chỉ thị phân tử AFLP

Kỹ thuật dựa trên cơ sở PCR Đa hình độ dài các đoạn khuyếch đại Amplified fragment length polymorphisms (AFLPs) Để mô tả sự hiện diện của các độc tố alpha, beta, epsilon, iota bằng PCR của các chủng C. perfringens Phân tích sự da dạng di truyền của các chủng C. perfringens thông qua AFLP

Đa hình độ dài đoạn khuyếch đại Amplified fragment length polymorphisms (AFLPs) LOGO Kỹ thuật dựa sở PCR www.trungtamtinhoc.edu.vn Ứng dụng Đánh giá đa dạng di truyền Phân tích độ dài di truyền Kiểm tra dấu hiệu di truyền Company Logo www.trungtamtinhoc.edu.vn Phân tích sưu tập nguồn gene Xây dựng đồ gene Quản lí thị thăm dò Example Clostridium perfringens www.trungtamtinhoc.edu.vn Introduction Clostridium perfringens trực khuẩn yếm khí Là tác nhân gây bệnh đường tiêu hóa vật nuôi Có khả sinh 14 loại độc tố loại độc tố là: alpha, beta, epsilon iota www.trungtamtinhoc.edu.vn Title Use of single-enzyme amplified fragment length polymorphism for typing Clostridium perfringens isolated from diarrheic piglets Để mô tả diện độc tố alpha, beta, epsilon, iota PCR chủng C perfringens Phân tích da dạng di truyền chủng C perfringens thông qua AFLP www.trungtamtinhoc.edu.vn Vật liệu phương pháp Bacterial strains: Dạng sinh học A, Dạng sinh học B, Dạng sinh học C, Dạng sinh học D Tách chiết DNA Phản ứng phát gen độc độc tố: tố: Các phản ứng thực 25 gel chứa:     5,0 ml mẫu DNA 1,5 mM MgCl2 200 mM dNTP, 250 pmol mồi oligonucleotide 1,25 U Taq DNA polymerase Phản ứng 95ºC phút, 55ºC phút, 72ºC phút Thực 35 chu kì www.trungtamtinhoc.edu.vn Cắt Enzyme hạn chế, gắn adapter Cắt hạn chế: Ủ 10 mg DNA 16 37ºC với 24 unit Hind III đệm nước cất (tổng thể tích 20 ml) Gắn adapter:   ml DNA; 0,2 mg oligonucleotide adapter ADH1-5' ACGGTATGCGACAG 3' ADH2- 3'GAGTGCCATACGCTGTCTCGA 5‘    1U T4 DNA ligase, đệm ligase, nước (tổng thể tích 20 ml) Ủ nhiệt độ phòng h Ligase DNA đun nóng đến 80ºC 10 phút, pha loãng 1/5 nước cất vô trùng, ml sử dụng cho phản ứng www.trungtamtinhoc.edu.vn     PCR ml DNA ligase 2.5 mM MgCl2 300 ng HIG- 5'GGTATGCGACAGAGCTTG 3‘ 1,25 U Taq DNA polymerase Tổng thể tích 50ml Các sản phẩm khuếch đại phân tích gel agarose 2,0%, nhuộm với ethidium bromide (0,5 mg / ml), quan sát transilumination UV, chụp ảnh Phân tích thống kê Phân tích mô hình dải thực với phần mềm NTSYS (Numerical phân loại hệ thống phân tích đa biến) với hệ số Jaccard www.trungtamtinhoc.edu.vn Kết   Mỗi chủng có chứa từ đến 12 mảnh vỡ DNA (band) khoảng 380-2,072 bp Chủng tìm thấy khác liên quan đến diện hay vắng mặt band, chiều dài band khoảng 1.050 1.450 bp www.trungtamtinhoc.edu.vn Thảo luận  Phát gen mã hóa độc tố C perfringens phương pháp PCR thực số tác giả, không cần sử dụng động vật phòng thí nghiệm không phụ thuộc vào hình thành bào tử ống nghiệm thể  Typing công cụ dịch tễ học quan trọng việc công nhận ổ dịch, phát ô nhiễm chéo xác định nguồn lây nhiễm, nhận dạng chủng độc lực cao giám sát chương trình tiêm chủng www.trungtamtinhoc.edu.vn www.trungtamtinhoc.edu.vn Phương pháp  www.trungtamtinhoc.edu.vn Từ nguồn nguyên liệu DNA li trích sẵn, DNA kiểm tra độ tinh nồng độ phương pháp điện di gel agarose 1,4% quang phổ kế EcoRI Cắt thử DNA chạy kt gel 1,5% Enzyme cắt hạn chế Msel Ủ 2h, 37 C làm bất hoạt enzyme 70 C khoảng 15’ 3X buffer T4 ligase Kiểm tra DNA www.trungtamtinhoc.edu.vn 0,0025M NaCl 0,0625X buffer T4 0,005mg BSA Chuẩn bị hỗn hợp enmzy Enzyme MseI T4 ligase Enzyme EcoRI www.trungtamtinhoc.edu.vn Phản ứng cắt gắn adaptor g un d i Nộ 01 1X buffer T4 ligase có ATP; 0,05M NaCl; 0,05mg BSA; 1µl adaptor MseI; 1µl adaptor EcoRI; 2µl hỗn hợp enzyme (chuẩn bị trên); 600ng DNA mẫu i Nộ i Nộ d g un 02 Ủ ở 37 C d g un 03 Pha loãng phản ứng cắt gắn TE 1X để thể tích 200µl www.trungtamtinhoc.edu.vn Nhân tiền chọn lọc 01 4µl sản phẩm phản ứng cắt gắn pha loãng www.trungtamtinhoc.edu.vn 02 1µl primer nhân tiền chọn lọc 03 15µl hỗn hợp core mix AFLP Hỗn hợp phản ứng khuếch đại Biến tính 94 C 30s Hồi tính 56 C 30s PCR Kéo dài 72+0 C 1’ Ủ 60 C 30’ giữ lạnh C www.trungtamtinhoc.edu.vn Nhân chọn lọc 3µl sản phẩm nhân tiền chọn lọc pha loãng www.trungtamtinhoc.edu.vn 5µM primer MseI-CNN 1µM primer EcoRI-ANN 15µl hỗn hợp chất phát huỳnh quang core mix AFLP Xử lí liệu  Phần mềm MSTATC sử dụng để tuyển chọn tổ hợp primer chọn lọc (Primer cho kết  khuếch đại cao) Kích thước sản phẩm khuếch đại thu sau điện di máy giải trình tự gen mã hóa thành dạng nhị phân  Khi có sản phẩm khuếch đại mã hóa thành sản phẩm khuếch đại mã hóa thành www.trungtamtinhoc.edu.vn Phân tích  Với 64 tổ hợp primer nhân chọn lọc mẫu PG5, PG6, TU9 TU20 Kết khuếch đại chọn lọc trình bày qua bảng www.trungtamtinhoc.edu.vn www.trungtamtinhoc.edu.vn www.trungtamtinhoc.edu.vn www.trungtamtinhoc.edu.vn Kết  Hình vẽ cho thấy hệ số đồng dạng di truyền 26 mẫu điều phân tích biến thiên từ 0,69 đến 0,92 => Như vậy, mẫu phân tích có quan hệ di truyền gần www.trungtamtinhoc.edu.vn Thank You ! www.trungtamtinhoc.edu.vn [...]... core mix AFLP Hỗn hợp phản ứng này được khuếch đại 0 Biến tính ở 94 C trong 30s 0 Hồi tính ở 56 C trong 30s PCR Kéo dài ở 72+0 C trong 1’ 0 Ủ ở 60 C trong 30’ và giữ lạnh ở 0 4 C www.trungtamtinhoc.edu.vn Nhân bản chọn lọc 1 3µl sản phẩm nhân bản tiền chọn lọc đã pha loãng 3 www.trungtamtinhoc.edu.vn 2 5µM primer MseI-CNN 4 1µM primer EcoRI-ANN 15µl hỗn hợp chất phát huỳnh quang core mix AFLP Xử lí... khuếch đại cao) Kích thước của các sản phẩm khuếch đại thu được sau khi điện di bằng máy giải trình tự gen được mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1  Khi có sản phẩm khuếch đại thì mã hóa thành 1 và không có sản phẩm khuếch đại thì mã hóa thành 0 www.trungtamtinhoc.edu.vn Phân tích  Với 64 tổ hợp primer nhân bản chọn lọc trên 4 mẫu PG5, PG6, TU9 và TU20 Kết quả khuếch đại chọn lọc được trình bày qua bảng... www.trungtamtinhoc.edu.vn www.trungtamtinhoc.edu.vn www.trungtamtinhoc.edu.vn www.trungtamtinhoc.edu.vn Kết quả  Hình vẽ cho thấy hệ số đồng dạng di truyền của 26 mẫu điều phân tích biến thiên từ 0,69 đến 0,92 => Như vậy, các mẫu phân tích có quan hệ di truyền khá gần nhau www.trungtamtinhoc.edu.vn Thank You ! www.trungtamtinhoc.edu.vn ... đại phân tích gel agarose 2,0%, nhuộm với ethidium bromide (0,5 mg / ml), quan sát transilumination UV, chụp ảnh Phân tích thống kê Phân tích mô hình dải thực với phần mềm NTSYS (Numerical phân. .. giá đa dạng di truyền Phân tích độ dài di truyền Kiểm tra dấu hiệu di truyền Company Logo www.trungtamtinhoc.edu.vn Phân tích sưu tập nguồn gene Xây dựng đồ gene Quản lí thị thăm dò Example Clostridium... tả diện độc tố alpha, beta, epsilon, iota PCR chủng C perfringens Phân tích da dạng di truyền chủng C perfringens thông qua AFLP www.trungtamtinhoc.edu.vn Vật liệu phương pháp Bacterial strains: