Tổng hợp thử hoạt tính sinh học số dẫn chất aryloxy-s-triazin SYNTHESIS AND 3I0L0GICAL ACTIVITY OF SOME ARYLOXY-S-TRIAZIN DERIVATIVES Đinh Thị Thanh Hải*, Trần Việt Hùng** *BỘmôn Hoá Hữu cơ, Trường Đại học Dược Hà Nội **Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương - Bộ Ktế SUMMARY: By the reaction o fcya n u ric chloride with various phenols in the presence ofN aO H as a catalyst com pound i - was obtained The structures o f synthesized com pounds were conftm ed by IR, 'H-NMR, 13C-NMR and m ass spectroscopy The obtained com pounds had been investigated on biological activity such as antifungal activity, antibacterial activity and cytotoxic activity Keyw ords; aryloxy-s-triazln, biological activity, cyanuric chloride Đặt vấn đề Triazin dị vòng cạnh chứa dị tố nitơ, dẫn xuất từ lâu sử dụng rộng rãi làm thuốc y học, đặc biệt lĩnh vực điều trị ung thư hexamethylmelamin, triethylenemelamin [1],[2],[3],[5] Trong nám qua, có nhiều công trình nghiên cứu thê giới tiếp tục nghiên cứu tổng hợp sàng lọc tác dụng sinh học dẫn chất 1,3,5-triazin để tìm kiếm thuốc [4],[6],[8] Tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu dẫn chất triazin, thực để tài nghiên cứu "Tổng hỢp thử hoạt tính sinh học s ố dẫn chất aryloxy-s-triazin" với mục tiêu: Tổng hợp số dẫn chất aryloxy-s-triazin thử hoạt tính sinh học dẫn chất tổng hợp (kháng khuẩn kháng nấm, kháng tế bào ung thư) với hy vọng tìm chất có hoạt tính sinh học cao hướng tới nghiên cứu sâu khả ứng dụng thực tế Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu, hóa chất: Là hóa chất thông thường có nguồn gốc từ hãng Merck (Đức), Aldrich (Mỹ), Trung Quốc Việt Nam Thiết bị nghiên cứu: Thiết bị tiến hành phản ứng tổng hợp thông thường, sắc ký lớp mỏng (SKLM) tiến hành mỏng Silicagel Kieselgel 60 Fjj^iMerck) Nhiệt độ nóng chảy đo máy Electrothermal Digital Phổ hồng ngoại (IR) ghi máy Perkin - Elmer Phòng thí nghiệm trung tâm, trường ĐH Dược Hà Nội Phổ khối lượng (MS) ghi máy Agilent 6310 ion Trap Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ('H - NMR - NMR) ghi máy Bruker - AV500 Phương pháp nghiên cứu: Áp dụng phương pháp thực nghiệm hóa học hữu để tổng hợp sản phẩm dự kiến Theo dõi tiến trình phản ứng tổng hợp SKLM, xác định cấu trúc chất tổng hợp dựa kết phân tích phổ hổng ngoại (IR) phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ('H - NMR - NMR) Thực nghiêm Quy trình chung đ ể tổng hợp chất 1- Tiến hành phởn ứng: Cho vào bình cẩu cổ 0,03 mol hợp phẩn phenol, ml dung dịch NaOH 20% (0,03 mol) Khuấy cho tan hoàn toàn Thêm từ từ 0,01 mol cyanuric clorid Đun hồi lưu Theo dõi phản ứng SKLM với hệ dung môi toluen:AcOEt (4:1) Kết thúc phản ứng sau 5h, để nguội Xử lý hỗn hợp sau phản ứng: Hỗn hợp sau phản ứng lọc hút chân không, rửa tủa nước cất Chiết sản phẩm hỗn hợp dung môi AcOEt : HjO (1:1) Gạn bỏ lớp nước, chiết lấy lớp AcOEt, làm khan Na^so^, lọc qua phễu thuỷ tinh, cất quay loại dung môi Ket tinh lại benzen, sấy khô thu sản phẩm, Chất 1: Hiệu suất 55,4% , nhiệt độ nóng chảy 236 - 238°c IR (KBr) (em '): 3060, 1568' 1492, 1378 MS (ESI): 357 'H-NMR (DMSO-dp õ(ppm): 7,36 -7,32 (t, H, H-3, H-3', H-3", H-5, H-5', H-5"), 7,23-7,20 (t, H, H-4, H-4', H-4"); 7,14-7,12 (d, J=7,5 Hz, H, H-2, H-2', H-2", H-6 , H^6 ', H^6 " )J3C-NMR ô(ppm): 173,58 (3Ctriazin-1,3,5); 151,60 (3C-1, r , 1"); 129,43 (6C-3, 5, 3', 5', 3", 5"); 126,03 (3C- 4,4', 4"); 121,39 (6 C - 2, , , ', ", ") Chất 2: Hiệu suất 43% , nhiệt độ nóng chảy 176 -1 78"C IR (KBr) (cm '): 3074,1692,1563,1478,1361 MS (ESI): 441 Quy trình chung đ ể tổng hợp chất 3-6 Tiên hành phản ứng: Cân 0,045mol hợp phẩn phenol cho vào bình cầu cổ, thêm 40 ml aceton + l , g NaOH (0,045mol), khuấy tạo thành hỗn dịch đồng Thêm từ từ 0,01 mol cyanuric clorid Đun hồi lưu 5h Theo dõi phản ứng SKLM với hệ dung môi toluen: AcOEt (4:1) Xử lý hỗn hợp sau phản ứng: Lọc hút chân không, rửa tủa hỗn hợp EtOH : H p (1:1) Kết tinh lại từtoluen C i^ N XI Chất 3; Hiệu suất 73,5%, nhiệt độ nóng chảy 194°c IR (KBr) (em '): 3067, 2853, 1692, 1571, 1508, 1369 MS (ESI): 531 Chất 4: Hiệu suất 58,5%, nhiệt độ nóng chảy 133°c IR (KBr) (cm '): 3043, 1575, 1504, 1532, 1374 MS (ESI): 492 'H-NMR (DMSO-d^) ô(ppm): 8,04 -8,02 (d, Hz, 3H, H*3, H-3', H-3"); 7,66-7,63, (t, 3H, H-5, H-5', H-5"); 7,41-737(t, 3H, H-4, H-4', H-4"); 7,307,28(d, J=8,5 Hz, 3H, H-6 , H-6 ', H-6 ") '^C-NMR ỗ(ppm): 173,11 (3Ctriazin-1,3,5); 144,40 (3C-1, r , "); 141,07 (3C- 2, 2', 2"); 135,19 (3C-5, 5', 5"); 128,28-127,12 (3C4,4', 4"); 125,80-124,79 (3C - , , ") Chất 5: Hiệu suất 62,0%, nhiệt độ nóng chảy 230°c IR (KBr) (em '): 3390, 1615, 1506, 1378 MS (ESI): 402 Chất : Hiệu suất 62,0%, nhiệt độ nóng chảy 230°c IR (KBr) (em '): 3074, 1723, 1565, 1475, 1362 MS (ESI): 457 Kết nghiên cứu Tổng hợp hoá học Sơ đồ tổng hợp hoá học: Chúng tòi tiến hành phản ứng tổng hợp theo sơ đồ phản ứng chung sau đây: NaO H Ar + NaCI + SHọO Hồi iưu T ỎI ''Ar Oị N Ar = — ■ m (1 ) OHC A r= (2 ) _ i Ar=—f '''í;—CHO H ^ x/ (3) Ar = Ar = NH - O HOOC p) (6 ) Dựa quy trình tổng hợp dẫn chất aryloxy-striazin theo tài liệu tham khảo [6], tiến hành thử nghiệm khảo sát phản ứng tổng hợp dẫn chất aryloxy-s-triazin Các thông sổ phản ứng tổng hợp là: Tỷ lệ mol chất phản ứng: Phenol/ cyanuric clorid/NaOH :1 :3 Thời gian phản ứng: 3h Nhiệt độ phản ứng: 25°c hồi lưu Dung môi phản ứng; Aceton ứng dụng quỵ trình tiến hành phản ứng tổng hợp 2,4,6-triphenyloxy-l,3,5-triazin (1) từ phenol cyanuric clorid Kết cho thấy hiệu suất phản ứng thấp đạt 17% Chính vậy, khảo sát điều kiện phản ứng đưa quy trình tổng hợp với thông số phù hợp sau; Tỷ lệ mol chất phản ứng; Phenol/ cyanuric clorid/NaOH thay đổi tuỳ theo hợp phẩn phenol tham gia phản ứng Thời gian phản ứng: 5h Nhiệt độ phản ứng: Đun hồi lưu Dung mỏi phản ứng: Nước (đối với phản ứng tổng hợp chất 1,2); hỗn hợp dung môi aceton + nước, tỉ lệ ; (đối với phản ứng tổng hợp chất ,4 , ) Các phản ứng theo dõi sắc ký lớp mỏng để xác định thời gian phản ứng thích hợp Đã sơ kiểm tra độ tinh khiết chất tổng hợp đo nhiệt độ nóng chảy SKLM Xác nhận cấu trúc chất tổng hợp qua phân tích phổ IR, MS, 'H-NMR, ’^C-NMR.' Kết thử tác dụng sinh học Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Chúng tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hoá học hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học Công nghệ quốc gia theo phương pháp đại Vanden Bergher Vlietlinck [9], thực phiến vi lượng 96 giếng Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm chủng vi khuẩn; Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923), Bacillussubtillis (ATCC 27212), Staphylococcus aureus (ATCC 12222) chủng vi nấm Aspergillus niger (493), Fusarium oxysporum (M42), Candida albicans (ATCC 7754), Saccharomyces cerevisiae (SH 20) Kết thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm: Chúng thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm chất tổng hợp chất (1), (2) (4) Kết cho thấy chất đểu họat tính kháng chủng vi khuẩn vi nấm thử nghiệm Thử tác dụng kháng tế bào ung thư: Các chất tổng hợp gổm chất (1), (2) (4) thử tác dụng gây độc tính tế bào ung thư phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hoá học chất thiên nhiên (Viện Khoa học công nghệ quốc gia) theo phương pháp SRB Likhiwitayawuid cộng [7], Trên hai dòng tê' bào ung thư gổm Hep - (tế bào ung thư gan người) LU (tế bào ung thư phổi) Chất chuẩn dương tính: Ellipticin Chất thử: (1), (2) (4) Kết quả: Thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư cho thấy chất (1); (2); (4) tác dụng kháng dòng tế bào ung thư gan (Hep 2) dòng tế bào ung thư phổi (LU) Bàn luận v ề tổng hợp hoá học Về ảnh hưởng nhóm hợp phân phenol: Gốc aryl hợp phấn phenol mà lựa chọn để tiến hành tổng hợp dẫn chất mong muốn có nhóm có hiệu ứng điện tử khác nhân thơm Chúng tỏi dự định khảo sát cách hệ thống ảnh hưởng nhóm hợp phẩn phenol khả tham gia phản ứng nhân vào vòng s-triazin Tuy nhiên, hoá chất phục vụ nghiên cứu không sẵn có thị trường nên tiến hành tổng hợp dẫn chất aryloxy-5-triazin từ nguyên liệu sẵn có đưa số nhận xét sơ khả phản ứng hợp phần phenol sau: + Sự có mặt nhóm đẩy điện tử hợp phẩn phenol -OCH3 , -NHj làm tăng khả phản ứng nhân vào vòng s - triazin + Ngược lại có mặt nhóm hút điện tử hợp phẩn phenol -CHO, -N O j, -COOH làm giảm khả phản ứng vào vòng s-triazin Bên cạnh ảnh hưởng nhóm đến phản ứng tổng hợp, hiệu suất phản ứng phụ thuộc nhiều vào trình tinh chế sản phẩm v ề xác định cấu trúc Các chất tổng hợp ghi phổ hổng ngoại máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr vùng 4000 - 500 cm ’ phòng Phân tích phổ IR (Viện Hoá học - Viện Khoa học Công nghệ quốc gia) Kết phân tích số liệu phổ hồng ngoại ghi phán thực nghiệm chất Cả chất đểu không thấy dải hấp thụ đặc trưng cho dao động C-CI mà xuất dải hấp thụ đặc trưng cho dao động hoá trị C-O-Ar khoảng 1378 - 1361 em ', điều chứng tỏ nhóm thê' -Cl thay - -A r Cả chất đểu có dải hấp thụ đặc trưng cho dao động hoá trị C=N vùng 1615 - 1563cm'\ dao động vòng benzen vùng 1508 - 1478 cm ’ dao động biến dạng C-H vòng benzen vùng 1279 - 1194cm Điều phù hợp với dự đoán chất đểu có vòng s-triazin nhân thơm Chất (2), chất (3) có dải hấp thụ 1692, 1693cm ' chất (6 ) có dải hấp thụ 1723cm 'đặc trưng cho dao động hoá trị nhóm c=0 Riêng chất (3) có thêm dao động hoá trị 2852cm ' đặc trưng nhóm -OCH3 từ nguyên liệu ban đẩu vanillin Chát (4) có dải hấp thụ 1532cm ’ 1374cm ' đặc trưng cho dao động hoá trị đối xứng dao động hoá trị bất đối xứng nhóm -NOj Chất (5) có dải hấp thụ 3390cm ' đặc trưng cho dao động hoá trị nhóm NHj Phổ khối lượng (MS) ghi máy Agilent 6310 ion Trap phòng Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học (Viện Khoa học Công nghệ quốc gia) máy Autospec Premier phòng Thí nghiệm Hoá vật liệu - Khoa Hoá học trường ĐHKHTN - ĐHQGHN Kê't phân tích phổ khối lượng cho thấy chất ghi phổ đểu có pic phân tử có số khối số khối chất dự kiến đểu dẫn chất triaryloxy Kết phân tích phổ khối lượng ghi phẩn thực nghiệm chất Chúng tiến hành phân tích phổ cộng hưởng từ proton ('H - NMR) cộng hưởng từ hạt nhân ('^C- NMR) ghi máy Bruker - AV500 (dung môi CDCI3 ) phòng Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học (Viện Khoa học Công nghệ quốc gia) Kết phân tích phổ cộng hưởng từ proton ('H - NMR) cộng hưởng từ hạt nhân ('^C- NMR) ghi phẩn thực nghiệm chất Phổ cộng hưởng từ proton (’ H - NMR) cho phép nhận biết dạng proton số lượng proton dạng chất ghi phổ qua sổ liệu vể độ chuyển dịch hoá học cường độ pic Cả chất ghi phổ (1, 4) có tín hiệu có độ dịch chuyển hoá học nằm khoảng 7,20 - 8,10ppm proton thơm (vòng benzen), có số tín hiệu cộng hưởng proton tương ứng với cấu trúc chất dự kiến dẫn chất triaryloxy dẫn chất di hay monoaryloxy Kết phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (’^C- NMR) chất ghi phổ (1, 4) cho nhận biết tín hiệu cộng hưởng nguyên tử carbon tương ứng với nguyên tử carbon có cấu trúc phân tử chất dự kiến dẫn chấttriaryloxy Cản vào kết phân tích phổ IR, MS, ’ H-NMR, - NMR chất ghi phổ, đặc biệt phổ MS, 'H-NMR, - NMR cho thấy chất thu có cấu trúc dự kiến đểu dẫn chất triaryloxy v ể tác dụng sình học Về tác dụng kháng khuân, kháng nấm: Chúng thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm chất tổng hợp chất (1), (2) (4) Kết cho thấy chất hoạt tính kháng chủng vi khuẩn vi nấm thử nghiệm Có thể chế tác dụng kháng tế bào vi khuẩn vi nấm chất tổng hợp in vitro mà cẩn hoạt hoá loại enzym cán thiết thể vể tác dụng kháng tế bào ung thư: Ba chất (1), (2) (4) đem thử hoạt tính kháng tế bào ung thư gan (Hep - 2) tế bào ung thư phổi (LU) đểu cho kết âm tính Như chất khả kháng dòng tế bào Hep - dòng tế bào LU in vitro Dựa theo số tài liệu nghiên cứu dẫn chất aryloxỵ-s-triazin cho thấy vào thể dẫn chất bị chuyển hoá gan nhờ enzym Cytocrom P-450 tạo chất chuyển hoá trung gian có hoạt tính sinh học cao Chúng dự đoán có mặt enzym Cytocrom P450 có ảnh hưởng lớn tới hoạt tính chất Chính vậy, điểu kịên thời gian kinh tế cho phép, thời gian tới tiến hành thử nghiệm hoạt tính chống khối u chuột chất tổng hợp Kết luận Đã tổng hợp dẫn chất aryloxy-s-triazin theo qui trình đơn giản thu hiệu suất cao, có chất (2 - ) chất chưa thấy công bố tài liệu tham khảo Đã xác định cấu trúc chất tổng hợp phân tích phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ proton ’ H-NMR phổ cộng hưởng từ hạt nhân '^C-NMR Kết phân tích phổ cho phép kết luận tất chất tổng hợp đểu tinh khiết có cấu trúc dự kiến Đã thử tác dụng kháng khuẩn kháng nấm chất (1), (2), (4) với chủng vi khuẩn chủng vi nấm kiểm định Kết cho thấy chất hoạt tính kháng chủng vi khuẩn vi nấm thử nghiệm Đã thửtác dụng kháng tế bào ung thưcủa chất (1),(2) (4) dòng tế bào ung thư gan người (Hep - 2) tế bào ung thư phổi (LU) Kết cho thấy chất tác dụng kháng dòng tế bào ung thư in vitro TÀI LIỆU THAM KHẢO Bonny L Jonhson et al (1978),"Hexamethylmelamine in alkylating agent resistant ovarian carcinoma", Journo/ o f Cancer, Vol 42, pp.2157-2161, Donald w Kaiser et al (1951), "Substituted Meiamines", Journal o f The American Chemical Society, Vol 73, pp 2984 - 2986 Edwin M s and Lorence R (1959), The chemistry o f heterocyclic compounds s-triazine and derivatives, New York, chapter I, chapter VI Fredric c, Schaefer, JackT.Thurston and James R Dudiy (1951),"Aryloxy-s-triazines" Jouma/o/'f/ie/lmer/can Chemical Society, Vol 73, pp 2990-2992 Goodman and Gilman's (2001), The Pharmacological basic o f therapeutics, Me Graw- Hill Medical Publishing Division, 10'*' edition, Vol II, chapter 52, pp 1389 -1392, p.1397 Hutton R., Jonathan A Park (1992),"Processesfor the preparation substituted-l,3,5-triazines", European Patent Office, PN: 0544444 A1 Likhiwitayawuid K., Angerhofer C.K et al (1993), "Methods in cytotoxicity assay", ^our, Nat Prod, vol.56 (1), 30-38 Sewa s Legha et al (1976),"Hexamethymelamine An Evaluation of Its Role in the Therapy of Cancer", Journal o f Cancer, vol 38, pp 27- 33, vlietlinck A.J., Vanden Berger D.A (1991), Methods in plants biochemistry, 6,47 - 68 98 Nghiéncứu dược Thòng tin thuoc ... trình tổng hợp dẫn chất aryloxy- striazin theo tài liệu tham khảo [6], tiến hành thử nghiệm khảo s t phản ứng tổng hợp dẫn chất aryloxy- s- triazin Các thông s phản ứng tổng hợp là: Tỷ lệ mol chất. .. gian tới tiến hành thử nghiệm hoạt tính chống khối u chuột chất tổng hợp Kết luận Đã tổng hợp dẫn chất aryloxy- s- triazin theo qui trình đơn giản thu hiệu suất cao, có chất (2 - ) chất chưa thấy công... chủng vi nấm Aspergillus niger (493), Fusarium oxysporum (M42), Candida albicans (ATCC 7754), Saccharomyces cerevisiae (SH 20) Kết thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm: Chúng thử hoạt tính kháng