Bài báo cáo môn di truyền phân tử kỹ thuật AFLP (amplified fragments length polymorphism)

Bài báo cáo môn di truyền phân tử kỹ thuật AFLP (amplified fragments length polymorphism)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NC VÀ PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- 

 -BÀI BÁO CÁO

MÔN: DI TRUYỀN PHÂN TỬ

Tháng 10/2015

PHẦN MỞ ĐẦU

Công tác lai tạo giống theo phương pháp truyền thống có hệ số nhân chậm

và có nhiều trở ngại vì cơ chế sinh học sinh sản của giống cây trồng và vật nuôi rấtphức tạp Kiểm soát một số tính trạng của các giống này làm tiêu tốn nhiều thờigian, chi phí cho chương trình lai tạo giống Hơn nữa, nhà đầu tư quan tâm nhiềuđến các tính trạng liên quan đến số lượng hơn là chất lượng Gần đây, nhờ sự pháttriển của sinh học phân tử cùng với sự hỗ trợ của marker chọn lọc cho phép pháttriển những qui trình dựa trên kiểu gen (không chịu ảnh hưởng khi điều kiện môitrường biến đổi) hơn là chọn lọc dựa trên kiểu hình như phép chọn lọc truyềnthống vẫn thực hiện Bằng kỹ thuật AFLP (amplified fragment lengthpolymorphism), một phương pháp có hiệu quả để nhân dòng và giải trình tự nhữngmarker liên kết này để xác định đặc điểm của chúng

AFLP nhanh, đơn giản không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát đượctoàn bộ gen Kỹ thuật này đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu, không cần biết trướctrình tự đích và độ lặp lại phản ứng cao, các mồi sử dụng không cần đặc hiệu loài(các mồi thương mại có thể dùng cho hầu hết các loài)

PHẦN NỘI DUNG

A GIỚI THIỆU

I KỸ THUẬT AFLP

1 Khái quát

Về căn bản, bất cứ một chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt giữa hai

cá thể, hai dòng hoặc hai giống khác nhau, đều được xem như là một DNAmarker DNA marker được chia làm bốn nhóm như sau:

- PCR based ( ALP, AFLP, SSR, SSCP, STS)

- DNA- không phải là PCR base như: DNA/DNA hybrybization: RFLPminysatellite RFLP thường có hệ di truyền là Dominant

- Genomic base: Thí dụ SNP dùng để tách các vùng đột biến

- Protein base và proteomic: các marker chia ra 3 kiểu

+ Isozyme là enzyme marker

Trong các marker trên kỹ thuật AFLP thuộc nhóm PCR based được hiểu là sự

đa dạng của các đoạn DNA được nhân lên có định hướng sau khi bị cắt bởi 2enzyme giới hạn, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếchđại PCR AFLP là một trong những kỹ thuật in dấu DNA (DNA fingerprinting)được phát triển bởi Vos và cộng sự năm 1995

Fingerprinting đã và đang được phát triển khá thành công với hai hướng chiếnlược nghiên cứu như sau :

- Fingerprinting trên cơ sở lai, có tính chất kinh điển: Bao gồm kỹ thuật cắtDNA, kỹ thuật điện di, RFLP được phát hiện bởi kỹ thuật lai với probe thông quaxét nghiệm Southern.

- Fingerprinting trên cơ sở PCR: Bao gồm kỹ thuật khuếch đại DNA in vitrobằng primer đặc biệt hay primer ngẫu nhiên

Kỹ thuật AFLP là một công cụ hữu ích để xác nhận nhiều loại của đa hìnhDNA mà không cần phải biết trước thông tin về trình tự DNA của chúng(Michelmore và ctv., 1998), phương pháp này có thể đưa ra nhanh chóng một ướclượng độ đa dạng di truyền trong và giữa những quần thể với nhau (Breyen và ctv.,1997; Cervera và ctv.,1996)

Nghiên cứu đa hình của DNA nhờ AFLP là mô hình mẫu trong nghiên cứu ditruyền Menden, do đó nó có thể được dùng trong việc xây dựng bản đồ gen củacác sinh vật, trong đó có con người để chẩn đoán và chữa trị các bệnh di truyền,cũng như tạo ra ngân hàng gen phục vụ lợi ích cho con người

2 Nguyên tắc

Nguyên tắc của phương pháp AFLP là dựa trên độ đặc hiệu của các enzymcắt giới hạn (restriction enzym – RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA

bộ gen Sự khác biệt vị trí giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau

Kỹ thuật AFLP gồm hai nội dung cơ bản là:

- Cắt DNA bằng enzyme giới hạn có bổ sung các adaptor đặc hiệu tạo nên

các đoạn mút giống nhau, đặc trưng cho các mồi đã chọn trước Cặp enzyme

thường được dùng nhất là EcoRI - MseI Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần

trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme Khi sử dụng chúng chung với nhau, những enzym này sẽ tạo ra những đoạn DNA rất ngắn, chúng được khuếch đại khá tốt, và đạt được kích thước tối hảo (<1Kb) chạy điện di trên gel polyacrylamide Do việc thiết kế primer và kỹ thuật

khuếch đại, người ta thường dùng phối hợp EcoRI - MseI hơn là phối hợp EcoRI - EcoRI hoặc MseI - MseI.

- Khuếch đại đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR ngắt quãng với hai loại mồi

khác nhau Mồi của phản ứng PCR được thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới được khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR

và làm đơn giản quá trình phân tích Phương pháp này tạo ra một lượng lớn các band trong điện di, làm cho việc phát hiện thể đa hình thuận lợi hơn rất nhiều Số đoạn phân tử DNA khuếch đại có thể được kiểm soát bằng cách chọn lọc base khác nhau và thành phần nucleotide trong adaptor

3 Ưu điểm và nhược điểm

* Ưu điểm

- Xây dựng bản đồ di truyền có mật độ cao của genome

- AFLP không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gen.

- Có tính lặp lại cao hơn RAPD và chỉ cần sử dụng một lượng nhỏ DNA ban đầu(2.5pg-25ng)

- Khuếch đại có chọn lọc một lượng lớn các đoạn DNA đa hình (polymorphism)trong một phản ứng PCR, phù hợp cho việc phân tích đa dạng giữa các quần thể cóquan hệ gần nhau

- Không cần biết trước trình tự DNA của gen cần nghiên cứu, không cần sử dụngnhiều loại primer

- Là kỹ thuật in dấu DNA còn khá mới lạ nhưng rất hiệu quả, có thể in dấu DNAcủa bất kỳ nguồn gốc phức tạp nào từ sinh vật sơ hạch, thực vật, động vật đến conngười

*Nhược điểm

- Tuy nhiên AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp.

- Qui trình dài, phức tạp, tốn nhiều thời gian thực hiện

- Lệ thuộc nhiều vào thao tác ở những bước đầu để có được phổ diện các phânđoạn DNA lý tưởng

II ENZYME CẮT GIỚI HẠN (RE)

1 Khái quát:

Trong phân tích genome, enzyme có nhiệm vụ cực kỳ quan trọng là nhómrestriction endonuclease (enzyme nội sinh, phân cắt giới hạn) Đó là nhóm củaDnase, ghi nhận các chuỗi trình tự đặc biệt của các nucleotide và cắt DNA tại vị tríđặc biệt Người ta xem nó như chìa khóa để nghiên cứu kỹ thuật “recombinantDNA”

Enzyme giới hạn được Werner Arber tìm thấy ở vi khuẩn vào năm 1962.Ông cho rằng các RE có khả năng rất đặc biệt đó là khả năng nhận biết DNA chủ

và DNA lạ Enzyme này hạn chế sự nhân lên của DNA lạ khi chúng xâm nhập vào

tế bào vi khuẩn bằng cách cắt chúng ra thành từng đoạn một cách đặc hiệu, vì thếông gọi là restriction có nghĩa là hạn chế Với phát minh này ông cùng các cộng sự(Daniel Nathans và Hamilton O Smith) đã giành giải thưởng Nobel vào năm1978

Các RE hợp thành hệ thống bảo vệ ở tế bào sơ hạch (procaryote), một câuhỏi đặt ra là vì sao các RE chỉ cắt DNA của các phage mà không cắt DNA của tếbào vi khuẩn? Câu trả lời là nhờ Methylase đây là enzyme giúp vi khuẩn có khảnăng này, chính enzyme này chịu trách nhiệm gắn nhóm metyl (CH3) vào cácnucleotides ở vị trí cắt của các RE trên DNA của vi khuẩn vì thế bảo vệ DNA của

vi khuẩn khỏi sự phân cắt của RE Tuy vậy đôi lúc methylase lại gắn nhằm cảnhóm metyl vào chính DNA của phage, điều này giải thích vì sao đối với các dòng

vi khuẩn kháng phage vẫn có các tế bào bị phân hủy

Enzyme ngoài chức năng phân cắt, nó còn có chức năng kết nối các phân tửDNA lại với nhau.

2 Tên gọi của enzyme cắt giới hạn

Chữ đầu viết hoa là chữ đầu tên vi khuẩn từ đó RE được ly trích Hai chữ

kế không viết hoa tương đương với tên loài của vi khuẩn Cả 3 chữ nầy đều viết innghiêng Kế đến là chữ số la mã chỉ thứ tự RE được phát hiện trong trường hợpnhiều RE được tìm thấy trong cùng một vi khuẩn

Đôi khi còn có thêm chữ viết hoa (viết thẳng) để chỉ chủng vi khuẩn sửdụng

EcoRI: là enzym đầu tiên tìm thấy trên vi khuẩn E coli

EcoRV: enzym thứ 5 tìm thấy trên vi khuẩn E.coli

3 Các loại enzyme cắt giới hạn

Loại I: khi enzym nhận biết trình tự nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA

cách đó 1000-5000 nu và giải phóng độ vài chục nu

Loại II: enzym nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đó.

Loại III: enzym nhận biết trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó 20 nu.

Enzyme cắt giới hạn đầu tiên được phân lập vào năm 1968, cho đến nay cókhoảng 3.400 RE được khám phá Trong số này có khoảng 540 RE đã đượcthương mại hóa

Adapter Oligonucleoside sequence

Pst I adapter sequence 1 (96)

Pst I adapter sequence 2(97)

MseI adapter sequence 1 (A 18)

MseI adapter sequence 1 (A 19)

5’ CTCGTAGACTGCGTACACATGCA-3’

3’ CATCTGACGCATGT’ -5’

5’ GACGATGAGTCCTGAG – 3’

3’ TACTCAGGAGCTGAG- 5’

Primer / trước khi khuếch đại:

Chuỗi mã của adapter và primer dùng trong phân tích AFLP

III KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction)

1 Khái quát

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction (Phản ứngchuỗi trùng hợp - phản ứng khuếch đại gen) Đây là kỹ thuật của sinh học phân tửcho phép nhân bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen DNA của cơ thể sinh vậtthành nhiều bản sao, kỹ thuật này được nhà khoa học người Mỹ - Kary Mullis vàcộng sự phát minh năm 1985 tại công ty Cetus; mặc dù nguyên tắc này đã được

mô tả chi tiết trước đó một thập niên bởi Khorana và ctv., (Kleppe và ctv., 1971; Panet và ctv., 1974), và được giới thiệu lần đầu tiên tại Hội thảo lần thứ 51 ở Cold

Spring Harbor vào năm 1986 và ông đã nhận được giải thưởng Nobel Hoá sinhhọc vào năm 1993 Kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứusinh học trên toàn thế giới

ty thể và lạp thể (ở thực vật) cũng chứa DNA ở dạng plasmid

Các phân tử DNA ở những tế bào hoạt động bình thường chỉ được nhân lêntrong quá trình phân bào nguyên nhiễm Để thực hiện được quá trình này, đòi hỏiphải có mặt enzyme DNA polymerase, sự tham gia của các đoạn mồi có trình tự

bổ sung gắn vào vào sợi DNA khuôn và các dNTPs làm nguồn cung cấp nucleotit.Trong quá trình phân bào nguyên nhiễm, các sợi DNA kép được mở xuắn táchthành các sợi DNA sợi đơn Dưới tác dụng của enzyme DNA polymerase, quátrình tổng hợp DNA được xảy ra theo cách gắn lần lượt các nucleotit vào đoạn mồi

để kéo dài chuỗi theo nguyên tắc bổ sung với DNA khuôn

Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơbản của sao chép DNA trong cơ thể nhưng có sự khác biệt:

+ Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzyme helicase

+ Kết hợp với enzyme DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp DNA mới trongmôi trường thích hợp

+ Hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chuyên biệt,chủ động

3 Các giai đoạn phản ứng PCR

Có 3 giai đoạn chính trong phản ứng PCR và chúng được lặp đi lặp lạinhiều lần (chu kỳ) (thường từ 25 đến 75 chu kỳ)

* Giai đoạn biến tính (denaturation): tách chuỗi DNA từ sợi đôi tách thành

2 sợi đơn Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA ra Bước này gọi là biếntính, nhiệt độ tăng lên sẽ phá vỡ cầu nối hydrogen của chuỗi DNA Trước chu kỳ

1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA vàmồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn Thời gian ở giai đoạn nàykhoảng : 1-2 phút

* Giai đoạn bắt cặp (annealing): gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ

sung Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ xuống để mồi có thể gắn vàosợi DNA đơn Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơnnhiệt độ biến tính khoảng 45-60°C Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫnđến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện.Thời gian bắt cặp từ 1-2phút

* Giai đoạn kéo dài (extension): tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi

DNA gốc DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống Nó bắt đầu bám vào và hoạtđộng dọc theo sợi DNA Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase Thời giancủa bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh DNA cầnkhuếch đại Như một quy tắc 1000bp/ 1 phút

Các đoạn DNA mới được hình thành lại được sử làm khuôn để tổng hợp chocác chu kỳ tiếp theo

Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ, tínhtheo lý thuyết số lượng bản sao là 2n

Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNAriêng biệt Ðây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự

có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao

Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao củaDNA polymerase được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống trongcác suối nước nóng) Phần lớn các DNA polymerase chỉ làm việc ở nhiệt độ thấp.Nhưng ở nhiệt độ thấp, DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerase không có nhiềukhả năng làm biến tính phần lớn các phần của phân tử Nhưng các polymerasechịu nhiệt này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên đến 1000C Ở nhiệt độ nàyDNA sẽ bị biến tính (DNA dạng xoắn sẽ duỗi ra và ở dạng thẳng).

Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳgồm ba giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp, giai đoạn kéo dài

B PHƯƠNG PHÁP KỸ THUẬT AFLP

Kỹ thuật AFLP gồm các bước sau:

-Phân lập DNA

-Cắt bằng enzyme cắt giới hạn và nối bằng adapter

-Tiền khuếch đại

-Khuếch đại

-Chạy điện di và phân tích kết quả

Sơ đồ chung của kỹ thuật AFLP

I PHÂN LẬP DNA

Thành tế bào bị phá vỡ bằng biện pháp cơ học và các chất tẩy mạnh DNAđược giải phóng và làm sạch tạp chất Rnase DNA được kết tủa trong Ethanol100% và thu lại nhờ ly tâm

Trước hết chúng ta phải chuẩn bị chất thăm dò của marker và bộ lọc DNAlai Đó là giai đoạn có tính quyết định trong phân tích AFLP Ví dụ chúng ta cần

có DNA từ mô lúa với số lượng nhiều và chất lượng tốt Trong quá trình phân lậpDNA, người Ta phải lấy mô lúa từ trong nhà kính hoặc trên đồng ruộng, mô nàyđược nghiền bằng cối trong Nitơ lỏng Chất đệm khi li trích DNA có chứa SDS,

chất này có thể phân giải màng tế bào và màng nhân, phóng thích DNA vào dungdịch, SDS là một chất tẩy khá mạnh, nó có thể biến đổi protein ở nhiệt độ 650C Sựbiến đổi này làm cho các DNA gắn với protein tích rời với DNA cần nghiên cứu.Protein và chất cặn bã của tế bào được tách khỏi DNA bằng phenol/Chlorophom.DNA ở pha lỏng sẽ dược kết tủa bằng cách tiêm Isopropanol.

Phân lập DNA bằng phương pháp nói trên chỉ áp dụng với DNA có kíchthước lớn hơn 30 kb có một ít tạp chất như polysachcaric Chúng sẽ gây khó khănkhi chạy điện di trên gel, do đó chúng ta phải hết sức thận trọng trong phân lậpDNA

DNA được phân lập có thể được tồn trữ ở âm 200C Nhưng chúng ta phảilưu ý rằng, một chút thay đổi nhỏ nào trong quá trình đông lạnh cũng có thể làmthay đổi DNA, tránh đông lạnh nhiều lần hoặc làm tan băng nhiều lần DNA

Trong quá trình phân lập người ta phải sử dụng nhiều dung môi Có haidung môi rất quan trọng là EDTA và Tris

Tris( trisma, base) đã được sử dụng với khả năng đệm rất có hiệu quả trongdung môi Ở ph=8 DNA rất ổn dịnh Trong môi trường axít, purine rất dễ bị phânhủy cầu nối phosphodieste dễ bị phá vỡ tạo ra kết quả purine hóa Do đó người taphải kiểm soát pH của dung môi ở mức 8.0 khi dùng Tris

DNA có thể bị hỏng bởi các enzyme làm cho mẫu DNA bị tạp Chỉ cần chấtgây tạp ở thể vệt cũng đủ để gây cho DNA bị hỏng, do vậy chúng ta phải rất cẩntrọng Để ngăn ngừa DNA bị phân hủy bởi enzyme, người ta phải sử dụng thêmEDTA EDTA có thể kiềm giữ Mg2+ và làm bất hoạt nó trong dung môi Không có

Mg2+, enzyme không thể hoạt động

II.CẮT BẰNG ENZYME VÀ NỐI DNA BẰNG ADAPTER

* Một số quy tắc khi thực hiện phản ứng cắt bằng RE