Các kỹ thuật chủ yếu trong phân tích axit nucleic

Các kỹ thuật chủ yếu phân tích axit nucleic -Các phương pháp tách chiết DNA, RNA -Các phương pháp phân tích DNA i)Kỹ thuật PCR nhóm phương pháp phụ thuộc PCR ii)Lai phân tử iii)Giải trình tự Tách chiết, định lượng định tính axít nucleic Yêu cầu: -DNA đảm bảo độ tinh khiết -Đảm bảo nguyên vẹn cấu trúc để thực bước nghiên cứu tiếp Các bước chính: -Phá vỡ tế bào (vật liệu ban đầu) giải phóng DNA/RNA: học, nitơ lỏng, chất tẩy (SDS) phân tử lưỡng cực kết hợp với protein màng photpholipid làm phá vỡ màng tế bào nhân -Bổ sung chất chống chất hoạt hóa enzyme DNAase làm biến tính phân tử protein, chất hữu cơ, -Tách DNA khỏi tạp chất khác -Thu, rửa, hòa tan DNA Quy trình chung: Phá vỡ tế bào: - Nghiền mẫu nito lỏng thành bột mịn -Xử lý mẫu đệm CTAB 55-65 C Loại bỏ protein photpholipid: -Ly tâm loại cặn, thu dịch -Xử lý với chloroform:isoamil -Ly tâm loại bỏ protein Thu nhận DNA: -Tủa DNA isopropanol or ethanol -Ly tâm thu tủa DNA rửa lại ethanol 70% -Hòa tan DNA TE or nước cất -Bảo quản 4C -20 đến -80 C Vai trò số chất thông dụng: -Nito lỏng: làm cho màng (thành) tế bào cứng, giòn, dễ vỡ Hạn chế hoạt động enzyme phá hủy nucleotide -EDTA: Hạn chế enzyme phân hủy nội bào liên kết ion liên quan trình xúc tác thủy phân DNA (ion hóa trị Mg, Ca, ) -Tris: điều chỉnh pH, tránh đứt gãy DNA môi trường kiềm or acid -CTAB (cetryl ammonium bromide): loại bỏ polysacaride hòa tan DNA cao, hiệu cao 55-65 C -Chloroform: làm biến tính protein loại bỏ liên kết DNA-CTAB -Ethanol (2:1): tủa DNA điều kiện có lực ion, nồng độ muối cao - isopropanol (2:1) tủa DNA điều kiện muối, loại bỏ RNA, DNA đứt gãy, -RNAse: loại bỏ RNA, Dnase: loại bỏ DNA -TE/nước cất: hòa tan bảo vệ DNA/RNA 1.1 Phương pháp tách chiết ADN - DNA có kích thước lớn cần tránh tách nhân gây đứt gãy - DNA genome (ĐV, TV) sau tách chiết phải có kích thước lớn (15kb-300kb) • Phương pháp tách chiết gồm bước:  Bước Phá màng tế bào màng nhân Ở tế bào ĐV TV, cách nghiền tế bào mô nitơ lỏng – 1960C dùng hỗn hợp chất tẩy (SDS, Sarcosyl) proteinase K  Bước Loại bỏ thành phần không mong muốn mẫu, protein, polysaccharide Mẫu bổ sung hỗn hợp dung dịch (phenol: chloroform: isoamine tỉ lệ 25:24:1), lắc mạnh dung dịch có dạng trắng sữa (Do protein bị biến tính kết tủa) Sau ly tâm cao tốc hỗn hợp dung dịch chia làm pha: + Pha pha nước chứa DNA, RNA + Pha pha chứa protein chất thứ cấp bị kết tủa + Phá dung dịch phenol: chloroform: isoamine  Bước Tủa axít nucleic + Tủa ethanol tuyệt đối (tỉ lệ 2:1), tủa tốt -20oC 30 phút 0oC qua đêm Hầu toàn phân tử axít nucleic kết tủa + Tủa isopropanol (tỉ lệ 1:1) 0oC, phân tử DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị kết tủa >>> Sau ly tâm ta thu cặn (DNA, RNA), cặn rửa cồn 70% để loại bỏ muối isopropanol lại  Bước Hoà tan (DNA, RNA) xử lý loại bỏ RNA enzyme Rnase Sau kết tủa lại DNA 1.2 Phương pháp tách chiết RNA tổng số mRNA - Chú ý: + Phân tử RNA không bên, dễ bị phân huỷ enzyme Rnase + Rnase lại có mặt khắp nơi (ở đầu ngón tay, nước bọt, không khí…) + Rnase enzyme có hoạt tính cao, bền nhiệt Do đó: Thao tác tách chiết RNA tốt điều kiện vô trùng, tránh tiếp xúc tay trần Phương pháp tách chiết RNA tổng số mRNA Tách RNA tổng số: tương tự bước tách chiết DNA Ngoại trừ: -Tránh dễ phân hủy RNA enzyme RNase,tất dung dịch dụng cụ thí nghiệm xử lý DEPC khử trùng nhiệt độ cao -Cẩn thận thao tác tránh nhiễm Rnase từ môi trường -Nghiền mẫu chất tẩy mạnh (SDS, sarcosyl), chất gây biến tính (guamidium thiocyanate), chất khử (mercaptoethanol) để ức chế Rnase nội bào tách protein liên kết -Loại bỏ DNA Dnase Tinh mRNA: -rRNA (80-85%); tRNA(15-20%),mRNA(1-5%), snRNA([...]... tử mRNA 2 Các phương pháp phân tích định tính và định lượng axít nucleic 2.1 Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế -Các axit nucleic trong dung dịch sẽ hấp thụ ánh sáng tia cực tím (UV) trong dải từ 210 nm đến 300 nm với độ hấp thụ cực đại ở 260 nm -Vì các DNA và RNA và các nucleotide cùng có độ hấp thụ cực đại ở 260 nm, nên DNA không thể xác định bằng máy đo quang phổ trong vùng cực tím khi dung... 1OD260nm~50ug/ml (DNA mạch kép) ~40ug/ml (RNA) ~33ug/ml (DNA mạch đơn) 2.2 Phân tích định tính bằng Phương pháp điện di Nguyên tắc của điện di: - Dựa vào đặc tính phân tử (DNA, RNA) mang điện tích âm DNA được phân tách bằng phương pháp điện di dựa trên điện tích và phân tử lượng của chính nó Ethidium bromide (EtBr) liên kết vào các phân tử DNA và khi được kích thích bằng ánh sáng UV sẽ phát huỳnh quang... được nhuộm với chất ethidium bromide, EtBr xen vào giữa các base và soi dưới tia UV (λ ≈ 300nm) axit nucleic sẽ có màu đỏ da cam Có 2 loại gel sử dụng điện di: + Gel agarose dùng điện di axít nucleic + Gel polyacrylamide dùng để điện di axit nucleic và protein - Việc chọn loại gel và nồng độ gel tuỳ thuộc vào kích thước đoạn axít nucleic cần phân tách Kiểm tra bằng điện di: So sánh với mẫu chuẫn... vào phân tử mRNA có đuôi poly A - Do đó sau khi tách chiết được RNA toàn phần, cho qua cột sắc ký ái lực (oligod T-cellulose hoặc các viên bi từ gắn đoạn oligod T) - mRNA có đuôi poly A sẽ tiên kết bổ sung với đoạn oligod T - Dùng dung dịch rửa cột, các rRNA, tRNA sẽ bị rửa trôi chỉ còn mRNA được giữ lại - Sau đó dùng dd có nồng độ muối thấp rửa cột hoặc li tâm sẽ thu được các phân tử mRNA 2 Các phương... quang tỉ lệ với lượng DNA tổng số, nên số lượng DNA có trong mẫu có thể được ước tính bằng cách so sánh huỳnh quang được tạo ra bởi mẫu chưa biết với một dãy định lượng chuẩn Để định lượng chính xác hơn về hàm lượng DNA thì RNA phải được loại bỏ bằng phương pháp enzyme - Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào: + Điện tích, kích thước và cấu trúc không gian của phân tử + Nồng độ của chất cấu thành gel - Gel sau... trình tự DNA, tách các đoạn nhỏ  Gel agarose: - Đây là loại gel thông dụng nhất, sử dụng đơn giản - Dùng để tách các đoạn (DNA, RNA) có kích thước từ 0,2-20Kb - Gel đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di theo phương nằm ngang  Gel polyacrylamide - Dùng để tách các đoạn (DNA, RNA có khích thước nhỏ dưới 1000 cặp base - Thao tác phức tạp hơn gel agarose - Mục đích sử dụng: + Tính sạch các đoạn oligonucleotide... 260 nm, nên DNA không thể xác định bằng máy đo quang phổ trong vùng cực tím khi dung dịch bị nhiễm nucleotide và RNA Do vậy RNA cần được loại bỏ bằng phương pháp thuỷ phân với enzyme RNase Các nucleotide và oligonucleotide thu được từ thuỷ phân RNA cũng cần được loại bỏ, nếu không loại bỏ sẽ dẫn đến đánh giá thừa hàm lượng DNA của mẫu thử Ngoài ra DNA xoắn kép hấp thụ ánh sáng UV ít hơn DNA xoắn đơn nên... đoạn (DNA, RNA có khích thước nhỏ dưới 1000 cặp base - Thao tác phức tạp hơn gel agarose - Mục đích sử dụng: + Tính sạch các đoạn oligonucleotide tổng hợp + Xác định trình tự DNA + Tách đoạn DNA nhỏ (trong kỹ thuật SSR, AFLP, RFLP…) + Điện di protein - Gel được đổ giữa hai tấm thuỷ tinh và điện di theo chiều thẳng đứng - Thường nhuộm bạc,có độ nhạy cao ... nồng độ muối thấp rửa cột li tâm thu phân tử mRNA Các phương pháp phân tích định tính định lượng axít nucleic 2.1 Phương pháp định lượng quang phổ kế -Các axit nucleic dung dịch hấp thụ ánh sáng... mạch đơn) 2.2 Phân tích định tính Phương pháp điện di Nguyên tắc điện di: - Dựa vào đặc tính phân tử (DNA, RNA) mang điện tích âm DNA phân tách phương pháp điện di dựa điện tích phân tử lượng... Tủa axít nucleic + Tủa ethanol tuyệt đối (tỉ lệ 2:1), tủa tốt -20oC 30 phút 0oC qua đêm Hầu toàn phân tử axít nucleic kết tủa + Tủa isopropanol (tỉ lệ 1:1) 0oC, phân tử DNA có trọng lượng phân tử