Chỉ thị phân tử kỹ thuật AFLP

ĐẠI HỌC KHOA HỌC HUẾ KHOA SINH HỌC CHỈ THỊ PHÂN TỬ KỸ THUẬT AFLP (Amplified fragment length polymorphisms) Giảng viên: TS Nguyễn Thị Thu Liên Huế - 12/2011 Học viên: Nguyễn Hữu Nhân Nguyễn Bảo Triệu NỘI DUNG TRÌNH BÀY 1.Giới thiệu 2.Nguyên lý kỹ thuật AFLP 3.Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị 4.Ứng dụng 5.Kỹ thuật cDNA-AFLP 6.Ưu, nhược điểm 7.Kết luận 8.Tài liệu tham khảo Giới thiệu Kỹ thuật AFLP phát triển công ty KeyGene đầu năm 1990 trở thành công nghệ in dấu vân tay di truyền (fingerprinting) phổ biến toàn giới Kỹ thuật AFLP dựa nguyên lý kết hợp kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) PCR để khuếch đại đoạn DNA có chiều dài giới hạn sau cắt hạn chế enzyme cắt hạn chế Phương pháp có độ nhạy cao việc tìm dấu vết DNA nguồn gốc hay phức tạp Có thể thực với DNA toàn hệ gen hay với cDNA (bản nguyên bản) Kỹ thuật AFLP cấp sáng chế vào năm 1991 thời điểm ban hành nhiều quốc gia Canada, Châu Âu, Nhật Bản, Úc Mỹ Hiện ứng dụng rộng rãi giới Nguyên lý kỹ thuật AFLP - DNA phân giải hai enzyme cắt hạn chế khác - Phần nối (adapter) oligonucleotide nối với đầu tận phân đoạn DNA - Tập đặc trưng sản phẩm phân giải DNA khuyếch đại, sử dụng kết hợp primer chọn lọc - Phát đa hình thực với đồng vị phóng xạ, nhuộm màu huỳnh quang hay nhuộm bạc Nguyên lý kỹ thuật AFLP Hình 1.Tổng quan kỹ thuật AFLP Nguyên lý kỹ thuật AFLP Enzyme cắt hạn chế (RE): - Sử dụng RE loại II Thường sử dụng hai enzyne cắt hạn hạn chế khác nhau: EcoRI MseI Hai RE không cắt vị trí nhận biết MboI và Sau3AI BamHI: - Tất RE sau cắt phải tạo đầu lồi Nguyên lý kỹ thuật AFLP Enzyme cắt hạn chế (RE): Kết sau cắt RE Nguyên lý kỹ thuật AFLP Phần nối (adapter) - Sau cắt RE, đầu đoạn DNA gắn adapter enzyme ligase - Đoạn adapter gồm hai phần: phần trình tự lõi phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme Nguyên lý kỹ thuật AFLP PCR - Mồi PCR thiết kế dự trình tự adapter trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide - Chỉ phân đoạn chứa trình tự adapter trình tự chọn lọc chọn lọc - Chính trình tự chọn lọc làm giảm xuất sản phẩm PCR làm đơn giản trình phân tích Quá trình PCR gồm hai phản ứng (preselective PCR) selective PCR Nguyên lý kỹ thuật AFLP PCR • Preselective PCR: Sử dụng primer + nucleotide Nguyên lý kỹ thuật AFLP PCR • Selective PCR: Sử dụng primer + + nucleotide Nguyên lý kỹ thuật AFLP Phát đa hình -Trường hợp primer có gắn đồng vị phóng xạ hóa chất phát quang phát hệ thống PCR có thu xử lý tín hiệu phát quang Nguyên lý kỹ thuật AFLP Phát đa hình - Trường hợp primer bình thường sau chạy PCR, mẫu điện di gel nhộm gel Pristionchus pacificus: C: California P: Poland H: Hawaii W: Washington Kỹ thuật cDNA-AFLP * Phân lập mRNA từ mẫu quan tâm * Sao chép ngược mRNA cách sử dụng primer oligo-dT tổng hợp cDNA * Các bước tiến hành cắt hạn chế, PCR, phát đa hình tương tự DNA Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị Nguồn -Nước cất (hoặc) nước khử ion (deionised water) - Hoá chất Trang thiết bị - Tủ lạnh, tủ đông sâu - Laminar có dòng hút khí - Máy li tâm - Máy PCR - Máy đo pH - Cân chuẩn - Máy điều chỉnh nguồn điện - Máy điện di phương thẳng đứng - Lò hâm (hotplate) - Máy giải trình tự tự động lò vi sóng (Microwave) - Máy soi cực tím (UV transilluminator) Dụng cụ - Các loại Micropipette pipette tip tương ứng (đầu côn) - Các loại tube eppendorf - Cối chày sứ - Găng tay Ứng dụng - Đánh giá đa dạng di truyền - Phân tích độ dài di truyền - Kiểm tra dấu hiệu di truyền - Phân tích sưu tập nguồn gene (germplasm collections) - Xây dựng đồ gene - Quản lý thị thăm dò Ưu, nhược điểm Ưu điểm: -AFLP nhanh, đơn giản không phức tạp RFLP khảo sát toàn gen -Kỹ thuật cần lượng DNA ban đầu -Không cần biết trước trình tự đích -Có độ lặp lại phản ứng cao -Các mồi sử dụng không cần đặc hiệu loài -Khuếch đại có chọn lọc lượng lớn đoạn DNA đa hình phản ứng PCR, phù hợp cho việc phân tích đa dạng quần thể có quan hệ gần Ưu, nhược điểm Nhược điểm: • AFLPs tạo lượng lớn thông tin cần phải phân tích tự động, cần giúp đỡ kỹ thuật máy tính cao • AFLP marker trội, điều làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp dị hợp • Trong xây dựng đồ di truyền, AFLPs thường tập trung lại vùng centromeres telomeres • Nhân viên phải có kỹ thuật phòng thí nghiệm đặc biệt phân tích liệu Kết luận -Kỹ thuật AFLP dựa vào khuyếch đại chọn lọc phân đoạn hạn chế sau phân giải DNA -Nó thăm dò đa hình gây thay đổi điểm hạn chế hay vùng lân cận - Kỹ thuật tạo nên lượng lớn bands lần chạy, bước tiến hành đòi hỏi kỹ thuật cao Thank you!!! [...]... điểm: • AFLPs tạo ra một lượng lớn thông tin cần phải được phân tích tự động, vì thế cần sự giúp đỡ của kỹ thuật máy tính cao • AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp • Trong xây dựng bản đồ di truyền, AFLPs thường tập trung lại ở vùng centromeres và telomeres • Nhân viên phải có kỹ thuật phòng thí nghiệm và đặc biệt là phân tích dữ liệu Kết luận -Kỹ thuật AFLP. ..Nguyên lý của kỹ thuật AFLP 3 PCR • Selective PCR: Sử dụng primer + 1 + 2 nucleotide Nguyên lý của kỹ thuật AFLP 4 Phát hiện sự đa hình -Trường hợp primer có gắn đồng vị phóng xạ hoặc hóa chất phát quang thì được phát hiện bằng hệ thống PCR có thu và xử lý tín hiệu phát quang Nguyên lý của kỹ thuật AFLP 4 Phát hiện sự đa hình - Trường hợp primer bình thường... gene - Quản lý các chỉ thị thăm dò Ưu, nhược điểm Ưu điểm: -AFLP nhanh, đơn giản không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gen -Kỹ thuật này chỉ cần lượng ít DNA ban đầu -Không cần biết trước trình tự đích -Có độ lặp lại phản ứng cao -Các mồi sử dụng không cần đặc hiệu loài -Khuếch đại có chọn lọc một lượng lớn các đoạn DNA đa hình trong một phản ứng PCR, phù hợp cho việc phân tích đa dạng... biệt là phân tích dữ liệu Kết luận -Kỹ thuật AFLP dựa vào sự khuyếch đại chọn lọc các phân đoạn hạn chế sau khi phân giải DNA -Nó thăm dò sự đa hình gây ra bởi những thay đổi trong những điểm hạn chế hay những vùng lân cận - Kỹ thuật này tạo nên một lượng lớn bands trong một lần chạy, và các bước tiến hành đòi hỏi kỹ thuật cao Thank you!!! ... 4 Phát hiện sự đa hình - Trường hợp primer bình thường thì sau khi chạy PCR, mẫu sẽ được điện di trên gel và nhộm gel Pristionchus pacificus: C: California P: Poland H: Hawaii W: Washington Kỹ thuật cDNA -AFLP * Phân lập mRNA từ mẫu quan tâm * Sao chép ngược của mRNA bằng cách sử dụng primer oligo-dT tổng hợp cDNA * Các bước tiến hành cắt hạn chế, PCR, phát hiện đa hình tương tự như ở DNA Hóa chất,... Máy điều chỉnh nguồn điện - Máy điện di phương thẳng đứng - Lò hâm (hotplate) - Máy giải trình tự tự động hoặc lò vi sóng (Microwave) - Máy soi bằng cực tím (UV transilluminator) Dụng cụ - Các loại Micropipette và pipette tip tương ứng (đầu côn) - Các loại tube eppendorf - Cối chày sứ - Găng tay Ứng dụng - Đánh giá đa dạng di truyền - Phân tích độ dài di truyền - Kiểm tra dấu hiệu di truyền - Phân tích ... 1.Giới thiệu 2.Nguyên lý kỹ thuật AFLP 3.Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị 4.Ứng dụng 5 .Kỹ thuật cDNA -AFLP 6.Ưu, nhược điểm 7.Kết luận 8.Tài liệu tham khảo Giới thiệu Kỹ thuật AFLP phát triển công... nguyên bản) Kỹ thuật AFLP cấp sáng chế vào năm 1991 thời điểm ban hành nhiều quốc gia Canada, Châu Âu, Nhật Bản, Úc Mỹ Hiện ứng dụng rộng rãi giới Nguyên lý kỹ thuật AFLP - DNA phân giải hai... vị phóng xạ, nhuộm màu huỳnh quang hay nhuộm bạc Nguyên lý kỹ thuật AFLP Hình 1.Tổng quan kỹ thuật AFLP Nguyên lý kỹ thuật AFLP Enzyme cắt hạn chế (RE): - Sử dụng RE loại II Thường sử dụng hai