Đang tải... (xem toàn văn)
Vector biểu hiện là vector có thể mang các gen ngoại lai mong muốn cho phép thực hiện sự phiên mã của các bản sao được tạo dòng và sự dịch mã các mRNA của chúng trong Escherichia coli hay nấm men Saccharomyces cerevisiae, nấm mốc Aspergillus niger…
Chương Biểu gen tái tổ hợp Escherichia coli Mở đầu O Vector biểu hiện vector mang các gen ngoại lai mong muốn cho phép thực phiên mã của các bản được tạo dòng và sự dịch mã các mRNA của chúng Escherichia coli hay nấm men Saccharomyces cerevisiae, nấm mốc Aspergillus niger… Các phương pháp plasmid vector sử dụng để sản xuất protein dung hợp (fusion protein) protein nguyên thể (native protein) vi khuẩn I Sản xuất protein dung hợp Protein dung hợp Gen dung hợp ATG Gen B Promoter Gen A DNA SD AUG mRNA SD Met N Protein dung hợp SD: đoạn Shine-Dalgarno C Ưu điểm protein dung hợp Được sản xuất với hàm lượng lớn khởi đầu phiên mã dịch mã điều khiển trình tự tiêu chuẩn E coli Cho kết sản phẩm ổn định protein ngoại lai nguyên thể Khối lượng phân tử lớn so với hầu hết protein E coli dễ nhận biết điện di Có thể được tiết môi trường nhờ biểu hiện của vi khuẩn EcoRI 5000 Các hệ thống vector biểu gen dung hợp với gen lacZ Vùng tạo dòng Pst I Ampr 4000 1000 pUR278 (5,2 kb) lacZ ori Plac 3000 Vùng tạo dòng lacZ lac UV5 2000 pUR278 TGTCAAAAAGG GGATCC GTCGAC TCTAGA AAGCTT ATCGAT G BamHI Sal I XbaI HindIII ClaI pUR288 TGTCGG GGATCC GTCGAC TCTAGA AAGCTT ATCGAT GAT BamHI SalI XbaI HindIII ClaI pUR289 TGTCAGG GGATCC GTCGAC TCTAGA AAGCTT ATCGAT GA BamHI SalI XbaI HindIII ClaI pUR290 TGTCAAAAAGG GGATCC GTCGAC CTGCAG CCAAGC TTATCGATGA BamHI SalI PstI HindIII ClaI pUR291 TGTCGG GGATCC GTCGAC CTGCAG CCAAGC TTATCG ATG BamHI SalI PstI HindIII Cla I pUR292 TGTCAGG GGATCC GTCGAC CTGCAG CCAAGC TTATCG AT BamHI SalI PstI HindIII ClaI Phần tận amino gen lacZ thay số trình tự gen cro bacteriophage λ gen lacI E coli - Stop: codon kết thúc dịch mã - Term: tín hiệu kết thúc phiên mã bacteriophage fd R P 5000 cro Ampr lacI pEX2 (5,8 kb) 4000 1000 lacZ ori 2000 Vùng tạo dòng 3’ Term Stop 3000 Vùng tạo dòng PR cro lacZ EcoRI BamHI SmaI PstI SalI Xây dựng plasmid biểu phát protein dung hợp Plasmid vector Khuẩn lạc mang DNA ngoại lai - Tách chiết DNA plasmid vector, cắt hạn chế - Điện di Dna ngoại lai Sự dung hợp khung đọc Sàng lọc khuẩn lạc sản xuất protein dung hợp chủng K12 71/18 JM 103 cho vector pUR Vi khuẩn E.coli chủng M5219 cho vector pEX Phương pháp sàng lọc Tiểu thể 5-10 khuẩn lạc LB(ampicillin) Qua đêm, 37oC 1xSDS Tái huyền phù Bổ sung thêm IPTG pU R 37oC Biến tính 100oC,3 40oC pE X phút phút Ly tâm 1200g Nhiệt độ phòng 1,2,3,4 1mL Ly tâm Dịch nuôi cấy Điện di SDS Kết polyacrylamide gel 6% Tách chiết protein dung hợp để sản xuất kháng thể Có thể tách chiết theo số cách: dùng dịch chiết urea, sắc ký lực aminophenylthiogalactoside, điện di SDS-polyacrylamide gel phối hợp cách Sau điện di (ở mục 3) Nhuộm gel phát băng protein Sản xuất kháng thể Cắt khỏi gel, đem đông khô khoảng 48h Nghiền thành bột mịn Tiêm vào thỏ Hiệu suất dịch mã của mRNA chịu sự chi phối của một vài yếu tố: - Mức độ bổ sung giữa chuỗi SD và đầu 3’ của 16S rRNA - Khoảng cách giữa chuỗi SD và codon AUG để chuỗi DNA eukaryote định vị - Nucleotide theo sau AUG ảnh hưởng sự liên kết ribosome III Xác định mức độ biểu gen tạo dòng Điện di polyacrylamide gel - protein quan tâm quan sát cách nhuộm gel với Coomassie Brilliant Blue thuốc nhuộm bạc Phân tích Western blot lk đặc hiệu kháng thể-kháng nguyên thực diện di SDS-PAGE Nếu mức độ biểu thấp nên đặt gen lacZ hướng với gen biểu Như vậy, phiên mã dịch mã hạn chế biểu gen thay đổi hệ thống biểu kiểm soát thay đổi hoạt tính βgalactosidase Protein gel (điện di SDS) Hình Sơ đồ kỹ thuật Western blot Thẩm tích protein lên màng nitrocellulose Kháng thể đặc hiệu Gắn kháng thể với protein kháng nguyên Kháng thể có đánh dấu enzyme Gắn kháng thể với kháng thể Bổ sung chất Phát triển màu Kháng thể (thỏ/chuột) liên AP kết alkaline phosphatase AP Kháng thể (thỏ/chuột) AP Protein kháng nguyên Hình 10 Sơ đồ mô tả liên kết protein (kháng nguyên) với kháng thể thứ đặc hiệu kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme Western blot Hình 7.11 Sơ đồ kỹ thuật ELISA Kháng nguyên gắn lên giếng Kháng thể Kháng thể liên kết enzyme Một giếng đĩa ELISA Đĩa ELISA (microtiter plate) có 96 giếng Enzyme phức hợp kháng nguyênkháng thể bắt màu với chất IV Tăng mức độ biểu gen tạo dòng Cho DNA ngoại lai Kiểmđược tra dung hợp với thử nghiệm đoạn tương ứng gen lacZ chứa năng, xét nghiệm miễn Các plasmid có dịchđoạn khác promoter đặt tối ưu nhận Phức tạp biết cách biến nạp vi khuẩn Lac- thu hoạt tính βgalactosidase đĩa thị lactose Plasmid dùng pLG mang gen lacZ mã hóa đầu tận Khắc carboxyl có hoạt tính βphục galactosidase Mức độ biểu thấp: RNA không ổn định, kết thúc chưa hoàn chỉnh, dịch mã không hiệu quả, protein không ổn định V Tinh protein Thể vùi phương pháp hòa tan thể vùi Các đuôi lực Thể vùi phương pháp hòa tan thể vùi Protein có mức độ biểu cao E coli thường tạo hạt nhỏ không hòa tan tế bào chất Thể vùi Ly tâm Tiểu thể + Rửa với Triston X-100 EDTA urea Phương pháp hòa tan thể vùi Làm tan tế bào Ly tâm Tái huyền phù PMSF RT,và 20lysozyme phút Bổ sung deoxycholic acid 37oC khuấy 30 phút RT Bổ sung DNase I Phương pháp hòa tan thể vùi Phương pháp Ly tâm Ly tâm Trong nước,15’ điện di Tinh rửa thể vùi tái huyền phù RT, phút tái huyền phù đệm 2xSDS gel-loading dye Phương pháp Phương pháp hòa tan thể vùi Phương pháp Tinh rửa thể vùi Phương pháp Ly tâm tái huyền phù X3 lần nước Tris.HCl + urea đệm 2xSDS gel-loading dye điện di nước Phương pháp hòa tan thể vùi Hòa tan thể vùi Rửa đệm dung ly KH2PO4, EDTA NaCl ly tâm tái huyền phù 1xSDS gel-loading dye điện di Các đuôi lực • Đuôi lực xuất thiết kế di truyền với mục đích giúp cho tinh protein enzyme hiệu • Gen protein quan tâm dung hợp với chuỗi DNA mã hóa cho số trình tự amino acid • Tinh protein đích sắc ký lực Cho hỗn hợp protein tái tổ hợp qua cột sắc ký có chứa phối tử liên kết đặc hiệu với protein mang đuôi lực Các đuôi lực Các đuôi lực [...]... biểu hiện của gen được tạo dòng Điện di polyacrylamide gel - protein quan tâm có thể quan sát bằng cách nhuộm gel với Coomassie Brilliant Blue hoặc bằng thuốc nhuộm bạc Phân tích Western blot bằng lk đặc hiệu kháng thể-kháng nguyên thực hiện diện di SDS-PAGE Nếu mức độ biểu hiện thấp thì nên đặt gen lacZ cùng hướng với gen được biểu hiện Như vậy, nếu sự phiên mã hoặc dịch mã hạn chế biểu hiện của gen. .. dấu enzyme trong Western blot Hình 7.11 Sơ đồ kỹ thuật ELISA Kháng nguyên được gắn lên giếng Kháng thể 1 Kháng thể 2 liên kết enzyme Một giếng trong đĩa ELISA Đĩa ELISA (microtiter plate) có 96 giếng Enzyme trong phức hợp kháng nguyênkháng thể bắt màu với cơ chất IV Tăng mức độ biểu hiện của gen được tạo dòng Cho DNA ngoại lai Kiểmđược tra bằng dung hợp với thử nghiệm đoạn tương ứng của gen lacZ chứa... tâm tái huyền phù X3 lần nước Tris.HCl + urea đệm 2xSDS gel-loading dye điện di nước Phương pháp hòa tan thể vùi Hòa tan các thể vùi Rửa trong đệm dung ly KH2PO4, EDTA và NaCl ly tâm tái huyền phù 1xSDS gel-loading dye điện di 2 Các đuôi ái lực • Đuôi ái lực xuất hiện khi thiết kế di truyền với mục đích giúp cho sự tinh sạch protein hoặc enzyme hiệu quả hơn • Gen của protein quan tâm được dung hợp. .. promoter tac Cùng hướng với các vị trí tạo dòng là rrnB mang gen 5S của E coli và hai nhân tố kết thúc phiên mã T1 và T2 Vùng tạo dòng tac P 5S T1 T2 Ampr pKK177-3 (2,9 kb) ori 2000 1000 Vùng tạo dòng Ptac SalI EcoRI SmaI HindIII PstI 3 Promoter bacteriophage T7 Cho phép mức độ biểu hiện cao của một vài gen không được biểu hiện hiệu quả trong các hệ thống khác EcoRV EcoRI 0 NheI EcoRV ClaI TФ 4000... không hòa tan ở trong tế bào chất Thể vùi Ly tâm Tiểu thể + Rửa với Triston X-100 và EDTA hoặc urea Phương pháp hòa tan thể vùi Làm tan tế bào Ly tâm Tái huyền phù PMSF RT,và 20lysozyme phút Bổ sung deoxycholic acid 37oC và khuấy 30 phút ở RT Bổ sung DNase I Phương pháp hòa tan thể vùi Phương pháp 1 Ly tâm Ly tâm Trong nước,15’ điện di Tinh sạch và rửa thể vùi tái huyền phù RT, 5 phút tái huyền phù đệm... Sản xuất các protein nguyên thể Promoter TAC DNA Gen A SD AUG mRNA SD Protein nguyên thể N Met C Các protein nguyên thể có thể được sản xuất trong E coli bằng cách sử dụng promoter điều hòa mạnh và một trình tự liên kết ribosome hiệu quả Để biểu hiện gen prokaryote có trình tự liên kết ribosome mạnh chỉ cần cung cấp một promoter là đủ Các vector biểu hiện mang promoter PL của bacteriophage λ, promoter... một vị trí được nhận biết bởi sản phẩm của gen N (nutL), bản thân gen N, và tín hiệu kết thúc phiên mã phụ thuộc rho (tL) Vị trí nhận biết HpaI nằm với vùng mã hóa của gen N EcoRI 0 HindIII 6000 λ 1000 Ampr PL pKC30 (6,4 kb) 5000 nutL N HpaI 2000 ori tL 4000 BamHI 3000 2 Promoter trp-lac Hình 6 Vector pKK177-3 pKK177-3 là một tac vector chứa các vị trí tạo dòng gen ngoại lai cùng hướng với promoter tac... được dùng là pLG mang gen lacZ mã hóa đầu tận cùng Khắc carboxyl có hoạt tính βphục galactosidase Mức độ biểu hiện thấp: do RNA không ổn định, sự kết thúc chưa hoàn chỉnh, sự dịch mã không hiệu quả, hoặc chính protein không ổn định V Tinh sạch protein 1 Thể vùi và phương pháp hòa tan thể vùi 2 Các đuôi ái lực 1 Thể vùi và phương pháp hòa tan thể vùi Protein có mức độ biểu hiện cao trong E coli thường... sự tinh sạch protein hoặc enzyme hiệu quả hơn • Gen của protein quan tâm được dung hợp với chuỗi DNA mã hóa cho một số trình tự amino acid • Tinh sạch protein đích bằng sắc ký ái lực Cho hỗn hợp protein tái tổ hợp đi qua cột sắc ký có chứa một phối tử liên kết đặc hiệu với các protein mang một đuôi ái lực 2 Các đuôi ái lực 2 Các đuôi ái lực ... SDS-PAGE Nếu mức độ biểu hiện thấp thì nên đặt gen lacZ cùng hướng với gen được biểu hiện Như vậy, nếu sự phiên mã hoặc dịch mã hạn chế biểu hiện của gen thì những thay đổi trong hệ thống biểu hiện có thể được kiểm soát bằng những thay đổi trong hoạt tính của βgalactosidase Protein gel (điện di SDS) Hình 9 Sơ đồ kỹ thuật Western blot Thẩm tích protein lên màng nitrocellulose Kháng thể 1 đặc hiệu Gắn kháng ... dung hợp (fusion protein) protein nguyên thể (native protein) vi khuẩn I Sản xuất protein dung hợp Protein dung hợp Gen dung hợp ATG Gen B Promoter Gen A DNA SD AUG mRNA SD Met N Protein dung hợp. .. nhận biết điện di Có thể được tiết môi trường nhờ biểu hiện của vi khuẩn EcoRI 5000 Các hệ thống vector biểu gen dung hợp với gen lacZ Vùng tạo dòng Pst I Ampr 4000 1000 pUR278 (5,2... có 96 giếng Enzyme phức hợp kháng nguyênkháng thể bắt màu với chất IV Tăng mức độ biểu gen tạo dòng Cho DNA ngoại lai Kiểmđược tra dung hợp với thử nghiệm đoạn tương ứng gen lacZ chứa năng, xét