thực vật chuyển gen

Tại sao phải tạo cây chuyển gen?• Theo phương pháp truyền thống, nhà tạo giống tìm cách tổ hợp lại các gen giữa hai cá thể thực vật nhằm tạo ra con lai mang những tính trạng mong muốn..

thực vật chuyển gen

1

Nguyễn Quỳnh Anh

Võ Đạo Hiền Nguyễn Thị Huệ

Lê Đình Hưng

Lâm Hồng Ngọc Phạm Thị Kim Thanh

Nam Đức Vũ

Lớp: Sinh K33

Kỹ thuật di truyền

GVHD: TS Dương Thị Bạch Tuyết

Tại sao phải tạo cây chuyển gen?

• Theo phương pháp truyền thống, nhà tạo giống tìm cách tổ hợp lại các gen giữa hai cá thể thực vật nhằm tạo ra con lai mang những tính trạng mong muốn

• Phương pháp thông thường bị hạn chế bởi:

 Chỉ có thể thực hiện được giữa cá thể cùng loài hoặc có họ hàng

gần

 Phải mất nhiều thời gian mới thu được kết quả mong muốn và

thường các tính trạng quan tâm lại không tồn tại trong loài có họ hàng gần.

 Kỹ thuật chuyển gen cho phép những nhà chọn giống cùng lúc đưa vào một thực vật những gen mong muốn từ những sinh

I Tổng quan về thực vật

chuyển gen

1 Công nghệ chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen là việc chuyển đoạn DNA ngoại lai của một sinh vật này sang cho một sinh vật khác, sau đó đoạn DNA ngoại lai này sẽ có mặt ở hầu hết các tế bào và được truyền lại cho thế hệ sau.

Sinh vật biến đổi gen (Genetically Modified Organism - GMO) là những sinh vật được thay đổi vật liệu di truyền (ADN) bằng công nghệ sinh học hiện đại , hay còn gọi là kỹ thuật chuyển gen GMO đã xuất hiện hơn 2 thập kỷ này.

4

2 Thực vật chuyển gen

5

• Thực vật chuyển gen là một thực vật mang một hay nhiều gen được đưa vào nhân tạo thay vì thông qua lai tạo

• Những gen được đưa vào (gen chuyển) có thể được phân lập từ những loài thực vật có có quan hệ họ hàng hoặc từ loài khác biệt hoàn toàn

Bắp cải chuyển gen

3 Điều kiện cần cho chuyển gen ở thực vật

6

Muốn đưa một gen vào tế bào thực vật, trước tiên nó phải được gắn vào một vectơ, đây là nhân tố giúp mang gen, nhân bản và đôi khi biểu hiện một trình tự DNA trong tế bào đích

Vector transposon

Kích thước của vectơ càng nhỏ càng tốt.

Vectơ phải có khả năng tái bản.

Mang những đặc điểm cho phép phát hiện

dễ dàng, được mã hóa bởi các gen chỉ thị chọn lọc.

Chứa ít nhất một vị trí nhận biết của enzim giới hạn để dùng làm vị trí ghép DNA trong tạo thể tái tổ hợp.

Các đối tượng thường dùng làm vectơ trong chuyển gen ở thực vật là:

vi khuẩn và vi sinh vật có phân tử DNA dạng vòng

và tương đối nhỏ , tách biệt với NST vi khuẩn và sao chép độc lập Ngoài ra còn có virus.

Khối u tạo ra do vi

khuẩn Agrobacterium

Không phải toàn bộ tế bào đều thể hiện tính toàn năng (totipotenc

y)

Các cây khác nhau

có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gen ngoại lai

Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh

và khả năng thu nhận gen biến nạp vào genome

Thành phần của các quần thể tế bào được xác định bởi loài, kiểu gen, từng

cơ quan, từng giai đoạn phát triển của mô và

cơ quan

4 Nguyên tắc chuyển gen thực vật

9

4 nguyên tắc khi chuyển gen thực vật

Chọn phương pháp chuyển gen phụ

thuộc

Mức độ biểu hiện được

mong đợi, biểu hiện

trong thời gian ngắn

hoặc biểu hiện ổn định

Loại tế bào đích, như tế bào dịch huyền phù hoặc tế bào dính bám, các dòng tế bào đã thích nghi hoặc phân

hóa

A Phương pháp chuyển gen trực tiếp

Mỗi phương pháp đều đòi hỏi sự tối ưu cao,

bao gồm các yếu tố

Phương pháp cụ

thể

Phân loại

Phương pháp cơ học

Kỹ thuật dùng CaCl2

PEG làm kích hoạt sự dung hợp tế bào trần, tạo

khả năng du nhập gen lạ vào tế bào trần

Sử dụng polyethylen glicol (với nồng độ 0,2 - 0,3M) có thể tạo các tế bào lai đạt từ 25 - 50%

và các tế bào lai có thể tồn tại qua nhiều thế hệ

Kỹ thuật PEG (polyethylene glycol)

Kỹ thuật xung điện (electroporation)

Kỹ thuật xung điện (electroporation)

• Ðể tạo ra xung điện cao

thế trong một thời gian

ngắn người ta sử dụng

một máy xung gen

• Xung điện cần thiết cho

kỹ thuật này thường là

khoảng 10.000-100.000

V/cm (tùy theo kích

thước của tế bào)

Phát siêu âm với tần số 20kHz theo từng nhịp ngắn 100 miligiây Số nhịp khoảng từ 6-9

Đem protoplast nuôi trong các môi trường thích hợp

Chọn lọc để tách các protoplast đã được chuyển gen

Nuôi cấy invitro

để tái sinh cây

Chọn lọc cây và đưa ra trồng ở môi trường ngoài.

Kỹ thuật siêu âm

Kỹ thuật vi tiêm (micro injection):

Nguyên tắc

Hiệu quả ở phôi non

Dùng cơ học đưa DNA vào tế

bào có thành tế bào của các tế

bào tiền phôi của hợp tử hoặc

của hạt phấn

Khí helium áp

lực cao

Bắn hạt bụi kim loại bọc

Kỹ thuật súng bắn gen (Biolistics)

Nguyên tắc

Tiến hành

Tác động cơ học của vi đạn với với tốc độ cao xuyên

màng tế bào

Kỹ thuật súng bắn gen (Biolistics)

Kỹ thuật súng bắn gen (Biolistics)

Gene Gun PDS He-1000.

Kỹ thuật súng bắn gen (Biolistics)

Kỹ thuật súng bắn gen (Biolistics)

1. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi sinh vật đất Agrobacterium.

.Nguyên lý chung.

• Ti-plasmid của Agrobacterium tumefaciens

• Vector liên hợp và vector nhị thể.

.Phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium.

• Quy trình chuyển gen vào lúa mì nhờ Agrobacterium.

• Chuyển gen vào cây lúa nước nhờ Agrobacterium.

2 Chuyển gen gián tiếp nhờ virus

B CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN

GIÁN TIẾP

1 CHUYỂN GEN GIÁN TIẾP NHỜ VSV ĐẤT

Agrobacterium.

NGUYÊN LÝ CHUNG:

 Sử dụng vi sinh vật đất Agrobacterium để

chuyển gen ở thực vật là phương pháp hiệu quả

và phổ biến nhất hiện nay nhờ vào khả năng

gắn gen ngoại lai vào hệ gen thực vật một cách

chính xác và ổn định.

 Agrobacterium là nhóm VSV đất Gr (-) các

triệu chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết

thương.

Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens

Sự gây ra các khối u do

Agrobacterium:

Agrobacterium tumefaciens

và A rhizogenes là hai loài vi

khuẩn sống trong đất gây ra

Ti-plasmid của Agrobacterium tumefaciens

Plasmid Ti đã cắt bỏ gen gây khối u, các gen tổng hợp opin nhưng vẫn giữ vùng vir, bờ phải và bờ trái.

Thay vào những phần gen bị cắt bỏ là những đoạn tương đồng của plasmid trung thứ hai có chứa vùng gắn gen cần chuyển theo ý muốn của con người

Vector liên hợp và vector nhị thể

Vector liên hợp: là kết quả của sự liên hợp của 2 loại vector

Vector thứ nhất: tách dòng từ E coli trong đó có thiết kế

vùng bờ phải, bờ trái và ở giữa hai bờ này là các gen chỉ thị và các gen cần chuyển vào cây.

Vector (plasmid) thứ hai là plasmid Ti đã bị cắt bỏ T –

DNA, bờ phải, bờ trái và chỉ giữ lại vùng vir Nhờ hệ thống vector nhị thể này có thể chuyển gen một cách

hữu hiệu.

Vector nhị thể: Chúng có cả 2 loại vector (plasmid)

cùng tồn tại và hoạt động trong VK A.tumefaciens.

Sơ đồ

hệ thống vector liên hợp (A) và vector nhị thể (B)

PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT NHỜ

Agrobacterium

Chuẩn bị phôi từ hạt lúa mì

Chuẩn bị Agrobacterium

Nuôi cấy phôi với Agrobacterium

Quy trình chuyển gen vào lúa mì nhờ

Agrobacterium

Chuyển gen vào cây lúa nước nhờ Agrobacterium.

Các bước tiến hành:

 Thân non, hoặc lá non của lúa được

khử trùng bề mặt bằng dung dịch chlor, trong 20 phút

 Rửa bằng nước cất vô trùng 5 lần

 Agrobacterium đã mang vector nhị

thể và plasmid Ti được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng, ở nhiệt độ 250C, có bổ sung các chất kháng sinh thích hợp

 Đo độ đục của dung dịch nuôi tới khi đạt

OD600nm= 0,4 thì tiến hành ly tâm tốc độ 2600 vòng/ phút, trong 40 phút thu cặn

Agrobacterium Hòa cặn Agrobacterium vào 4ml MT tạo mô sẹo IM rồi ủ ở nhiệt độ phòng,

 Chuyển mô vào MT mô sẹo CIM rồi để vào bóng

tối, ở nhiệt độ 19 – 250C trong thời gian 2 – 3 ngày

 Rửa mô bằng nước cất vô trùng 4 – 5 lần, sau đó rửa

bằng dung dịch rửa

 Chuyển mô vào MT tạo mô sẹo có bổ sung các chất

chọn lọc như kháng sinh Kanamycin 50mg/l,

cefotaxin 50mg/l, sau đó để trong tối 20 – 30 ngày

 Chuyển mô sẹo sang môi trường tạo chồi SIM có bổ sung 100mg/l Kanamycin và nuôi trong 3 – 4 tuần.

 Chuyển chồi sang MT tạo rễ với việc bổ sung 0.5µM IBA cùng với 25mg/l Kanamycin Thời gian rễ kéo dài vài tháng thì tạo cây con

2 CHUYỂN GEN GIÁN TIẾP NHỜ

Tuy nhiên để có thể chuyển gen thì virus phải

có các tiêu chuẩn sau:

 Hệ gen của virus phải là DNA.

 Virus có khả năng di chuyển từ TB này 

TB khác qua các lỗ vách ở TB.

 Có khả năng mang được đoạn DNA mới, sau đó chuyển gen này vào tế bào thực vật.

 Có phổ ký chủ rộng

 Không tác hại đáng kể cho thực vật

Đối chiếu các tiêu chuẩn trên, hiện nay có 2 loại virus

sử dụng làm vector chuyển gen là caulimovirus và

geminivirus

Tuy nhiên, việc sử dụng virus để chuyển gen ở thực vật còn ít được sử dụng vì DNA virus khó ghép nối với hệ gen của thực vật

III CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU CHÍNH TRONG CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT

1 Cây trồng chuyển gen kháng các nấm gây bệnh:

Thành phần chính của

vỏ tế bào nấm chitin

và β-1,3 glucan

Các enzyme làm thoái hóa các thành phần này đang được chú ý

Cà chua cho tính kháng nấm Fusarium cao hơn hẳn sau khi được chuyển cả hai gen mã hóa chitinase và glucanase

chitinase

Cây thuốc

lá có tính kháng nấm rất cao

• Protein ức chế ribosome (ribosomal inhibition RIP) cũng biểu hiện tính kháng nấm tốt

• Chuyển giao sang cây

thuốc lá cũng phòng ngừa được vi khuẩn

Pseudomonas syringae.

Chuyển gen sản xuất protein làm giảm độc

tố của vi khuẩn

• Gen này chủ yếu

là gen sản xuất các loại enzyme

phân hủy độc tố của vi khuẩn 

vô hiệu hóa tác hại của chúng.

2 Cây trồng chuyển gen kháng các vi

khuẩn gây bệnh:

huy ển

ge

n m

ã hó

a pr ote

•C

huy ển

ge

n t

ạo e nzy

me

•C

huy ển

ge

n c

ó t rìn

Kỹ thuật RNAi (RNA interference) tạo cây

trồng chuyển gen kháng virus

• RNAi là cơ chế gây bất hoạt gen sau phiên mã nhằm

chống lại sự xâm nhập của các nucleotide acid ngoại lai (có nguồn gốc từ virus), cũng như điều khiển sự biểu hiện của gen nội bào.

Cơ chế hoạt động của RNAi (RNA interference) được 2 nhà khoa học Mỹ

là Fire và Mello phát hiện

và công bố trên tạp chí Nature vào năm 1998

 2006: nhận giải Noben

về y học và sinh lý học

Cơ chế hoạt động của

ARNi

Dicer: Ribonuclease III cắt RNA kép

thành các đoạn ngắn ARN

RISC (RNA induced silencing complex): tương tác với mRNA tạo tín hiệu đê Rnase thủy phân

4 Cây trồng chuyển gen kháng côn trùng

phá hoại

Bacillus thuringensis

δ-endotoxin bị đứt gãy trong

dạ dày kiềm của côn trùng để tạo thành độc tố hoạt động

Protein endotoxin Gen Cry

δ-Chọc thủng ruột giữa

gây nên sự tổn thương Côn trùng chết

5 Cây trồng chuyển gen cải tiến các

protein hạt

Ngoài protein thì các amino acid không thay thế, phải

được tiếp nhận cùng thức ăn vì con người và động vật

không tự tổng hợp được

Thức ăn gia súc chủ yếu là đậu tương và ngô, phải bổ sung các amino acid được sản xuất bằng phương pháp lên men như lysine,

methionine, threonine và tryptophan.

Phương thức có khả năng hơn là tạo dòng các gen ở cây đậu tương hoặc ngô mã hóa cho protein giàu những

amino acid này

Gen mã hóa cho một

loại protein chứa các

amino acid có lưu

huỳnh cao bất thường

Đậu lupin

Tăng trọnglượng 7% v

à

sản lượng l

ông tăng 8%

tăng 100% h

àm lượng prote

in trong hạt

6 Cây trồng chuyển gen sản xuất những

loại protein mới

• Những gen mã hóa cho protein được gắn với một promoter

và đảm bảo cho protein chỉ được tổng hợp ở rễ.

• Tiếp theo protein tạo thành có một hệ thống tín hiệu, đảm bảo cho nó được vận chuyển vào một vị trí xác định trong tế bào.

• Protein đi vào lưới nội chất có thể được thải ra bên ngoài và chỉ ở vùng rễ, vì promoter chỉ đặc hiệu cho vùng này.

• Người ta dùng một số dung dịch muối để tách protein một cách dễ dàng và với giá thành hợp lý

7 Cây trồng chuyển gen kháng thuốc diệt

cỏ

• Thuốc diệt cỏ kiềm hãm sự hoạt động của

enzyme enol pyruvat sikimat phosphat

synthetase ( EPSPS)- chuyển hóa sản phẩm quang hợp thành axit sikimic làm rối loạn quá trình trao đổi chất của cỏ cỏ chết.

lần Tách gen EPSPS + cải

biến gen

• Mục đích: tạo ra các cây trồng mang tính bất

dục đực nhằm tránh hiện tượng tự thụ phấn gây giảm năng suất cây trồng ( ví dụ: bắp,

thuốc lá)

8 Cây trồng chuyển gen mang tính

bất dục đực

Công trình thử nghiệm mới

Gen

rolC Agrobacterium

tumefaciens

Promoter CaMV 35S

Virus gây bệnh khảm ở súp-lơ

Cây thuốc lá

Cây chuyển gen

bất thụ

9 Thực vật biến đổi gen để sản xuất các acid

béo thiết yếu

Dầu cá Tài nguyên hải sản

Gia tăng độc

tố ở các loại hải sản

Nghiên cứu sản xuất các acid béo thiết yếu

Các nhà nghiên cứu của đại học Bristol (Anh) công bố:

Thực vật chuyển gen

có thể trở thành nguồn cung cấp các acid béo quan trọng

mà chúng ta thường chỉ nhận được từ cá

Eiconsapentaenoic acid

ô nhiễm đất

Terry và cộng sự (Đại học California)

bổ sung

GM này có thể hấp thụ selen cao gấp 4,3 lần

Cây mù tạt

Brassica juncea

Gen tạo enzyme đói selen

Dùng làm thức ăn cho trâu bò thiếu selen trong bữa ăn Chống ô nhiễm

Cây dương xỉ trung quốc (Pteris

vittata) đã được sử dụng để hút

thạch tín khỏi đất

Pteris vittata

Loại thực vật chuyển gen này có lai với các loại hoa màu khác hay

không?

Theo Rugh (Đại học Michigan) nếu chuyển một gen hấp thụ nhiều kim loại vào cây dùng để xử lý ô nhiễm, thì chúng ta phải đảm bảo rằng gen đó không xâm nhập vào hoa màu

Nếu không, hoa màu cũng sẽ hút nhiều kim loại, ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng

11 Làm thức ăn chăn nuôi

Loại đậu tương và ngô chuyển

gen, có hàm lượng các loại

amino acid không thay thế cao

hơn, có hàm lượng dầu cao hơn

cung cấp nhiều năng lượng hơn

cho bò, lợn và gia cầm.

Nghiên cứu tăng hàm lượng phosphore trong thức ăn chăn nuôi

Vaccine sản xuất truyền thống hay DNA tái tổ hợp có

giá thành cao, điều kiện bảo quản và vận chuyển

nghiêm ngặt, cần có kỹ thuật viên để tiến hành tiêm

12 Văcxin thực phẩm:

Được chính mô và thành tế bào thực vật bao bọc, ổn định, bền vững trong cơ

thể

Dễ dàng sản xuất

khối lượng lớn, giá thành thấp.

Tính ổn định cao,

dễ bảo quản, dễ

sử dụng và kinh tế

cao.

Độ an toàn cao , ít bị nhiễm với các tác nhân gây bệnh của động vật và

người.

Có thể không cần

tinh sạch như các

loại văcxin khác

Đặc điểm của vaccine thực vật

Mô

hình sản

xuất vacxin thực phẩm

Mô hình phát

triển

vacxin thực vật

- Sản xuất vaccine

viêm gan B trong cây chuối chuyển gen, rau diếp

- Chuyển gen ltb của

E.coli gây bệnh đường

ruột vào khoai tây

- Chuyển gen ctb gây bệnh tả của vi khuẩn

Vibrio cholerae và gen

ltb vào cây thuốc lá

Ứng dụng:

Tại Việt Nam

Bằng phương pháp chuyển gien bằng vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens,

kết quả nghiên cứu của Viện Sinh học Nhiệt đới đã nhận được một số loại cây trong

đó có cây cà chua mang gien

mã hoá kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B

- Tạo vaccine viêm gan B “ăn được” từ trái

cà chua

Hiện nay người ta đang nghiên cứu trên khoai tây

IV Những thành tựu của công nghệ biến đổi gen ở thực vật

COUNTRIES GROWING GENETICALLY MODIFIED CROPS

Lần đầu tiên giống cà chua Calgene biến đổi gen được bán trên thị trường (FlavrSaver).

Năm 1998, trên thế giới đã có 48 giống cây trồng biến đổi gen và sản phẩm được thị trường hóa.

Một số sự kiện

Một số loại cây trồng chuyển gen quan

trọng hiện nay

Cải dầu Chống chịu chất diệt cỏ, hàm lượng laurate cao, hàm

lượng oleic acid cao.

Ngô , bông Kháng côn trùng, kháng virus.

Khoai tây, đậu tương Chống chịu chất diệt cỏ, hàm lượng oleic acid cao.

Cà chua Chín chậm, kháng sâu bệnh

Lúa Chống chịu chất diệt cỏ, sản xuất vitamin A.