Nghiên cứu nấm Bipolaris oryzae hại hạt giống lúa thu thập tại một số tỉnh phía Bắc và ven biển miền Trung Việt Nam

PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Không dễ để nhận thấy nấm Bipolaris oryzae (B oryzae) gây hại hạt giống hay lây nhiễm làm giảm sản lượng trồng đồng ruộng, nhiên nhận thấy nấm bệnh phá hủy biểu mô hạt, làm giảm sức sống mầm (Neergaard, 1966) B oryzae nấm gây hại hạt giống lúa tiêu biểu tồn bên hạt nhiều năm, nấm gây chết mầm gây vết bệnh mầm (Ou, 1985) B oryzae tồn lúa tất giai đoạn phát triển, gây hại mầm, phiến lá, bẹ lá, cổ bông, phôi hạt Trên mạ nhiễm B oryzae gây triệu chứng thối vịng quanh mầm làm biến dạng sơ cấp thứ cấp B oryzae xâm nhập vào hạt qua lớp vỏ hạt, nguyên nhân gây “pecky rice” thuật ngữ hạt bị đốm biến màu (Webster and Gunnel, 1992) Nấm B oryzae không ý nhiều thời gian gần không gây thiệt hại nặng suất kinh tế, B oryzae không gây thành dịch hại số loài nấm khác, nhiên B oryzae coi nấm gây bệnh lúa nông dân nghèo vùng đất bị khô hạn đất nghèo dinh dưỡng (Zadoks, 2002) Theo kết khảo nghiệm kiểm nghiệm giống trồng hàng năm từ năm 1998 đến 2008 Trung tâm khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm trồng Quốc gia, Trung tâm nghiên cứu mẫu hạt giống không đạt tiêu chất lượng nảy mầm theo quy chuẩn kỹ thuật Việt Nam phòng Bệnh hạt giống Kết nghiên cứu cho thấy số loại nấm xuất hiện, B oryzae lồi nấm tìm thấy toàn mẫu hạt giống với tỷ lệ tương đối cao nguyên nhân gây tỷ lệ nảy mầm thấp, hạt bị chết, mầm khơng bình thường mầm khơng bình thường Các nghiên cứu Trường Đại học Cần Thơ, Viện Lúa đồng sông Cửu Long cho B oryzae có ảnh hưởng tới tỷ lệ nảy mầm hạt giống lúa giai đoạn mạ đồng ruộng tỉnh phía Nam Các nghiên cứu cho thấy nấm B oryzae không gây thiệt hại suất gây thiệt hại số lượng chất lượng hạt giống Sản xuất lúa Việt Nam thường hai hình thức gieo mạ sau cấy chuyển ruộng gieo sạ trực tiếp đồng ruộng Cả hai phương pháp có khả bị ảnh hưởng hạt giống bị nhiễm B oryzae gây ra, lượng hạt giống sử dụng phải tăng lên để bù vào tỷ lệ hạt bị B oryzae gây hại Đối với gieo mạ để cấy, tình trạng thiếu mạ xảy hạt giống bị chết B oryzae Đối với phương pháp gieo sạ, B oryzae gây khoảng dẫn tới tăng cơng lao động cấy dặm bị giảm suất không bù khoảng Nếu sử dụng giống lúa cấy vụ năm, giống có thời gian ngủ nghỉ dài, giống cổ truyền phải để qua vụ, giống dự trữ Quốc gia với mục đích khác nhau, B oryzae ngun nhân tác động dẫn tới giảm sức sống mầm Với diện tích trồng lúa khoảng triệu Việt Nam, hạn chế khả gây hại nấm B oryzae tiết kiệm lượng lớn hạt giống lúa Hạt giống lúa chất lượng tốt hạt giống ưu điểm vượt trội suất hay chất lượng phải đáp ứng yêu cầu đặt độ ẩm, độ sạch, hạt khác giống tỷ lệ nảy mầm Để đảm bảo tỷ lệ nảy mầm cao lơ hạt giống lúa phải loại bỏ yếu tố gây bệnh hạt lép lửng chứa nguồn bệnh thân hạt giống không mang nguồn bệnh Tuy bệnh hạt giống lúa chưa coi yếu tố quan trọng trình sản xuất hạt giống Việt Nam, chưa có tiêu chuẩn cụ thể tỷ lệ hạt nhiễm nấm lô hạt giống đạt yêu cầu làm giống phép lưu thông thị trường Việc trao đổi mua bán hạt giống diễn thường xuyên dễ dàng việc quản lý bệnh hạt giống chưa quan tâm đặc biệt với nấm B oryzae lan truyền qua hạt giống Để có thơng tin đầy đủ tồn diện, thơng tin thực luận án sở liệu để nghiên cứu ứng dụng để tạo hệ thống sản xuất hạt giống lúa bệnh toàn vùng trồng lúa Việt Nam 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích - Nghiên cứu xác định khả xâm nhiễm, gây hại nấm B oryzae hạt giống lúa giải pháp phịng chống bệnh tỉnh phía Bắc ven biển miền Trung Việt Nam 1.2.2 Yêu cầu - Có thơng tin gây hại B oryzae đồng ruộng, tỷ lệ hạt bị nhiễm nấm hạt giống lúa tỉnh miền Bắc ven biển miền Trung - Xác định trình xâm nhiễm B oryzae vào hạt giống ảnh hưởng nấm tới khả nảy mầm hạt giống - Xác định số đặc điểm sinh học, đặc điểm gây hại hạt đa dạng di truyền nấm B oryzae - Xác định biện pháp, chế biến bảo quản hạt giống lúa biện pháp xử lý hạt giống lúa để phòng trừ nấm B oryzae 1.3 Những đóng góp đề tài - Bổ sung số liệu mức độ gây hại nấm B oryzae đồng ruộng hạt giống lúa sản xuất Việt Nam - Bổ sung đặc điểm sinh học đặc điểm vùng gen ITS nguồn nấm thu thập từ vùng sinh thái từ giống lúa khác - Bổ sung thông tin vị trí nấm B oryzae cấu giống canh tác từ tìm phương pháp hạn chế tỷ lệ hạt giống lúa bị nhiễm B oryzae hạn chế gây hại nấm B oryzae lúa 1.4 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học - Kết nghiên cứu nấm B oryzae gây hại hạt giống lúa sản xuất Việt Nam bổ sung liệu khoa học nấm B oryzae hại lúa - Các kết thu đề tài sở để xây dựng tiêu chuẩn hạt giống tỷ lệ hạt nhiễm nấm phép lúa xây dựng quy trình sản xuất hạt lúa giống có chất lượng cao 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Đề tài bổ sung nghiên cứu nấm B oryzae, sở để xây dựng hệ thống quản lý hạt giống lúa cấp giống nhằm cung cấp nguồn giống lúa bệnh cho sản xuất từ quản lý trình lan truyền gây hại B oryzae 1.5 Đối tượng phạm vi nghiên cứu đề tài 1.5.1 Đối tượng nghiên cứu Hạt giống lúa sử dụng phổ biến sản xuất nguồn nấm B oryzae gây hại hạt giống lúa thu thập tỉnh phía Bắc ven biển miền Trung Việt Nam 1.5.2 Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu mức độ phổ biến, mức độ gây hại, khả lan truyền, khả tồn hạt giống lúa, đặc điểm sinh học, đặc điểm nuôi cấy, đa dạng di truyền nấm B oryzae nghiên cứu số biện pháp xử lý hạt giống để phòng trừ bệnh PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Những nghiên cứu nước 2.1.1 Tên gọi vị trí phân loại nấm B.oryzae Nấm gây bệnh Bipolaris oryzae (Brede de Haan) Shoemaker, trước gọi Helminthosporium oryzae Brede de Haan Drechslera oryzae (Brede de Haan), giai đoạn hữu tính gọi Cochliobolus miyabeanus (Ito and Kurib) thuộc Pyrenomycetales, lớp nấm túi Ascomycetes (Ou, 1985) Nấm có phân loại Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Dothideomycetes, Pleosporomycetidae, Pleosporales, Pleosporaceae, Bipolaris (Shoemaker, 1959) 2.1.2 Hình thái học nấm B.oryzae Theo Ou (1985), Brede người mơ tả hồn chỉnh nấm B oryzae Sợi nấm bào tử có từ 1đến 14 nhân Trên mơi trường ni cấy, nấm có màu trắng xốp xám nâu đen Bào tử hữu tính gặp, thường gặp cuối giai đoạn sinh trưởng phát triển cây, có hình sợi dài, có từ đến 15 ngăn, nằm thể có màu vàng nhạt tìm thấy rơm rạ 2.1.3 Đặc điểm phát sinh phát triển nấm B.oryzae Sau mùa thu hoạch, nấm tồn tàn dư bệnh, rơm rạ, hạt giống ký chủ dại cỏ mầm, điều kiện khơ bào tử tồn năm sợi nấm năm (Vũ Triệu Mân Lê Lương Tề, 2001) Theo Ou (1985), sợi nấm nằm mô bệnh năm, với điều kiện thường bào tử tồn đất tháng nhiệt độ 350C Nấm phát triển thích hợp 27- 30°C, bào tử nảy mầm tốt từ 25 30°C, phát triển điều kiện nhiệt độ từ 10 -410C với độ ẩm khơng khí 60 -100% Bào tử chết nhiệt độ từ 50 -510C sợi nấm chết ở nhiệt độ từ 48 -500C 10 phút pH thích hợp cho nấm phát triển từ 6,6 -7,4, pH thích hợp cho bào tử nảy mầm từ 2,6 -10,9 Bào tử sinh pH từ - 10, môi trường vượt 0,5% sucrose 0,1% pepton phát triển tản nấm sinh sản bào tử bị hạn chế (Shoemaker, 1959) Bào tử nấm B.oryzae có kiểu nảy mầm là: nảy mầm đầu bào tử, nảy mầm tế bào bào tử nảy mầm đầu bào tử Tỷ lệ kiểu nảy mầm phụ thuộc vào loại môi trường nuôi cấy, nhiệt độ nuôi cấy, loại ánh sáng thời gian chiếu sáng q trình ni cấy (Dela, 2006) Khơng tìm thấy liên quan vùng địa lý với đa dạng cấu trúc gen hay bệnh lý khả gây bệnh nấm (Kamal and Mia, 2009) Nghiên cứu biến đổi gen độc tính nấm, 352 isolate thu thập 11 địa phương Philippin thống kê mặt đa dạng sinh học Kết cho thấy có đa dạng sinh học, địa điểm có hai loại gen cổ điển vơ tính (Burgos, 2013) 2.1.4 Độc tố hình thành bào tử nấm B.oryzae Misra et al (1962) tìm khác biệt tính độc hình thành bào tử hai ioslate phân lập Matuo (1948) cho bào tử từ lúa mọc dung dịch có hay khơng có kali độc tính cao Hình thành bào tử địi hỏi phải có hai giai đoạn tối sáng, ánh sáng xanh ức chế hình thành bào tử (Honda and Sakamoto, 1969) B oryzae tiết hai loại độc tố Cochliobolin gây độc cho mạ, hạn chế phát triển rễ lúa nồng độ 30ppm; Ophiobolin gây độc cho rễ diệp lục, gây héo úa nồng độ 2-5ppm Các độc tố bị oxychlorua đồng làm bất hoạt Nếu bệnh phát triển mơi trường hay khơng có kali, độc tính gây bệnh gia tăng Từ bào tử hay ni cấy từ tế bào ngọn, tạo nên dịng có độc tính khác (Shoemaker, 1959) 2.1.5 Cơ chế lây nhiễm nấm B.oryzae lên hạt giống Theo Nome et al (2012), có trường hợp xảy ra: - Nhiễm bệnh toàn hạt giống: nấm xâm nhiễm phần hạt giống hệ thống mạch dẫn trực tiếp vết thương tự nhiên nhân tạo Nấm lây nhiễm thông qua giai đoạn nở hoa tạo hạt, bào tử số loại nấm nảy mầm sợi nấm phát triển đến phơi nơi chúng tồn sợi nấm tiềm sinh không hoạt động hạt nảy mầm Khi hạt nảy mầm, điều kiện cho nấm phát triển xuất - Mang nguồn bệnh thụ động: mầm bệnh dính vào hạt giống thu hoạch sau thu hoạch bao gồm u sưng, hạch nấm… phận hạt đất có mang mầm bệnh tác nhân gây bệnh làm hạt giống nhiễm bệnh thứ cấp thông qua cọ sát trình sản xuất hạt giống thu hoạch, chế biến đóng gói Bằng biện pháp kỹ thuật Schroeder (1966) chứng minh sợi nấm Drechslera oryzae nằm nội nhũ, sợi nấm phát triển dọc theo vách tế bào Các phần bị nhiễm bệnh hạt: vỏ trấu, vỏ cám phôi hạt lúa 2.1.6 Biện pháp phòng trừ nấm B.oryzae Theo Ou (1985), biện pháp phòng trừ tốt sử dụng giống chống chịu bệnh sử dụng hạt giống bệnh Xử lý hạt giống phương pháp vật lý, hóa học, sinh học để bảo vệ khơng nhiễm bệnh từ hạt giống truyền sang, qua làm giảm khả phát sinh dịch bệnh trồng Xử lý hạt giống để tăng tỷ lệ nảy mầm, giảm khả truyền bệnh sang con, trồng không bị gây hại bệnh truyền qua hạt giống, để bảo vệ hạt nảy mầm khỏi công nấm 2.2 Những nghiên cứu nước 2.2.1 Đặc điểm nấm B.oryzae Bệnh đốm nâu (tiêm lửa) nghiên cứu từ năm 60, 70 Theo Vũ Triệu Mân Lê Lương Tề (2001), bệnh tiêm lửa nấm B oryzae gây hại chủ yếu lúa xấu, thiếu dinh dưỡng giai đoạn sinh trưởng mà khủng hoảng dinh dưỡng phận già hay thiếu dinh dưỡng, thời kỳ cuối mạ lúa bị hạn, già, giai đoạn cuối mạ chuẩn bị nhổ cấy, già sau đẻ nhánh, vỏ hạt bơng lúa non lúc trỗ địng non khiến lúa bị lép Mức độ thâm canh cao bệnh gây hại, giống lúa dài ngày dễ bị bệnh có nhiều giai đoạn sinh trưởng thiếu dinh dưỡng Bệnh gây tác hại mức độ nhẹ, bệnh nặng, vết bệnh nhiều làm bị úa vàng khơ héo 2.2.2 Tình hình nấm B.oryzae gây hại hạt giống Theo Trung tâm khảo kiểm nghiệm giống, sản phẩm trồng Quốc gia, nghiên cứu từ năm 1998 đến năm 2008 mẫu hạt giống thu thập tỉnh miền Bắc miền Trung, nấm B oryzae tìm thấy số giống có chất lượng gạo ngon Tám, Hương thơm số 1, IR353-66 Tỷ lệ hạt nhiễm bệnh cao 80%, mẫu hạt giống có tỷ lệ hạt nhiễm nấm B oryzae có tỷ lệ mầm bất bình thường cao, tỷ lệ nảy mầm thấp Một số dòng bố mẹ lúa lai tạo giống lúa lai chất lượng bị nhiễm bệnh với tỷ lệ 60% 2.2.3 Khả truyền bệnh nấm B.oryzae hạt B oryzae nấm bệnh truyền qua hạt giống, tất phần hạt tìm thấy bào tử nấm Phôi, nội nhũ, mày hạt, vỏ trấu trên, vỏ trấu dưới, lớp vỏ cám bị nấm bệnh công gây hại Nấm nằm bên hạt sát bề mặt hạt lớp vỏ hạt (Somsiri and Vu Van Ba, 2005) 2.2.4 Khả gây hại nấm B.oryzae mầm Nấm bệnh truyền qua mạ biểu triệu chứng thành chín kiểu khác nhau, mạ trở thành mầm khơng bình thường khơng tính vào tỷ lệ nảy mầm, có nghĩa tỷ lệ nảy mầm chung lô hạt giống bị giảm tỷ lệ mang triệu chứng bệnh: Cây mầm khơng có rễ; Khơng có rễ bị thối thân mầm; Rễ ngắn; Thối thân mầm; Thối mầm thối rễ; Rễ sơ cấp bị biến màu nâu, khơng phân nhánh khơng có rễ sơ cấp; Mầm còi cọc vặn xoắn; Mầm nhỏ, yếu, úng nước; Rễ sơ cấp nhỏ yếu (Huỳnh Văn Nghiệp Ashok, 2004) 2.2.5 Biện pháp phòng trừ nấm B.oryzae Theo Phạm Văn Dư cs (2011), bệnh lem lép có nấm B oryzae chiếm tỷ lệ 4,9% Các giống lúa cải tiến có tỷ lệ bệnh cao giống lúa địa phương Sử dụng phương pháp lựa chọn hạt giống bệnh dùng dung dịch muối pha loãng 15% trước gieo sạ ruộng, phương pháp làm giảm tỷ lệ truyền bệnh qua hạt, tăng suất từ 12 đến 15% Hiện việc xử lý hạt giống thuốc hóa học sử dụng rộng rãi, sử dụng loại dịch chiết thực vật áp dụng PHẦN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu - Mẫu hạt giống lúa thuần, lúa lai nguồn nấm thu thập tỉnh phía Bắc ven biển miền Trung 3.2 Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp điều tra theo QCVN 01-38:2010/BNNPTNT - Phương pháp lấy mẫu hạt giống theo ISTA (2010) - Phương pháp kiểm nghiệm hạt giống theo ISTA (2010) - Phương pháp nghiên cứu đặc điểm phân tử: hai mồi ITS1 ITS2 (White et al., 1990) sử dụng để nhân tồn vùng ITS mẫu nấm Tìm kiếm sở liệu Genbank phần mềm trực tuyến BLAST NCBI (the National Center for Biotechnology Information) Phân tích trình tự gene thực phầm mềm ClustalX MEGA5.1 - Phương pháp giám định nấm B oryzae hạt giống lúa theo Mathur and Olga (2003) - Tính hiệu lực thuốc theo cơng thức Abbott (1925) - Số liệu xử lý phần mềm Microsoft Excel, phân tích phương sai (ANOVA) phần mềm IRRISTAT 5.0 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Điều tra tình hình nấm B oryzae gây hại đồng ruộng Trong hai vụ xuân mùa năm 2010, 2011, 2012, tiến hành điều tra 20 giống lúa thuần, 10 giống lúa lai trồng phổ biến Các giống lúa bao gồm có lúa nếp, lúa tẻ, giống lúa thuộc nhóm chất lượng, giống lúa thuộc nhóm suất cao, giống lúa cổ truyền giống lúa chọn lọc, lai tạo Với lúa thuần, mức độ nhiễm nấm giống khác nhau, vụ mùa mức độ nhiễm nấm cao so với vụ xuân Nấm B oryzae tồn đồng ruộng, khả thâm nhập, gây bệnh ln trì Các vết bệnh nấm B oryzae gây tập trung già bánh tẻ lúa, triệu chứng bệnh bắt đầu xuất gần bơng địng vào thời điểm thu hoạch Đa số giống có số bệnh đồng ruộng thấp 1%, tỷ lệ bệnh 10% Bị gây hại nặng giống Bao thai lùn: vụ xuân tỷ lệ bệnh cao 10,5% số bệnh 1,8%; vụ mùa tỷ lệ bệnh 18,6% số bệnh 3,5% vào năm 2012, số bị nấm gây hại chủ yếu cấp bệnh Với lúa lai, kết cho thấy tất giống nhiễm nấm B oryzae với số bệnh tương đối thấp, cao giống HYT 100 (1,7%) vào vụ mùa năm 2012 Toàn số điều tra bị nhiễm bệnh cấp bệnh Chỉ số bệnh giống qua năm biến động tỷ lệ bệnh số bệnh giống không lớn So với giống lúa tỷ lệ bệnh số bệnh giống lúa lai thấp 4.2 Tình hình bệnh B oryzae gây hại hạt giống lúa Với hạt giống lúa thuần, tổng số 1200 mẫu hạt giống thu thập tỉnh phía Bắc ven biển miền Trung giám định để điều tra năm Tỷ lệ hạt nhiễm nấm mẫu thu thập khơng có biến động nhiều qua năm ngoại trừ số mẫu có kết tăng đột biến Tỷ lệ mẫu nhiễm tỷ lệ hạt nhiễm nấm vụ mùa cao vụ xuân Tỷ lệ mẫu nhiễm nấm thấp giống Q5 (18,3% vụ xuân), tỷ lệ hạt nhiễm thấp giống nếp Vải (1,6% vụ xuân năm 2010) Tỷ lệ mẫu nhiễm nấm tỷ lệ hạt nhiễm nấm trung bình cao giống IR 353-66 (tỷ lệ mẫu nhiễm nấm trung bình cao 91,7% vụ mùa, tỷ lệ hạt nhiễm 23,7% vụ mùa năm 2012) Với hạt giống lúa lai sản xuất nước, tỷ lệ mẫu nhiễm tỷ lệ hạt nhiễm nấm vụ mùa cao vụ xuân Các giống lúa lai có bố mẹ sản xuất nước có tỷ lệ mẫu nhiễm nấm tỷ lệ hạt nhiễm nấm cao giống có bố mẹ nhập Các giống có tỷ lệ hạt nhiễm nấm khơng q 5%, tỷ lệ có biến động không đáng kể qua năm Tỷ lệ hạt nhiễm thấp giống TH3-3 sản xuất năm 2010 (1,8%), 2011, 2012 (1,9%); tỷ lệ hạt nhiễm nấm cao xuất giống HYT 100 sản xuất vào năm 2011 LC 20 sản xuất vào năm 2012 với tỷ lệ 4,9% Với hạt giống lúa lai nhập khẩu, tiến hành điều tra mẫu lúa nhập vào nước ta vụ xuân vụ mùa ba năm 2010, 2011, 2012 liên tục, kết cho thấy khơng có mẫu bị nhiễm nấm B oryzae Với hạt giống lúa thu thập vùng sinh thái khác nhau, tỷ lệ hạt nhiễm nấm thấp thuộc vùng đồng sông Hồng, tỷ lệ nhiễm cao vùng 8,3% vào năm 2012 Các tỉnh vùng Bắc trung có tỷ lệ hạt nhiễm nấm cao (15,3% vào năm 2011) Sau tỉnh vùng Tây bắc có tỷ lệ cao 10,0% vào năm 2010; vùng Đơng bắc có tỷ lệ cao 9,5% vào năm 2011 Ở tất vùng, tỷ 10 lệ hạt nhiễm nấm khơng có biến đổi nhiều qua năm điều tra, tỷ lệ mẫu nhiễm nấm từ 36,6% đến 50% Với hạt giống lúa thu thập chế độ địa hình canh tác khác nhau, chế độ canh tác vụ lúa, vụ cá có tỷ lệ hạt nhiễm thấp (tỷ lệ cao 1,5%), chế độ chuyên canh lúa tỷ lệ hạt nhiễm cao (25,5%) Đất sản xuất vụ lúa, vụ cá thường khu đất trũng (đầm), giàu dinh dưỡng, lúa phát triển tốt, đẻ nhánh khỏe, loại sâu bệnh khác gặp Sau gặt, tất tàn dư bị ngập nước thời gian dài nên tỷ lệ mẫu nhiễm nấm thấp hạn chế việc truyền bệnh sang vụ sau Trên đất trồng lúa luân canh sản xuất vụ đông (khoai tây, rau họ thập tự), tỷ lệ mẫu nhiễm hạt nhiễm nấm có nhiều thấp chân đất trồng lúa, vụ đông ký chủ B oryzae nên hạn chế trình truyền bệnh đồng ruộng Các mẫu thu thập Nghệ An có tỷ lệ hạt nhiễm nấm lên tới 62,5%, khu ruộng chuyên canh lúa nằm khu vực cao, địa hình dốc, khơ hạn, khó khăn việc tưới tiêu Q trình chăm sóc làm cỏ, bón phân cơng tác bảo vệ thực vật cịn hạn chế, phát triển giống ruộng không đạt mức tối đa, phát triển dẫn đến nấm bệnh phát triển nhiều Tại Quảng Bình, mẫu thu ruộng chuyên canh lúa ven biển, đất pha cát bạc màu có tỷ lệ hạt nhiễm lên tới 52,5% Các mẫu thu ruộng đất nhiễm phèn tỉnh cho tỷ lệ hạt nhiễm 19,0% Số mẫu nhiễm mẫu kiểm tra cao loại địa Trên đất trũng có số mẫu nhiễm nấm thu thập số mẫu kiểm tra thấp (1/10), tỷ lệ hạt nhiễm nấm loại đất thấp (1,5%) 4.3 Một số đặc điểm sinh học, phân tử nấm B oryzae 4.3.1 Kiểu nảy mầm bào tử nấm B.oryzae Quá trình nảy mầm bào tử nấm xảy sau nhiệt độ 250C điều kiện đủ nước, ánh sáng nhẹ, khơng địi hỏi u cầu đặc biệt Bào tử nấm nảy mầm theo kiểu: nảy mầm đầu bào tử (70%) 11 nảy mầm đầu tế bào bào tử (30%) Kết nghiên cứu thu phù hợp với nghiên cứu Dela (2006) Tuy nhiên kiểu nảy mầm đầu bào tử không quan sát thấy, đa dạng sinh học nên có khác biệt Việt nam Philippin 4.3.2 Ảnh hưởngcủa nhiệt độ đến phát triển nấm B.oryzae Ở ngưỡng nhiệt độ khác nhau, phát triển nấm B oryzae sau ngày ni cấy có khác rõ rệt, nấm phát triển chậm ngưỡng 10oC bị ức chế hoàn toàn ngưỡng 35oC, phạm vi nhiệt độ thuận lợi cho sinh trưởng nấm B oryzae 25 -30oC Kết nghiên cứu phù hợp với Shoemaker (1959) tác giả khác Đây phạm vi nhiệt thường có điều kiện tự nhiên cuối vụ xuân vụ mùa miền Bắc lúa bước vào giai đoạn trỗ chín 4.3.3 Ảnh hưởng môi trường đến phát triển nấm B.oryzae Môi trường thuận lợi cho sinh trưởng phát triển nấm B oryzae PGA MEA, môi trường cung cấp nhiều cacbonhydrat cho nấm phát triển Nấm phát triển môi trường WA RTA, hai loại mơi trường khơng đáp ứng đủ dinh dưỡng cho nấm Bào tử sinh sớm với số lượng nhiều môi trường PGA Môi trường WA nấm không sinh bào tử sau ngày 4.3.4 Ảnh hưởng hàm lượng amylose protein hạt giống tới phát triển nấm B.oryzae Hàm lượng protein mối liên quan với tỷ lệ hạt nhiễm bệnh Tỷ lệ hạt nhiễm nấm cao thường xuất giống có tỷ lệ amylose thấp trung bình Tuy nhiên mối quan hệ tỷ lệ hạt nhiễm nấm tỷ lệ amylose chưa rõ ràng nên cần có nghiên cứu sâu để kết luận giống mẫn cảm với nấm B oryzae phụ thuộc vào hai tiêu hay không 4.3.5 Ảnh hưởng thời gian tới khả lan truyền nấm B.oryzae Theo thời vụ, sau 3, 6, tháng, hạt giống lúa sử dụng để gieo trồng Sau khoảng thời gian nhìn chung khả bảo tồn để lan truyền nấm không thay đổi Trên mẫu hạt giống có tỷ lệ hạt nhiễm nấm thấp, tháng sau thu hoạch bảo quản tỷ lệ nhiễm B.oryzae 12 hầu hết mẫu hạt giống lúa kiểm tra không thay đổi, sau tháng tỷ lệ nhiễm nấm tăng nhẹ (giống IRi 352 tăng 1,5%) Trên nhóm hạt giống có tỷ lệ hạt nhiễm nấm cao, tỷ lệ hạt nhiễm nấm B oryzae ổn định suốt thời gian lưu giữ tháng 4.3.6 Đặc điểm phân tử vùng gen ITS nấm B oryzae Hiện nay, vùng liên gien ITS (internally transcribed spacers) cụm gien rDNA vùng gen phổ biến để nghiên cứu đa dạng xác định nhiều loài nấm Các rDNA nấm tổ chức thành đơn vị phiên mã Mỗi đơn vị phiên mã lặp lại nhiều lần genome Về cấu trúc, sinh vật nhân thật, đơn vị phiên mã thường lặp lại nhiều lần kề thành cụm đơn vị phiên mã Một đơn vị phiên mã gồm gen xếp theo thứ tự 18S5.8S-28S Xung quanh vùng gen 5.8S vùng ITS ký hiệu ITS1 (ở đầu 5’) ITS2 (ở đầu 3’) Hình 4.1 Sơ đồ vùng ITS B oryzae Trình tự ITS1 ITS nấm: >B.oryzae AAGGTCTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTAC ACAACAAAATATGAAGGCCTGGCTTTCGCGGCC GGCTGAAGTATTTTTTTCACCCATGTCTTTTGCGCACTTGTTG TTTCCTGGGCGGGTTCGCCCGCCACCA GGACCAAACCATAAACCTTTTTTTCTTATGCAGTTTCCATCAG CGTCAGTAAAAACAATGTAATTATTAC AACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGA ACGCAGCGAAATGCGATACGTAGTGTGA ATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATT GCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGC 13 CTGTTCGAGCGTCATTTGTACCTTCAAGCTTTGCTTGGTGTTG GGCGTTTTTTTGTCTCCCTCTTTCTGG GAGACTCGCCTTAAAACGATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTC GGAGCGCAGCACATTTTTTGCGCTTTGT ATCAGGAGAAAAGGACGGTACTCCATCAAGACTCTACATTTT TCACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGA TACCCGCTGAACTTAAGCATATCA Tám mẫu nấm loại hạt giống lúa khác thu thập từ tỉnh khác (bảng 4.1) giải trình tự để tìm kiếm đa dạng vùng gen ITS Đoạn nucleotide đọc vùng ITS 539bp Kết tìm kiếm trình tự gần gũi GenBank cho thấy loài gần gũi Cochliobolus miyabeanus có nguồn gốc Nhật Bản, mã JN943398; đoạn so sánh 100%, mức đồng trình tự 100% Bảng 4.1 Nguồn gốc mẫu nấm B.oryzae thu thập STT Danh sách isolate/ Mẫu nấm Địa điểm thu thập BT7-V4/ Số Ninh Bình VL50-IV10/ Số 10 Hà Nội (Gia Lâm) QN1-IV17/ Số 17 Bắc Giang QR-III21/ Số 21 Hải Phòng HT1-I24/ Số 24 Thái Bình KD18-I248/ Số 248 Điện Biên IR35366-V557/ Số 557 Hà Tĩnh P6ĐB-III695/ Số 695 Thanh Hóa Tìm kiếm Genbank có 23 trình tự gen gần gũi với trình tự giải mã Việt Nam Các trình tự tìm thấy Cochliobolus miyabeanus gây hại họ hòa thảo lúa, lúa dại, niễng, cỏ ngọt, cỏ lồng vực, ngô, cá biệt gây hại chuối Lựa chọn 20 mẫu B oryzae 10 mẫu loài Bipolaris khác Genbank để so sánh mức đồng với mẫu B oryzae thu thập Việt Nam Trình tự gen mẫu nấm thu thập giống lúa tỉnh khác cho kết giống 14 vùng gen ITS1 ITS2 đồng với nhóm B oryzae công bố giới từ 82,2% trở lên, đồng với nhóm lồi Bipolaris khác công bố giới từ 81,1% trở lên 74 163DZAB016 (Mẫu số 24) 163DZAB020 (Mẫu số 695) 163DZAB010 (Mẫu số 4) 163DZAB018 (Mẫu số 248) 100 163DZAB019 (Mẫu số 557) 163DZAB015 (Mẫu số 21) 163DZAB014 (Mẫu số 17) 163DZAB012 (Mẫu số 10) B.oryzae (JQ237248) 63 B.oryzae (GU222693) B.oryzae (JQ517483) 76 B.oryzae (HM572291) B.oryzae (HM131852) B.oryzae (KF688970) Cụm loài B.oryzae B.oryzae (HM147247) B.oryzae (JQ753706) B.oryzae (HM147248) B.oryzae (KJ522982) B.oryzae (KJ563117) B.oryzae (KC315929) B.oryzae (JF693910) B.oryzae (KJ371107) B.oryzae (KC315942) 52 B.oryzae (KC315940) 80 B.oryzae (KC315943) 57 B.oryzae (KC315939) B.cynodontis (JX256412) B.chloridis (JN192372) B.microlaenae (JN601032) 74 B.peregianensis (JN601034) B.sativus (JX256418) 54 B.melinidis (JN601035) 74 B.victoriae (JN601027) B.maydis (AF071325) B.carbonum (AF158110) 84 57 B.zeae (AF081452) 0.005 Hình 4.2 Phân tích phả hệ dựa trình tự tồn vùng ITS mẫu nấm B oryzae Cây xây dựng phương pháp Neighbor-Joining (NJ) Giá trị nốt giá trị thống kê boostrap dạng % (1000 lần lặp) (ngưỡng tin cậy nhìn chung 75% có nghĩa 1000 lần lặp 750 lần đơn vị phân loại phân nhóm với nhau) Các mẫu B oryzae Việt Nam đánh dấu dấu chấm biểu diễn mã giải trình tự 15 Phân tích phả hệ dùng trình tự mẫu trình tự lồi xác định thơng qua tìm kiếm Blast (hình 3.2) Các mẫu thu phân nhóm chặt chẽ với cụm lồi tương ứng chúng Mức độ đồng mẫu thu thập Việt Nam với nhóm B oryzae cơng bố giới từ 74% trở lên Trình tự gen mẫu nấm giống lúa khác thu tỉnh khác cho kết giống vùng gen ITS1 ITS2 cho thấy Việt Nam nấm B oryzae chưa tìm thấy đa dạng vùng gen Để tìm đa dạng sinh học nấm B oryzae cần có nghiên cứu sâu phương pháp khác 4.4 Đặc điểm gây hại nấm B.oryzae hạt 4.4.1 Giai đoạn xâm nhiễm nấm B oryzae vào hạt Theo dõi trình xâm nhiễm tự nhiên nấm B oryzae vào hạt tiến hành ruộng sản xuất hạt giống lúa Hương thơm số Thái Bình vụ mùa năm 2012 Ruộng lúa lựa chọn để nghiên cứu giai đoạn phân hóa địng có tỷ lệ nhiễm nấm B oryzae 100%, số bệnh 7,9% Để đảm bảo trình xâm nhiễm vào hạt khơng bị ảnh hưởng, ruộng thí nghiệm khơng phun thuốc trừ bệnh Bảy giai đoạn phát triển hình thành hạt giống lúa điều tra lấy mẫu bơng mang phịng thí nghiệm để kiểm tra xuất nấm hạt, kết cho thấy số bệnh ruộng giống tăng dần từ giai đoạn phân hóa địng đến thu hoạch, giai đoạn trình hình thành hạt có xuất nấm B oryzae với hạt nhiễm nấm bơng tăng dần chín hoàn toàn, tỷ lệ hạt nhiễm nấm tăng từ 0,5 đến 6% Để đánh giá khả xâm nhiễm nấm B oryzae vào hạt thời điểm tạo hạt, lúa bệnh trồng chậu đặt ruộng lúa theo dõi Tồn bơng chậu thí nghiệm thu hoạch vào cuối giai đoạn phát triển để kiểm tra tỷ lệ hạt nhiễm nấm Tổng số 24 chậu lúa gieo từ nguồn hạt giống xử lý nấm bệnh trồng cách ly với nguồn bệnh sử dụng làm 16 thí nghiệm Kết cho thấy giai đoạn từ đẻ nhánh đến chuẩn bị trỗ lúa có thời gian tiếp xúc với nấm bệnh lâu B oryzae chưa xâm nhập vào địng nên khơng có chứng cho thấy nấm xâm nhập vào hạt Tỷ lệ hạt nhiễm nấm tăng đột biến vào giai đoạn trỗ 50% trở đi, tỷ lệ hạt nhiễm cao vào giai đoạn lúa trỗ 100% giảm dần vào giai đoạn sau (bảng 4.2) Bảng 4.2 Kết theo dõi mức độ nhiễm nấm B oryzae giai đoạn hình thành hạt đồng ruộng STT Giai đoạn phát triển Chỉ số bệnh (%) 3,1 Tỷ lệ hạt nhiễm nấm (%) - Đẻ nhánh Phân hóa địng 7,9 Chuẩn bị trỗ 7,9 1,5d Trỗ 50% 8,0 6,5b Trỗ 100% 9,9 9,0a Chín sữa 13,2 8,5a Chín sáp 14,0 3,0c Chín hồn tồn 15,3 2,0d Mỗi giai đoạn thực với chậu, chậu trồng cây, chậu đặt vào ruộng bị nhiễm bệnh Cuối giai đoạn thu chậu đặt chậu để thực giai đoạn Các ký tự khác có khác biệt mức ý nghĩa 0,05; CV=7,3% 4.4.2 Vị trí tồn nấm B oryzae hạt giống lúa Thu ngẫu nhiên lúa từ ruộng lúa Hương thơm số có số bệnh lớn 15%, chọn ba nhóm hạt có triệu chứng không biến màu, biến màu nhẹ, biến màu biến dạng Tách phần hạt, đặt phần giấy ẩm theo phương pháp Blotter Kết thu cho thấy tất phần vỏ trấu, phôi, vỏ cám nội nhũ ba nhóm hạt xuất nấm B oryzae (bảng 4.3) 17 Bảng 4.3 Vị trí tồn nấm B oryzae hạt Vị trí tồn nấm Đặc điểm mẫu Vỏ trấu Phôi Vỏ cám Nội nhũ Hạt không biến màu Hạt biến màu nhẹ Hạt biến màu biến dạng Ghi chú: + ++ +++ + ++ +++ + + ++ + + ++ + + + 25% số hạt bị nhiễm nấm vị trí kiểm tra 4.4.3 Vị trí phát triển gây hại hạt nấm B.oryzae Vị trí phát triển hạt nấm có ý nghĩa lớn q trình nảy mầm hạt Song song với trình hạt giống lúa nảy mầm, nấm B oryzae phát triển, vị trí nấm phát triển gần phơi hạt khả mầm bị gây hại nặng cao Gây nguy hiểm hạt giống lúa nấm tồn phát triển phơi vị trí sát cạnh phơi, mầm phát triển nấm công gây hại Với mức độ nhiễm nặng, nấm gây thối (chết) phôi hạt chưa kịp nảy mầm làm chết mầm hạt vừa nhú Vị trí gây hại nấm phát triển phía cuối hạt nơi cách xa phơi nhất, nhiên phụ thuộc vào mức độ nhiễm nấm hạt Nấm B oryzae gây hại hạt với biểu sau: - Gây chết hạt (hạt bị thối trước nảy mầm) - Toàn bề mặt hạt bị bao phủ lớp nấm màu xám đen - Mầm bị thối hoàn toàn - Rễ bị thối hoàn toàn - Mầm rễ bị thối toàn - Một phần mầm rễ bị thối Nấm gây hại hạt trình nảy mầm cấp độ khác tạo thương tổn khác (hình 4.3) 18 Hình 4.3 Các dạng mầm hạt giống lúa HT1 bị nấm B oryzae gây hại Mật độ bào tử xuất hạt có ý nghĩa việc lan truyền đồng ruộng Mật độ bào tử dầy tức số lượng bào tử nhiều, khả lan truyền nhanh mạnh, mật độ bào tử thưa, sợi nấm nhiều khả lan truyền Kết nghiên cứu cho thấy bào tử phát triển dày đặc xuất với tần xuất nhiều hạt bị nấm bao phủ nửa bề mặt Đối với hạt mang nấm phát triển nửa hạt kiểu mật độ bào tử thưa xuất nhiều Nghiên cứu xu phát triển nấm bề mặt hạt kết cho thấy nấm có xu phát triển phía phơi hạt với tỷ lệ cao tất mẫu nghiên cứu 4.4.4 Khả gây bệnh nguồn nấm B.oryzae thu thập tỉnh Toàn 24 mẫu nấm tham gia thí nghiệm cho kết tương đối giống thời kỳ tiềm dục, khả lây bệnh mức độ gây hại Thời gian xuất triệu chứng bệnh sau lây nhiễm khoảng từ đến ngày Tỷ lệ bệnh tương đối cao từ 74,5 đến 86,8%, số bệnh từ 7,6 đến 10,3% Khơng có khác nhiều độ độc khả gây bệnh nguồn nấm thu thập Hạt mang nấm bên hạt hay bám dính bên ngồi có khả gây hại tương tự nhau, tỷ lệ hạt chết mầm bất bình thường tương đương 19 4.4.5 Ảnh hưởng tỷ lệ hạt nhiễm nấm B.oryzae đến tỷ lệ nảy mầm hạt giống lúa Nấm cơng trực tiếp vào phơi làm hạt khơng có khả nảy mầm mầm bị chết Cây mầm trở nên yếu ớt bất bình thường bị nhiễm bệnh thứ cấp có vết bệnh nghiêm trọng vị trí thân mầm bao mầm Các mẫu có tỷ lệ nảy mầm cao có tỷ lệ hạt nhiễm nấm thấp, mẫu có tỷ lệ nảy mầm thấp có tỷ lệ hạt nhiễm nấm cao tương đương tỷ lệ hạt chết mầm bất bình thường mẫu (bảng 4.4, 4.5) Bảng 4.4 Ảnh hưởng tỷ lệ hạt nhiễm nấm B oryzae đến tỷ lệ nảy mầm giống Hương thơm số Tỷ lệ (%) Tỷ lệ hạt Dung Đặc điểm nảy nhiễm nấm lượng Mầm Mầm Hạt Hạt mầm mẫu B.o (%) mẫu BT KBT KNM chết Cao (> 80%) Trung bình Thấp (80% 100 57,2 21,4 21,4 38,0 37,0 25,0 20 Nhóm nảy mầm 50-80% 10% để đảm bảo tỷ lệ nảy mầm đạt yêu cầu làm giống - Các công ty sản xuất hạt giống lúa nên xây dựng quy trình chế biến hạt giống sử dụng phương pháp sấy khô để hạn chế tối đa lan truyền nấm bệnh qua hạt Có thể áp dụng quy trình: quạt vỏ từ 2- giờ, sấy nhiệt độ 380C, 400C, 420C ngưỡng giờ, tăng nhiệt độ sấy lên 500C giờ, để giảm nhiệt tự nhiên lò sấy 24 ... gây hại B oryzae 1.5 Đối tượng phạm vi nghiên cứu đề tài 1.5.1 Đối tượng nghiên cứu Hạt giống lúa sử dụng phổ biến sản xuất nguồn nấm B oryzae gây hại hạt giống lúa thu thập tỉnh phía Bắc ven biển. .. Kết nghiên cứu nấm B oryzae gây hại hạt giống lúa sản xuất Việt Nam bổ sung liệu khoa học nấm B oryzae hại lúa - Các kết thu đề tài sở để xây dựng tiêu chuẩn hạt giống tỷ lệ hạt nhiễm nấm phép lúa. .. ruộng, tỷ lệ hạt bị nhiễm nấm hạt giống lúa tỉnh miền Bắc ven biển miền Trung - Xác định trình xâm nhiễm B oryzae vào hạt giống ảnh hưởng nấm tới khả nảy mầm hạt giống - Xác định số đặc điểm sinh