên tố vô Bảng 13.3:Thành phần hóa học tế bào vi khuẩn (theo F.C.Neidhardt et al.,1996) Chú thích: (1) -Khối lượng khô tế bào vi khuần Escherichia coli sinh trưởng khoảng 2.8 x 10-13g 3/20 Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật (2) - Giả thiết Peptidoglycan Glycogen thành phần chủ yếu (3) - Tế bào chứa vài loại phospholipid, tính đa dạng thành phần acid béo chi vi khuẩn khác ảnh hưởng điều kiện sinh trưởng mà có nhiều hình thức tồn loại phospholipid Nước thành phần thiếu để trì hoạt động sống bình thường tế bào Nước thường chiếm đến 70-90% trọng lượng tế bào Độ chênh lệch trọng lượng tươi trọng lượng khô lượng nước tế bào, thường biểu thị tỷ lệ % tính theo công thức sau đây: (Trọng lượng tươi - Trọng lượng khô) / Trọng lượng tươi x 100% Đơn vị trọng lượng tế bào dịch nuôi cấy thường biểu thị đơn vị g/ l hay mg/ml Phương pháp nung khô tế bào nhiệt độ 5500C thường làm phân giải số hợp chất tế bào tính trọng lượng khô tế bào nên dùng phương pháp sấy khô 1050C hay làm khô nhiệt độ không cao chân không, làm khô nhanh nhờ tia hồng ngoại Các chất dinh dưỡng chức sinh lý Vi sinh vật chủ yếu thu nhận chất dinh dưỡng từ môi trường bên Căn vào chức sinh lý khác tế bào mà người ta thường chia chất dinh dưỡng thành nhóm lớn: Nguồn carbon (source of carbon) Là nguồn vật chất cung cấp C trình sinh trưởng vi sinh vật Trong tế bào nguồn C trải qua loạt trình biến hoá hoá học phức tạp biến thành vật chất thân tế bào sản phẩm trao đổi chất C chiếm đến khoảng nửa trọng lượng khô tế bào Đồng thời hầu hết nguồn C trình phản ứng sinh hoá sinh tế bào nguồn lượng cần thiết cho hoạt động sống vi sinh vật Một số vi sinh vật dùng CO2 làm nguồn C hay chủ yếu để sinh trưởng, nguồn C nguồn sinh lượng Vi sinh vật sử dụng cách chọn lọc nguồn C Đường nói chung nguồn C nguồn lượng tốt cho vi sinh vật Nhưng tuỳ loại đường mà vi sinh vật có khả sử dụng khác Ví dụ môi trường chứa glucose galactose vi khuẩn Escherichia coli sử dụng trước glucose (gọi nguồn C tốc hiệu) galactose sử dụng sau (gọi nguồn C trì hiệu) Hiện sở lên men công nghiệp người ta sử dụng nguồn C chủ yếu glucose, saccharose, rỉ đường (phụ phẩm nhà máy đường) tinh bột (bột ngô, bột khoai sắn ), cám gạo, nguồn cellulose tự nhiên hay dịch thuỷ phân cellulose 4/20 Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật Năng lực đồng hoá nguồn C vi sinh vật khác không giống Có loài có khả sử dụng rộng rãi nhiều nguồn C khác nhau, có loài khả chọn lọc Chẳng hạn vi khuẩn Pseudomonas đồng hoá tới 90 loại hợp chất C, vi khuẩn thuộc nhóm dinh dưỡng methyl (methylotrophs) đồng hoá hợp chất 1C methanol, methane Nguồn C chủ yếu vi sinh vật sử dụng gồm có đường, acid hữu cơ, rượu, lipid, hydrocarbon, CO2, carbonat (Bảng 13.4) Bảng 13.4: Nguồn C vi sinh vật sử dụng Nguồn C Các dạng hợp chất Đường glucose, fructose, maltose, saccharose, tinh bột, galactose, lactose, mannite, cellobiose, cellulose, hemicellulose, chitin Acid hữu acid lactic, acid citric, acid fumaric, acid béo bậc cao, acid béo bậc thấp, aminoacid Rượu ethanol Lipid lipid, phospholipid Hydrocarbon khí thiên nhiên, dầu thô, dầu paraffin Carbonate NaHCO3, CaCO3, đá phấn Các nguồn C Hợp chất nhóm thơm, cyanide, protein, pepton, acid nucleic khác 5/20 Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật Hình 13.1: Sản lượng sinh trưởng tối ưu vi sinh vật dị dưỡng sử dụng nguồn C khác Nguồn carbon thường sử dụng công nghiệp lên men rỉ đường (molasses) Sự khác rỉ đường mía rỉ đường củ cải thấy rõ bảng 13.5 Bảng 13.5: Thành phần hóa học rỉ đường củ cải rỉ đường mía Thành phần Tỷ lệ Rỉ đường củ cải Rỉ đường mía Đường tổng số % 48-52 48-56 Chất hữu đường % 2-17 9-12 Protein (N x 6,25) % 6-10 2-4 K % 2-7 1,5-5,0 Ca % 0,1-0,5 0,4-0,8 Mg % khoảng 0,09 khoảng 0,06 P % 0,02-0,07 0,6-2,0 Biotin mg/kg 0,02-0,15 1,0-3,0 Acid pantoteic mg/kg 50-110 15-55 Inositol mg/kg 5000-8000 2500-6000 Tiamin mg/kg khoảng 1,3 khoảng 1,8 Tỷ lệ nguyên tố hợp chất cao phân tử vi sinh vật thấy rõ bảng sau đây: Bảng 13.6: Tỷ lệ nguyên tố cao phân tử tế bào vi sinh vật Thành phần % trọng lượng khô Trung bình Biên độ dao động %C %H %O %N %S %P Protein 55 15c-75 53 23 16 - RNAd 21 5c –30e 36 34 17 - 10 6/20 Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật DNAd 1c –5f 36 34 17 - 10 peptidoglycan 0g –20h 47 40 - - Phospholipit 0i-15 67 19 - Lipopolysaccharide 0h-4j 55 10 30 - Lipit trung tính - 0-45k 77 12 11 - - - Acid Teichoic - 0l-5d 28 52 - - 15 Glycogen 0-50k 28 49 - - - PHB - 0-80k 45 37 - - - PHA (C8)m - 0-60k 56 23 - - - Polyphosphatd - 0-20n 68 - 61 - - 39 Cyanophycino - 0-10 - 15 25 27 - - Theo Herbert (1976) Các thông số thu nhận từ vi sinh vật khác nhau, không điển hình cho nhóm Ở E coli (trong pha sinh trưởng log) Theo Neidhardt et al (1990) Các tế bào có nguồn dự trữ C Bao gồm cao phân tử ARN, ADN, polyphosphate số thành phần thành tế bào Tại mức độ có tỷ lệ sinh trưởng cao Các tế bào sinh trưởng chậm Các loài ký sinh thành tế bào Vi khuẩn Gram(+) Các chủng thay nguồn phospholipid chất tương tự chứa P tự do, điều kiện hạn chế nguồn P 10 Vi khuẩn Gram(-) 11 Các tế bào điều kiện hạn chế nguồn N 12 Hạn chế nguồn P 13 PHA (polyhydroxyaldehyde) chứa 3-hydroxyoctanoic acid 14 Một số nấm men vi khuẩn 15 Một số vi khuẩn lam có nguồn dự trữ N cyanophycin [(asp-arg)].n *PHB= Poly- β- hydroxy butyrate 7/20 Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật Nguồn N (source of nitrogen) Nguồn N nguồn cung cấp N cho vi sinh vật để tổng hợp nên hợp chất chứa N tế bào Thường không nguồn lượng, số vi sinh vật tự dưỡng (thuộc nhóm ammon hoá-ammonification, nhóm nitrate hoá- nitrification) dùng muối ammone, muối nitrate làm nguồn lượng Trong điều kiện thiếu nguồn C số vi sinh vật kỵ khí điều kiện oxy sử dụng số aminoacid làm nguồn lượng Nguồn N thường vi sinh vật sử dụng protein sản phẩm phân huỷ protein ( peptone, peptide, aminoacid ), muối ammone, nitrate, N phân tử (N2), purine, pyrimidine, urea, amine, amide, cyanide (bảng 13.7) Bảng 13.7: Nguồn N vi sinh vật sử dụng Nguồn N Các dạng hợp chất Protein sản peptone, peptide, aminoacid (một số vi sinh vật tiết men phẩm phân giải proteinase phân giải protein thành hợp chất phân tử nhỏ protein hấp thu vào tế bào) Ammone muối NH3, (NH4)2SO4, (dễ hấp thu) ammone Nitrate KNO3 (dễ hấp thu) N phân tử N2 (với vi sinh vật cố định N) Các nguồn N khác purine, pyrimidine, urea, amine, amide, cyanide (chỉ số nhóm vi sinh vật đồng hoá được) Nguồn N thường sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật gồm có pepton, bột cá, bột nhộng tằm, bột đậu tương, bột khô lạc, cao ngô, cao thịt, cao nấm men Vi sinh vật sử dụng chọn lọc nguồn N Chẳng hạn xạ khuẩn sản sinh terramycin sử dụng cao ngô với tốc độ nhanh so với sử dụng khô đậu tương hay khô lạc, nguồn N cao ngô sản phẩm phân giải dễ hấp thu protein Cao ngô coi nguồn N tốc hiệu, khô dầu coi nguồn N trì hiệu Loại N tốc hiệu có lợi cho sinh trưởng vi sinh vật, loại trì hiệu lại có lợi cho hình thành sản phẩm trao đổi chất Khi sản xuất terramycin chẳng hạn, người ta phối hợp sử dụng cao ngô khô dầu theo tỷ lệ định để phối hợp giai đoạn sinh trưởng tạo sinh khối giai đoạn sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi chất, nhằm mục tiêu nâng cao sản lượng terramycin Năng lực hấp thu muối ammone nitrate vi sinh vật mạnh Ion NH4+ sau tế bào hấp thu trực tiếp sử dụng, nguồn muối ammone coi nguồn N tốc hiệu Còn nitrate sau hấp thụ cần khử thành 8/20 Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật NH4+ vi sinh vật sử dụng Đa số vi khuẩn hoại sinh (saprophyte), vi khuẩn đường ruột, vi sinh vật gây bệnh người, động vật, thực vật dùng muối ammone, muối nitrate làm nguồn N Chẳng hạn vi khuẩn Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa sử dụng nguồn (NH4)2SO4 NH4NO3 làm nguồn N; xạ khuẩn sử dụng KNO3 làm nguồn N; nấm sợi sử dụng KNO3 làm nguồn N Lúc dùng muối (NH4)2SO4 để làm nguồn N nuôi cấy vi sinh vật cần ý sau vi sinh vật hấp thu NH4+ làm hạ thấp pH môi trường Người ta gọi muối có tính sinh lý acid Ngược lại dùng muối nitrate (như KNO3) sau vi sinh vật hấp thu NO3- làm nâng cao pH môi trường Người ta gọi muối có tính sinh lý kiềm Để làm cho pH môi trường nuôi cấy vi sinh vật bị biến động người ta bổ sung thêm chất có tính đệm (buffer substance) Nguồn muối vô (source of inorganic salt) Các muối vô nguồn chất dinh dưỡng thiếu sinh trưởng vi sinh vật Chúng có chức sinh lý chủ yếu là: tham gia vào thành phần trung tâm hoạt tính enzyme vi sinh vật, trì tính ổn định kết cấu cá đại phân tử tế bào, điều tiết trì cân áp suất thẩm thấu tế bào, khống chế điện oxy hoá khử tế bào nguồn vật chất sinh lượng số loài vi sinh vật (bảng 13.8) Bảng 13.8: Muối vô chức sinh lý chúng Nguyên Hợp chất sử Chức sinh lý tố dụng Là thành phần acid nucleic, nucleoprotein, phospholipid, coenzyme, ATP Làm nên hệ thống đệm giúp điều chỉnh pH môi trường P KH2PO4, K2HPO4 S Là thành phần aminoacid chứa S, số vitamin; (NH4)2SO4, glutathione có tác dụng điều chỉnh điện oxy hoá khử MgSO4 tế bào Mg Ca MgSO4 CaCl2, Ca(NO3)2 Là thành phần trung tâm hoạt tính enzyme phosphoryl hoá hexose, dehydrogenase acid isocitric, polymerase acid nucleic, thành phần chlorophyll bacteriochlorophyll Tạo tính ổn định số cofactor, enzyme trì, cần cho dựng trạng thái cảm thụ tế bào 9/20 Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật Na NaCl Thành phần hệ thống chuyển vận tế bào, trì áp suất thẩm thấu, trì tính ổn định số enzyme K KH2PO4, KH2PO4 Là cofactor số enzyme, trì áp suất thẩm thấu tế bào, nhân tố ổn định ribosome số vi khuẩn ưa mặn FeS04 Thành phần sắc tố vi khuẩn số enzyme, vật chất nguồn lượng số vi khuẩn sắt, cần thiết để tổng hợp chlorophyll độc tố vi khuẩn bạch hầu Fe Trong trình sinh trưởng vi sinh vật cần tới số nguyên tố vi lượng Những nguyên tố có vai trò quan trọng cần với số lượng nhỏ, khoảng 10-8-10-6 mol/ L môi trường nuôi cấy Nguyên tố vi lượng tham gia vào thành phần enzyme làm hoạt hoá enzyme (Bảng 13.9) Bảng 13.9: Tác dụng sinh lý nguyên tố vi lượng Nguyên Tác dụng sinh lý tố Zn Có mặt alcohol dehydrogenase, lactodehydrogenase, phosphatase kiềm, ARNpolymerase, ADNpolymerase Mn Có mặt peroxyd dismutase, carboxylase ciitric synthetase Mo Có mặt reductase nitrate, nitrogenase, dehydrogenase formic Se Có mặt reductase glycin, reductase formic Co Có mặt mutase glutamic Cu Có mặt cytochrome oxydase W Có mặt dehydrogenase formic Br Có mặt urease, cần cho sinh trưởng vi khuẩn hydrogen Nếu thiếu nguyên tố vi lượng trình sinh trưởng hoạt tính sinh lý vi sinh vật bị giảm sút, chí ngừng sinh trưởng Do nhu cầu dinh dưỡng vi sinh vật không giống khái niệm nguyên tố vi lượng chi có ý nghĩa tương đối Vi sinh vật thường tiếp nhận nguyên tố vi lượng từ chất dinh dưỡng hữu thiên nhiên, hoá chất vô cơ, nước máy hay từ dụng cụ nuôi cấy thuỷ tinh Chỉ trường hợp đặc biệt cần bổ sung nguyên tố vi lượng vào môi trường nuôi cáy vi sinh vật 10/20 Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật Vì nhiều nguyên tố vi lượng kim loại nặng dư thừa gây hại cho vi sinh vật Khi cần bổ sung thêm nguyên tô vi lượng vào môi trường cần lưu ý khống chế xác liều lượng Nhân tố sinh trưởng Nhân tố sinh trưởng (growth factor) hợp chất hữu mà có vi sinh vật cần thiết để sinh trưởng với số lượng nhỏ không tự tổng hợp đủ so với nhu cầu Các vi sinh vật khác có yêu cầu không giống chủng loại liều lượng nhân tố sinh trưởng Sau số ví dụ (bảng 13.10) Bảng 13.10: Các nhân tố sinh trưởng cần thiết dối với số loài vi sinh vật Chú thích: mg= 10-6g; 1ng= 10-9g 11/20 Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật Vi sinh vật tự dưỡng số vi sinh vật dị dưỡng (như Escherichia coli) chí sinh trưởng mà không cần nhân tố sinh trưởng Mặt khác, loài vi sinh vật nhu cầu nhân tố sinh trưởng thay đổi tuỳ theo điều kiện môi trường Ví dụ Mucor rouxii sinh trưởng điều kiện kỵ khí cần thiamin (B1) biotin (H), điều kiện hiếu khí lại tự tổng hợp vitamin Có trường hợp chưa giải thích chất nhu cầu nhân tố sinh trưởng số loài vi sinh vật Thông thường bổ sung vào môi trường chất hữu cao nấm men, cao thịt, dịch đun động thực vật (nhộng, giá đỗ…) đáp ứng nhu cầu nhân tố sinh trưởng Căn vào khác cấu trúc hoá học chức sinh lý nhân tố sinh trưởng người ta chia nhân tố sinh trưởng thành nhóm vitamin, aminoacid, purine pyrimidine Vitamin nhân tố sinh trưởng tìm thấy chất hoá học sớm Hiện người ta phát nhiều loại vitamin có tác dụng nhân tố sinh trưởng Một số vi sinh vật tự tổng hợp vitamin, nhiều loại khác lại cần cung cấp vitamin môi trường dinh dưỡng sinh trưởng Vitamin chủ yếu coenzyme hay cofactor enzyme tham gia vào trình trao đổi chất Một số vi sinh vật không tự tổng hợp aminoacid đó, cần bổ sung vào môi trường aminoacid hay bổ sung peptide chuỗi ngắn Chẳng hạn vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides cần tới 17 loại aminoacid sinh trưởng đươc Một số vi khuẩn cần cung cấp D-alanin để tổng hợp thành tế bào Purine pyrimidine chủ yếu dùng làm coenzyme hay cofactor enzyme cần thiết cho trình tổng hợp nucleoside, nucleotide acid nucleic Bảng 13.11: Chức số vitamin thông thường vi sinh vật Vitamin Chức -Carboxyl hóa (cố định Biotin (H) CO2) -Trao đổi chất carbon Ví dụ vi sinh vật cần cung cấp Leuconostoc mesenteroides (B) Saccharomyces cerevisiae (F)Ochromonas malhamensis (A)Acanthammoeba castellanii (P) Vitamin B12 -Sắp xếp lại phân tử Lactobacillus spp (B) Euglena gracilis Nhóm mang methyl (A)Tảo silic nhiều vi tảo khác trao đổi chất carbon (A)Acanthammoeba castellanii (P) Acid folic -Trao đổi chất carbon Acid lipoic -Chuyển nhóm acyl Enterococcus faecalis (B) Tetrahymena pyriformis (P) Lactobacillus casei (B) Tetrahymena spp (P) 12/20 Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật Acid pantotenic -Tiền thể CoA (oxy Proteus morganii (B) Hanseniaspora spp hóa pyruvat, trao đổi axit (F)Paramecium spp (P) béo) Pyridoxin (B6) -Trao đổi acid amin Lactobacillus spp (B) Tetrahymena pyriformis (P) Niacin -Tiền thể NAD, NADP Brucella abortus (B) Haemophilus influenza (B)Blastocladia pringsheimii (F)Crithidia fasciculata (P) Caulobacter vibrioides (B) Dictyostelium Riboflavin -Tiền thể FAD, FMN spp (F)Tetrahymena pyriformis (P)Bacillus (B2) anthracis (B) Thiamin (B1) -Chuyển nhóm aldehyd (khử carboxyl pyruvat, oxy hóa acid α-keto) Phycomyces blakesleeanus (F) Ochromonas malhamensis (A)Colpidium campylum (P) Chú thích: B-Vi khuẩn; F-Vi nấm; A-Vi tảo; P-Động vật nguyên sinh Nước Nước thành phần thiếu để vi sinh vật sinh trưởng Chức sinh lý nước tế bào là: - Hoà tan chuyển vận chất, hỗ trợ cho việc hấp thu chất dinh dưỡng, giải phóng sản phẩm trao đổi chất - Tham gia vào hàng loạt phản ứng hóa học tế bào - Duy trì cấu hình thiên nhiên ổn định đại phân tử protein, acid nucleic - Là thể dẫn nhiệt tốt, hấp thu tốt nhiệt lượng sinh trình trao đổi chất khuếch tán kịp thời bên để trì ổn định nhiệt độ bên tế bào - Duy trì hình thái bình thường tế bào - Thông qua trình thuỷ phân hay khử nước để khống chế kết cấu tế bào (enzyme, vi ống, tiên mao ) tháo lắp virút Tính hữu hiệu nước sinh trưởng vi sinh vật thường biểu thị độ hoạt động (hoạt độ) nước (water activity, aw) Đó tỷ lệ áp lực nước dung dịch điều kiện nhiệt độ áp lực định với áp lực nước khiết điều kiện vậy: 13/20 Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật a w = p w / p w0 Ở Pw áp lực nước dung dịch, aw0 áp lực nước khiết Pw0 nước khiết 1.0 Dung dịch chứa nhiều dung chất (chất hoà tan) aw nhỏ Vi sinh vật thường sinh trưởng điều kiện có aw khoảng 0,6-0,99 Đối với số loài vi sinh vật aw thấp tốc độ sinh trưởng tổng sinh khối giảm Các vi sinh vật khác có aw thích hợp không giống (bảng 13.12) Bảng 13.12: aw thích hợp cho sinh trưởng số nhóm vi sinh vật Nhìn chung aw thích hợp cho sinh trưởng vi khuẩn cao nấm men nấm sợi Vi sinh vật ưa mặn có aw thích hợp cho sinh trưởng thấp Phần nước tham gia vào trình trao đổi chất vi sinh vật gọi nước tự Phần lớn nước tồn tế bào vi sinh vật nước tự Phần nước liên kết với hợp chất hữu cao phân tử tế bào gọi nước liên kết Nước liên kết khả hoà tan lưu động Khái niệm sinh trưởng điều kiện hạn chế chất dinh dưỡng Ở môi trường nuôi cấy lắc phòng thí nghiệm, tất chất dinh dưỡng cung cấp cho sinh trưởng vi sinh vật thiết kế tối ưu dư thừa xảy vào lúc đầu tế bào sinh trưởng theo logarit với tốc độ sinh trưởng lớn Tuy nhiên, hệ thống môi trường kỹ thuật nuôi cấy, sinh trưởng vi sinh vật tiếp diễn mà không bị giới hạn khoảng thời gian dài Một tính toán đơn giản để chứng minh nhận định là: sau ngày sinh trưởng theo 14/20 Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật logarit, tế bào vi sinh vật 20 phút lại nhân đôi lần tạo xấp xỉ x 1043 tế bào Giả sử khối lượng trung bình tế bào 10-12 g toàn sinh khối tế bào có khối lượng gấp gần 400 lần khối lượng đất Vì vậy, thể tích nuôi cấy, sinh trưởng luôn sớm bị giới hạn cạn kiệt vài chất dinh dưỡng Thuật ngữ “các chất dinh dưỡng hạn chế” sử dụng với nhiều ý nghĩa, thường bị nhầm lẫn Các chất dinh dưỡng hạn chế có khả ảnh hưởng đến sinh trưởng môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo hai cách riêng biệt: hóa học và động học Sự hạn chế hóa học định nghĩa khối lượng lớn sinh khối tạo điều kiện giới hạn chất dinh dưỡng “Nguyên lý Liebig” bắt nguồn từ nghiên cứu màu mỡ nông nghiệp Justus von Liebig vào năm 1840 Trong nghiên cứu ông tìm hàm lượng chất dinh dưỡng định đến suất mùa màng, miễn tất chất dinh dưỡng khác có mặt cách dư thừa (phương trình 1) Giới hạn động học xuất nồng độ chất dinh dưỡng thấp (trong phạm vi từ miligram tới microgram lit), hạn chế chất dinh dưỡng điều khiển tốc độ sinh trưởng riêng tế bào (μ) Điều khiển động học tốc độ sinh trưởng thường kéo theo động lực bão hòa phương trình Monod (phương trình 2) sử dụng để mô tả mối quan hệ nồng độ chất dinh dưỡng tốc độ sinh trưởng riêng tế bào (μ) X = X0 + ( S0 - S) x YX/S (1) μ = μmax x x s / (KS + S) (2) Trong S0 nồng độ ban đầu s nồng độ cuối chất dinh dưỡng bị hạn chế S; X(X0) nồng độ sinh khối (ban đầu); sản lượng sinh khối thu chất dinh dưỡng S, μmax tốc độ sinh trưởng riêng lớn nhất, KS số lực chất Monod Điều thể rõ hình 13.2 sinh trưởng hệ thống nuôi cấy kín Các tế bào ban đầu sinh trưởng không giới hạn tiêu thụ chất dinh dưỡng hạn chế bị hết dần, dẫn đến tốc độ sinh trưởng suy giảm dần, sau tốc độ sinh trưởng ngừng hẳn Đó lúc đạt đến nồng độ cuối sinh khối Trong nuôi cấy liên tục, người bổ sung môi trường cách liên tục lượng môi trường dư thừa loại bỏ Tốc độ bổ sung thêm vào chất dinh dưỡng bị hạn chế điều khiển đồng thời μ nồng độ sinh khối môi trường nuôi cấy (Pirt, 1975; Kovarova Egli, 1998) 15/20 Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật Hình 13.2: Động học giới hạn sinh trưởng vi sinh v ật nuôi cấy đóng giới hạn nồng độ chất dinh dưỡng (cơ chất) S S nồng độ chất ban đầu, s nồng độ thực chất, X nồng độ sinh khối; X : nồng độ sinh khối ban đầu; Y: sản lượng sinh khối thu chất S Trong thực nghiệm, người ta nuôi cấy tế bào điều kiện biết rõ, nhờ chất dinh dưỡng hạn chế xác định Đối với việc nuôi cấy vi sinh vật dị dưỡng để nghiên cứu tạo sản phẩm sinh khối, môi trường thiết kế phổ biến với nguồn carbon lượng giới hạn, tất chất dinh dưỡng khác cung cấp dư thừa Tuy nhiên, trình công nghệ sinh học, giới hạn chất dinh dưỡng nguồn carbon giữ chức điều khiển trạng thái sinh lý trình trao đổi chất vi sinh vật Sự hạn chế chất dinh dưỡng thường kích thích tăng cường tạo thành nhiều sản phẩm trao đổi chất enzyme vi sinh vật Ví dụ, suất tăng lên trình lên men tạo chất kháng sinh sinh trưởng môi trường hạn chế photphat, sản xuất acid citric môi trường có hạn chế Fe-, Mn-, Zn Còn sinh tổng hợp NAD thực điều kiện hạn chế Zn-Mn Việc tích lũy nguyên liệu dự trữ nội bào PHB PHA (chất dẻo sinh học-bioplastic) bị giới hạn nguồn cung cấp hợp chất giàu nitrogen Rõ ràng sinh trưởng vi sinh vật điều khiển thường xuyên chất dinh dưỡng mà kết hợp hai hay nhiều chất dinh dưỡng đồng thời (Kovarova Egli, 1998) Thiết kế phân tích môi trường sinh trưởng tối thiểu Để sinh trưởng tổng hợp nguyên liệu tế bào cho thân mình, vi sinh vật phải thu nhận thành phần cấu trúc (hay tiền chất chúng) lượng cần 16/20 Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật thiết từ môi trường sống Do đó, để nuôi cấy vi sinh vật phòng thí nghiệm chất dinh dưỡng phải cung cấp đầy đủ vào môi trường chất dinh dưỡng phải dạng mà vi sinh vật sử dụng Do có đa dạng sinh lý giới vi sinh vật mà có vô số môi trường với thành phần dinh dưỡng khác đưa ra, với mục đích làm giàu cách chọn lọc để nuôi cấy nhóm ví sinh vật đặc thù (LaPage cs, 1970; Balows cs 1992; Atlas, 1997) Tất môi trường chứa thành phần với chức dinh dưỡng rõ ràng, đặc biệt cân nhắc chức cấu trúc sinh lượng Tuy nhiên, hầu hết nghiên cứu chất dinh dưỡng tiến hành định tính định lượng chất dinh dưỡng khác thêm vào nhiều hay cách tùy ý Ngoài ra, nhiều môi trường nuôi cấy có chứa thành phần rõ ràng sử dụng nguyên liệu hữu ngô, khoai tây,… Trong điều kiện như: nhiệt độ pH, tốc độ sinh trưởng riêng lớn vi sinh vật bị ảnh hưởng đa dạng chất dinh dưỡng môi trường Điều minh họa cách cụ thể sinh trưởng Salmonella typhimurium (thí nghiệm Schaechter cs, 1958) Họ sử dụng 22 môi trường có thành phần khác nhận thấy tốc độ sinh trưởng khác môi trường điều kiện dư thừa chất dinh dưỡng Kết cho thấy chất lượng tiền chất đưa vào môi trường khoáng cho phép điều chỉnh tốc độ sinh trưởng cách rõ ràng Thiết kế môi trường kiểm tra chất dinh dưỡng giới hạn Thiết kế môi trường sinh trưởng Trong thiết kế môi trường sinh trưởng, định đưa chọn lựa nồng độ cao cho phép tạo sinh khối (Xmax), xác định chất dinh dưỡng giới hạn (theo nguyên lý Liebig) Điển hình, môi trường sinh trưởng cho vi sinh vật dị dưỡng thiết kế với nguồn lượng - carbon riêng biệt giới hạn lượng sinh khối tạo ra, ngược lại tất chất dinh dưỡng khác (được thêm vào dạng hợp chất đơn) cung cấp dư thừa Dựa vào giá trị X max, tính toán nồng độ tối thiểu nguyên tố khác cần thiết môi trường nuôi cấy Để đảm bảo dư thừa tất chất dinh dưỡng không giới hạn môi trường nồng độ chúng nhân với nhân tố dư (FE) Bằng cách này, nồng độ chất dinh dưỡng đòi hỏi môi trường tăng trưởng (Ereq) gấp x lần theo lý thuyết nguồn carbon Ereq = X max / YX/E x FE (3) 17/20 Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật YX/E(the individual average elemental growth yield) sản lượng tăng trưởng trung bình dựa nguyên tố Một ví dụ cho việc thiết kế môi trường giới hạn nguồn carbon, cho phép tạo sản lượng sinh khối khô đạt 10g/l sinh (bảng 13.13) Cần ý rằng, môi trường thành phần lựa chọn cho thay đổi nồng độ nguyên tố (ví dụ thay thể MgCl2 NaHSO4 MgSO4) Hơn nữa, môi trường có tính chất đệm yếu (weakly buffered), cần thiết phải khống chế pH suốt trình sinh trưởng Cách thức sử dụng cho việc thiết kế môi trường nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí với mật độ sinh khối thấp trung bình Phức tạp thiết kế môi trường cho nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí, nhiều thành phần môi trường dễ dàng kết tủa oxy hóa khử cần thiết, mật độ tế bào cao có chứa chất hòa tan vấn đề độc tính số môi trường Bảng 13.13: Thiết kế môi trường tối thiểu bị giới hạn bời nguồn C cho phép sản lưởng sinh khối khô đạt 10g/l a,b Năng suất sinh Thành trưởng (g sinh phần môi Nguồn khối khô/g trường nguyên tố) Các nhân tố dự thừa với nguồn carbon tương ứng Khối lượng nguyên tố (g/l) Khối lượng thành phần cấu tạo (g/l) Glucose C, lượng 1 10 25.0 NH4Cl N 3.75 14.33 NaH2 PO4 P 33 1.52 5.88 KCl K 100 0.5 0.95 NaH2SO4 Na 100 0.5 1.87 MgCl2 Mg 200 0.25 0.98 CaCl2 Ca 100 10 1.0 2.77 FeCl2 Fe 200 10 0.5 1.13 MnCl2 Mn 104 20 0.02 0.046 ZnCl2 Zn 104 20 0.02 0.042 18/20 Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật CuCl2 Cu 105 20 0.002 0.0042 CoCl2 Co 105 20 0.002 0.0044 Dựa vào sản lượng tăng trưởng nguyên tố sinh khối khô Theo Pirt (1975), Egli Fiechter (1981) Sản lượng tăng trưởng C nguyên tố vết Zn, Cu, Mo, Mn Nhân tố YX/E phân tích từ sinh khối khô nuôi cấy điều kiện không giới hạn tăng trưởng hệ thống đóng Đối với carbon, oxy, hydro, YX/E tính toán xác trực tiếp từ thành phần tế bào thành phần không tạo nên sinh khối, mà có chức trao đổi chất khác.Ngoài ra, bảng không nói đến số lượng lớn chất nhận điện tử cần thiết phải đảm bảo cho trình sinh trưởng Tính chất hóa học thành phần môi trường sinh trưởng phải tính đến chọn FE Ví dụ, phần lớn nguyên tố vi lượng dễ dàng kết tủa môi trường sinh trưởng pH trung tính kiềm giảm bớt khả hấp thụ sinh học (khó khăn để xác định) Do đó, chúng thêm vào nhiều gấp 10 tới 20 lần (Bridson Brecker, 1970) Trong công nghệ sinh học, trình nuôi cấy theo mẻ (batch) nuôi cấy theo mẻ có bổ sung (fed-batch) nghiên cứu từ lâu có lợi thiết kế môi trường chứa tất nguyên tố với lượng xác lượng cần thiết, cho tất nguyên tố phải tiêu thụ hết cuối kì tăng trưởng Tuy nhiên, khó khăn đạt điều tính đa dạng nguyên tố phụ thuộc chúng vào điều kiện nuôi cấy.Tất nhiên, công nghệ sinh học, việc tối ưu hóa môi trường quan trọng để tính toán tiêu thụ chất dinh dưỡng để hạn chế tối đa hao phí nguyên liệu, hóa chất Bảng 13.14: Các nhân tố tăng trưởng sản lượng chất cho nhận điện tử Các chất cho điện tử H2 YX/H2 = 12g/mol S 2O YX/S2O3 = 4g/mol Fe2+ YX/Fe2+ = 0.35g/mol NH4+ - NO3- YX/NH4 = 1.3-2.6/mol NO2_ - NO3 YX/NO2 = 0.9-1.8g/mol 19/20 Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật Chất nhận điện tử O2 YX/O2 = 10a-42bg/mol NO3- - N2 YX/NO3 = 27g/molc NO2- - N2 YX/NO2 = 17g/molc N2O- - N2 YX/N2O = 9g/molc a Đối với chất khử methane n-alkanes b Đối với chất oxy hóa glucose c Đối với Paracoccus denitrificans với nguồn carbon glutamate 20/20 [...]... tổng hợp đủ so với nhu cầu Các vi sinh vật khác nhau có những yêu cầu không giống nhau về chủng loại và liều lượng của các nhân tố sinh trưởng Sau đây là một số ví dụ (bảng 13.10) Bảng 13.10: Các nhân tố sinh trưởng cần thiết dối với một số loài vi sinh vật Chú thích: 1 mg= 10-6g; 1ng= 10-9g 11/20 Yêu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật Vi sinh vật tự dưỡng và một số vi sinh vật dị dưỡng (như Escherichia... trường sinh trưởng tối thiểu Để sinh trưởng và tổng hợp các nguyên liệu tế bào cho bản thân mình, vi sinh vật phải thu nhận các thành phần cấu trúc (hay các tiền chất của chúng) và năng lượng cần 16/20 Yêu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật thiết từ môi trường sống Do đó, để nuôi cấy vi sinh vật trong phòng thí nghiệm thì các chất dinh dưỡng phải được cung cấp đầy đủ vào môi trường và các chất dinh dưỡng. .. nuôi cấy (Pirt, 1975; Kovarova và Egli, 1998) 15/20 Yêu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật Hình 13.2: Động học của sự giới hạn sinh trưởng của vi sinh v ật trong nuôi cấy đóng do giới hạn nồng độ của chất dinh dưỡng (cơ chất) S S 0 là nồng độ cơ chất ban đầu, s là nồng độ thực của cơ chất, X là nồng độ sinh khối; X 0 : nồng độ sinh khối ban đầu; Y: sản lượng sinh khối thu được đối với cơ chất S Trong thực... càng nhỏ Vi sinh vật thường sinh trưởng trong điều kiện có aw trong khoảng 0,6-0,99 Đối với một số loài vi sinh vật khi aw quá thấp thì tốc độ sinh trưởng và tổng sinh khối giảm Các vi sinh vật khác nhau có aw thích hợp không giống nhau (bảng 13.12) Bảng 13.12: aw thích hợp nhất cho sinh trưởng ở một số nhóm vi sinh vật Nhìn chung aw thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của vi khuẩn cao hơn của nấm men.. .Yêu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật Vì nhiều nguyên tố vi lượng là kim loại nặng cho nên nếu dư thừa sẽ gây hại cho vi sinh vật Khi cần bổ sung thêm nguyên tô vi lượng vào môi trường cần lưu ý khống chế chính xác liều lượng Nhân tố sinh trưởng Nhân tố sinh trưởng (growth factor) là những hợp chất hữu cơ mà có những vi sinh vật cần thiết để sinh trưởng tuy với số lượng rất... ngày sinh trưởng theo 14/20 Yêu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật logarit, một tế bào vi sinh vật cứ 20 phút lại nhân đôi một lần sẽ tạo ra xấp xỉ 2 x 1043 tế bào Giả sử khối lượng trung bình của mỗi tế bào là 10-12 g thì toàn sinh khối tế bào trên sẽ có khối lượng gấp gần 400 lần khối lượng của quả đất Vì vậy, trong mỗi một thể tích nuôi cấy, sự sinh trưởng luôn luôn sớm bị giới hạn do sự cạn kiệt của. .. kiện hạn chế các chất dinh dưỡng Ở môi trường nuôi cấy lắc trong phòng thí nghiệm, khi tất cả các chất dinh dưỡng được cung cấp cho sự sinh trưởng của vi sinh vật đã được thiết kế tối ưu thì sự dư thừa xảy ra vào lúc đầu và các tế bào sinh trưởng theo logarit với tốc độ sinh trưởng là lớn nhất Tuy nhiên, trong mỗi hệ thống môi trường và kỹ thuật nuôi cấy, sự sinh trưởng của vi sinh vật không thể tiếp... bằng độ hoạt động (hoạt độ) của nước (water activity, aw) Đó là tỷ lệ giữa áp lực hơi nước của dung dịch trong những điều kiện nhiệt độ và áp lực nhất định với áp lực của hơi nước thuần khiết trong cùng những điều kiện như vậy: 13/20 Yêu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật a w = p w / p w0 Ở đây Pw là áp lực hơi nước của dung dịch, còn aw0 là áp lực của hơi nước thuần khiết Pw0 của nước thuần khiết là 1.0... thích: B -Vi khuẩn; F -Vi nấm; A -Vi tảo; P-Động vật nguyên sinh Nước Nước là thành phần không thể thiếu để vi sinh vật có thể sinh trưởng Chức năng sinh lý của nước trong tế bào là: - Hoà tan và chuyển vận các chất, hỗ trợ cho vi c hấp thu chất dinh dưỡng, giải phóng các sản phẩm trao đổi chất - Tham gia vào hàng loạt các phản ứng hóa học trong tế bào - Duy trì cấu hình thiên nhiên ổn định của các đại... hoặc Zn Còn sự sinh tổng hợp của NAD là được thực hiện trong điều kiện hạn chế Zn-Mn Vi c tích lũy các nguyên liệu dự trữ nội bào PHB hoặc PHA (chất dẻo sinh học-bioplastic) sẽ bị giới hạn bởi nguồn cung cấp hợp chất giàu nitrogen Rõ ràng là sự sinh trưởng của vi sinh vật được điều khiển thường xuyên không phải chỉ bởi một chất dinh dưỡng mà bởi sự kết hợp của hai hay nhiều chất dinh dưỡng đồng thời ... cần khử thành 8/20 Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật NH4+ vi sinh vật sử dụng Đa số vi khuẩn hoại sinh (saprophyte), vi khuẩn đường ruột, vi sinh vật gây bệnh người, động vật, thực vật dùng muối ammone,... tố vi lượng vào môi trường nuôi cáy vi sinh vật 10/20 Yêu cầu dinh dưỡng vi sinh vật Vì nhiều nguyên tố vi lượng kim loại nặng dư thừa gây hại cho vi sinh vật Khi cần bổ sung thêm nguyên tô vi. .. urease, cần cho sinh trưởng vi khuẩn hydrogen Nếu thiếu nguyên tố vi lượng trình sinh trưởng hoạt tính sinh lý vi sinh vật bị giảm sút, chí ngừng sinh trưởng Do nhu cầu dinh dưỡng vi sinh vật không